PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.86 MB, 33 trang )
L/O/G/O
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH STAPHYLOCOCCUS AUREUS
NỘI DUNG
1
Tổng quan về S.aureus
2
Quy trình phân tích S.aureus
3
Ví dụ PP phân tích S.aureus
TỔNG QUAN S.AUREUS
Staphylococcus aureus
Thuộc họ Staphylococcaceae
Còn gọi là Tụ cầu vàng
Sống hiếu khí tùy nghi
Khóa phân loài của
S. aureus
Giới (Kingdom):
Bacteria
Nghành (Phylum):
Lớp (Class):
Bộ
Firmicutes
Bacilli
(Order): Bacillales
Họ (Family): Staphylococcaceae
Giống
(Genus): Staphylococcus
Loài (Species):
S. aureus
PƯ catalase, coagulase dương tính
PƯ oxidase âm tính
Hầu hết có khả năng tan huyết (95%)
Lên men tạo acid từ mannitol
Phát triển được trên môi trường chứa 15% NaCl
Trên môi trường không chọn lọc tạo sắc tố vàng
Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt
Dấu hiệu nhiễm và các bệnh do S. aureus
Khả năng gây ngộ độc
thực phẩm
• Sinh 5 độc tố ruột: enterotoxin A, B, C, D, E
bền nhiệt
– Viêm dạ dày ruột: ăn thức ăn bị nhiễm độc tố
– Viêm ruột non – đại tràng: ăn thức ăn bị nhiễm tụ
cầu với số lượng lớn (>105 vi khẩn/1g thức ăn)
• Sinh độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc
2. Quy trình phân tích S.aureus
1. Phương pháp định lượng truyền thống
• Phương pháp đếm khuẩn lạc
• Phương pháp MPN
2. Phương pháp hiện đại
• Phương pháp ELISA
• Phương pháp PCR
1. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
Nguyên tắc
Sử dụng môi trường chọn lọc để bắt những
khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus
• Môi trường Baird Parker Agar (BPA)
• Khuẩn lạc đặc trưng: đường kính 0,5 – 1 mm, lồi,
đen bóng có vòng trắng đục hẹp, vòng sáng rộng
Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định
• S. aureus có phản ứng coagulase dương tính – làm
vón cục huyết tương
Môi trường, hóa chất
Môi trường
Dung dịch Saline Peptone Water
(SPW)
Môi trường thạch Braid Parker
Agar (BPA)
Môi trường Trypticase Soy Agar
(TSA)
Huyết tương thỏ
Hóa chất
Cồn 90o và
70o
HCl 10%
NaOH 10%
QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUS
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
Bước 1: Định lượng mẫu, đồng
nhất mẫu (10g mẫu trong 90ml môi
trường SPW)
Bước 2: Pha loãng mẫu theo nồng
độ pha loãng thập phân
Bước 3: Cấy 0,1 ml dung dịch mẫu ở các nồng độ pha
loãng lên bề mặt các đĩa mt Baird Parker agar (BPA) có
bổ sung Egg-York, trải đều bằng que trang.
Úp ngược đĩa, ủ 37 ±
0,5oC trong 24-48 h
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (Nt) và
số khuẩn lạc không đặc trưng (Na)
Bước 4: Chuyển 5 kl đặc trưng và 5
kl không đặc trưng sang mt TSA
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
KL đặc trưng của S. aureus
trên mt BPA
KL đặc trưng
Bước 5: Cấy chuyền vào ống
chứa 0,3ml huyết tương
Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ.
Nếu không có kết quả dương tính sẽ ủ đến 24
giờ. Xác định tỉ lệ dương tính Rt (KL đặc
trưng) và Ra(KL không đặc trưng)
Kết quả: số S. areus (cfu/g)
1
S=
( N t Rt + N a Ra )
nVf
KL không đặc
trưng
Thử nghiệm coagulase
Âm tính
Dương tính
Mức độ đông tụ huyết tương
2. PHƯƠNG PHÁP MPN
Nguyên tắc
Tăng sinh trong môi trường chọn lọc
• Môi trường MSB
• Ống dương tính sẽ chuyển từ màu đỏ sang vàng
Mẫu có biểu hiện dương tính được phân lập trên
môi trường chọn lọc
• Môi trường BPA
• KL đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 0,5 – 1
mm, có vầng sáng chung quanh
Khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ
• Phản ứng coagulase làm ngưng kết huyết tương
Môi trường, hóa chất
Môi trường
Dung dịch Saline Peptone Water
(SPW)
Môi trường canh MSB (Mannitol
Salt Broth)
Môi trường thạch Braid Parker
Agar (BPA)
Môi trường Trypticase Soy Agar
(TSA)
Huyết tương thỏ
Hóa chất
Cồn 90o và
70o
HCl 10%
NaOH 10%
QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUS
BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN
Định lượng mẫu, đồng nhất mẫu (10g
mẫu trong 90ml môi trường SPW)
Pha loãng mẫu theo nồng độ pha
loãng thập phân
QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
S. AUREUS BẰNG PP MPN
MSB
Cấy 1 ml vào ống nghiệm chứa 10ml MSB
1ml
(-)
(+)
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 - 48 giờ
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
10-1
Ống (+) môi trường chuyển
sang màu vàng
1ml
Ống (-) môi trường không chuyển màu
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
-2
Cấy ống (+)10sang
môi trường BPA
1ml
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 48 giờ
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
10-3
Chọn kl đặc trưng cấy chuyển sang TSA
BPA MSB
10ml
KL đặc trưng
TSA
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
TSA
Cấy chuyền vào ống chứa 0,3ml huyết
tương thỏ
Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8
giờ. Nếu không có kết quả dương tính
sẽ ủ đến 24 giờ.
Kết quả: Đọc kết quả thử nghiệm
Coagulase
Tra bảng MPN
1 ống (+)
Phát hiện
Tất cả (-)
Không
Phát hiện
Đọc kết quả thử
nghiệm coagulase
10-1
1
10-2
1
10-3
0
Kết quả MPN
4 MPN/g
VÍ DỤ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
S.AUREUS THỰC TẾ
Định tính
Staphylococcus
aureus trong
mẫu chả lụa ở
chợ Đồng Xoài
- Bình phước
Quy trình thực hiện:
Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
Cấy mẫu
Đọc kết quả
Khẳng định
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Mẫu chả lụa được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy
trong điều kiện vô trùng cho tới khi đồng nhất.
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
- Cân chính xác 10g mẫu chả lụa đã được chuẩn bị cho
vào túi nilon vô trùng.
- Thêm 90ml nước đệm phosphate và đồng nhất mẫu
trong vòng 2 phút => dung dịch mẫu thử 10-1
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống
nghiệm chứa sẵn 9 ml nước đệm phosphate, lắc đều =>
dung dịch 10-2.
- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được dung dịch
mẫu thử 10-3.
