BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN DƢỢC LIỆU

HOÀNG MINH CHÂU
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI
TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA
SYLVESTRE (RETZ.) R. Br. EX SCHULT.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN DƢỢC LIỆU

HOÀNG MINH CHÂU
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI
TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA
SYLVESTRE (RETZ.) R. Br. EX SCHULT.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Văn Ơn
PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu

HÀ NỘI - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình khoa học của riêng tôi dưới
sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Văn Ơn và PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu.
Các số liệu, kết quả trình bày trong Luận án là trung thực, khách quan
và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tác giả Luận án

NCS. Hoàng Minh Châu


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án này, tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ quý báu của các tập thể thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc
nhiều lĩnh vực, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn và
PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận án
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Dược liệu, các thầy cô trong
Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong
quá trình nghiên cứu và hàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
- GS Oh Wen Keun, Khoa Dược, trường ĐH Quốc Gia Seoul, Hàn Quốc
- Thạc sỹ Phạm Hà Thanh Tùng, Giáo viên bộ môn Thực vật, trường Đại
học Dược Hà Nội, Nghiên cứu sinh tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn
Quốc.

- GS.TS Nguyễn Thanh Kỳ, nguyên Hiệu trưởng trường Đại học Dược Hà
Nội
- PGS.TS Đỗ Thị Hà, phó trưởng khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu.
- PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh, trưởng Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y
Hà Nội.
Đã tạo điều kiện giúp đỡ,hướng dẫn và đóng góp ý kiến quý báu cho tôi
hoàn thiện Luận án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, đến
những người đồng nghiệp trong công ty Nam Dược đã luôn ủng hộ, gánh vác
công việc và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
NCS. Hoàng Minh Châu


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
ALP
ALAT
ASAT
ARN
AUC
COSY
DMSO
DMEM
DTT
DTC
ĐTĐ
EA
EDTA
ESI- MS


:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:

EtOH
GAPDH
GACP – WHO

:
:
:

G.albiflorum
G. alterfolium
G.griffithii
G. hirsutum
G. inodorum

G.latifolium
G.sylvestre
G.yunnansense
G. montanum
Gla
Glc
GM
GS

:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:

Acid deoxyribonucleic
Alkaline Phosphatase
Chỉ số men gan
Chỉ số men gan
Acid ribonucleic
Diện tích dƣới đƣờng cong (Area under the curve)
Phổ Cosy (Correlation Spectroscopy)

Dimethyl sulfoxid
Dulbecco's Modified Eagle's medium
Dithiothreitol
Dây thìa canh Gymnema sylvestre
Đái tháo đƣờng
Ethyl acetat
Acid ethylene diamin tetraacetic
Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray
Ionization Mass Spectrometry)
Ethanol
Glyceraldehyd 3- phosphate dehydrogenase
Thực hành trồng trọt, thu hái, chế biến tốt dƣợc liệu theo
tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới
Gymnema albiflorum
Gymnema alterfolium
Gymnema griffithii
Gymnema hirsutum
Gymnema inodorum
Gymnema latifolium
Gymnema sylvestre
Gymnema yunnansense
Gynema montanum
Acid glucuronic
Glucose
Gymnemagenin
Gymnema sylvestre


GS3
GS4

G3PDH
HBA1C
HDL
HE x 400
HFD
HMBC
HPLC

:

Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh
Một phân đoạn chiết xuất của Dây thìa canh
Glycerol - 3- phosphate dehydrogenase
Chỉ số gắn kết của đƣờng trên hemoglobin hồng cầu
High density lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao
Nhuộm Hematoxylin – Eosin, độ phóng đại 400 lần
Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet)

:

Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

:
:
:
:
:
:

:

:

HRESI MS

:

HSQC

:

IR
MeCN
MeOH
NFD
NMR
NOESY
NP
LDL
LOL
LOD
LOQ
OA
OVL
PBS
PTP1B
p-NPP
RP
SD
STZ
TG

TLC

:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:

(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High- performance liquid
chromatography)
Phổ khối lƣợng phun mù điện tử phân giải cao (High resolution
Electron Spray Ionization Mass Spectrometry)
Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua 1 liên kết (Heteronuclear


Single Quantum Connectivity)
Insulin receptor
Acetonitril
Methanol
Chế độ ăn bình thƣờng (Nomal fat diet)

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic
resonance Spectrometry)

Phổ Noesy (Nuclear Overhause Effect Spectroscopy)
Pha thƣờng (Normal phase)
Low density lipoprotein- Lipoprotein tỷ trọng thấp
Giới hạn tuyến tính ( Limit of Linear)
Giới hạn phát hiện ( Limit of Detection)
Giới hạn định lƣợng ( Limit of Qualification)
Acid oleanolic
Chồng lấn (Overlap)
Phosphate buffered saline
Protein tyrosine phosphatases
p-nitrophenyl phosphate
Pha đảo (Reverse phase)
Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
Streptozocin
Triglycerid
Sắc ký lớp mỏng


TLTK
UA
Xyl

1

H NMR

2-NBDG
2D-NMR
13

C -NMR

: Tài liệu tham khảo
: Acid ursolic
: Xylose
: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear
Magnetic Resonance Spectrometry)
fluorescent 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4: Glucose
yl)Amino)-2-Deoxyglucose
cộng hƣởng từ hạt nhân 2 chiều (Two – dimension
: Phổ
Nuclear magnetic resonance Spectrometry)
cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13
: Phổ
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry)


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br trên thế giới

4


Bảng 1.2. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam

6

Bảng 1.3. Các hợp chất saponin có khung olean trong DTC G. sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult
Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học các hợp chất alternosid phân lập từ
G.alternifolium (Lour.) Merr
Bảng 1.5. Cấu trúc hóa học một số saponin khung olean của Gymnema
inodorum (Lour.) Decne
Bảng 1.6. Một số hợp chất saponin khung dammaran phân lập từ
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult
Bảng 1.7. Tổng hợp một số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi
Gymnema R.Br Gymnema R.Br
Bảng 1.8. Hàm lƣợng Gymnemagenin các mẫu DTC thu theo tháng với
các cách làm khô khác nhau

10
16
17
19
26
30

Bảng 2.1. Thời gian thu mẫu DTC G.sylvestre R. Br. ex Schult

33

Bảng 2.2. Chế độ ăn NFD và HFD tính trên 100g thức ăn


40

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của chất 1 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ

49

NMR của chất 2

53

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của chất 3

57

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của chất 4

59

Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR chất 5

63

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của các chất 6,7

67

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của các chất 8

72


Bảng 3.8. Sự biến đổi nồng độ glucose máu của chuột sau 8 tuần ăn
thức ăn giàu chất béo

77

Bảng 3.9. Vi thể tụy của chuột sau 2 tuần uống mẫu

80

Bảng 3.10. Hoạt tính ức chế enzyme PTP1B của các chất 1-8

86

1

13

Bảng 3.11. Dữ liệu phổ H-NMR và C-NMR của TCNH, aglycon chất
5 và gymnemagenol tham khảo
Bảng 3.12. Tính thích hợp của của hệ thống
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu chất
đối chiếu

93
101
101


Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu thực


102

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phƣơng pháp

102

Bảng 3.16. Kết quả khảo sát tính đúng của phƣơng pháp

103

Bảng 3.17. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

10
5

Bảng 3.18. Hàm lƣợng gymnemagenol các mẫu dịch chiết thuỷ phân
DTC theo các tháng
Bảng 4.1. Danh sách các chất phân lập từ Dây thìa canh

10
5

Bảng 4.2. Sinh khối DTC vùng trồng Nam Định tại các thời điểm thu
hoạch

111
120


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc khung olean của các hợp chất trong G. sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult
Hình 1.2. Cấu trúc các nhóm thế của hợp chất saponin khung olean
trong Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học chung của các alternosid phân lập từ loài
G.alternifolium (Lour.) Merr
Hình 1.4. Cấu trúc các nhóm thế trong các hợp chất alternosid phân lập
từ G. Alternifolium (Lour.) Merr
Hình 1.5. Cấu trúc của một số hợp chất saponin có khung olean phân
lập từ Gymnema inodorum (Lour.) Decne
Hình 1.6. Cấu tạo của gymnemasid VI và gymnemasid VII
Hình 1.7. Cấu tạo chung của các gymnemasid I-V
Hình 1.8. Cấu trúc các nhóm thế trong các gymnemasid phân lập từ G.
sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult
Hình 1.9. Sự thay đổi hàm lƣợng ginsenosid Rg1, Re và Ro trong rễ
nhân sâm theo tuổi thu hái
Hình 1.10. Hàm lƣợng gymnemic acid II tại tại các bộ phận của
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult
Hình 2.1. Lá và hoa cây Dây thìa canh tại vùng trồng Hải Hậu, Nam
Định
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu trên chuột nhắt
ĐTĐ typ 2
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất, phân lập các chất từ Dây thìa canh

Hình 3.3. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) trong chất
1



C) và COSY (H-H) của chất 2


Hình 3.6. Cấu trúc hóa học chất 3

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học chất 4

1
5
16
17
18
18
19
30
31
34
41

49
5
1

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học chất 2

Hình 3.7. Các tƣơng tác HMBC (H

9

47

Hình 3.2. Cấu trúc hóa học chất 1


Hình 3.5. Các tƣơng tác HMBC (H

8



C) và COSY (H-H) của chất 3

5
3
5
5
5
6


56
59


Hình 3.9. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) trong chất
4

62

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học chất 5

62


Hình 3.11. Các tƣơng tác HMBC (H



C) và COSY (H-H) của chất 5

63

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học chất 6

66

Hình 3.13. Cấu trúc hóa học chất 7

66

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học chất 8

71

Hình 3.15. Các tƣơng tác HMBC (H



C) và COSY (H-H) của chất 8

72

Hình 3.16. Sự thay đổi khối lƣợng chuột tại các thời điểm nghiên cứu


76

Hình 3.17. Ảnh hƣởng của mẫu thử lên nồng độ glucose máu của chuột
nhắt trắng ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần uống mẫu thử
Hình 3.18. Trọng lƣợng gan tƣơng đối của chuột ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần
điều trị

78

Hình 3.19. Trọng lƣợng tụy của chuột ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần điều trị

80

Hình 3.20. Hình thái vi thể tụy chuột lô chứng (chuột số 2) (HE x 400)

82

Hình 3.21. Hình thái vi thể tụy chuột lô mô hình (chuột số 18) (HE x
400)
Hình 3.22. Hình thái vi thể tụy chuột lô mô hình (chuột số 21) (HE x
400)
Hình 3.23. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột
số 27) (HE x 400)
Hình 3.24. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột
số 29) (HE x 400)
Hình 3.25. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 2,88 g dƣợc liệu
khô/kg (chuột số 78) (HE x 400)
Hình 3.26. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 2,88 g dƣợc liệu
khô/kg (chuột số 79) (HE x 400)
Hình 3.27. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu

khô/kg (chuột số 71) (HE x 400)
Hình 3.28. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu
khô/kg (chuột số 74) (HE x 400)

82

Hình 3.29. Nồng độ ức chế 50% (IC50) của chất 5 trên enzyme PTP1B

86

Hình 3.30. Ảnh hƣởng của các chất 1-5 trên khả năng hấp thu glucose
fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1

87

79

83
83
84
84
8
5
8
5

88


Hình 3.31. A. Ảnh hƣởng của chất 5 trên khả năng hấp thu glucose

fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1; B. Ảnh hƣởng
của chất 5 ở điều kiện nồng độ khác nhau trên khả năng hấp thu glucose
fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1

88

Hình 3.32. Cấu trúc của gymnemagenol

90

Hình 3.33. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) của
TCNH
Hình 3.34. So sánh phổ của chất 4 có CH2OH-29 và chất tham khảo có
cấu hình CH2OH-29
Hình 3.35. Cấu trúc của TCNH

97
98
99

Hình 3.36. Sắc ký đồ của chất đối chiếu gymnemagenol và các mẫu thử

100

Hình 3.37. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng gymnemagenol

103

Hình 3.38. Dãy nồng đồ xác định giới hạn tuyến tính của phƣơng pháp


104

Hình 3.39. Tỷ lệ % gymnemagenol trong các mẫu dịch chiết thuỷ phân
theo các tháng

107

Hình 4.1. Mẫu DTC lƣu giữ tại Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Paris, Pháp

109

Hình 4.2. Cơ chế giảm tác dụng kháng insulin của chất ức chế enzym
PTP1B

117


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.....................................................................................3
1.

THỰC VẬT HỌC..........................................................................................3

1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R. Br.............3

1.2. Chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài................6
2.

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI

GYMNEMA R. Br...................................................................................................7
2.1.

Nhóm hợp chất saponin...............................................................................7

2.2.

Các nhóm chất khác................................................................................... 19

3.

TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT VÀ CHỐNG TĂNG LIPID HUYẾT

CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R. Br....................................20
3.1.

Tác dụng hạ đƣờng huyết.......................................................................... 20

3.2.

Tác dụng chống tăng lipid huyết................................................................ 25

4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT
SAPONIN TRONG MỘT SỐ DƢỢC LIỆU...................................................... 28
4.1. Phƣơng pháp định lƣợng và đánh giá động thái tích lũy hoạt chất.................28

4.2 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo tuổi cây.......................................................... 28
4.3. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời gian thu hái trong năm...........................29
4.4. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời điểm sinh trƣởng và bộ phận của cây....30
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......33
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU......................................................... 33


2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu................................................................................ 33
2.1.2. Vật liệu, dung môi, hóa chất......................................................................... 34
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu................................................... 35
2.1.4. Động vật thực nghiệm dùng trong nghiên cứu.............................................. 37
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................ 38
2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học.................................................................... 38
2.2.1.2.Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập.............................................. 38
2.2.2. Nghiên cứu tác dụng sinh học....................................................................... 38
2.2.2.1. Phƣơng pháp điều chế mẫu dịch chiết DTC cho thử tác dụng hạ đƣờng
huyết........................................................................................................................... 39
2.2.2.2.Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột của dịch chiết Dây thìa
canh............................................................................................................................ 39
2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập đƣợc............41
2.2.2.3.1. Phƣơng pháp xác định khả năng ức chế enzym PTP1B của hoạt chất....41
2.2.2.3.2. Phƣơng pháp biệt hóa tế bào mô mỡ 3T3-L1......................................... 42
2.2.2.3.3. Phƣơng pháp đo độ hấp thu glucose trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các
chất phân lập............................................................................................................... 43
2.2.2.3.2.4. Phƣơng pháp chụp ảnh tế bào phát huỳnh quang................................43
2.2.2.3.5. Phƣơng pháp phân tích kết quả.............................................................. 43
2.2.3. Nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất trong lá Dây thìa canh................... 44
2.2.3.1. Phƣơng pháp thủy phân và xác định cấu trúc aglycon...............................44
2.2.3.2.Phƣơng pháp định lƣợng aglycon và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất 44


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................... 46
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC......................46
3.1.1. Chiết xuất và phân lập các chất tinh khiết từ Dây thìa canh.......................... 46
3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học các chất đã phân lập đƣợc.................................. 48


3.1.2.1. Chất 1........................................................................................................ 48
3.1.2.2. Chất 2........................................................................................................ 52
3.1.2.3. Chất 3........................................................................................................ 55
3.1.2.4. Chất 4........................................................................................................ 58
3.1.2.5. Chất 5........................................................................................................ 61
3.1.2.6. Chất 6........................................................................................................ 65
3.1.2.7. Chất 7........................................................................................................ 66
3.1.2.8. Chất 8........................................................................................................ 69
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC.........................74
3.2.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột...........................74
3.2.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập.........85
3.3.2.1.Hoạt tính ức chế enzym PTP1B.................................................................. 85
3.2.2.2.Hoạt tính hấp thu glucose trong tế bào 3T3-L1 của các chất......................86
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT.......88
3.3.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc aglycon gymnemagenol...............88
3.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng gymnemagenol và theo dõi động thái tích
lũy hoạt chất trong DTC............................................................................................. 96
3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu dƣợc liệu và khảo sát điều kiện phân tích...........................96
3.3.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống......................................................... 98
3.3.2.3. Độ lặp lại của phƣơng pháp....................................................................... 98
3.3.2.4. Khảo sát khoảng tuyến tính của phƣơng pháp........................................... 99
3.3.2.5. Độ đúng của phƣơng pháp......................................................................100
3.3.2.6. Giới hạn của phƣơng pháp......................................................................101
3.3.2.7. Định lƣợng gymnemagenol các mẫu Dây thìa canh theo các tháng thu hái102


CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN.....................................................................................106
4.1. VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU.............................................................106


4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC................................................................107
4.3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC.....................................................................112
4.3.1. Về tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết Dây thìa canh.........................112
4.3.2. Về tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập từ Dây thìa canh.........115
4.4. VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT............................................117
4.5. BÀN LUẬN CHUNG...................................................................................119
KẾT LUẬN.............................................................................................................121
1. Về thành phần hóa học...................................................................................121
2. Về tác dụng sinh học.......................................................................................122
3. Về động thái tích lũy hoạt chất......................................................................122
ĐỀ XUẤT................................................................................................................124

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ
Dây thìa canh (DTC) (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.),
thuộc chi Gymnema R.Br, phân bố rất rộng từ Tây Châu Phi sang Châu Úc,
Châu Á. DTC đã đƣợc sử dụng trong nền Y học cổ truyền Ấn Độ từ hơn 2000
năm để điều trị Đái tháo đƣờng (ĐTĐ), cho đến nay có hàng trăm nghiên cứu
tại Ấn Độ và nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Ấn Độ, Nhật Bản, M , Trung Quốc
…liên quan đến DTC, tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng
sinh học, trong đó chủ yếu là tác dụng hạ đƣờng huyết cũng nhƣ một số bệnh
lý chuyển hóa khác.

Tại Việt Nam, Dây thìa canh bắt đầu đƣợc tập trung nghiên cứu từ năm 2008,
trên các khía cạnh đa dạng sinh học, phân bố, độc tính, tác dụng hạ đƣờng
huyết, từ đó nghiên cứu phát triển tạo ra nhiều sản phẩm hạ đƣờng huyết dƣới
dạng viên nang, viên nén, dạng trà túi lọc và cả dạng dƣợc liệu khô đóng gói để
sắc uống. Nhằm bảo đảm nguồn nguyên liệu, DTC cũng đã đƣợc nghiên cứu
nhân giống, trồng trọt. Đến năm 2015, đã có 2 vùng trồng đạt tiêu chuẩn GACP
- WHO của công ty Nam Dƣợc tại Hải Hậu (Nam Định) và của công ty DK
Natura tại Phú Lƣơng (Thái Nguyên).
Trong quá trình phát triển và ứng dụng trong thực tiễn DTC có nguồn gốc tự
nhiên ở Việt Nam, xuất hiện nhiều vấn đề chƣa đƣợc làm sáng tỏ nhƣ thành
phần hóa học khác so với DTC ở Ấn Độ, khó đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu
dựa trên hàm lƣợng hoạt chất, xác định thời gian thu hái cho chất lƣợng tốt
nhất trong trồng trọt,... Lý do chính là thiếu các nghiên cứu về thành phần hóa
học và tác dụng sinh học của các chất trong DTC. Từ những lý do trên, đề tài
‖Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất
của cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.)‖ đƣợc
thực hiện với 2 mục tiêu chính:
1. Xác định cấu trúc hóa học các thành phần hóa học chính của lá
Dây thìa canh Việt Nam.

1


2. Xác định sự thay đổi hàm lƣợng một số hoạt chất chính theo thời
gian thu hái trong năm của lá Dây thìa canh.
Để đạt được mục tiêu trên, Luận án tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau:
Về thành phần hóa học:
- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các thành phần hóa học chính
trong lá Dây thìa canh.
Về thử tác dụng sinh học:

- Thử tác dụng in vivo tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết toàn phần lá
Dây thìa canh.
- Thử tác dụng in vitro tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập
đƣợc từ lá Dây thìa canh.
Về nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất:
- Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hoạt chất chính trong lá Dây thìa
canh.
- Theo dõi sự thay đổi hàm lƣợng hoạt chất của các mẫu lá Dây thìa canh
thu hái trong năm.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1. THỰC VẬT HỌC
1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R. Br.
 Vị trí phân loại
Có hai quan điểm khác nhau về vị trí phân loại của chi Gymnema R. Br.
Quan điểm thứ nhất cho rằng chi Gymnema R. Br. thuộc họ Thiên lý
(Asclepiadaceae). Đa số các tài liệu phân loại thực vật kinh điển đều theo quan
điểm này [19]. Một số tài liệu về thực vật ở Việt Nam cũng xếp chi Gymnema
R. Br. vào họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [2], [7],[8].
Tuy nhiên, năm 2009 Takhtajan đã công bố hệ thống phân loại trong đó xếp
Gymnema R. Br. là một chi trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là
Apocynaceae [17]. Cho đến nay, quan điểm này đƣợc thừa nhận rộng rãi trong
các hệ thống phân loại quốc tế [32],[79]. Theo đó, Gymnema R. Br. là một chi
thuộc phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae), họ Trúc đào (Apocynaceae), bộ
Long đởm (Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan
(Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [17].
 Đặc điểm hình thái chung của chi Gymnema R. Br.

Cây leo, không có rễ phụ trên thân. Lá mọc đối, không nạc. Cụm hoa xim,
tán hoặc chùm. Hoa nhỏ. Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít
khi không có tuyến. Tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền
khai hoa vặn phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính ở tràng, thƣờng có các
hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau; bao phấn 2 ô, thƣờng có phần
phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối
phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót dính và 2
chuôi; khối phấn hƣớng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy
phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị-nhụy
hình ống nhọn đầu [20],[32].

3


 Các loài thuộc chi Gymnema R. Br. và sự phân bố của chúng trên thế
giới
Có nhiều nhận định khác nhau về số lƣợng loài của chi Gymnema R. Br, một
số tài liệu cho rằng chi này có khoảng 25 loài trên toàn thế giới [7], [20], [32].
Tuy nhiên, sau khi tổng hợp các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới, các tác
giả thuộc dự án ―The plant list‖ đã xác định đƣợc 144 tên loài thuộc chi
Gymnema R. Br. trong đó có 51 tên khoa học đƣợc chấp nhận (35,4%), 66 tên
đƣợc xác định là tên đồng nghĩa (45,8%) và 27 tên chƣa xác định đƣợc chính
xác thông tin (18,8%) [80].
Bảng 1.1. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br trên thế giới
STT Tên các loài thuộc chi Gymnema R.
Br. đƣợc chấp nhận [50]

Phân bố

1


Gymnema acuminatum Wall.

Nepal, Ấn Độ, Malaysia [80]

2

Gymnema albidum Decne.

Timor [80]

3

Gymnema albiflorum Costantin

Việt Nam [91]

4

Gymnema brevifolium Benth.

Úc [80]

5

Gymnema calycinum Schltr.

Luzon [80]

6


Gymnema chalmersii Schltr.

New Guinea [80]

7

Gymnema cumingii Schltr.

Philippin [80]

8

Gymnemacuspidatum(Thunb.)
Kuntze

9

Gymnema decaisneanum Wight

Tamil Nadu [80]

10

Gymnema dissitiflorum Ridl.

Malaysia [80]

11


Gymnema dunnii (Maiden & Betche)
P.I.Forst.

Úc [80]

12

Gymnema elegans Wight & Arn.

Tamil Nadu [80]

13

Gymnema erianthum Decne.

New Caledonia [80]

14

Gymnema foetidum Tsiang

Việt Nam [1], Trung Quốc [20]
4


STT Tên các loài thuộc chi Gymnema R.
Br. đƣợc chấp nhận [50]

Phân bố


15 Gymnema glabrum Wight

Myanmar [80]

16 Gymnema griffithii Craib

Thái Lan, Việt Nam

17 Gymnema hainanense Tsiang

Trung Quốc [20]

18 Gymnema hirtum Ridl.

Malaysia [80]

19 Gymnema inodorum (Lour.) Decne.
20 Gymnema javanicum Koord.

Trung Quốc, Ấn độ, Đông Nam
Á [79]
Java [80]

21 Gymnema khandalense Santapau

Maharashtra [80]

22 Gymnema
kollimalayanum X ( Chƣa xác định)
A.Ramach. & M.B.Viswan.

23 Gymnema lacei Craib

Myanmar; Bangladesh [80]

24 Gymnema lactiferum (L.) R.Br. ex
Schult.

Ấn Độ, Sri lanka [80]

25 Gymnema latifolium Wall. ex Wight
26 Gymnema littorale Blume

Trung Quốc [75]; Ấn Độ, Nepal;
Đông Nam Á [80]
Java [80]

27 Gymnema longiretinaculatum Tsiang

Trung Quốc [20]

28 Gymnema lushaiense M.A.Rahman & Thành phố Assam [80]
Wilcock
29 Gymnema macrothyrsa Warb.

Sulawesi [80]

30 Gymnema maingayi Hook.f.

Malacca [80]


31 Gymnema mariae Schltr.

Philipin [80]

32 Gymnema micradenium Benth.

Queensland [80]

33 Gymnema molle Wall. ex Wight

Myanmar [80]

34 Gymnema montanum Hook.f.

Ấn Độ [80]

35 Gymnema muelleri Benth.

Úc [80]

36 Gymnema pachyglossum Schltr.

Luzon [80]

37 Gymnema piperii Schltr.

Mindanao [80]
5



STT Tên các loài thuộc chi Gymnema R.
Br. đƣợc chấp nhận [50]

Phân bố

38 Gymnema pleiadenium F.Muell.

Queensland [80]

39 Gymnema recurvifolium Blume

New Guinea [80]

40 Gymnema rotundatum Thwaites

Sri Lanka [80]

41 Gymnema rufescens Decne.

Madagascar [80]

42 Gymnema schlechterianum Warb.

Philipin [80]

43 Gymnema spirei Costantin

Lào [80]

44 Gymnema suborbiculare K.Schum.


New Guinea [80]

45 Gymnema sylvestre (Retz.)

R.Br. ex Việt Nam [2],[7], Trung Quốc

Sm.

[20], Đài Loan [32], Ấn độ [58]

46 Gymnema syringaefolium
Costantin

(Decne.) Việt Nam [1] Timor

47 Gymnema thorelii Costantin

Lào [80]

48 Gymnema tricholepis Schltr.

New Guinea [80]

49 Gymnema trinerve R.Br.

Úc [80]

50 Gymnema uncarioides Schltr.


Luzon [80]

51 Gymnema yunnanense Tsiang

Trung Quốc [20]

1.2.

Chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài

Theo Danh lục các loài thực vật Việt Nam của Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật xuất bản năm 2005, chi Gymnema tại Việt Nam có 8 loài là: Gymnema
albiflorum Cost., Gymnema alterniflorum (Lour.) Merr., Gymnema foetidum
Tsiang, Gymnema griffithii Craib, Gymnema inodorum (Lour.) Decne,
Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema reticulatum (Moon) Alston,
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult [6].
Bảng 1.2. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam
TT

Tên khoa học

Tên thƣờng dùng

6

Phân bố


1


Gymnema albiflorum
Cost.

Loã ti hoa trắng

Hà Tây [92]

2

Gymnema alterniflorum
(Lour.) Merr.

Lõa ti

Các tỉnh duyên hải
Miền trung [92]

3

Gymnema foetidum
Tsiang

Các tỉnh phía bắc
giáp Vân Nam
Trung Quốc [92]

4

Gymnema griffithii Craib


Các tỉnh giáp
Campuchia

5

Gymnema inodorum
(Lour.) Decne.

Rau mỏ

Bắc Kạn, Thái
nguyên, Hoà Bình,
Ninh Bình, Khánh
Hoà [92]

6

Gymnema latifolium
Wall ex Wight

7

Gymnema reticulatum
(Moon) Alst.

8

Gymnema sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult


Loã ti lá rộng

Hoà Bình, Ninh
Bình, Kon Tum [92]

Lõa ti rừng, Dây thìa
canh, Dây muôi.

Các tỉnh duyên hải
Miền trung, đồng
bằng Bắc bộ [92]

2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI
GYMNEMA R. Br.
2.1.

Nhóm hợp chất saponin

Từ lá của Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult, các nhà khoa học đã
phân lập đƣợc hơn 50 saponin tritecpen, trong đó có hơn 40 hợp chất có khung
olean, số còn lại có khung dammaran [33], [34], [36], [42], [45], [57], [69],
[71]. Từ Gymnema alternifolium (Lour.) Merr có ít nhất 19 saponin khung

7


olean đã đƣợc phân lập [27], [40]. Từ Gymnema inodorum (Lour.) Decne cũng
có 4 saponin khung olean đã đƣợc phân lập [70].
2.1.1. Saponin có khung olean
 Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult

Các hợp chất saponin khung olean phân lập từ G. sylvestre gồm các acid
gymnemic, gymnemasaponin, gymnemosid, gymnemasin,… Chúng có cấu tạo
từ khung olean (hình 1.1), khác nhau ở vị trí các nhóm thế ( hình 1.2). Ngoài ra,
tại Việt Nam, năm 2011, Trần Văn Ơn và cộng sự đã phân lập đƣợc một
saponin có khung olean từ lá của G. sylvestre là glochioeriosid A [5].

Hình 1.1. Cấu trúc khung olean của các hợp chất trong Gymnema sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult

8