BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG THỊ HOÀI

KHẢO SÁT TỶ LỆ MẮC 11 TÁC NHÂN GÂY
BỆNH LÂY TRUYỀN QUA ĐƯỜNG TÌNH DỤC
THƯỜNG GẶP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI
PHÂN TỬ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG THỊ HOÀI

KHẢO SÁT TỶ LỆ MẮC 11 TÁC NHÂN GÂY
BỆNH LÂY TRUYỀN QUA ĐƯỜNG TÌNH DỤC
THƯỜNG GẶP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI
PHÂN TỬ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
Chuyên ngành : Da liễu

Mã số

: 60720152

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Phạm Thị Lan

HÀ NỘI – 2018


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BLTQĐTD

Bệnh lây truyền qua đường tình dục

CT

Chlamydia trachomatis

DNA

Deoxyribonucleic acid

HCTDÂĐ

Hội chứng tiết dịch âm đạo

HCTDNĐ


Hội chứng tiết dịch niệu đạo

HPV

Human papillomavirus

HSV

Herpes simpex virus

MG

Mycoplasma genitalium

MH

Mycoplasma hominis

NG

Neissseria gonorrhoeae

PCR

Poymerase Chain Reaction

TV

Trichomonas vaginalis


UP

Ureaplasma

UU

Ureaplasma urealyticum


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BIỂU ĐỒ


DANH MỤC HÌNH


7

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, mỗi năm trên thế giới có tới 370 triệu
trường hợp mắc mới các bệnh lây truyền qua đường tình dục (BLTQĐTD) và có
khoảng hơn 1.000.000 người mắc mỗi ngày, trong đó có tới 85% nhiều bệnh nhân
không có biểu hiện lâm sàng hoặc biểu hiện lâm sàng không điển hình, vì vậy việc
chẩn đoán sớm bị bỏ lỡ [1]. Việc điều trị không đúng bệnh, đúng phác đồ do chưa
chẩn đoán đúng làm tăng nguy cơ mắc biến chứng và đặc biệt là nguy cơ kháng

thuốc. Vì vậy việc chẩn đoán đúng là cần thiết trước khi bắt đầu điêu trị.
Hiện tại đã xác định được hơn 30 vi khuẩn, virus, parasites có thể gây ra bệnh
lây truyền qua đường tình dục, ví dụ như: Chlamydia trachomatis, Neissseria
gonorrhoeae,

Treponema

pallidum,

Mycoplasma,

Herpes

simpex

virus,

Ureaplasma, Human papillomavirus , Trichomonas vaginalis,… Trong đó, các
BLTQĐTD còn có tỷ lệ đồng nhiễm cao như có tới 30,4% bệnh nhân nhiễm
Mycoplasma genitalium đồng nhiễm với lậu và 25% đồng nhiễm với Chlamydia
trachomatis [2]; 3,4% bệnh nhân nhiễm Mycoplasma hominis đồng nhiễm với
Ureaplasma urealyticum [3]. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng có sự liên quan
giữa nhiễm Chlamydia trachomatis, Herpes simplex 2 với nhiễm Human
papillomavirus vùng sinh dục [4]. Tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh, có nhiều
phương pháp chẩn đoán khác nhau như nhuộm soi tìm vi khuẩn, nuôi cấy, phản ứng
huyết thanh học, xét nghiệm khuyếch đại nucleic acid,… Trong đó nuôi cấy được
xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán. Tuy nhiên trong một số trường hợp việc sư
dụng xét nghiệm này đòi hỏi nhiều thời gian hơn và độ nhạy cũng thấp hơn so với
xét nghiệm khuyếch đại nucleic acid [5], [6], [7]. Xét nghiệm tìm 11 tác nhân gây
bệnh BLTQĐTD bằng phương pháp lai phân tư dựa trên phản ứng khuyếch đại

nucleic acid có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian trả kết quả nhanh, và đã được
đưa vào hướng dẫn điều trị các bệnh lây truyển tình dục của Trung tâm kiểm soát và
phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention – CDC)
[8]. Ngoài ra, xét nghiệm này có thể giúp xác định đồng thời 11 tác nhân gây bệnh


8

thường gặp trong cùng một xét nghiệm. Trên thế giới đã có những nghiên cứu về kỹ
thuật này trong việc xác định tỷ lệ nhiễm bệnh, tuy nhiên ở Việt Nam còn thiếu dữ
liệu, nghiên cứu về kỹ thuật xét nghiệm này. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu
với tên đề tài "Khảo sát tỷ lệ mắc 11 tác nhân gây bệnh lây truyền qua đường
tình dục thường gặp bằng phương pháp lai phân tử và các yếu tố ảnh hưởng"
với mục tiêu:
1.

Mô tả tỷ lệ dương tính với 11 tác nhân lây truyền qua đường tình dục bằng
phương pháp lai phân tử ở các bệnh nhân đến khám và được chỉ định làm
xét nghiệm này tại bệnh viện Da liễu Trung Ương từ tháng 7/2018 đến

tháng 7/2019.
2. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm 11 tác nhân lây
truyền qua đường tình dục bằng phương pháp lai phân tử.


9

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.


Đại cương về các bệnh lây truyền qua đường tình dục

Bệnh lây truyền qua đường tình dục là các bệnh nhiễm trùng lây truyền trực
tiếp từ người sang người qua tiếp xúc tình dục (bao gồm qua âm đạo, miệng, hậu
môn). Ngoài ra, một số bệnh BLTQĐTD không lây truyền qua đường tình dục mà
qua đường máu, tiếp xúc với mô, qua đường mẹ con trong thời kỳ mang thai và thời
kỳ chu sinh.
1.1.1. Nhiễm Chlamydia trachomatis
Nhiễm Chlamydia trachomatis (CT) trong số các bệnh nhân mắc các
BLTQĐTD có xu hướng tăng lên trong thời gian gần đây. Thống kê cho thấy tỷ lệ
mắc CT ở Mỹ tăng từ 453,3/100.000 dân năm 2012 lên 497,3/100.000 dân năm
2016, đặc biệt tỷ lệ mắc bệnh ở nữ giới cao hơn ở nam giới. Năm 2016, tỷ lệ nhiễm
CT ở nữ giới tại Mỹ là 497,3/100.000 dân, trong khi đó tỷ lệ này ở nam giới là
330,5/100.000 dân [9].
Theo Diệp Xuân Thanh, tỷ lệ nhiễm CT trên bệnh nhân mắc BLTQĐTD khám
tại Viện Da liễu Quốc gia trong 2 năm 1997-1998 là 10,98%, trong đó nam giới
chiếm 64% trên tổng số bệnh nhân [12]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Huyền
(năm 2000) cho thấy tỷ lệ nhiễm CT ở phụ nữ có hội chứng tiết dịch âm đạo là
10,5% [13].
1.1.1.1.

Căn nguyên gây bệnh

Chlamydia Trachomatis là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, có chứa đồng thời
hai loại acid nucleic : DNA và RNA. CT có thành và màng tế bào tương tự như các
vi khuẩn Gram âm khác, tuy nhiên do CT ký sinh bên trong tế bào nên không phát
hiện được bằng phương pháp nhuộm Gram.
1.1.1.2.


Biểu hiện lâm sàng của nhiễm Chlamydia trachomatis

 Ở nam giới:
-

Viêm niệu đạo


10

-

Viêm mào tinh hoàn
Viêm tiền liệt tuyến
 Ở nữ:
Viêm cổ tư cung
Viêm niệu đạo
Viêm tuyến Bartholin
Bệnh viêm tiểu khung: Có 10-40% phụ nữ nhiễm CT có thể bị hậu quả là viêm
tiểu khung, tỷ lệ này ở nhóm 15-19 tuổi còn cao hơn [14]. Biểu hiện lâm sàng
của viêm tiểu khung là: đau bụng dưới, tiết dịch âm đạo hoặc có thể chảy máu,

-

đau khi di động cổ tư cung, nhưng cũng có thể không có biểu hiện gì.
Viêm nội mạc tư cungBiểu hiện lâm sàng ngoài đường sinh dục
Viêm quanh gan (hội chứng Fitz- Hugh – Curtis) [15]
Viêm trực tràng: đau, chảy máu khi đi ngoài, đi ra chất nhầy, tiêu chảy. Soi
trực tràng thấy niêm mạc bị tổn thương.
 Biến chứng

Các biến chứng của nhiễm CT thường gặp là: Viêm hố chậu, tắc vòi trứng,
chưa ngoài tư cung, vô sinh….
1.1.1.3.

Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm CT trong phòng thí nghiệm

CT là nhóm vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, chúng tồn tại cạnh nhân tế
bào chủ tạo nên những hạt vùi chứa cả hai loại DNA và RNA. CT có vách tế bào,
có chung nhóm kháng nguyên là Lypopolysaccharid (LPS).
Các phương pháp xét nghiệm CT bao gồm:
 Xét nghiệm nhuộm soi trực tiếp:
+ Phương pháp nhuộm Giemsa:
Kỹ thuật này đơn giản, rẻ tiền nhưng phải xét nghiệm đúng thời kỳ và thận
trọng khi nhận định kết quả. Kết quả bị phụ thuộc vào chất lượng Giemsa và đòi hỏi
luôn luôn kiểm tra dung dịch đệm.
+ Phương pháp nhuộm iod:
Kỹ thuật này rất đơn giản, chỉ cần 1 kính hiển vi thông thường, tuy nhiên độ
nhạy lại kém, hiện nay ít được ứng dụng.
Các phương pháp trên ít được sử dụng vì hiệu quả thấp.
 Nuôi cấy phân lập:
Do có độ đặc hiệu đạt gần tới 100% nên nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng
trong chẩn đoán CT, và được dùng trong y pháp.


11



Các xét nghiệm miễn dịch:
+ Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct Fluorescent Antibody - DFA) để

phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm
+ Miễn dịch gắn men (Enzyme Immunoassay - EIA): là phương pháp phát
hiện kháng thể lipopolysacharid (LPS) đặc hiệu loài
 Xét nghiệm lai axid nucleic (DNA Probe).
+ Phương pháp này sư dụng các mồi lai DNA gắn với chất phát quang hoặc
phóng xạ, khi kết hợp với bệnh phẩm, mồi lai này kết hợp với RNA ribosome
16S có trong bệnh phẩm. Phức hợp này được phát hiện bằng máy đo màu
hoặc máy đếm phóng xạ. Phương pháp này có độ đặc hiệu cao hơn EIA.
 Xét nghiệm khuếch đại DNA:
+ Phương pháp khuếch đại DNA là các phương pháp rât nhạy cảm trong
việc chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng. Có rất nhiều phương pháp khuếch
đại DNA nhưng hay sư dụng nhất là phương pháp Polymerase Chain
Reaction (PCR).
1.1.2. Nhiễm Neissseria gonorrhoeae
Neisseria gonorrhoeae (NG) là tác nhân gây bệnh lậu ở người.
1.1.2.1.

Lâm sàng

− Thời gian ủ bệnh: nam giới sau 2-5 ngày, nữ giới sau 5-10 ngày. Tuy nhiên,

1-5% nam và 20-40% nữ mắc bệnh nhưng không biểu hiện lâm sàng.
 Nam giới
− Tiết dịch niệu đạo với số lượng nhiều. Triệu chứng thường rõ ràng và rầm rộ

hơn viêm niệu đạo do Chlamydia.
− Khó chịu dọc niệu đạo, kèm theo đái rắt, đái buốt.
− Khám miệng sáo đỏ có dính mủ, vuốt dọc niệu đạo mủ chảy ra ở miệng sáo.
 Nữ giới
− Tiết dịch âm đạo ở các mức độ khác nhau.

− Đi tiểu khó, chảy máu sau giao hợp, đau bụng dưới.
− Khám cổ tư cung nhiều dịch nhày, hoặc mủ. Có thể gặp tiết dịch/mủ ở niệu

đạo, tuyến Skene, tuyến Bartholin.


12

 Lậu trực tràng
− Có thể không có triệu chứng.
− Đau khi đại tiện, tiết dịch mủ nhày, chảu máu trực tràng.
− Soi trực tràng có thể thấy trực tràng viêm và có mủ.
 Lậu mắt trẻ sơ sinh
− Xuất hiện 1-3 ngày sau khi sinh.
− Viêm kết mạc mắt trẻ sơ sinh: Kết mạc đỏ, có mủ vàng đặc, mi mắt sưng nề,

dính vào nhau không mở ra được. Nếu không chữa kịp thời sẽ gây mù.
 Biến chứng
Các biến chứng thường gặp như:
− Nam giới: Viêm túi tinh, ống dẫn tinh, mào tinh hoàn, vô sinh ở nam
− Nữ giới: Viêm niêm mạc tư cung, vòi trứng, viêm buồng trứng dẫn đến hẹp

ống dẫn trứng, chưa ngoài tư cung, vô sinh ở nữ, và lậu mắt trẻ sơ sinh
− Trực tràng: gây áp xe tại chỗ

1.1.2.2.

Xét nghiệm

− Nhuộm Gram phiến đồ tế bào sau đó soi trực tiếp dưới vật kính dầu thấy


song cầu hình hạt cà phê bắt màu Gram âm nằm trong và ngoài bạch cầu đa
nhân trung tính đang thoái hóa.
− Nuôi cấy thực hiện trên môi trường Thayer- Martin, Martin Lewwis
− Kỹ thuật lai phân tư: có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

1.1.3. Nhiễm Mycoplasma genitalium
Mycoplasma genitalium (MG) là vi khuẩn nội bảo nhỏ nhất, có bộ gen nhỏ
với 580 kb, có khả năng sinh sản và được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1981 gây
viêm niệu đạo ngoài lậu hay gặp ở nam giới.
1.1.3.1.

Biểu hiện lâm sàng:

 Ở nam
-

Viêm niệu đạo cấp tính ở nam:


13

Theo một nghiên cứu, ở những bệnh nhân viêm niệu đạo không do lậu thì có
đến 27% có kết quả dương tính với MG và có 9% bệnh nhân không có viêm
niệu đạo dương tính [16].
-

Viêm quy đầu, viêm dương vật.
Viêm tuyến tiền liệt mạn tính.
Viêm mào tinh hoàn cấp tính.

 Ở nữ:
Viêm niệu đạo, viêm âm đạo, viêm cổ tư cung ở nữ, có thể gây ra nhiễm trùng

đường sinh dục trên, gây hội chứng đau bung dưới, có thể để lại các biến chứng như
viêm tắc vòi trứng, vô sinh, chưa ngoài tư cung, viêm nội mạc tư cung [17], [18].
1.1.3.2.

Xét nghiệm chẩn đoán

Việc phát hiện mycoplasma gây bệnh đường sinh dục và ureaplasma thường
bằng nuôi cấy, tuy nhiên mất thời gian từ 2-5 ngày đối với Ureaplasma spp. và
M.homunis và đến 8 tuần đối với M. genitalium. Các tác nhân gây bệnh này có thể
được phát hiện trong vòng 8 giờ bằng kỹ thuật khuyếch đại acid nucleic và phương
pháp lai phân tư [19].
1.1.4. Nhiễm Mycoplasma hominis
Mycoplasma hominis (MH) có thể được phân lập với tần số đáng kể từ hệ
thống tiết niệu sinh dục của con người và được cho là gây ra các hội chứng khác
nhau như viêm niệu đạo, viêm khung chậu, viêm bể thận hoặc vô sinh. MH được
phát hiện nhiều hơn ở âm đạo nữ so với niệu đạo nam. Ở cả nam và nữ, bệnh nhiễm
Trichomonas có tỷ lệ đồng nhiễm với MH cao, MH được tìm thấy nhiều hơn ở những
phụ nữ bị viêm âm đạo do vi khuẩn hơn là những người không bị. Và nhiễm trùng cổ
tư cung với NG hoặc CT làm tăng tỷ lệ có mặt của MH trong dịch âm đạo [20].

1.1.5. Nhiễm Ureplasma parvum và Ureaplasma urealyticum
Ureplasma là vi khuẩn có thể lây truyền qua tiếp xúc tình dục mặc dù nó
không được xếp và nhóm BLTQĐTD cổ điển vì mức độ gây bệnh thấp. Trong nhóm


14


này có 2 loài là U. parvum và U. Urealyticum. Các tác giả cho rằng phần lớn người
hoạt động tình dục bị nhiễm Ureaplasma mà không gây ra bất cứ triệu chứng gì.
UU là một trong những nguyên nhân chính gây viêm niệu đạo không do lậu ở
nam giới, với tỷ lệ được phân lập là 12% trong nhóm này [20]. Ngoài ra UU còn
được báo cáo là gây ra bệnh viêm màng phổi, nhiễm trùng thận, viêm khớp phản
ứng trong hội chứng Reiter và viêm khớp ở bệnh nhân giảm gammaglobulin [21]. Ở
phụ nữ, UU còn có vai trò trong các nguyên nhân gây biến chứng cho thai nghén,
gây sẩy thai, vô sinh, viêm vùng chậu, … Việc lây nhiễm UU tới thai nhi hoặc trẻ sơ
sinh có thấy gây ra chứng loạn dưỡng cơ nghiêm trọng và thậm chí gây ra các bệnh
lý nhiễm trùng thần kinh trung ương ở trẻ [22].
Tỷ lệ nhiễm Ureaplasma sinh dục trong mẫu tinh trùng ở nam giới bị vô
sinh là 19,2%, nhiễm Mycoplasma là 15,8%. Tần suất Ureplasma urealyticum
(15%) cao hơn Mycoplasma hominis (10,8%), Ureaplasma parvum (4,2%) và
Mycoplasma genitaliaum (5%) [23] .
1.1.6. Nhiễm Trichomonas vaginalis.
Trichomonas là một BLTQĐTD gây ra bởi ký sinh trùng ký sinh vào biểu mô
niêm mạc, gây ra các vết loét rất nhỏ. Thời kỳ ủ bệnh khoảng 4-28 ngày. Hầu hết ở
nam giới không có biểu hiện lâm sàng, một số có biểu hiện tiết dịch niệu đạo, tiểu
khó hoặc tiểu dắt. Ở nữ giới, có thể không có biểu hiện hoặc có biểu hiện nhiễm
trùng thành từng đợt (thường gặp ở trong hoặc sau khi có kinh nguyệt). Phụ nữ
nhiễm bệnh có thể có tiết dịch âm đạo, màu vàng xanh, ngứa âm ỉ, sưng nề, ban đỏ,
khó chịu vùng bụng dưới, tiểu khó. Nhưng hầu hết (70-85%) không có triệu chứng
và không được điều trị.

 Các xét nghiệm dùng để chẩn đoán nhiễm T.vaginalis:
- Đo độ pH của âm đạo: pH có xu hướng trên 4,5 ở bệnh nhân nhiễm T.

Vaginalis. Phương pháp này không đặc hiệu do ở những bệnh nhân bị viêm
âm đạo do vi khuẩn cũng có hiện tượng này.



15

-

Soi tươi mẫu bệnh phẩm trong nước muối: là phương pháp phổ biến nhất để
chẩn đoán nhiễm trùng roi. Hình ảnh đặc trưng là thấy đơn bào hình trứng với

-

sự di chuyển đặc trưng. Xét nghiệm cần được thực hiện ngay sau khi lấy mẫu.
Nuôi cấy: có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kết quả thường có sau 48 giờ.
ELISA phát hiện kháng nguyên của T.vaginalis. cho kết quả nhanh.
PCR, lai phân tư.
1.1.7. Nhiễm Human papillomavirus
Human papillomavirus (HPV) là một vi rút DNA chuỗi đôi thuộc họ

Papovaviridae. Có hơn 100 loại HPV khác nhau, trong đó có khoảng hơn 30 loại vi
rút HPV gây bệnh tại bộ phận sinh dục. Phân loại HPV có thể được chia theo nguy
cơ gây ung thư:
-

Loại nguy cơ thấp chủ yếu là loại 6, 11, 42, 43 và 44. Biểu hiện lâm sàng của
loại này là sùi không tiến triển thành ung thư.

-

Loại nguy cơ cao chủ yếu là loại 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51 và 52, có thể
biểu hiện lâm sàng có nguy cơ gây ung thư cổ tư cung và ung thư sinh dục
khác. Đây là biến chứng nguy hiểm của bệnh SMG.


Có đến 90% bệnh nhân có tổn thương sùi mào gà do type 6 và 11.
1.1.7.1.

Triệu chứng lâm sàng

Sau khi tiếp xúc với người bị bệnh khoảng 2 – 3 tháng, tuỳ tình trạng miễn
dịch của người bệnh, vị trí tổn thương, loại HPV mà có biểu hiện trên lâm sàng
khác nhau:
- Biểu hiện rõ ràng:
+ Tổn thương sùi: sẩn nổi cao, trên có các nhú mềm màu hồng tươi giống

như các tinh thể nhô lên, xoè rộng ra giống mào gà, hay giống súp lơ,
thương tổn có khi có cuống. Không có hiện tượng thâm nhiễm.
+ Tổn thương sẩn dạng mụn cơm: là các sẩn nổi cao màu hồng hoặc màu
xám, bề mặt thô có các nhú rất nhỏ.
- Tổn thương dưới lâm sàng: Tổn thương không nhìn thấy hoặc chỉ là một vùng
thô mất bóng, nếu như bôi axít axetic 3-5% sau 5 phút thấy màu trắng.
- Không tổn thương lâm sàng
- Triệu chứng cơ năng: Không đau, không ngứa.


16

1.1.7.2.
-

Cận lâm sàng:

Sinh thiết, nhuộm HE: nhân tế bào lớn, tăng thoái hoá sắc tố và koilocytosis (Tế

bào sừng nhân đặc hoặc nhiều nhân liên kết lại, bắt màu kiềm, xung quang là

-

vùng sáng (halo) và nguyên sinh chất ít).
Axít axetic 3-5%: Sau khi bôi axít axetic 5 phút nếu xuất hiện mảng giới hạn rõ
màu trắng, hơi nổi cao, bề mặt thô, nếu dùng kích lúp có thể thấy rõ bề mặt thô

-

rõ hơn, trên có các nhú thì thư nghiệm dương tính.
PCR
Kỹ thuật lai phân tư, định type HPV.
1.1.8. Nhiễm Herpes simplex
Bệnh herpes là do Virút có tên là Herpes simplex virus (HSV), gồm có typ 1

và typ 2 gây ra. Theo ước tính của WHO trên thế giới hàng năm có hàng triệu
người bị bệnh herpes. Việt Nam chưa có số liệu thống kê đầy đủ, nhưng hàng năm
có hàng trăm người bị bệnh herpes đến khám và điều trị tại phòng khám Bệnh Viện
Da Liễu Trung Ương .
1.1.8.1.

Căn nguyên và cách lây truyền của Virút

- Virút HSV có đường kính là từ 100 – 110nm, bên trong có chứa vật liệu di
truyền là một chuỗi xoắn kép DNA. HSV có 2 type gây bệnh: Virút Type 1 gây
bệnh chủ yếu ở nưa người trên và hay gặp nhất ở vùng bán niêm mạc quanh miệng,
môi. Virút Type 2 gây bệnh ở cơ quan sinh dục là chủ yếu.
1.1.8.2.


Triệu chứng lâm sàng

Trước khi có biểu hiện tổn thương da và niêm mạc, bệnh nhân có cảm giác
ngứa, nóng râm ran ở vùng da và niêm mạc.
Sau đó xuất hiện một dát đỏ phù nề, trên có nhiều mụn nước. Các mụn nước
thường đứng thành từng cụm từ 2-10 mụn nước. Mụn nước thường căng tròn kích
thước bằng đầu đinh ghim, bên trong chứa dịch vàng trong hoặc trong suốt có thể
xuất huyết (dịch đỏ có xuất huyết do sang chấn).
Triệu chứng toàn thân: có thể sốt, hạch lân cận sưng to, đau, mệt mỏi, chán ăn.
1.1.8.3.

Các xét nghiệm cận lâm sàng


17

+ Xét nghiệm tế bào học(dịch trong bọng nước): Có tế bào gai lệch hình hoặc tế
bào gai nhân khổng lồ.
+ Các xét nghiệm khác
-

Phản ứng ELISA, PCR (Polymerase Chain Reaction) để chẩn đoán xác định.

-

Nuôi cấy Virút để phân lập.

1.2.

Kỹ thuật lai phân tử


1.2.1. Định nghĩa:
Hiện tượng lai phân tư là hiện tượng khi một phân tư DNA mạch đôi ở một
nhiệt độ vượt quá “ nhiệt độ nóng chảy Tm” thì 2 mạch đơn sẽ tách rời hau do sự
phá vỡ của liên kết Hydro nối liền mạch. Khi 2 mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản
ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiên thí nghiệm thích hợp chúng sẽ bắt cặp
trở lại.
1.2.2. Nguyên tắc
Phương pháp lai phân tư bao gồm các giai đoạn: tổng hợp mẫu dò, đánh dấu
mẫu dò, biến tính DNA mục tiêu, chuyển DNA lên màng lai, tiến hành lai, đọc kết quả.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sư dụng Kit phát hiện đồng thời 11 tác nhân
STI dựa vào phản ứng PCR và công nghệ lai phân tư “Flow through”. ADN của các
tác nhân gây bệnh nếu có sẽ được khuyếch đại bằng phản ứng PCR sư dụng bộ mồi
được gắn biotin. Các sản phẩm PCR sẽ được lai với các đầu dò đặc hiệu thông qua
quá trình lai “Flow through”. Các sản phẩm lai nếu có sẽ được phát hiện nhờ hệ
thống streptavidin-Alkaline phosphatase conjugate và NBT/BCIP.

1.2.3. Xét nghiệm tìm 11 tác nhân gây BLTQĐTD bằng phương pháp lai
phân tử
Xét nghiệm tìm 11 tác nhân gây BLTQĐTD thường gặp bằng phương pháp lai
phân tư sư dụng phương pháp Poymerase Chain Reaction (PCR) và phương pháp
lai phân tư xuôi dòng (“Flow-through” hybridization). Máy lai là thiết bị lai dòng
chảy tự động giúp phát hiện và xác định đoạn DNA đích trong mẫu thư bằng cách


18

so sánh với đoạn DNA trong Kit được cung cấp đi kèm với máy sư dụng hệ thống
FT-PRO, với hiệu quả cao, độ chính xác cao và chi phí thấp. Hệ thống FT-PRO là
có ưu điểm:

- Hệ thống có dòng chảy tự động, có cùng hệ thống tách chiết được sư dụng
trong phương pháp PCR.
- Chạy được 48 mẫu và xác định được 11 tác nhân gây BLTQĐTD thường gặp
trong cùng một lần chạy.
- Có độ nhạy và độ đặc hiệu cao vì sư dụng 2 đoạn mồi.
- Kết quả có thể trả trong vòng 3,5 giờ.
- Dễ sư dụng
11 tác nhân gây bệnh STD thường gặp
1. Chlamydia trachomatis (CT)
2. Neisseria gonorrheae (NG)
3. Mycoplasma genitalium (MG)
4. Ureaplasma urealyticum (UU)
5. Ureaplasma parvum (UP)
6. Trichomonas vaginalis (TV)
7. Mycoplasma hominis (MH)
8. Human papillomavirus typ 6
9. Human papillomavirus typ 11
10. Herpes simplex virus typ 1
11. Herpes simplex virus typ 2
12. Kiểm soát yếu tố khuyếch đại DNA (AC)
13. Chứng dương (PC)

Hình 1.1. Sơ đồ vị trí đoạn mồi của các tác nhân STD trong xét nghiệm
 Quy trình xét nghiệm gồm 5 bước cơ bản:

- Lấy mẫu: Mẫu bệnh phẩn được sư dụng là mẫu tăm bông từ âm đạo, cổ tư cung
và niệu đạo, nước tiểu và dịch chứa tế bào.
- Tách chiết DNA
- Khuyếch đại DNA



19

- Lai dòng chảy
- Đọc kết quả

Mẫu bệnh

Tách chiết

Khuếch đại

Lai dòng

phẩm

DNA

DNA

chảy

30-40 phút

120 phút

Đọc kết quả

35 phút


Hình 1.2. Sơ đồ các bước tiến hành xét nghiệm


20

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Tất cả các bệnh nhân đến khám và có chỉ định làm xét nghiệm tìm 11 tác nhân
gây bệnh lây truyền qua đường tình dục bằng phương pháp lai phân tư tại
BVDLTW từ tháng 7/2018 – 7/2019
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
− Bệnh nhân ≥ 18 tuổi
− Bệnh nhân không có vấn đề về sức khỏe tâm thần
− Bệnh nhân đến khám và được chỉ định xét nghiệm tìm 11 tác nhân gây bệnh

lây truyền qua đường tình dục bằng phương pháp lai phân tư
− Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
− Bệnh nhân dưới 18 tuổi
− Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
− Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2. Vật liệu nghiên cứu
− Bệnh án nghiên cứu.
− Bàn khám phụ khoa, mỏ vịt, bông lấy bệnh phẩm.

− Bộ kit thực hiện xét nghiệm xác định 11 tác nhân STD bằng phương pháp lai

phân tư của GenoFlow STD Array Test Kit.
− Hệ thống lai Flow through và hệ thống chụp ảnh đọc kết quả của hãng

DiagCor.
− Máy PCR, máy li tâm spin down
− Micropipette 200 μl, micropipette đa kênh.


21

Hình 2.1: Máy lai phân tử

Hình 2.2: Hệ thống chụp ảnh đọc kết quả lai phân tử

Hình 2.3: Bộ GenoFlow STD Array Test Kit


22

2.2.3. Cỡ mẫu
Nghiên cứu của chúng tôi sư dụng công thức tính cỡ mẫu ước tính 1 tỷ lệ:
n= Z21-α/2
Trong đó:
p: Tỉ lệ xét nghiệm dương tính ước tính.
: Khoảng sai lệch mong muốn.
α: Mức ý nghĩa thống kê.
Z1-α/2: Giá trị Z thu được từ bảng Z ứng với giá trị α được chọn .
Chọn α=0,05, giá trị Z tương ứng là 1,96.

Chọn =0,1. Chọn p=0,7.
Thay vào công thức trên tính được cỡ mẫu n=80, cộng với 10% số bệnh nhân
có thể bỏ điều trị được cỡ mẫu n=88.
2.2.4. Các bước tiến hành
2.2.4.1. Phỏng vấn trực tiếp
− Khai thác tiền sư, bệnh sư và các yếu tố liên quan đến tình trạng bệnh theo

mẫu bệnh án nghiên cứu
− Giải thích cho bệnh nhân về nghiên cứu và chỉ định làm xét nghiệm
2.2.4.2. Khám lâm sàng
Bệnh nhân được khám, đánh giá các triệu chứng cơ năng và thực thể của các
bệnh lây truyền qua đường tình dục, ghi lại các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân
vào bệnh án nghiên cứu
2.2.4.3. Tiến hành làm xét nghiệm
- Lấy mẫu bệnh phẩm, trong nghiên cứu của chúng tôi sư dụng bệnh phẩm là
mẫu quét tăm bông niệu đạo hoặc cổ tư cung, âm đạo.
- Tiến hành kỹ thuật xét nghiệm.
2.2.5. Quy trình kỹ thuật xét nghiệm phát hiện đồng thời 11 tác nhân STI bằng
phương pháp lai phân tử:
-

Kiểm tra cẩn thận thông tin trên ống mẫu và phiếu chỉ định xét nghiệm. Gán mã
cho mỗi mẫu.

-

Tiến hành tách chiết DNA.

-


Tiến hành chạy PCR:


23

•

Lấy ống PCR Master Mix, STD Primer Mix, DNase Free Water và STD
DNA control ra khỏi ngăn lạnh bảo quản, để rã đông. Trước khi sư dụng, trộn
và ly tâm cho tất cả các hóa chất này.

•

Chuẩn bị phản ứng PCR (thể tích cuối cùng 25 μl) theo bảng dưới đây:

Thành phần
Thể tích (μl)
PCR Master Mix
18,6
STD Primer Mix
1,0
DNA Taq Polymerase
0,4
DNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm
tới 5,0 *
DNase Free Water
thay đổi theo lượng ADN
Tổng thể tích
25
*lượng ADN cho mỗi phản ứng nên nằm trong khoảng từ 5 ng – 100 ng

•

Cho vào mỗi ống PCR 20 μl mix PCR (có chứa PCR Master Mix, STD
Primer Mix và DNA Tag polymerase) vào mỗi ống PCR và thêm lượng ADN
phù hợp (theo gợi ý trên) vào ống. Nếu cần thiết, cho thêm DNase Free
Water vào ống để tổng thể tích phản ứng của mỗi ống là 25 μl.

•

Trộn và ly tâm dồn hỗn hợp phản ứng xuống đáy ống. Đặt các ống vào máy
PCR và chạy chương trình nhiệt như sau:
Giai đoạn
43 chu kỳ

•
-

Bước
Biến tính ban đầu
Biến tính
Gắn mồi
Kéo dài
Kéo dài cuối cùng
Giữ sản phẩm

Nhiệt độ (oC)
95
95
60
72

72
4

Thời gian
10 phút
30 giây
30 giây
60 giây
7 phút
∞

Sản phẩm PCR sẽ được đưa vào quá trình lai “Flow through”

Quá trình lai “Flow through”
•

Làm ấm dung dịch Hybridization trong bể ổn nhiệt đặt ở 43 oC. Các dung
dịch khác để cân bằng với nhiệt độ phòng. Nếu quan sát thấy có kết tủa, làm
ấm dung dịch ở 50oC đến khi kết tủa tan hoàn toàn.


24

•

Làm biến tính sản phẩm PCR ở 95 oC trong vòng 5 phút. Làm lạnh nhanh
mẫu bằng cách đặt trong giá giữ lạnh hoặc đá bào trong ít nhất 2 phút.

•


Rưa buồng lai bằng nước cất trước khi sư dụng

•

Đặt nhiệt độ hệ thống lai ở 43 oC và làm ấm ít nhất 15 phút trước khi bắt đầu
quá trình lai

•

Mỗi một giếng trong cassette cần được đánh dấu theo đúng tên mẫu. Đặt các
cassette vào buồng lai theo đúng chiều. Hạ đóng khung giữ bên trên, ấn dứt
khoát cho đến khi khung vào đúng vị trí.

•

Khi nhiệt độ buồng lai đạt tới 43 oC, cho vào mỗi giếng 150 μl dung dịch
Hybridization đã được làm ấm trước, đóng nắp để hạn chế quá trình mất
nhiệt và ủ trong ít nhất 2 phút.

•

Chuẩn bị mẫu ADN bằng cách thêm vào mỗi ống sản phẩm PCR 150 μl dung
dịch Hybridization rồi trộn đều.

•

Nhấn phím Drain trên màn hình cảm ứng của hệ thống để loại bỏ dung dịch
Hybridization trong các giếng.

•


Hút toàn bộ hỗn hợp trong ống sản phẩm PCR cho vào các giếng tương ứng,
đóng nắp và ủ ở 43oC trong vòng 5 phút.

•

Nhấn phím Drain để hút bỏ dung dịch

•

Rưa màng lai bằng 200 μl dung dịch Hybridization

•

Nhấn phím Drain để hút bỏ dung dịch

•

Lặp lại bước này 2 lần nữa (tổng số rưa 3 lần)

•

Đặt nhiệt độ về 25oC

•

Sau khi đạt 25oC, cho vào mỗi giếng 150 μl dung dịch Blocking Solution,
đóng nắp rồi ủ trong 5 phút

•


Nhấn phím Drain để hút bỏ dung dịch

•

Thêm 150 μl dung dịch Enzyme Conjugate vào mỗi giếng (đảm bảo nhiệt độ
là 25+/-1oC), đóng nắp rồi ủ 5 phút

•

Nhấn phím Drain để hút bỏ dung dịch


25

•

Điều chỉnh nhiệt độ lên 36oC

•

Trong khi đợt nhiệt độ đạt 36oC, rưa màng lai bằng 200 μl dung dịch A

•

Nhấn phím Drain để hút bỏ dung dịch. Lặp lại bước này 3 lần (tổng số rưa 4 lần)

•

Thêm 150 μl dung dịch Detection vào mỗi giếng khi nhiệt độ đạt 36+/-1 oC.

Đóng nắp và ủ trong 3 phút cho đến khi lên màu. Quá trình này có thể kéo
dài đến 10 phút để màu lên rõ. Không nên kéo dài quá 10 phút vì điều đó có
thể gây tăng màu nền.

•

Nhấn phím Drain để hút bỏ dung dịch

•

Rưa màng lai kỹ bằng 200 μl dung dịch A

•

Nhấn phím Drain để hút bỏ dung dịch, lặp lại bước này 2 lần (tổng số 3 lần).

•

Dừng phản ứng bằng cách them 150 μl dung dịch Stop Solution, đóng nắp và
ủ trong 1 phút.

•

Nhấn phím Drain để hút bỏ dung dịch

•

Bỏ cassette ra khỏi buồng lai. Để cassette khô trong không khí trên một
miếng giấy thấm.


•

Rưa buồng lai bằng nước cất sau khi sư dụng. Đổ bỏ dung dịch ra khỏi bình
dung dịch thải (Wash Bottle).

•

Đọc kết quả bằng phần mềm Capture đi kèm với buồng Camera chụp ảnh.

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
− Địa điểm: bệnh viện Da liễu Trung ương
− Thời gian: từ tháng 7/2018 – 7/2019

2.4. Xử lý số liệu
− Số liệu được nhập và xư lý bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0. Các biến

định lượng được thể hiện dưới dạng trung bình và độ lệch chuẩn, các biến
định tính thể hiện dưới dạng tỷ lệ phần trăm %. Sư dụng T-Test để so sánh
các giá trị trung bình. Sư dụng test Khi bình phương để so sánh các tỷ lệ.
2.5. Khống chế sai số
−

Các xét nghiệm được thực hiện tại labo đạt chuẩn của khoa xét nghiệm hoá