VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ XUÂN CÔNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP
LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. KHUẤT HỮU TRUNG

HÀ NỘI – NĂM 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----------------------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP
LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA

Người hướng dẫn

: PGS.TS. KHUẤT HỮU TRUNG

Học viên thực hiện

: LÊ XUÂN CÔNG

Lớp

: K20

Hà Nội - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi
dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Khuất Hữu Trung. Các số liệu và tài liệu
được trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không
trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó.
Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.
Hà Nội, 06 tháng 8 năm 2018
Học viên

Lê Xuân Công


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS
Khuất Hữu Trung, ThS. Nguyễn Thị Hồng Hải cùng toàn thể các cán bộ Bộ
môn Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi

hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công Nghệ
sinh học, Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật đã tận tình truyền đạt kiến
thức trong hai năm tôi học tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình
học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu luận văn mà còn là hành
trang quí báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã
luôn ở cạnh tôi, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công
trong sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Bộ môn
Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều
thành công tốt đẹp trong công việc.
Hà Nội, ngày 6 tháng 8 năm 2018
Học viên

Lê Xuân Công


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN


MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
Chương 13: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 3
1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus .......................................3
1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus trên thế giới...............3
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus ở Việt Nam ................5
1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus...........................................................................6
1.2.1. Giới thiệu vê Staphylococcus...............................................................................6

1.2.2. Hình thái và đặc điểm sinh hóa .........................................................................10
1.2.3. Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố ................................................................14
1.2.4. Tính kháng thuốc kháng sinh .............................................................................15
1.3. Enzym tái tổ hợp .................................................................................................. 15
1.3.1. Hệ thống biểu hiện:...........................................................................................15
1.3.2.18Các vector biểu hiện .......................................................................................18
1.4. Tổng quan về enzym endolysin ........................................................................... 21
1.4.1. Giới thiệu về enzym endolysin ...........................................................................21
1.4.2. Vai trò và ứng dụng ...........................................................................................23
1.4.3. Tổng hợp nhân tạo endolysin kháng khuẩn .......................................................24
1.4.4. Ứng dụng của endolysin trong công nghệ sinh học thực phẩm ........................26
1.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzym endolysin ......27
1.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy .................................................................27
1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ......................................................................27
1.5.3. Ảnh hưởng của pH .............................................................................................28
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP28 NGHIÊN CỨU .............................. 28
2.1. Vật liệu..................................................................................................................29
2.2. Hóa chất và thiết bị ...............................................................................................29
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................30
2.3.1. Phương pháp biểu hiện gen LysSA trong vi khuẩn E.coli .................................30
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.coli
BL21 tái tổ hợp đến sinh trưởng và biểu hiện endolysin.............................................31
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của enzyme
endolysin LysSa tái tổ hợp ...........................................................................................31
2.3.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE .....................................................................32
2.3.5. Phương pháp tinh sạch enzyme endolysin bằng cột sắc ký ái lực....................34
2.3.6. Xác định hoạt độ của enzym endolysin tái tổ hợp ............................................34


2.3.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng của endolysin LysSa với vi khuẩn gây

bệnh có trong sữa với các nồng độ endolysin và các thời gian bổ sung endolysin
LysSa
khác
nhau
.....................................................................................................................35
2.3.8. Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau khi bổ sung enzyme
endolysin LysSa............................................................................................................35
2.3.9. Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi thanh trùng sau khi bổ sung
enzyme endolysin LysSa...............................................................................................35
Chương 3: KẾT QUẢ ................................................................................................. 36
3.1. Nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.Coli BL21 tái tổ hợp
và biểu hiện ................................................................................................................. 36
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ..................................................................36
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
...........................37
3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng ...........................................39
3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và thu hồi sinh khối.................40
3.2. Nghiên cứu thu hồi enzym endolysin tái tổ hợp bằng phương pháp phá tế bào...41
3.3. Kết quả nghiên cứu tinh sạch enzyme endolysin tái tổ hợp. ................................42
3.4. Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus của enzym
endolysin LysSa tái tổ hợp...........................................................................................44
3.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ..........................46
3.4.2. Phổ kháng khuẩn của enzym endolysin .............................................................47
3.5. HoNK \l "_Toc3793088"vi khuẩn gây bệnh của endolysin LysSapháp phá tế
bàodolysin LysSan LysSa với..................................................................................... 49
3.6. Chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa .......51
3.7. Hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh có trong sữa tươi thanh trùng của
endolysin
LysSa ...........................................................................................................................52
3.8. Chất lượng sữa tươi thanh trùng sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa

........53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 55
1. KẾT LUẬN..............................................................................................................55
2.
KIẾN
NGHỊ
.............................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 56


M5AGER
Hiện nay ngộ độc thực phẩm đã và đang là mối lo ngại nghiêm trọng cho
sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Nguyên nhân là do con người sử dụng
các loại thực phẩm đã bị nhiễm các loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố của
chúng. Mặc dù đã có công nghệ hiện đại, các phương pháp thực hành sản xuất
tốt (GMP), kiểm soát chất lượng và vệ sinh cũng như an toàn sản xuất và đánh
giá rủi ro (HACCP), nhưng số lượng các trường hợp bị ngộ độc và bị bệnh do
thực phẩm vẫn tăng lên trong suốt thập kỷ qua. Ở châu Âu, mỗi năm ước tính
có hơn 380.000 người dân bị bệnh do sử dụng các sản phẩm thực phẩm nhiễm
vi khuẩn, các loại vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella,
Listeria.
Staphylococcus aureus là tác nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện
cũng như trong cộng đồng dân cư với tỷ lệ mắc và tử vong cao trên toàn thế
giới. S. aureus khi nhiễm độc thức ăn, đồ uống do tiếp xúc giữa người mang
mầm bệnh sẽ có thể dẫn đến và viêm ruột cấp do các thức ăn có chứa độc tố
ruột của S. aureus, gây mất nước và điện giải có thể dẫn tới sốc. S. aureus là
một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Những
chủng S. aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả năng kháng lại
nhiều kháng sinh. S.aureus còn gây hội chứng sốc nhiễm độc do tiết ra độc tố
gây sốc. Theo một số cơ quan quản lý thực phẩm châu Âu, các vi sinh vật gây

bệnh phổ biến có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia
coli O157:H7, S. aureus và Listeria cùng với một số loài khác. Sử dụng các
chất hóa học để bảo quản thực phẩm ít được chấp nhận vì nhiều chất bảo quản
hóa học đã làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng. Trong số các chất
bảo quản sinh học được biết hiện nay, endolysin hiện đang thu hút sự quan tâm
của các nhà khoa học do nó có khả năng diệt và ức chế các vi sinh vật gây bệnh.
Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồn
gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của
1


thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩn
thể. Các enzyme này làm giảm độ mạnh cơ học của thành tế bào dẫn đến dung
giải tế bào và giải phóng ra các thực khuẩn thể thế hệ tiếp theo. Do đó khi có
mặt endolysins chúng có thể phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào của
mọi vi sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết. Do vậy chúng
được coi như là một chất thay thế kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn
lọc, không thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàn
cho con người.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu thu nhận enzym Endolysin tái tổ hợp LysSa và đánh giá hoạt
tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong bảo quản sữa.”
1. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu tối ưu các điều kiện nhân nuôi chủng tái tổ hợp E.coli BL21,
thu nhận enzyme endolysin LysSa và đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây
bệnh Staphylococcus aureus của endolysin LysSa tái tổ hợp trong bảo quản
sữa.
2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng, xác định các điều kiện tối ưu cho chủng E.coli
BL21 sinh trưởng và biểu hiện enzym endolysin LysSa:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
- Ảnh hưởng của pH
- Ảnh hưởng của chất cảm ứng IPTG
2.2. Nghiên cứu thu hồi và enzyme endolysin LysSa
- Nghiên cứu phương pháp thu hồi enzyme endolysin LysSa
- Nghiên cứu tinh sạch enzyme endolsin LysSa.
2.3. Đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong
bảo quản sữa

2


Chương 1
Thương 1N TÀI LIsữ
1.1.Tình hình ngu LIsữaus tính khánStaphylococcus aureus
1.1.1. Tình hình ngus aureusc ph hình ngus aureuscus aureus trên theusius
Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng rất lớn
đến sức khỏe con người và kinh tế, làm 1,5 tỉ lượt người bệnh, ở các nước công
nghiệp 30% dân số bị ngộ độc thực phẩm hàng năm. Trên thế giới, vụ ngộ độc
lớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan (Mỹ) do
phomai. Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt từ bò bị bệnh. Khô bò bị
nhiễm tụ cầu cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo, Michigan vào năm 1907.
Năm 1914, ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa lấy từ bò bị viêm vú đã gây
ra ngộ độc ở người. Năm 1930, Dark lại xác định được vụ ngộ độc do S.
aureus từ bánh giáng sinh (Reginald Bennett, 2001). Ở Pháp, số vụ ngộ độc
báo cáo từ năm
1999-2000 cho thấy: 32% số vụ là do sản phẩm sữa và đặc biệt là phô mai, 22%
do thịt, 15% do xúc xích, bánh pate; 11% do các và hải sản; 11% do trứng và
sản phẩm trứng; 9,5% do gia cầm (Haeghebaert và cs., 2002). Ngộ độc do S.

aureus đứng hàng thứ hai sau Salmonella (bảng 1.1). Những thực phẩm bị
nhiễm tụ cầu và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá, gà và sản phẩm của chúng,
rau cải, trứng, nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kem, phomai, thực phẩm lên
men…(Normanno G. và cs, 2004). Ở Đài Loan, S. aureus chiếm 30% trong số
các vụ dịch từ năm 1986 đến năm 1995. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc
thực phẩm do tụ cầu tại một trường trung học ở Taichung County làm 10 trong
số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng (Wei H.L. và
Chiou C.S., 2001). Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai
vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu
(Simeão L.C và cs, 2001). Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S. aureus là
tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm ( Rosec J.P. và

3


Gigaud O., 2002). Ở Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998, số trường hợp ngộ độc
do tụ cầu chiếm 3,1-11,9% tổng số các vụ

4


ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn. Ngày 17/6/1999, 21 trong số 53 công nhân sau
khi ăn trưa tại căn tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh, trong
đó có 8 trường hợp phải nhập viện (Norinaga M. và cs, 2000).
Bảng 1.1. Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ở Pháp
năm

S
al
m

o
n
el
la
S
ta
C
lo
B
a
H
is

1999-2000 (%)

s s SS
ố ố ốố
c
v t nh
6
3 7
,
8
1
6 5
5
2
2

1

0
0

3

0

0
0
0

Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc thực phẩm do S.aureus cũng
rất khác nhau ở mỗi quốc gia. Chẳng hạn ở Mỹ, 50% số vụ ngộ độc được báo
cáo từ năm 1969-1990 là từ các sản phẩm thịt, các món ăn từ thịt và đặc biệt là
thịt muối;
22% trường hợp là do gia cầm, các món ăn từ gia cầm, 8% từ sữa và sản phẩm
sữa; 7% do cá và tôm cua, ghẹ; 3,5% do trứng. Số vụ ngộ độc báo cáo từ năm
1975-1982 cho thấy: 36% do thịt; 12,3% do salad; 11,3% do gia cầm; 5,1% do
bánh nướng, bánh bao và chỉ có 1,4% do sữa và sản phẩm hải sản. 17,1% thực
phẩm liên quan vụ ngộ độc không được biết (Genigeorgis, 1989). Sự khác biệt
này là do thói quen ăn uống cũng rất khác nhau theo từng nước. Tụ cầu gây ra
khoảng
14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm; và hàng năm, Mỹ mất khoảng 1,5 tỉ đô la
cho những vụ ngộ độc do tụ cầu. Trong các loại độc tố gây ra các vụ ngộ độc thì
5


SEA là loại độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất (77,8%), SED (37,5%) và SEB (10%)
(Normanno G.và ctv, 2004).


6


Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản
thực phẩm không tốt. Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay
người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản thực phẩm ở
nhiệt độ không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ
cầu, chúng sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt
độ rất lớn, từ 7-48oC. Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trình
phát triển của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực
phẩm, do đó ít được chú ý (Mary K. S. và cs, 2002).
1.1.2. Tình hình ng vn bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản
Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm Việt nam có khoảng
trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD. Trong những
năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng. Năm 2000
có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc 59 người tử vong (Bùi Thế
Hiền, Tô Thị Thu và cs,
2003). Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong
những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do
tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong
số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là Staphylococcus aureus (Nguyễn Đỗ
Phúc và cs, 2003). Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dự
phòng đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn
bị nhiễm khuẩn, chiếm
66% (Nguyễn Lý Hương và cs, 2005). Từ dữ liệu của Hội nghị tổng kết dự án
bảo đảm chất lượng vệ sinh an tòan thực phẩm của Cục vệ sinh an toàn thực
phẩm năm 2006, số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là 164 vụ (tăng 14,6% so
với năm
2005), làm 7.135 người bị ngộ độc (tăng 65,8% so với năm 2005), trong đó có
64 vụ (38,8%) là do vi sinh vật gây ra (Hội nghị tổng kết dự án đảm bảo an tòan

vệ sinh thực phẩm, tháng 3/2007, Cục vệ sinh an tòan thực phẩm, Bộ Y tế) Qua
các cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế
7


biến sẵn tại các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao,
phù hợp với các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố Hồ
Chí Minh trong

8


những năm qua. Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30
mẫu (53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) (Nguyễn Đỗ Phúc và cs,
2003; Nguyễn Lý Hương và cs, 2005.
Một số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta liên quan đến S.aureus và độc tố
ruột của chúng đó là vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất
và Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM vào ngày 27/7/2006
trong chuyến đi thực tế và đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa). Chiều cùng
ngày, nhiều cán bộ sinh viên đau đầu, tiêu chảy, ói mửa, tất cả 105 người phải
vào bệnh viện để cấp cứu. Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế biến
không hợp vệ sinh, để lâu nên đã nhiễm tụ cầu vàng và đã sinh độc tố
enterotoxin.
Sau đó những vụ ngộ độ thức ăn do tụ cầu được phát hiện và nói đến
nhiều hơn (Đỗ Thị Hòa, 2006). Ở Thành phố Hồ Chí Minh vụ ngộ độc xảy ra
tại Trường Tiểu học Thanh Đa - Khu phố II Cư xá Thanh Đa, P.27, Q. Bình
Thạnh ngày
03/5/2006, có khoảng 20 cháu bị ngộ độc. Sau khi ăn khoảng 30 phút các cháu
có triệu chứng đau bụng, nôn ói, nhức đầu. Qua xét nghiệm cho thấy trong mẫu
chất nôn đã có độc tố tụ cầu khuẩn nhóm A.

Vụ ngộ độc ở nhà trẻ Hồng Nhung, thị trấn Đông Dương - H. Phú Quốc,
Kiên Giang ngày 2/9/2006. Thức ăn gồm có yaourt, cơm, thịt xào. Các triệu
chứng cũng tương tự như nôn ói, đau bụng. Kết quả kiểm tra cho thấy phần lớn
các mẫu thực phẩm đầu nhiễm S.aureus từ 101 vi khuẩn/gam đến 107 vi khuẩn
/gam. Trong đó độc tố được phát hiện có trong mẫu yaourt, độc tố nhóm C
(Nguyễn Thị Kê, 2006).
1.2. Vi khuhu1Staphylococcus aureus
1.2.1. Gi. hylococcê Staphylococcus
Staphylococcus là lọai cầu khuẩn, bao gồm cả loài hiếu khí
(Micrococcus, Planococcus

và

Deinococcus),

loài

kị

khí

tuỳ

nghi

(Staphylococcus, Stomacoccus, Streptococcus, Leuconostos, Pedio coccus,
9


Aerococcus và Gemella) và giống kị khí (Peptococcus, Peptostreptococcus,

Ruminococcus,

10


Coprococcus và Sarcina). Họ Micrococcaceae gồm bốn giống: Micrococcus,
Stomacoccus, Planococcus và Staphylococcus. Những đặc tính khác nhau của
cầu khuẩn Gram (+) gồm: sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt buộc, kị khí tuỳ
nghi hay vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện
cytochromes, sản phẩm lên men từ quá trình kị khí, peptidoglycan, axít teichoic
trong thành tế bào vi khuẩn (Scott E.M và cs, 2000).
Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus như sau:
 Giới: Prokaryote
 Phân loại: Firmicute
 Lớp: Firmibacteria
 Họ: Micrococceae
 Giống: Staphylococcus
Hiện nay có 32 loài Staphylococcus (bảng 1.2). Hàm lượng G+C trong
giống từ 30-39 mol%. Một vài loài khác hiện nay đang được nghiên cứu.
Có thể chia Staphylococcus thành 3 nhóm:
- Nhóm cho phản ứng coagulase dương tính.
- Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính và nhạy với Nobovicine.
- Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính và kháng với Nobovicine.

11


Bảng 1.2. Các loài Staphylococcus
T
LT

T
T
1 S. 1
a 2
2 S. 1
c 3
3 S. 1
h 4
4 S. 1
s 5
5 S. 1
s 6
6 S. 1
c 7
7 S. 1
x 8
8 S. 1
c 9
9 S. 2
h 0
1 S. 2
0 sc 1
1 S. 2
1 g 2

LT
T
S. 2
p 3
S. 2

e 4
S. 2
fe 5
S. 2
sc 6
S. 2
m 7
S. 2
e 8
S. 2
w 9
S. 3
h 0
S. 3
a 1
S. 3
c 2
S.
kl

S.
si
S.
in
S.
c
S.
le
S.
lu

S.
c
S.
a
S.
pi
S.
d
S.
vi

Trong số các loài Staphylococcus thì Staphylococcus aureus là loài
thường gặp nhất, chúng thuộc nhóm cho phản ứng coagulase dương tính. Tên
Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus
(hạt).
Staphylococci là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5-1,5µm,
có thể đứng riêng rẽ, từng đôi, bốn con, chuỗi ngắn (3-4 tế bào) hoặc chùm
không theo một trật tự nào cả. Sự hình thành chùm thường xảy ra trong quá
trình vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế
bào quá nhiều. Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có
mặt trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổn
định. Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như tryptic soy agar
(TSA) có thể màu kem đến màu hồng sáng. Các loài Staphylococcal là hiếu khí
hoặc kị khí tuỳ nghi và có cả quá trình hô hấp và lên men. Staphylococci thu
nhận năng lượng thông qua sự chuyển hoá glycosis, hexose monophosphate
và chu trình
12


axít tricarboxylic. Staphylococci có catalase dương và sử dụng nhiều loại

carbonhydrat khác nhau.
Năm 1871, Von Recklinghausen, nhà khoa học người Đức lần đầu tiên
theo dõi cầu khuẩn trong thận từ một bệnh nhân chết do nhiễm trùng máu. Năm
1880, Alexxander Ogston (bác sĩ phẫu thuật người Scốt-len) và Louis Pasteur
đã chứng minh áp xe viêm mủ là do cầu khuẩn gây ra. Ogston đã theo dõi hai
loại cầu khuẩn: một loại tạo thành chuỗi gọi là Streptococcus và một loại đứng
thành chùm gọi là Staphylococcus. Ogston tin tưởng vào sự khám phá của mình
và đặt tên cho cầu khuẩn đứng chùm là Staphylococcus. Ogston được công
nhận là người khám phá và đặt tên cho tụ cầu – Staphylococcus vào năm
1882. Năm
1884, Rosenbach là người phân lớp Staphylococci dựa trên cơ sở tên của nhà
khoa học Ogston và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là
Staphylococcus pyrogen aureus (Scott E.M và cs, 2000).
Phần lớn các loài Staphylococcus cư trú phổ biến ở da và màng nhầy.
Một vài loài tìm thấy một số vị trí cố định như loài S. apcapitis chỉ tìm thấy
vùng đầu và vùng trán. Các loài Staphylococcus tìm thấy ở người bao gồm:
S.aureus, S.epidermidis, S.hominis, S.haemoliticus, S.warneri, S.captis,
S.saccharolyticus, S.auricularis, S.simulans, S.saprophyticus, S.cohnii và S.
xylosus. Staphylococci cư trú trên da người chiếm tỷ lệ 65-90% các chủng phân
lập được.
S.aureus là loài phổ biến nhất trong giống Staphylococcus. Trong điều
kiện kị khí sự phát triển của vi khuẩn cần có amino acid và vitamin, nhưng
trong điều kiện hiếu khí cần có thêm uracil và các nguồn carbon. S.aureus phát
triển tốt nhất ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35 oC,
nhưng có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 10 đến 45 oC, khoảng pH
có thể phát triển từ 4,5 đến 9,3, nhưng pH tối thích khoảng 7,0 đến 7,5.
 Phân lập và phát hiện Staphylococcus:

13



Kiểm tra trực tiếp trên kính hiển vi với những dịch lỏng vô trùng (máu,
dịch não tuỷ). Kết quả được xác nhận là cầu khuẩn Gram (+) có nghĩa tương
đồng là Staphylococci.

14


Nhiều môi trường đặc dùng để phát hiện Staphylococci, đặc biệt là
S.aureus.
Môi trường chọn lọc S.aureus sử dụng một số hoá chất độc hại để tăng
khả năng chọn lọc. Thành phần môi trường gồm có NaCl, tellurite, lithium
chloride và nhiều kháng sinh khác nhau. Một số môi trường dùng để phân lập
và xác định mức nhiễm S.aureus >100 vi khuẩn/g thực phẩm là môi trường
staphylococcal
110, thạch VogelJohnson, thạch Egg yolk-sodium azide, thạch telluritepolymixin-egg yolk và BairdParker.
Phần lớn những môi trường chọn lọc thích hợp cho S.aureus bình thường
không bị tác động. Tuy nhiên do sự tác động của quá trình chế biến, bảo quản,
điều kiện bất lợi, bị tác động đến ngưỡng gần chết thì việc tăng sinh S.aureus
cần có những tác nhân chọn lọc. S. aureus có thể không phát triển trên những
môi trường tăng sinh chọn lọc truyền thống. Môi trường Baird-Parker là môi
trường thích hợp nhất cho việc tăng sinh những tế bào bị tổn thương.
Các loài Staphylococcal có thể xác định qua một vài đặc điểm như hình
thái khuẩn lạc, sự tạo thành coagulase, tan huyết, đề kháng novobiocin, sự tạo
thành acetoin, sử dụng nguồn carbonhydrat điều kiện hiếu khí. Trên môi trường
không chọn lọc như TSA (tryptic soy agar), thạch dinh dưỡng, phần lớn các loài
staphylococcal phát triển mạnh sau 18-24 giờ/35oC với đường kính khuẩn lạc 13 mm. Dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc có thể trợ giúp xác định các loài
Staphylococcal (Scott E.M và cs, 2000).
1.2.2. Hình thái và đ cs, 2000)c 1-3
Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những

tính chất chung của Staphylococcus. S. aureus là những vi khuẩn hình cầu,
không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình
chùm nho, không di động. Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với
lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu.

15


16


Hình 1.1. Hình thái

Hình 1.2. Tụ cầu Staphylococcus

Staphylococcus aureus

aureus gram dương dưới kính hiển vi

S.aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme
catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:
Cata

H2O2

H2O + O2

S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra
enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S.aureus, là tiêu
chuẩn để phân biệt S.aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase:

coagulase ―cố định‖ (―bound‖ coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase
―tự do‖ (―free‖ coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào. Có hai
phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính và
trong ống nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase ―cố
định‖ bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm
phát hiện những coagulase ―tự do‖ bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua
cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương tạo thành từng khối hay
thành cục (Collin C.H và cs, 1995) [9].

17


Huyết tương

Khối Fibrin

Cơ chế thông thường biểu diễn quá trình đông tụ huyết tương như sau:
Prothrombin
Ca2+

Thrombokinase enzym

Thrombin

Fibrinogen

Coa

Fibrin


Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có
khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S.
aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường
chứa đến 15% muối NaCl (Trần Linh Thước, 2002).
Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch
máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan
máu hẹp hơn so với đường kính khuẩn lạc. Hầu hết các dòng S.aureus đều tạo
sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà
thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố được tạo ra
nhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon
khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin C.H và cs, 1995).
Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có
màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng
rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy
phân lòng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và
cs, 2002). Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường
Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm
vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) (Mary K.
S. và cs, 2002).