BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

NGUYỄN MẠNH KIÊN

PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ MỘT SỐ STR MARKER
TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH
MỘT SỐ LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ
Chuyên ngành
Mã số

: Y Sinh học Di truyền
: 60720106

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.BS. Đoàn Thị Kim Phượng
PGS.TS. Trần Đức Phấn

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS.BS
Đoàn Thị Kim Phượng và PGS.TS Trần Đức Phấn, hai Người Thầy đã hết
lòng quan tâm, tận tình giảng dạy, chỉ bảo cho tôi trên con đường nghiên cứu
khoa học, là người trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
Từ những tình cảm chân thành nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các

thầy cô trong Bộ môn Y sinh học – Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội đã
luôn tận tình dạy dỗ, đào tạo tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại
Bộ môn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong hội đồng thông
qua đề cương đã đưa ra những góp ý vô cùng giá trị, giúp cho tôi có những
điều chỉnh để hoàn thành luận văn tốt hơn.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại
học, Phòng Kế hoạch tổng hợp của Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu, nguồn động lực
để tôi luôn cố gắng chính là những tình cảm quý giá của gia đình và bạn bè.
Vì vậy, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn ủng
hộ, giúp đỡ, động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống.
Hà Nội, ngày 22 tháng 8 năm 2018
Tác giả
Nguyễn Mạnh Kiên


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Mạnh Kiên, học viên lớp Cao học khóa 25, Trường Đại
học Y Hà Nội, chuyên ngành Y sinh học – Di truyền, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng
dẫn của TS.BS Đoàn Thị Kim Phượng và PGS.TS. Trần Đức
Phấn.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở
nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 22 tháng 8 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Mạnh Kiên


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BP

: Base pair

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

FISH

: Fluorescence In Situ Hybridization

FSH

: Follicle-stimulating hormone

MSI

: Microsatelitte instability

NST


: Nhiễm sắc thể

PCR

: Polymerase Chain Reaction

QF-PCR

: Quantiative Fluorescence-Polymerase Chain Reaction

RNA

: Ribonucleic Acid

STR

: Short Tandem Repeat

TAQ

: Theramus aquaticus


MỤC LỤC
Nguyễn Mạnh Kiên...........................................................................................3
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................4
MỤC LỤC.........................................................................................................5
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1...........................................................................................................3
TỔNG QUAN...................................................................................................3

1.1. Các bất thường lệch bội thường gặp.........................................................................................3

1.1.1. Hội chứng Down...............................................................................3
1.1.2. Hội chứng Edwards...........................................................................5
1.1.3. Hội chứng Patau................................................................................7
Tiến triển của bệnh thường rất xấu: 80% trẻ bị bệnh chết trong năm đầu. Các
xét nghiệm di truyền và sinh hoá có thể giúp ta chẩn đoán sớm ở giai đoạn
phôi thai hội chứng 3 NST 13. Với những cặp vợ chồng có nguy cơ cao như
trong gia đình đã có người sinh con bị bệnh này, lớn tuổi mà vẫn muốn sinh
con… khi có thai cần đến các phòng khám di truyền để được chẩn đoán trước
sinh cho thai nhi, phòng tránh xuất hiện các trẻ bị bệnh rối loạn NST nói
chung trong đó có bệnh 3 NST 13 ....................................................................8
1.1.4. Một số hội chứng do lệch bội NST giới............................................8
1.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh.................................................................................11

1.2.1. Phương pháp di truyền tế bào.........................................................11
- Nuôi cấy tế bào và lập karyotyp là phương pháp truyền thống được xem
như tiêu chuẩn vàng trong phân tích rối loạn NST ở người. Ứng
dụng kỹ thuật này vào chẩn đoán trước sinh bắt đầu được nghiên
cứu và thực hiện vào năm 1966 khi Steele và Breg báo cáo về nuôi
cấy tế bào ối để xác định bộ NST của thai . Tế bào ối, máu cuống
rốn hoặc gai nhau được đem nuôi cấy từ 3-14 ngày, sau đó sẽ dừng
chu kỳ tế bào ở chu kỳ giữa dưới tạc động của colchicin. Tiến hành
thu hoạch tế bào và trải lên lam kính, nhuộm băng rồi phân tích bộ
NST bằng phần mềm chuyên dụng.................................................11


- Kỹ thuật này có thể xác định các bất thường về số lượng và cấu trúc
NST với độ chính xác rất cao, từ 99,4-99,8% và rất đáng tin cậy...11
- Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này đó là thời gian trả kết quả

kéo dài từ 14-21 ngày. Điều này tạo ra tâm lý bất an kéo dài đối với
thai phụ và khiến việc chấm dứt thai kỳ nếu được chỉ định trở nên
phức tạp và nguy hiểm hơn. Bên cạnh đó, kỹ thuật này đòi hỏi tay
nghề và chuyên môn cao của người thực hiện ...............................11
1.2.2. Phương pháp di truyền tế bào - phân tử (kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh
quang FISH)....................................................................................12
Phép lai tại chỗ đầu tiên được thực hiện vào năm 1969 bởi hai nhà khoa
học là Joseph Gall và Mary Lou Pardue. Hai người đã công bố một
công trình chứng minh các bản sao gắn phóng xạ của DNA
ribosome có thể được sử dụng để phát hiện các trình tự DNA bổ
sung trong nhân tế bào....................................................................12
Ngày nay, các đầu dò huỳnh quang đã thay thế các đầu dò phóng xạ nhờ
tính an toàn, dễ phát hiện và độ ổn định cao. Trên thực tế, đa số các
kỹ thuật lai tại chỗ hiện nay đều sử dụng phép lai FISH. Kỹ thuật
FISH đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong nhiều lĩnh vực,
một trong số đó là ứng dụng phát hiện các bất thường lệch bội trong
chẩn đoán trước sinh ......................................................................12
FISH sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn được đánh dấu
huỳnh quang, gọi là DNA dò. DNA dò được lai với các DNA đích
trên NST của tế bào gian kỳ hoặc ở kỳ giữa, sau đó phân tích kết
quả dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kỹ thuật FISH có nhiều hạn
chế như giá thành cao, đòi hỏi thiết bị và chuyên môn cao của
người đọc kết quả............................................................................12
1.2.3. Phương pháp di truyền phân tử - Kỹ thuật QF-PCR (Quantiative..12
flourescence - polymerase chain reaction)................................................12
1.3. STR marker và ứng dụng trong y học.......................................................................................16

1.3.1. Khái niệm........................................................................................16
Kết quả giải trình tự cho thấy phần lớn hệ gen của sinh vật nhân chuẩn bậc cao không mã hoá
mRNA hay bất cứ RNA nào khác, chỉ có 1,5% mã hoá protein, RNA chức năng và các trình

tự điều hoà kiểm soát sự biểu hiện của chúng. Vùng không mã hoá còn lại chiếm đến
98,5%, đơn thuần là intron và DNA giữa các gen.................................................................16
DNA có thể được phân loại thành 2 loại cơ bản bao gồm: các trình tự có chức năng mã hoá
(coding gene) gồm gen 1 bản sao (solitary gene), gen lặp (duplicated gene), gen lặp liên


tiếp (tandemly repeated array) và các trình tự không mã hoá (non-coding DNA) gồm DNA
trình tự đơn giản, yếu tố DNA di động và DNA đệm............................................................16

1.3.2. Ứng dụng của STR marker trong y học..........................................18
1.3.3. Các nghiên cứu ứng dụng QF-PCR để chẩn đoán trước sinh các
lệch bội NST ở Việt Nam và trên thế giới.......................................21
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................25
.........................................................................................................................25
2.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................................................25
2.2. Địa điểm nghiên cứu................................................................................................................25
Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm tư vấn di truyền thuộc bệnh viện Đại học Y Hà Nội.. 25
2.3. Thời gian nghiên cứu................................................................................................................25
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 9/2016 đến tháng 8/2018..................................................25
2.4. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................................................26

2.4.1. Thiết kế nghiên cứu.........................................................................26
Là nghiên cứu mô tả cắt ngang.................................................................26
2.4.2. Cỡ mẫu............................................................................................26
Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định theo công thức sau:..........................26
2.4.3. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................27
2.5. Hóa chất, phương tiện sử dụng trong nghiên cứu..................................................................28
Hóa chất nghiên cứu :......................................................................................................................28
Kit tách DNA từ tế bào ối: QIAamp DNA Mini Kit...........................................................................28
Bộ kit Devyser complete v2 cho phản ứng PCR và điện di mao quản...........................................28

Phương tiện :...................................................................................................................................28
Máy PCR Bio – Rad...........................................................................................................................28
Máy đo nồng độ DNA, máy ly tâm..................................................................................................28
Tủ lạnh sâu, bàn ủ nhiệt...................................................................................................................28
Pipet định mức, đầu côn các loại, ống PCR, ống Eppendorf 1,5ml, ống Falcon vô trùng.............28
Máy điện di mao quản ABI 3500XL.................................................................................................28
Phần mềm phân tích DNA fragment: GenneMapper.....................................................................28
2.6. Kỹ thuật sử dụng trong phương pháp QF-PCR........................................................................28

2.6.1. Tách chiết DNA..............................................................................28
2.6.2. Xác định mức độ tinh sạch DNA....................................................29


2.6.3. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các trình tự STR..................29
Dùng kit Devyser complete v2..................................................................29
2.6.4. Điện di trên máy ABI 3500XL........................................................32
DNA của thai (chiết xuất từ dịch ối) sau khi được PCR khuếch đại các
trình tự STR sẽ được điện di trên máy ABI 3500XL......................32
2.6.5. Phân tích kết quả.............................................................................32
Kết quả điện di thu được phân tích bằng phần mềm Genmapper.............32
Phân tích kết quả dựa theo Guideline của tổ chức Di truyền tế bào học
lâm sàng (ACC) và Hội di truyền phân tử lâm sàng (CMGS) năm
2012 và Hướng dẫn thực hành của hãng Devyser ..........................32
Phân biệt các marker đồng hợp và dị hợp:................................................32
2.7. Kỹ thuật sử dụng trong phương pháp di truyền tế bào..........................................................34

2.7.1. Nuôi cấy tế bào...............................................................................34
Sau khi nhận mẫu, tiến hành cấy mẫu nhanh nhất có thể.............................................................34
Ly tâm ống lấy mẫu chứa dịch ối ở 1000 vòng/phút, trong 10 phút.............................................34
Tiến hành nuôi cấy trong tủ an toàn sinh học................................................................................34

Dùng bơm kim tiêm hút hết phần dịch nổi, giữ lại tế bào ối. Bổ sung thêm 3-4 ml môi trường
Amnio Max và trộn đều.........................................................................................................34
Chuyển tất cả môi trường và dịch nuôi vào lọ nuôi cấy..................................................................34
Chuyển lọ nuôi cấy vào tủ ấm 37 độ C, môi trường CO2 5%.........................................................34
Sau khoảng 7 - 10 ngày mang ra soi trên kính hiểu vi đảo ngược để đánh giá mức độ bám của tế
bào. Nếu tế bào bám tốt sẽ tiến hành thay môi trường. Trút dung dịch sang một lọ mới để
tiến hành lưu mẫu. Bổ sung môi trường mới vào chai nuôi cấy ban đầu và tiếp tục theo
dõi...........................................................................................................................................34

2.7.2. Các bước thu hoạch tế bào..............................................................35
Sau khi xác lập thời điểm thu hoạch tế bào, tiến hành các bước như sau:...................................35
Nhỏ vào chai nuôi cấy dung dịch Colcemid để dừng quá trình phân bào. Để tủ ấm 37 độ C trong
3 giờ........................................................................................................................................35
Đổ bỏ dung dịch trong chai, bổ sung 3ml dung dịch trypsin EDTA, để tủ ấm 10 phút..................35
Kiểm tra trên kính hiển vi, nếu tế bào bong hết thì chuyển toàn bộ dịch sang ống falcon 15ml.
Rửa lại bằng 2ml môi trường và cũng chuyển tất cả vào ống falcon...................................35
Ly tâm ống falcon ở 2500v/phút trong 10 phút..............................................................................35
Hút bỏ dịch nổi, bổ sung KCL và để tủ âm 30 phút.........................................................................35
Ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút............................................................................................35


Hút bỏ dịch nổi, cố định từ từ bằng dung dịch Carnoy để lạnh.....................................................35
Để ngăn mát tủ lạnh ít nhất là 45 phút...........................................................................................35
Ly tâm và rửa lại nhiều lần với Carnoy cho sạch.............................................................................35

2.7.3. Lập tiêu bản và nhuộm tiêu bản......................................................35
Ly tâm ống thu hoạch ở 2500 vòng/phút trong 10 phút................................................................35
Hút bỏ phần dịch phía trên, để lại khoảng 0.5 ml cặn....................................................................35
Trộn đều và dùng pipet nhỏ lên lam kính đã xử lý..........................................................................35
Để khô, chờ sấy và nhuộm...............................................................................................................35

Mang lam đi sấy 80 độ C trong 1 giờ...............................................................................................36
Chuẩn bị bể nhuộm Giemsa và bể nhuộm Trypsin.........................................................................36
Dừng hoạt độ Trypsin bằng dung dịch Buffer lạnh.........................................................................36
Nhuộm Giemsa trong 10 phút rồi rửa sạch, để khô.......................................................................36

2.7.4. Phân tích tiêu bản nhiễm sắc thể.....................................................36
Chụp hình các cụm NST dưới kính hiển vi bằng hệ thống camera có kết nối máy tính................36
Lập karyotyp và phân tích bất thường NST với phần mềm phân tích Ikaros analysis...................36
Kết luận về bộ NST của mẫu dịch ối................................................................................................36
2.8. Xử lý và phân tích số liệu..........................................................................................................36
Số liệu của nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0......................................................36
2.9. Đạo đức trong nghiên cứu.......................................................................................................36

Chương 3.........................................................................................................37
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................................37
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng................................................................................................37

3.1.1. Tỷ lệ giới tính thai...........................................................................37
3.1.2. Phân bố tuổi thai.............................................................................38
3.2. Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các STR marker....................................................................39

3.2.1. Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker STR đối với NST 13 39
3.2.2. Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker đối với NST 18........39
3.2.3. Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker đối với NST 21........40
3.2.4. Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker đối với NST X..........42
3.2.5. Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker đối với NST Y..........43
Nhận xét:...................................................................................................43


Có 5 marker được sử dụng để phát hiện NST Y là XY2, XY3, AMELXY,

ZFYX và SRY. Hai marker XY2, XY3 phát hiện đồng thời và
không phân biệt NST X và Y đã được nêu trên, 3 marker còn lại
không phải là STR nên chúng tôi không phân tích tính đồng/dị hợp
tử.....................................................................................................43
3.3. Giá trị của các STR marker sử dụng trong kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán lệch bội NST.......43

3.3.1. Tỷ lệ phát hiện alen của NST 13 bằng các STR marker.................43
Tỷ lệ phát hiện alen của NST 13 bằng các STR marker...........................43
Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gọn cho NST 13.............44
3.3.2. Tỷ lệ phát hiện alen của NST 18 bằng các STR marker.................45
Tỷ lệ phát hiện alen của NST 18 bằng các STR marker...........................45
Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gọn cho NST 18.............47
3.3.3. Tỷ lệ phát hiện alen của NST 21 bằng các STR marker.................49
Tỷ lệ phát hiện alen của NST 21 bằng các STR marker...........................49
Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gọn cho NST 21.............50
3.3.4. Tỷ lệ phát hiện alen của NST giới bằng các STR marker...............50
Tỷ lệ phát hiện alen của NST X bằng các STR marker............................51
Tỷ lệ phát hiện alen của marker SRY là 100%.........................................51
Tỷ lệ phát hiện alen chung cho 2 NST X và Y của các marker................52
3.4. Kết quả của 2 phương pháp chẩn đoán trước sinh (QF-PCR và di truyền tế bào).................53

3.4.1. Tỷ lệ thành công của phương pháp QF-PCR và di truyền tế bào.. .53
Tuần thai....................................................................................................53
Tỷ lệ thành công %...................................................................................53
Số lượng....................................................................................................53
Di truyền tế bào.........................................................................................53
QF-PCR.....................................................................................................53
16 đến ≤ 17 tuần........................................................................................53
100 53
100 53

530 53
> 17 đến ≤ 18 tuần.....................................................................................53


100 53
100 53
>18 tuần....................................................................................................53
100 53
100 53
Chung........................................................................................................53
100 53
100 53
Nhận xét:...................................................................................................53
Tỷ lệ thành công của cả 2 phương pháp đều đạt 100%............................53
3.4.2. So sánh kết quả của phương pháp QF-PCR và di truyền tế bào trong
chẩn đoán lệch bội NST..................................................................54
BÀN LUẬN....................................................................................................55
4.1. Giá trị của các marker sử dụng trong kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể
13, 18, 21................................................................................................................................55
4.2. Giá trị của các marker sử dụng trong kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể
giới..........................................................................................................................................60
4.3. Giá trị của phương pháp QF-PCR trong chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể...........................62

Kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể đồ từ tế bào ối hoặc tua rau đã được sử dụng
từ những năm 1970 và trở thành tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán trước sinh các
bất thường của nhiễm sắc thể. Kỹ thuật này đòi hòi thời gian từ 2-3 tuần để có
kết quả. Trong nhiều năm sau đó, một số phương pháp đã được phát triển để
rút ngắn thời gian này. Từ năm 1993, kỹ thuật QF-PCR đã được giới thiệu để
phát hiện một số lệch bội NST thường gặp, ứng dụng từ phát hiện về những
trình tự lặp lại ngắn của bộ gen (STR) ...........................................................62

QF-PCR là một kỹ thuật cho kết quả nhanh, kinh tế, khả năng tự động hoá cao
và phân tích cùng lúc nhiều mẫu. Nhờ vậy, kỹ thuật này nhanh chóng được sử
dụng tại nhiều labo trên thế giới nhằm phục vụ cho chẩn đoán trước sinh. Từ
tháng 1 năm 2005, tại Stockholm (Thụy Điển), thai phụ đã có thể lựa chọn
giữa kỹ thuật QF-PCR độc lập hoặc phân tích NST từ tế bào ối để chẩn đoán


trước sinh khi có chỉ định. Tương tự như vậy, từ tháng 5/2007, chẩn đoán
trước sinh độc lập bằng kỹ thuật QF-PCR cũng đã được giới thiệu tại London
và vùng Đông Nam vương quốc Anh . Kỹ thuật NST đồ chỉ được chỉ định
trong trường hợp siêu âm phát hiện các bất thường cấu trúc thai, hoặc có 2
trong 3 các dấu hiệu của trisomy 21, gồm độ mờ da gáy > 3 mm trước 14 tuần
thai, > 6 mm sau 14 tuần thai và tiền sử gia đình có bất thường NST , , .......63
Trong nghiên cứu của chúng tôi với 530 mẫu bệnh phẩm, kỹ thuật QF-PCR
đã phát hiện được tất cả 19 trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 13,18,21, X và
Y, không có trường hợp nào âm tính giả hay dương tính giả. Như vậy kỹ thuật
QF-PCR trong nghiên cứu này có độ nhạy là 100% (19/19), độ đặc hiệu là
100% (511/511), giá trị chẩn đoán dương tính là 100% (19/19), giá trị chẩn
đoán âm tính là 100% (511/511).....................................................................63
Trong một nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan và cộng sự (2013) , kỹ
thuật QF-PCR có độ nhạy 94,4%, độ đặc hiệu 100%, giá trị chẩn đoán dương
tính 100% và giá trị chẩn đoán âm tính 99,5%...............................................63
KẾT LUẬN.....................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................1
PHỤ LỤC..........................................................................................................9
Hình ảnh NST đồ và QF-PCR của một trường hợp Klinefelter........................9
Karyotyp: 47,XXY (Người nam mắc hội chứng Klinefelter)...........................9
...........................................................................................................................9
.........................................................................................................................10
Chú thích:........................................................................................................11

.........................................................................................................................11
DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU...............................................12



DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các marker sử dụng.............................................................................................................31
Bảng 2.2. Đối với marker có 2 peak.....................................................................................................33
Bảng 2.3. Đối với marker có 3 peak.....................................................................................................34
Bảng 3.1. Phân bố tuổi thai.................................................................................................................38
Bảng 3.2. Tỷ lệ dị/đồng hợp tử của các marker đối với NST 13.........................................................39
Bảng 3.3. Tỷ lệ dị/đồng hợp tử của các marker đối với NST 18.........................................................39
Bảng 3.4. Tỷ lệ dị/đồng hợp tử của các marker đối với NST 21.........................................................40
Bảng 3.5. Tỷ lệ dị/đồng hợp tử của các marker đối với NST X...........................................................42
Bảng 3.6. Tỷ lệ dị/đồng hợp tử của các marker đối với NST Y............................................................43
Bảng 3.7. Tỷ lệ phát hiện alen NST số 13 của các STR marker............................................................43
Bảng 3.8. Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gọn cho NST 13......................................45
(n = 530).
45
Các marker có tỷ lệ dị hợp tử cao nhất...............................................................................................45
Tổ hợp 4 marker...................................................................................................................................45
Tổ hợp 5 marker...................................................................................................................................45
Tổ hợp 6 marker...................................................................................................................................45
Tất cả 7 marker.....................................................................................................................................45
≤ 1 marker dị hợp tử............................................................................................................................45
(Không có giá trị chẩn đoán)................................................................................................................45
6
45
3

45
1
45
0
45
≥ 2 marker dị hợp tử............................................................................................................................45
(Có giá trị chẩn đoán)..........................................................................................................................45
524
45
527
45
529
45
530
45
Tỷ lệ phát hiện (%)...............................................................................................................................45
98,9
45
99,4
45
99,8
45
100
45
Bảng 3.9. Tỷ lệ phát hiện alen NST số 18 của các STR marker............................................................45
Bảng 3.10. Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gonj cho NST 18...................................47
(n = 530).
47



Các marker có tỷ lệ dị hợp tử cao nhất...............................................................................................47
Tổ hợp 4 marker...................................................................................................................................47
Tổ hợp 5 marker...................................................................................................................................47
Tổ hợp 6 marker...................................................................................................................................47
Tất cả 7 marker.....................................................................................................................................47
≤ 1 marker dị hợp tử............................................................................................................................47
(Không có giá trị chẩn đoán)................................................................................................................47
8
47
3
47
1
47
0
47
≥ 2 marker dị hợp tử............................................................................................................................47
(Có giá trị chẩn đoán)..........................................................................................................................47
522
47
527
47
529
47
530
47
Tỷ lệ phát hiện (%)...............................................................................................................................47
98,5
47
99,4
47

99,8
47
100
47
Bảng 3.11. Tỷ lệ phát hiện alen NST số 21 của các STR marker..........................................................49
Bảng 3.12. Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gọn cho NST 21....................................50
(n = 530).
50
Các marker có tỷ lệ dị hợp tử cao nhất...............................................................................................50
Tổ hợp 4 marker...................................................................................................................................50
Tổ hợp 5 marker...................................................................................................................................50
Tổ hợp 6 marker...................................................................................................................................50
Tất cả 7 marker.....................................................................................................................................50
≤ 1 marker dị hợp tử............................................................................................................................50
(Không có giá trị chẩn đoán)................................................................................................................50
11
50
3
50
1
50
0
50
≥ 2 marker dị hợp tử............................................................................................................................50
(Có giá trị chẩn đoán)..........................................................................................................................50
519
50
527
50
529

50


530
50
Tổng
50
530
50
Tỷ lệ phát hiện (%)...............................................................................................................................50
97,9
50
99,4
50
99,8
50
100
50
Bảng 3.13. Tỷ lệ phát hiện alen của NST X của các STR marker..........................................................51
Bảng 3.14. Tỷ lệ phát hiện alen của NST Y của các STR marker..........................................................52
Bảng 3.15. Tỷ lệ thành công của phương pháp QF-PCR và di truyền tế bào.....................................53
Bảng 3.16. So sánh kết quả phương pháp QF-PCR và di truyền tế bào.............................................54
Bảng 4.1. Tỷ lệ dị hợp tử của các marker chẩn đoán cho NST số 13 trong một số nghiên cứu........56
Bảng 4.2. Tỷ lệ dị hợp tử của các marker chẩn đoán cho NST số 18 trong một số nghiên cứu........57
Bảng 4.3. Tỷ lệ dị hợp tử của các marker chẩn đoán cho NST số 21 trong một số nghiên cứu........59
Bảng 4.4. Tỷ lệ dị hợp tử và tỷ lệ phát hiện đúng alen của các marker cho NST giới tính.................61
Bảng 4.5. Tỷ lệ dị hợp tử của các marker chẩn đoán cho NST giới trong một số nghiên cứu...........62


DANH MỤC HÌNH


Hình 1.1. Hình ảnh bệnh nhân hội chứng Down...................................................................................4
Hình 1.2. Hình thái bên ngoài và đặc điểm bàn tay, bàn chân của bệnh nhân thể ba nhiễm 18........6
Hình 1.3. Các bước khuếch đại PCR và phân tích một locus STR.......................................................13
Hình 1.4. Hai alen dị hợp tử................................................................................................................14
Hình 1.5. Hình ảnh 1 alen của NST X, ở người có Karyotyp 46, XY.....................................................15
Hình 1.6. Ba alen dị hợp tử với tỷ lệ đỉnh 1:1:1..................................................................................15
Hình 1.7. Ba alen dị hợp tử với tỷ lệ 2:1..............................................................................................16
Hình 1.8. Cơ chế hình thành STR.........................................................................................................17


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Dị tật bẩm sinh là một trong những bất thường hay gặp ở thai nhi và trẻ
sơ sinh. Tại các nước đang phát triển, ước tính có khoảng 4 triệu trẻ sinh ra có
dị tật bẩm sinh . Trong đó, bất thường nhiễm sắc thể là một trong những
nguyên nhân quan trọng gây ra dị tật bẩm sinh. Một số hội chứng bất thường
nhiễm sắc thể hay gặp như: hội chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứng
Patau và một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể giới như Klinefelter,
Turner. Các bất thường bẩm sinh này là nguyên nhân gây tử vong và bệnh tật
trong những năm đầu sau sinh, không chỉ để lại hậu quả nặng nề và thiệt thòi
lớn cho trẻ, mà còn là gánh nặng lớn cho gia đình và xã hội. Bất thường
nhiễm sắc thể chiếm khoảng 15% các dị tật bẩm sinh được chẩn đoán trước 1
tuổi ở châu Âu, và liên quan đến 25% tử vong chu sinh do dị tật bẩm sinh .
Hiện nay việc điều trị và khắc phục hậu quả cho những hội chứng này còn rất
nhiều khó khăn, do đó việc phòng bệnh và chẩn đoán sớm các dị tật bẩm sinh
thời kỳ phôi thai là một việc hết sức quan trọng và cấp thiết để có thể giảm
bớt gánh nặng tâm lý và kinh tế cho gia đình và xã hội , , .
Gần đây, người ta đã phát hiện ra các trình tự lặp lại ngắn STR (short

tandem repeat) có tính đa hình cao ở một số locus nhất định trên nhiễm sắc thể
số 13, 18, 21, X, Y. Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân gen những locus này,
chúng ta có thể xác định được số lượng các alen trên hình ảnh điện di. Do bất
thường số lượng alen tương ứng với bất thường các nhiễm sắc thể nên phương
pháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán các hội chứng bất thường số lượng
nhiễm sắc thể một cách nhanh chóng và chính xác mà không cần phải nuôi cấy
tế bào. Kỹ thuật QF-PCR được gọi là phản ứng chuỗi polymer huỳnh quang định
lượng dùng để khuếch đại các đoạn STR, mỗi một nhiễm sắc thể sẽ được khảo
sát trên nhiều locus STR khác nhau, nhờ đó tính chính xác của kỹ thuật rất cao.


2

Một số quốc gia như Thụy Điển, Anh đã dùng kỹ thuật này độc lập để chẩn đoán
trước sinh các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể. Chỉ các marker biểu hiện dị
hợp tử (2 peak hoặc 3 peak) mới có giá trị chẩn đoán các bất thường lệch bội
tăng. Các marker đồng hợp tử không có giá trị chẩn đoán này. Tuy nhiên, tỷ lệ
đồng hợp tử, dị hợp tử của các alen rất khác nhau ở các chủng tộc khác nhau.
Hiện nay, kỹ thuật chẩn đoán QF-PCR trước sinh ở Việt Nam đang thực hiện
trên các kit thương mại sử dụng các marker STR được phát triển ở các quần thể
người châu Âu, châu Mỹ. Do đó, giá trị của việc sử dụng các marker này trên
người Việt Nam cần được đánh giá thực tiễn. Bên cạnh đó, mỗi locus STR được
lựa chọn có những đặc điểm riêng về tính đa hình, hiện tượng dị/đồng hợp tử, từ
đó ảnh hưởng lớn đến việc phân tích kết quả và ý nghĩa chẩn đoán. Vì vậy, tôi
tiến hành đề tài “Phân tích giá trị một số STR marker trong chẩn đoán trước
sinh một số lệch bội nhiễm sắc thể” với 2 mục tiêu:
1. Xác định tỷ lệ đồng hợp tử, dị hợp tử của các STR marker sử dụng
trong kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán trước sinh một số lệch bội
nhiễm sắc thể.
2. Đánh giá giá trị của một số STR marker sử dụng trong kỹ thuật QFPCR để chẩn đoán trước sinh một số lệch bội nhiễm sắc thể.



3

Chương 1
TỔNG QUAN

1.1. Các bất thường lệch bội thường gặp
1.1.1. Hội chứng Down
Hội chứng Down là một trong những bất thường lệch bội hay gặp nhất,
tần số khoảng 1/319-1/1000 trẻ sơ sinh. Tần số này không có sự khác biệt
giữa các chủng tộc và giữa các tầng lớp xã hội trên thế giới , . Tỷ lệ nam/nữ
mắc hội chứng Down khoảng 3/2 .
Về di truyền tế bào học, khoảng 92,5% trường hợp là thể ba nhiễm 21
thuần (47,XX,+21 hoặc 47,XY,+21) . Thể ba nhiễm này xảy ra do rối loạn sự
phân ly cặp NST 21 trong quá trình tạo giao tử, karotyp của bố mẹ là bình
thường. Khoảng 2-3% trường hợp là thể khảm với 2 dòng tế bào, một dòng tế
bào chứa 46 NST, một dòng tế bào chứa 47 NST, thừa NST số 21 . Khoảng 24% trường hợp là thể chuyển đoạn , trẻ mắc hội chứng Down có 46 NST với 2
NST số 21 và NST 21 thứ 3 được chuyển đoạn với các NST tâm đầu khác,
hay gặp là NST số 13, 14, 15 thuộc nhóm D hoặc 21, 22 thuộc nhóm G. Triệu
chứng lâm sàng trong những trường hợp này không khác gì so với thể ba
nhiễm 21 thuần. Tuy nhiên, bệnh có tính chất gia đình, bố hoặc mẹ của những
đứa trẻ mắc hội chứng Down do chuyển đoạn có thể là những người bình
thường nhưng mang NST chuyền đoạn cân bằng giữa NST 21 với các NST số
13, 14, 15 hoặc 21, 22 .
Về triệu chứng lâm sàng, hội chứng Down có những biểu hiện rất dễ
nhận biết: đầu nhỏ, ngắn; mặt tròn, gốc mũi tẹt, khe mắt xếch, lưỡi to và dày,
tai nhỏ, thấp; cổ ngắn, gáy phẳng rộng, bàn tay rộng, các ngón tay ngắn , . Trẻ



4

mắc hội chứng Down chậm phát triển trí tuệ, IQ thấp trung bình 30-50.
Thường gặp dị tật tim (thông liên thất, thông liên nhĩ, còn ống động mạch), dị
tật tiêu hóa (hẹp tá tràng, không hậu môn và phình to đại tràng). Ngoài ra, hội
chứng Down còn liên quan đến bệnh Alzheimer, bạch cầu cấp, tăng huyết
áp…, , .

Hình 1.1. Hình ảnh bệnh nhân hội chứng Down
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ con mắc hội chứng Down tăng nhanh
theo tuổi mẹ, cơ chế liên quan đến đột biến này là do sự không phân ly của
NST 21 trong quá trình giảm phân tạo giao tử. Bên cạnh đó, tuổi mẹ quá trẻ
hoặc tuổi bố cao cũng ảnh hưởng đến tần số sinh con Down . Các nguyên
nhân khác có thể kể đến đó là các rối loạn nhiễm sắc thể ở bố mẹ, các đột biến
mới phát sinh và yếu tố môi trường .
Trong những năm gần đây kết hợp các kỹ thuật di truyền phân tử và lai
tại chỗ, các nhà di truyền học đã xác định được 5 gen có liên quan đến dấu
hiệu lâm sàng của Down đã được định vị trong một vùng của nhánh dài (q)
của NST 21 .
Các gen liên quan đến Down bao gồm: gen mã hóa protein superoxide
dismutase (SOD - 1) và alpha - A - Cristallin ở vị trí 21q22.1, 21q22.3. Gen


5

Gart, ets - 2 ở vị trí trong 21q21.1 và 21q22.2. Gen mã hóa Phosphofructokinase
(PFK) ở vị trí 21q22.3.
Vùng 21q22.3 gây ra những biểu hiện kiểu hình Down điển hình như:
chậm phát triển trí tuệ, đặc điểm đặc trưng của bộ mặt, những bất thường ở
tay và những dị tật bẩm sinh của tim.

Phân tích ở mức phân tử vùng 21q22.1 - q22.3 thấy chứa những gen liên
quan đến dị tật bẩm sinh của tim. Một gen mới DSCR1 được phát hiện trên vùng
21q21.1 - q22.2 biểu hiện ở não, tim và được coi như là tác nhân gây ra những dị
tật của tim và chậm phát triển trí tuệ trong hội chứng Down , , .
Việc tìm ra các gen này đã mở ra hướng chẩn đoán hội chứng Down ở
mức di truyền tế bào - phân tử và mức phân tử.
1.1.2. Hội chứng Edwards
Hội chứng thể ba nhiễm 18 được Edwards và cộng sự mô tả năm 1960.
Tỷ lệ chung của bệnh là 1/6000-1/8000 trẻ sinh ra sống . Tỷ lệ mắc bệnh phát
hiện khi sinh ở nữ cao hơn nam (nữ/nam khoảng 1,5). Tuy nhiên, tỷ lệ thai
chết lưu cao hơn ở thai nam so với nữ. Hơn nữa, trẻ nữ sinh ra sống biểu hiện
khả năng sống sót tốt hơn trẻ nam mắc bệnh , .
Về di truyền tế bào, 80% trường hợp là thể ba nhiễm thuần (47,XX,+18
hoặc 47,XY,+18). Khoảng 10% ở thể khảm và 10% ở thể chuyển đoạn hoặc
thể ba nhiễm kép.
Về triệu chứng lâm sàng, giai đoạn phôi: thai bị mắc hội chứng trisomy
18 có biểu hiện già tháng (trung bình 42 tuần), thai hoạt động yếu, đa ối, rau
bé, thường có 1 động mạch rốn.


6

Hình 1.2. Hình thái bên ngoài và đặc điểm bàn tay, bàn chân của bệnh
nhân thể ba nhiễm 18
Khi sinh ra, trẻ sinh ra nhẹ cân, thường đẻ non, có trán hẹp, sọ dài và to,
khe mắt hẹp, tai thấp, ít quăn và nhọn, miệng bé, hàm nhỏ và lùi ra sau. Bàn
tay rất đặc biệt, ngón cái quặp vào lòng bàn tay, bàn tay nắm lại, ngón trỏ
chùm lên ngón nhẫn. Bàn chân vẹo. Thường kèm theo dị tật ở tim, cơ quan
sinh dục, thoát vị rốn. Tiên lượng rất xấu, thường chết ngay sau khi đẻ hoặc
chỉ sống trung bình khoảng 10 tuần. Tuổi mẹ có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ

mắc hội chứng .
Xét nghiệm di truyền có giá trị chẩn đoán và cũng góp phần tiên lượng,
dự phòng tái xuất hiện bệnh ở các trẻ tiếp theo. Trẻ bị bệnh có khoảng 80% là
3 NST 18, 10% là thể khảm: bên cạnh dòng tế bào 3 NST 18 vẫn có dòng tế
bào bình thường có 2 NST 18, 10% người mắc hội chứng Edwards là do
chuyển đoạn của NST 18 .
Tiên lượng bệnh rất xấu, thường chết ngay sau khi đẻ hoặc chỉ sống
trung bình 10 tuần.
Chẩn đoán bệnh dựa vào:


7

- Kết quả xét nghiệm di truyền tế bào học.
- Các triệu chứng lâm sàng, siêu âm thai. Đặc biệt là các biểu hiện trên
bàn tay của trẻ bị bệnh.
Các dấu hiệu lâm sàng có thể gợi ý cho việc chẩn đoán. Tuy nhiên để
chẩn đoán xác định thì phải dựa vào xét nghiệm di truyền tế bào , .
1.1.3. Hội chứng Patau
Hội chứng thể ba nhiễm 13 được Patau và cộng sự miêu tả năm 1960. Tần
số chung của bệnh là 1/4000-1/10000 trẻ sinh ra sống, với tỷ lệ nữ mắc nhiều
hơn nam . Theo một nghiên cứu tại Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc hội chứng Patau là
1,26/10000 trẻ sinh ra sống .
Về di truyền tế bào, khoảng 75% trường hợp là thể ba nhiễm thuần; 20%
trường hợp là chuyển đoạn 13/13 do bố mẹ truyền cho (25%) hoặc mới phát
sinh (75%); 5% còn lại là thể khảm .
Trẻ mắc hội chứng Patau có đặc điểm: đầu nhỏ, nhãn cầu nhỏ hoặc
không có nhãn cầu, tai thấp và biến dạng, thường điếc, sứt môi hai bên, nứt
khẩu cái, tâm thần vận động kém phát triển, thường kèm theo dị tật tim và
ống tiêu hóa. Tiên lượng bệnh rất xấu, phần lớn chết trong năm đầu, các

trường hợp khảm biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn có thể sống lâu hơn .
Chẩn đoán bệnh dựa vào:
- Kết quả xét nghiệm di truyền tế bào học.
- Triệu chứng lâm sàng, triệu trứng trên siêu âm thai.


8

Các dấu hiệu lâm sàng có thể gợi ý cho việc chẩn đoán hội chứng
Patau. Tuy nhiên để chẩn đoán xác định thì phải dựa vào xét nghiệm di truyền
tế bào , .
Tiến triển của bệnh thường rất xấu: 80% trẻ bị bệnh chết trong năm
đầu. Các xét nghiệm di truyền và sinh hoá có thể giúp ta chẩn đoán sớm ở giai
đoạn phôi thai hội chứng 3 NST 13. Với những cặp vợ chồng có nguy cơ cao
như trong gia đình đã có người sinh con bị bệnh này, lớn tuổi mà vẫn muốn
sinh con… khi có thai cần đến các phòng khám di truyền để được chẩn đoán
trước sinh cho thai nhi, phòng tránh xuất hiện các trẻ bị bệnh rối loạn NST nói
chung trong đó có bệnh 3 NST 13 .
1.1.4. Một số hội chứng do lệch bội NST giới
Hội chứng Turner
Hội chứng Turner là một rối loạn ở nữ giới, đặc trưng bởi sự vắng mặt toàn
bộ hoặc một phần nhiễm sắc thể giới tính thứ 2, dẫn đến các biểu hiện lâm sàng
thường gặp là thấp lùn, rối loạn sinh dục, phù mạch bạch huyết bẩm sinh. Tần số
mắc hội chứng Turner ở trẻ gái sinh ra sống là 1/2500-1/3000 .
Hội chứng Turner có một tỷ lệ chết cao ngay ở giai đoạn phôi thai (9899%), chỉ một số nhỏ sống đến khi sinh .
Về di truyền tế bào, khoảng 55% trường hợp có karyotyp là 45,X; 10%
trường hợp ở dạng khảm 45,X/46,XX hoặc 45,X/47,XXX; 20% trường hợp
có NST đều ở nhánh dài hoặc nhánh ngắn 46,X,i(Xq); 5% trường hợp do mất
đoạn NST X ở nhánh dài hoặc nhánh ngắn 46,XXq hoặc 46,XXp-; 5% trường
hợp NST X vòng; 5% trường hợp có NST Y như trường hợp khảm

45,X/46,XY , .