BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÝ TRUNG KIÊN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
4-HYDROXYDERRICIN VÀ
XANTHOANGELOL TRONG
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
CHALCONE BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÝ TRUNG KIÊN
1401338

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
4-HYDROXYDERRICIN VÀ
XANTHOANGELOL TRONG
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
CHALCONE BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1. ThS. Nguyễn Lâm Hồng
2. ThS. Lê Hồng Dũng
Nơi thực hiện
Khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh
Dưỡng Quốc gia

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện, khóa luận “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định
lượng đồng thời 4-Hydroxyderricin và Xanthoangelol trong thực phẩm chức năng chứa
chalcon bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” đã hoàn thành. Để có được kết quả này, em đã
nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ từ phía nhà trường, bộ môn Hóa phân tích Độc chất và nơi em thực hiện đề tài - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia.
Trước tiên, em xin bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS. Nguyễn
Lâm Hồng - giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, người đã tận tình hướng dẫn
và theo sát em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Lê Hồng Dũng, người đã trực
tiếp hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện tối đa cho em trong suốt quá trình thực hiện
nghiên cứu. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị tại khoa Hóa thực
phẩm - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện nghiên
cứu.
Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, việc xuất hiện các thiếu sót
trong bài báo cáo là không tránh khỏi. Em rất mong nhận được các đóng góp, chỉ dẫn
của thầy cô để khóa luận của em được tiếp tục hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Lý Trung Kiên


i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
MỤC LỤC .................................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .............................................................. 2
1.1.1. Chalcone ................................................................................................... 2
1.1.2. Xanthoangelol ........................................................................................... 2
1.1.3. 4-Hydroxyderricin ..................................................................................... 3
1.1.4. Sản phẩm chứa Xanhoangelol và 4-Hydroxyderricin ................................. 3
1.1.5. Một số tính chất sinh hóa của Xanhoangelol và 4-Hydroxyderricin ........... 4
1.1.6. Một số phương pháp phân tích 4-Hydroxyderrcin và Xanthoangelol ......... 7
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 9
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 9
2.2. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 9
2.2.1. Chất chuẩn................................................................................................. 9
2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ................................................................... 9
2.2.3. Chuẫn bị dung dịch mẫu placebo ............................................................... 9
2.2.4. Dung môi, hóa chất.................................................................................... 9
2.2.5. Thiết bị, dụng cụ........................................................................................ 9
2.2.6. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 10
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 10
2.3.1. Kháo sát các điều kiện phân tích xanthoangelol và 4-hydroxyderricin bằng
HPLC ........................................................................................................................ 10

2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu................................................................... 11
2.3.3. Thẩm định quy trình ................................................................................ 12
2.4. Xử lý kết quả ................................................................................................. 14
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................... 15
ii


3.1. Xây dựng quy trình phân tích ...................................................................... 15
3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký ..................................................................... 15
3.1.2. Điều kiện sắc ký tối ưu ............................................................................ 20
3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ................................................................... 20
3.1.4. Quy trình chiết tối ưu............................................................................... 23
3.2. Thẩm định phương pháp .............................................................................. 24
3.2.1. Độ ổn định của hệ thống HPLC ............................................................... 24
3.2.2. Tính đặc hiệu của hệ thống ...................................................................... 24
3.2.3. Khoảng tuyến tính ................................................................................... 26
3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD và LOQ) ...................... 28
3.2.5. Độ lặp lại ................................................................................................. 29
3.2.6. Độ thu hồi................................................................................................ 30
3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích thực phẩm chức năng chalcone ........... 31
3.4. Bàn luận ........................................................................................................ 32
3.4.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 32
3.4.2. Điều kiện sắc ký HPLC ........................................................................... 32
3.4.3. Quy trình xử lý mẫu................................................................................. 32
3.4.4. Thẩm định phương pháp .......................................................................... 33
3.4.5. Ứng dụng định lượng trên thực phẩm chức năng chứa chalcon ................ 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

4-HD

4-Hydroxyderricin

ACN

Acetonitrile

CV

Coefficient of Variation

Hệ số biến thiên

ESI

Electrospray ionization

Ion hóa phun điện tử


GSH

Glutathion
Hàm lượng so với nhãn

HLSVN
HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC

Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế

LC

Liquid Chromatography

Sắc ký lòng

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện


LogD

Octanol/water Distribution
Coefficient

Hệ số phân bố octanol/nước

LogP (o/w)

Octanol/water Partition Coefficient

Hệ số phân tán
octanol/nước

LOQ

Limit of Qualification

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ


PDA

Photodiode Array Detector

Detector mảng diod

RS

Resolution

Độ phân giải

RSD %

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn
Tiêu chuẩn cơ sở

TCCS
UV

Untraviolet


XA

Xanthoangelol

Tử ngoại

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích 4-HD và XA ................................................ 7
Bảng 1.2: Phương pháp định lượng dựa trên TCCS..................................................... 8
Bảng 3.1: Kết quả độ ổn định của hệ thống HPLC .................................................... 24
Bảng 3.2: Thông số peak purity mẫu thử ................................................................... 26
Bảng 3.3: Nồng độ và diện tích peak của 4-HD ......................................................... 27
Bảng 3.4: Nồng độ và diện tích peak của xanthoangelol ............................................ 27
Bảng 3.5: Giá trị S/N của các pic thêm chuẩn và kết quả LOQ, LOD ........................ 28
Bảng 3.6: Kết quả độ lặp lại ...................................................................................... 29
Bảng 3.7: Kết quả độ thu hồi ở ba mức nồng độ thấp, trung bình và cao ................... 30
Bảng 3.8: Kết quả định lượng thực phẩm chức năng Chalcone.................................. 31

v


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Cấu trúc Chalcone ....................................................................................... 2
Hình 1.2: Cấu trúc Xanthoangelol ............................................................................... 2
Hình 1.3: Cấu trúc 4-Hydroxyderricin ......................................................................... 3
Hình 1.4: Một số thực phẩm chức năng chứa 4-HD và XA .......................................... 4

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất dự kiến .............................................................. 11
Hình 3.1: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Inertsil C8 ....................................... 15
Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Phenomenex Luna C18(2) ............... 16
Hình 3.3: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Agilent 5-HC C18(2) ....................... 16
Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (7/3) ....................... 17
Hình 3.5: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (8/2) ....................... 18
Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (9/1) ....................... 18
Hình 3.7: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH ........................................ 19
Hình 3.8: Phổ hấp thụ của 4-HD và XA ..................................................................... 19
Hình 3.9: So sánh giữa siêu âm và lắc ngang ............................................................ 20
Hình 3.10: So sánh giữa các tỷ lệ dung môi chiết ...................................................... 21
Hình 3.11: So sánh giữa các khoảng thời gian chiết .................................................. 21
Hình 3.12: So sánh giữa các nhiệt độ chiết ................................................................ 22
Hình 3.13: So sánh giữa số lần chiết ......................................................................... 23
Hình 3.14: Sơ đồ quy trình chiết xuất tối ưu .............................................................. 23
Hình 3.15: Sắc ký đồ mẫu placebo ............................................................................. 25
Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn .......................................................... 25
Hình 3.17: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp.......................................................................... 25
Hình 3.18: Kết quả peak purity mẫu thử .................................................................... 26
Hình 3.19: Biểu đồ mối tương quan nồng độ - diện tích peak của 4-HD .................... 27
Hình 3.20: Biểu đồ mối tương quan nồng độ - diện tích peak của xanthoangelol ....... 27
Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn LOQ .............................................................. 29

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu chăm sóc sức khỏe
của con người ngày càng cao. Chính vì vậy, ngày càng có nhiều người quan tâm và tìm
đến các sản phẩm bảo vệ và nâng cao sức khỏe, trong số đó thực phẩm chức năng với

các thành phần được công bố có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng được ưa chuộng.
Những năm trở lại đây, các dịch chiết từ bộ phận của cây Angelica keiskei, một
loài cây phân bố chủ yếu ở Nhật Bản, ngày càng được quan tâm. Dịch chiết của giống
cây này đã được chức minh khả năng ức chế phát triển khối u, cải thiển tình trạng viêm,
béo phì, tiểu đường, tăng huyết áp. Mặt khác, chúng cũng cho thấy hoạt tính chống huyết
khối, chống oxy hóa, chống tăng lipid, chống virus và ức chế vi khuẩn [6]. Trong đó,
hai chalcon là thành phần chính, 4-hydroxyderricin và xanthoangelol, tồn tại chủ yếu ở
dạng aglycon, với hàm lượng tương ứng mỗi chất trong dịch chiết thô của A. keiskei là
1,5% và 2,6%, đã đóng vai trò quan trọng với các tác dụng sinh học này [13]. Bởi vậy,
các sản phẩm thương mại hóa cũng được phát triển trên thế giới, đặc biệt là thực phẩm
phẩm chứ năng tại Nhật Bản: Chalcone Ashitaba Powder, Percent 36 Energy Booster.
Tuy nhiên, các sản phẩm tương tự hiện nay vẫn chưa phổ biến tại Việt Nam. Chính
vì vậy, tại Viện Dinh Dưỡng Quốc gia, với nhu cầu phát triển sản phẩm chứa hai loại
chalcon này, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng
thời 4-Hydroxiderrcin và Xanthoangelol trong thực phẩm chức năng chứa chalcone bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao” với các mục tiêu sau:
- Xây dựng quy trình định lượng đồng thời hàm lượng 4-Hydroxyderrcin và
Xanthoangelol trong thực phẩm chức năng chứa chalcon.
-

Ứng dụng quy trình đã xây dựng để định lượng sản phẩm chức năng Chalcone

đang lưu hành trên thị trường.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.1.1. Chalcone


O

Hình 1.1: Cấu trúc Chalcone
-

Công thức: C15H12O - CAS number: 94-41-7.

-

Tên khoa học: (E)-1,3-diphenylpropenon.

-

Phân tử lượng: 208,3g/mol.

-

LogP (o/w): 3,12 [21].

1.1.2. Xanthoangelol
HO

H3C

OH

OH
CH3


O

CH3

Hình 1.2: Cấu trúc Xanthoangelol
-

Công thức: C25H28O4 - CAS number: 62949-76-2.

-

Tên khoa học: (E)-1- [3-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-2,4-

dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-on.
-

Phân tử lượng: 392,5 g/mol.

-

Độ tan trong nước: 0,0039 mg/L ở 25oC, tan tốt trong dung môi hữu cơ không

phân cực như methanol, acetonitrile,….
-

LogP (o/w): 6,16.

-

LogD (pH = 7,4): 5,84.


-

pKa = 7,57 [22].

2


1.1.3. 4-Hydroxyderricin
OH

CH3
O

H3C

OH

O

CH3

Hình 1.3: Cấu trúc 4-Hydroxyderricin
-

Công thức: C21H22O4 - CAS number: 55912-03-3.

-

Tên khoa học: (E)-1-[2-hydroxy-4-methoxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-3-


(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-on.
-

Phân tử lượng: 338,4 g/mol.

-

Độ tan trong nước: 0,0038 mg/L ở 25oC, tan tốt trong dung môi hữu cơ không

phân cực như methanol, acetonitrile,…
-

LogP (o/w): 5,18.

-

LogD (pH = 7,4): 5,04.

-

pKa = 7,87 [20].

1.1.4. Sản phẩm chứa Xanhoangelol và 4-Hydroxyderricin
XA và 4-HD lần đầu tiên được xác định thông qua nghiên cứu của Kozawa và
cộng sự [9]. Từ đó đến nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ cây Ashitaba với 2 thành
phần chính là XA và 4-HD đã được thương mại hóa tại Nhật Bản dưới nhiều tên gọi
khác nhau. Các sản phẩm này hướng đến nhiều tác dụng sinh học khác nhau: điều trị
giảm cân, giảm mỡ, chống oxi hóa, v.vv…


3


Hình 1.4: Một số thực phẩm chức năng chứa 4-HD và XA
Trong nghiên cứu của chúng tôi, thực phẩm chức năng Chalcone được phát triển
hướng tới việc tăng cường chuyển hóa chất béo, qua đó hỗ trợ giảm cân và hướng tới
đối tượng người sử dụng trưởng thành có nguy cơ thừa cân, béo phì, người có chỉ số
khổi cơ thể BMI > 23 (kg/m2). Tác dụng này đã được chứng minh qua nghiên cứu ngẫu
nhiên có đối chứng, mù đôi trên đối tượng cả chuột và người của Katsunori và cộng sự.
Mối đối tượng chia làm 2 nhóm: 1 nhóm sử dụng bột chiết Ashitaba có thành phần chính
là XA và 4-HD, 1 nhóm sử dụng giả dược kéo dài trong 8 tuần. Kết quả cho thấy có sự
giảm đáng kể về lượng mỡ nội tạng và trọng lượng cơ thể ở nhóm được dùng chế phẩm
[16].
1.1.5. Một số tính chất sinh hóa của Xanhoangelol và 4-Hydroxyderricin
a. Hấp thu và chuyển hóa
 Phân bố: 4-HD và XA được tìm thấy ở tất cả các mô được kiểm tra sau 2 giờ
uống, chủ yếu ở dạng aglycon, trừ tế bào mỡ ở màng treo ruột lại là dạng liên hợp. Điều
này gợi ý rằng các chalcon Ashitaba có thể đi vào qua tĩnh mạch cửa và ống bạch huyết
tương tự như các chất chuyển hóa, sau đó được chuyển lại thành dạng aglycon trong cơ
thể [13].
 Thải trừ: 4-HD và XA được thải trừ chủ yếu ở dạng aglycon dạng liên hợp
(glucuronat và/ hoặc sulfat) trong nước tiểu trong khoảng từ 2 đến 4 giờ sau khi uống.
Trong phân, các chất này chỉ thải trừ dưới dạng aglycon. Thời gian XA được duy trì
trong cơ thể chuột dài hơn 4-HD. Tuy nhiên, lượng aglycon phát hiện được trong phân
và nước tiểu thấp hơn rất nhiều so với liều dùng [13].
b. Độc tính:
Trong một thử nghiệm trên chuột, bột Ashitaba chalcon không có độc tính với di
truyền. Với hệ bạch huyết ở hỗng tràng, có xuất hiện độc tính thấp khi sử dụng liều cao
4



(1000 mg/kg) ở cả 2 giới. Bên cạnh đó, có sự liên quan giữu liều và bệnh thận α-2globulin trên chuột đực. Liều cao nhất không gây độc với bột Ashitaba chalcon là 300
mg/kg ở cả chuột đực và chuột cái [11]. Trong một nghiên cứu đối chứng – giả dược,
mù đôi trên 26 người lớn béo phì nam và nữ kéo dài 56 ngày, kết quả cho thấy không
có sự khác biệt giữa nhóm 2 nhóm thử nghiệm và liều 200 mg Ashitaba chalcon hằng
ngày duy trì trong 56 ngày được coi là an toàn [16].
c. Tác dụng dược lý
 Hoạt tính chống loét dạ dày
Trong một thí nghiệm in-vitro sử dụng tế bào niêm mạc dạ dày lợn, 2 dẫn chất
chalcon, XA và 4-HD ức chế bơm H+-K+-ATPase với 2 giá trị IC50 tương ứng là 1,8 và
3,3 µM. Hai chất ức chế cạnh tranh với ATP và không cạnh tranh với K+. Hoạt tính ức
chế vận chuyển proton ở thí nghiệm này phụ thuộc liều. Đặc biệt, XA ở nồng độ 100
mg/kg ức chế đáng kể sự tiết acid dạ dày và sự hình thành các tổn thương tại dạ dày do
stress [12].
 Hoạt tính kháng khuẩn
Trong một thí nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên Streptococcus aureus, với việc
được làm giàu bằng một bộ liên kết phân tách hóa học, 4-HD ức chế trực tiếp hoạt tính
enzyme seryl-tARN synthetase bằng cơ chế alkyl hóa lượng dư cysteine cần thiết có
trong enzym và do đó có thể gây chết tế bào do sự suy giảm sinh tổng hợp protein của
vi khuẩn [2].
 Hoạt tính hạ đường huyết
Trong thí nghiệm của Kawataba và cộng sự trên tế bào cơ L6, 4-HD và XA ở
nồng độ 10 µg/ml làm tăng hấp thu đáng kể 2-deoxyglucozo trong tế bào lên 1,9 lần so
với nhóm chứng dùng dimethyl sulfoxit. Xét trên tính chất phụ thuộc thời gian, cả 2
chalcon này trong 1-2 giờ làm tăng đáng kể nồng đồ 2-deoxyglucozo trong tế bào với
mức tương đương với với imsulin. Bên cạnh đó, dích chiết Ashitaba sau khi được làm
giàu chứa 150,6 mg/g 4-HD và 146,0 mg/g XG ức chế tăng đường huyết cấp tính trong
một thử nghiệm dung nạp bằng đường uống trên chuột [5].
 Hoạt tính chống viêm
Theo nghiên cứu in vitro của Yasuda và cộng sự trên đại thực bào RAW264

chuột, 4 – hydroxyderricin (10 µg/ml) và XA (10 µg/ml) làm giảm đáng kể sự tiết nito
oxit (sản phẩm trung gian của lipopolysaccharid gây viêm) so với chalcon (25 µg/ml).
5


Hai chất này cũng ức chế sự tiết lipopolysaccharide này của tế bào TNF-α và biểu hiện
của enzyme cảm ứng tổng hợp nito oxid và cyclooxygenase-2. Mặt khác, cả 2 chalcon
đều làm giảm mức độ phosphoryl hóa (ở mức serin 536) của tiểu đơn vị p65 của NFκB. Chính vì vậy, 4-HD và XG hứa hẹn trong việc phòng phừa các bệnh viêm nhiễm
[19].
 Hoạt tính hạ huyết áp
Theo nghiên cứu trên chuột tăng huyết áp tự phát có nguy cơ đột quỵ, kết quả
cho thấy chế độ ăn uống có 4-HD ức chế mạnh huyết áp tâm thu, làm giảm nồng độ
lipoprotein tỷ trọng rất thấp huyết thanh và hàm lượng triglycerid trong gan [15].
 Hoạt tính chống oxy hóa
Theo nghiên cứu của Luo và cộng sự, sử dụng phương pháp LC-MS dùng
glutathion làm chất nền, XA và 4-HD có khả năng kết hợp với GSH rất nhanh và có thể
đem đến việc cảm ứng ở múc độ nhất định enzym nicotinamide adenin dinucleotide
(phosphate): quinion oxidoreductase 1. Mặt khác, enzyme này đã được chứng minh là
xúc tác cho các quinon, như menadion và hydroquinon giúp chống lại các tổn thương
oxi hóa. Chính vì vây, đây là cơ sở hóa học hướng tới các lợi ích của XA và 4-HD với
các thuốc chống ung thư [10].
 Hoạt tính chống ung thư
Thử nghiệm trên chuột mang tế bào ung thư phổi Lewis, kết quả cho thấy XA
đường uống (50mg/kg, 2 lần 1 ngày) ức chế chính sự tăng trưởng khối u và di căn đến
phổi, giảm trọng lượng phổi, kéo dài thời gian sống và tăng tủ lệ sống sót của chuột.
Hơn thế nữa, XA (50 hoặc 100 mg/kg 1 ngày) ức chế khối u di căn đến gan và sự tăng
trưởng của khối u ở gan chuột. Bên cạnh đó, XG phân lập từ Angelica keiskei không gây
ra các phản ứng có hại nghiêm trọng như tăng cân hay tử vong trên chuột [7].
 Hoạt tính chống trầm cảm
Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự trên chuột trên chuột, kết quả cho thấy XA

có khả năng ức chế enzym monoamine oxidazo không chọn lọc. Khả năng ức chế này
tương tự tinh chất của iproniazid. Mặt khác, nghiên cứu còn cho thấy 4-HD là môt chất
ức chế enzym monoamine oxidazo - B chọn lọc tiềm năng. Giá trị IC50 của 4-HD tuy
cao hơn thuốc chứng (deprenyl) nhưng với do mục đích sử dụng làm thực phẩm, giá trị
này vẫn rất thấp [3].

6


1.1.6. Một số phương pháp phân tích 4-Hydroxyderrcin và Xanthoangelol
1. Theo TLTK được trình bày ở bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích 4-HD và XA
STT

1

Nền mẫu

Phương
pháp

Mẫu thử

HPLC –

bột

Cột sắc
ký


Pha dung môi

Điều kiện sắc ký

Phương pháp
chiết

Cột

A: Acid acetic: nước

Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

Chiết 1g mẫu

UV –

Eclipse

(0,1 : 100).

Thời gian cân bằng giữa các

bằng MeOH trong

nghiền

ESI –

XDB-C18 B: Acid acetic: methanol


lần tiêm: 10 phút.

6h, có lắc ở nhiệt

nhỏ

MS

(4,6 x 150 (0,1 : 100).

Thể tích tiệm 10 µl.

độ phòng.

Angelica

mm; 5

Chế độ gradient:

 UV: 200-400 nm.

keiskei

µm)

0-3 phút: 90% B.

Đỉnh: 254 và 310 nm.


trên ly tâm 3000

(lá, rễ, vỏ

(Agilent)

3-8 phút: 60% B.

 Chế độ ion hóa ESI+

vòng/5 phút.

8-13 phút: 60% B.

Áp suất phun: 60 psi.

13-33 phút: 100% B.

Tốc độ thổi khí: 8 lít/phút.

lọc 0,45 µm rồi

33-38 phút: 100% B.

Nhiệt độ làm khô: 550oC.

đem đí sắc ký

Quét từ m/z: 100 - 500


HPLC.

rễ)

7

TLTK

Dịch chiết phía

Lọc qua màng

[17]


2

Rễ, thân

HPLC -

Cột Halo

A: Acid formic: nước

Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút.

lá cấy


PDA

C18 (4,6

(0,1 : 100).

Thể tích tiêm: 5 µl.

Angelica

x 150

B: MeOH.

Nhiệt độ cột: 40oC.

keiskei

mm; 2,7

Chế độ gradient:

Bước sóng: 370 nm.

µm)

0 - 2 phút: 30% A

[18]


2 - 40 phút: 30 - 0% A.
40 - 45 phút: 0% A.
45 - 50 phút: 30% A.
2. Theo tiêu chuẩn cơ sở của công ty Janpan Bio Science Laboratory Co., Ltd trên nền mẫu nguyên liệu và sản phẩm chức
năng chứa chalcon [4] trình bày ở bảng 1.2 sau:
Bảng 1.2: Phương pháp định lượng dựa trên TCCS
Phương
pháp

Cột sắc ký

Pha dung
môi

Điều kiện sắc ký

HPLC -

Cột Agilent HC – MeOH /H2O : Tốc độ dòng: 1

DAD

C18 (2) 150 x 4,6 8/2

ml/phút.

mm

Thể tích tiêm: 10 µl.
UV: 365 nm


Phương pháp chiết
0,1-1g mẫu vào bình tam giác 100ml,
thêm 20 ml MeOH 80%, siêu âm 15 phút.
Chuyển toàn bộ vào bình định mức 25
ml và định mức với MeOH 80%. Lọc qua
màng 0,45 µm rồi tiêm HPLC.

8


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là mẫu thực phẩm chức năng Chalcone được sản
xuất tại Viện Dinh Dưỡng Quốc gia.
2.2. Nguyên vật liệu
2.2.1. Chất chuẩn
-

Xanthoangelol: hàm lượng 98,50%, số lô CXL 0808, Japan Bio Science

Laboratory Co., Ltd.
-

4-Hydroxyderricin: hàm lượng 97,54%, số lô CHL 0810, Japan Bio Science

Laboratory Co., Ltd.
2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
-


Dung dịch chuẩn gốc: Với mỗi chất XA và 4-HD, tiến hành cân chính xác khoảng

20,0 mg chất chuẩn vào bình đựng mức 20 mL, hòa tan và định mức vừa đủ bằng
MeOH/H2O (8/2).
-

Dung dịch chuẩn làm việc: từ dung dịch chuẩn gốc, pha dãy chuẩn hỗn hợp có

nồng độ các chất từ khoảng 2 ppm đến 250 ppm:
- Tạo chuẩn hỗn hợp nồng độ mỗi chất khoảng 500 ppm bằng cách hút chính xác
đồng thể tích các chuẩn gốc đơn từng chất sau đó pha bằng MeOH/H 2O (8/2).
-

Pha loãng chuẩn hỗn hợp đến nồng độ phù hợp. Dung dịch chuẩn được bảo quản

ở -24oC đến khi dùng.
2.2.3. Chuẫn bị dung dịch mẫu placebo
-

Mẫu placebo: Trong đề tài này, mẫu placebo được cung cấp bởi khoa Hóa thực

phẩm - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia.
2.2.4. Dung môi, hóa chất
-

Methanol của Merck – Đức dùng cho HPLC.

-

Nước khử ion 18 mΩ.


-

MeOH/H2O (8/2): Lấy 80 ml MeOH vào cốc đong 100 mL, thêm H2O vừa đủ tới

vạch.
2.2.5. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu:
-

Hệ thống HPLC Waters Alliance gồm bơm Waters 2695 và detector PDA 2996

cùng phần mềm Empower software 3471 – Mỹ.
9


-

Máy siêu âm Elmasonic S120H – Đức.

-

Cân phân tích Mettler Toledo ME204T/00 (d = 0,1 mg) - Đức.

-

Máy ly tâm lạnh Universal 32R Hetich – Đức.

-


Tủ âm sâu Panasonic MDF - U5412 - Nhật Bản.

-

Máy lắc ngang WiseShake SHR-2D – Đức

-

Bơm hút chân không New Askir – Ý.

-

Máy lắc Rotex Thermolytex Maxi II Type 37600, M37619-26 – Mỹ.

-

Màng lọc PTFE 0,45 µm – Mỹ.

-

Pipetman 100 – 1000 µL, 10 – 100 µL, 10 – 200 µL.

-

Các dụng khác: Bình tam giác 100 Duran – Đức, bình định mức 25 ml, ống falocn

50ml, pipet thủy tinh, cốc đong, phễu, vial loại 1,5 mL…
2.2.6. Nội dung nghiên cứu
-


Xây dựng quy trình chiết xuất đồng thời XA, 4-HD trong mẫu thực phẩm chức

năng chứa chalcon.
-

Khảo sát điều kiện HPLC PDA để định lượng đồng thời 4-HD và XA.

-

Thẩm định phương pháp phân tích đã được xây dựng.

-

Áp dụng phương pháp phân tích để kiểm tra thực phẩm chức năng Chalcone dùng
đề tài.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Kháo sát các điều kiện phân tích xanthoangelol và 4-hydroxyderricin bằng
HPLC
Dựa trên các tài liệu [4], [17], các điều kiện được lựa chọn cố định như sau:
-

Tốc độ dòng: 1ml/ phút.

-

Thể tích tiêm: 10 µL.

-


Nhiệt độ cột: 35oC.

-

Khoảng bước sóng: 210 – 400 nm.

Dựa trên cơ sở vật chất của khoa Hóa thực phẩm, các điều kiện sau đây của quá trình
tách HPLC được khảo sát:
-

Cột sắc ký
o Cột Inertsil GL Science Inc C8 (250mm x 4,6mm x 5 µm) với cột bảo vệ
Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).
o Cột Phenomenex Luna C18(2) (250mm x 4,6mm x 5µm).
10


o Cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent
5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).
-

Tỷ lệ pha động: tăng dần từ MeOH/ H2O (7/3) đến MeOH 100%.

-

Quét phổ peak XA và 4-HD, chọn bước sóng phát hiện và định lượng.

2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
-


Dựa vào các tài liệu [4], [17] và khả năng hòa tan của hai chất cần phân tích, quy

trình chiết mẫu dự kiến được xây dựng được trình bày ở hình 2.1 sau:

Mẫu thực phẩm chức năng đã đồng nhất
Cân chính xác khoảng 0,2g mẫu
Thêm khoảng 20 mL dung môi chiết
Chiết mẫu theo cách được khảo sát
Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 25 mL
Rửa cắn bằng dung môi đến vừa đủ 25 mL
Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm
Tiêm vào hệ thống sắc ký
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất dự kiến
a. Khảo sát các phương pháp chiết:
-

Khảo sát hai phương pháp: siêu âm và lắc ngang.

b. Khảo sát điều kiện chiết
-

Dung môi chiết: khảo sát dung môi chiết là hỗn hợp MeOH/H2O ở các tỷ lệ khác

nhau để lựa chọn được tỷ lệ chiết phù hợp nhất
-

Thời gian chiết: Khảo sát thời gian chiết: 15 phút, 30 phút, 45 phút và 60 phút.

-


Số lần chiết: Chiết 1 lần, 2 lần.

-

Nhiệt độ chiết: ở ba khoảng nhiệt độ khác nhau bao gồm nhiệt độ thường; 45 oC;

60oC.
11


2.3.3. Thẩm định quy trình
Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích XA, 4-HD được thẩm định về các
tiêu chí sau:
a. Độ ổn định của hệ thống
-

Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch

chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện
tích peak của từng chất trong từng lần tiêm sắc ký.
-

Yêu cầu: chênh lệch của diện tích peak, thời gian lưu tR giữa các lần tiêm của

cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,00 %.
b. Tính đặc hiệu
-

Chuẩn bị các mẫu sau:
 Mẫu chuẩn hỗn hợp XA và 4-HD.

 Mẫu placebo, mẫu placebo thêm chuẩn.
 Mẫu thử: thực phẩm chức năng Chalcone.

 Điều kiện 1: Tiến hành chạy sắc ký ba mẫu gồm mẫu plaebo, mẫu placebo thêm
chuẩn và mẫu chuẩn hỗn hợp, so sánh các peak trên các sắc ký đồ thu được.
 Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu được, tại thời điểm xuất hiện peak
của các chất cần phân tích không được xuất hiện peak lạ.
 Điều kiện 2: Xác định độ tinh khiết
Tiến hành chạy sắc ký mẫu thử. Xác định độ tinh khiết qua công cụ peak purity.
 Yêu cầu: Thông số Purity Threshold lớn hơn Purity Angle.
c. Khoảng tuyến tính
-

Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương quan tuyến tính

trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại
lượng đo được Y và nồng độ chất cần phân tích X).
-

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ tăng dần phù hợp. Tiến hành

sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính của từng
peak giữa nồng độ từng chất và diện tích peak của chất đó.
 Yêu cầu:
 Đường hồi quy có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan: 0,99 ≤ R2 ≤ 1
có tương quán tuyến tính rõ rệt.
 Giá trị p-value của intercept > 0,05 [8].
12



d. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
-

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu

thử có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp đã
xây dựng. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu
thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm
mong muốn [1].
-

Cách xác định: Thêm chuẩn với nồng độ giảm dần vào mẫu placebo và xác

định giá trị S/N tương ứng. LOD là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn hơn
gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N=3), LOQ là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo
lớn hơn gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N=10), thường xác định giá trị LOQ dựa
trên giá trị LOD qua công thức: LOQ = 3 x LOD.
e. Độ lặp lại của phương pháp
-

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân

tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng
nhất dưới những điều kiện mô tả.
-

Cách xác định: Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng) xác

định bằng cách tiến hành thí nghiệm 6 lần (mỗi lần bắt đầu từ cân hay đong mẫu) với
cùng 1 mức nồng độ trên cùng 1 mẫu tiến hành trong cùng điều kiện.

-

Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD (%).
SD là độ lệch chuẩn
N là số lần thí nghiệm
xi là giá trị tính đƣợc của lần thử
nghiệm thứ “i”

 Yêu cầu: Theo AOAC 2016, chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng
độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của XA và 4-HD phải không lớn hơn 7,3% tại mức
nồng độ 10 ppm và 5,3% tại mức nồng độ 10 ppm [14].
f. Độ đúng
-

Độ đúng là sự gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị

thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (µ).
-

Cách xác định: Xác định độ đúng thông qua xác định độ thu hồi của phương pháp

bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo.
13


-

Tiến hành: Lượng chuẩn thêm vào ở 3 mức nồng độ: nồng độ thấp, nồng độ trung

bình, nồng độ cao. Tại mỗi mức nồng độ, phân tích lặp lại 3 lần. Tính tỷ lệ thu hồi

của các chất XA và 4-HD theo công thức

𝑅(%) =

Ct: hàm lượng tìm thấy

𝐶𝑡
. 100%
𝐶𝑐

CC: hàm lượng chuẩn thêm vào

 Yêu cầu: Theo AOAC 2016, tỷ lệ thu hồi đạt 90 - 107% tại mức nồng độ 10 - 100
ppm [14].
2.3.4 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra mẫu thực phẩm chức năng đang
lưu hành trên thị trường.
Nhằm kiểm tra và công bố hàm lượng hai chất XA và 4-HD có trong thực phẩm
chức năng Chalcone, phương pháp đã xây dựng được sử dụng để xác định hàm lượng
phần trăm hai chất có trong chế phẩm này.
2.4. Xử lý kết quả
Kết quả được phân tích, xử lý bằng phần mềm Empower Software 3471 và
Mircrosoft Excel 2013.

14


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng quy trình phân tích
3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
a. Khảo sát cột sắc ký

Cột sắc ký có vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích ra khỏi nhau,
là yếu tố quyết định khả năng của hệ thống sắc ký. Hiện nay, sắc ký pha đảo được sử
dụng phổ biến do tính phổ biến, tiết kiệm chi phí và đem lại hiệu quả cao. Do đó, trong
nghiên cứu này, sắc ký pha đảo được sử dụng. Dựa vào các tài liệu [4], [17] và cấu trúc
của chất cần phân tích, khả năng tách của các chất phân tích trên một số cột được khảo
sát gồm:
-

Cột Inertsil GL Science Inc C8 (250mm x 4,6mm x 5 µm) với cột bảo vệ Agilent

5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).
-

Cột Phenomenex Luna C18(2) (250mm x 4,6mm x 5µm).

-

Cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC

C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm).
Kết quả được trình bày ở các hình từ 3.1 đến 3.3 sau:

Hình 3.1: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Inertsil C8

15


Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Phenomenex Luna C18(2)

Hình 3.3: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Agilent 5-HC C18(2)

Nhận xét:
 Với cột Inertsil GL Science Inc C8: 2 peak có thời gian lưu không quá ngắn
(7,018 và 7,954), hình dạng peak đối xứng, khả năng tách khá tốt (R s = 1,89), tuy nhiên
có hiện tượng dính chân một chút nhỏ giữa 2 peak. Áp dụng công cụ peak purity factor
cho kết quả cả 2 peak lên đều tinh khiết (chỉ số Peak Threshold lớn hơn nhiều Peak
Angel), cho thấy khả năng tách cột khá tốt, sự ảnh hưởng của dính chân không đáng kể.
 Với cột Phenomenex C18(2), 2 peak không tách hoàn toàn khỏi nhau, dính chân
peak quá nhiều.
 Với cột Agilent 5-HC C18(2), 2 peak tách nhau rõ ràng (RS = 2,54), peak đối
xứng, không có hiện tượng dính chân, thời gian lưu không lớn (4-HD: 8,405 phút và
XA: 10,519 phút) nên khi tách trên mẫu thực có thể tránh được hiện tượng chồng peak,
dính peak với chất khác.
16


Kết luận: Qua khảo sát, kết quả sắc ký đồ cho thấy hệ cột Inertsil C8 và hệ cột
Agilent C18(2) đều thể hiện khả năng tách tốt. Tuy nhiên, với điều kiện cơ sở vật chất
cho phép, nghiên cứu quyết định sử dụng cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x
5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm) để tiến hành khảo
sát các yếu tố khác và định lượng mẫu. Với khả năng tách của cột Inertsil C8, đây có thể
là lựa chọn thứ 2.
b. Khảo sát thành phần pha động
Qua tham khảo tài liệu [4], điều kiện pha động chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn
hợp được lựa chọn: chế độ chạy đẳng dòng với hỗn hợp MeOH/H2O có tỷ lệ MeOH
tăng dần.
Kết quả thu được trình bày ở hình 3.4 đến 3.7 sau:
 Pha động 1: MeOH/ H2O (7/3)

Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (7/3)
Nhận xét: Ở tỷ lệ này, 2 peak xuất hiện, đối xứng, tách rõ ràng. Tuy nhiên, thời

gian lưu của 2 chất quá lớn (4-HD: 29,518 phút và XA: 49,518 phút). Thời gian lưu quá
gây hao phí dung môi sử dụng, không kinh tế.

17