BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LÊ THỊ DUYÊN

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN
THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU GEN MỘT SỐ
CHỦNG VIRUS VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN
BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG NĂM 2015

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LÊ THỊ DUYÊN

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN
THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU GEN MỘT SỐ
CHỦNG VIRUS VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN
BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG NĂM 2015
Chuyên ngành: Vi sinh y học

Mã số: 60720115
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS. LÊ THỊ HỘI

HÀ NỘI – 2017


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
HCV (Hepatitis C virus)
: virus viêm gan C
HCC (Hepatocellular Carcinoma)
: ung thư tế bào gan
NAT (Nucleic acid amplification) : thử nghiệm khuếch đại acid
nucleic
WHO (World Health Organrination) : Tổ chức Y tế thế giới
DAAs (Direct acting Antivirals)
: thuốc kháng virus trực tiếp
LVP (Lipo – viro – particles)
: hạt lipoprotein – virus
ORF (Open reading frame)
: khung đọc mở
UTRs (Untranslated regions)
: vùng không dịch mã
NS (Non structural)
: gen không cấu trúc
RDRP (RNA – dependent RNA : polymerarase RNA phụ thuộc
polymerase)
DNA
RNA

NGS (Next Generation Sequencing)
RT PCR (Reverse Transcription
Primer Chain Reaction)

RNA
: Deoxyribonucleic acid
: Ribonucleic acid
: giải trình tự gen thế hệ mới
: PCR phiên mã ngược


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.............................................................................3
1.1. Tình hình bệnh viêm gan virus C..............................................................3
1.2. Virus viêm gan C.......................................................................................6
1.2.1.

Cấu trúc hạt virus viêm gan C.............................................................6

1.2.2.

Cấu trúc bộ gen virus viêm gan C.......................................................7

1.2.3.

Các kiểu gen virus viêm gan C...........................................................8

1.3. Vai trò xác định kiểu gen HCV trong điều trị.........................................10
1.4. Các phương pháp xác định kiểu gen HCV..............................................11

1.4.1.

Phương pháp lai đầu dò (Line Probe Assay – LiPA).........................11

1.4.2.

Realtime PCR (Realtime Primer Chain Reaction)............................12

1.4.3.

Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger.....................................12

1.4.4.

Giải trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing). . .14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............17
2.1. Đối tượng nghiên cứu..............................................................................17
2.2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................17
2.3. Quy trình nghiên cứu................................................................................17
2.4. Thiết kế nghiên cứu..................................................................................18
CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ................................................................20
3.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân nghiên cứu.............................................20
3.2. Tỷ lệ kiểu gen và kiểu gen phụ HCV dựa trên phương pháp giải trình tự
gen thế hệ mới NGS........................................................................................21
3.2.1. Kết quả phân tích kiểu gen HCV bằng phương pháp NGS..................22
3.2.2. Tỷ lệ kiểu gen HCV...............................................................................21


3.2.3. Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV........................................................................22

3.3. Tỷ lệ kiểu gen và kiểu gen phụ HCV dựa trên phương pháp Sanger.......22
3.3.1. Tỷ lệ kiểu gen HCV...............................................................................22
3.3.2. Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV........................................................................23
3.4. So sánh giải trình tự gen HCV bằng 2 phương pháp NGS và Sanger......23
CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN............................................................24
DỰ KIẾN KẾT LUẬN....................................................................................24
DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ...........................................................................24
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Nội kiểm quy trình xét nghiệm……………………….…………...18
Bảng 3.1. Kết quả phân tích kiểu gen HCV bằng phương pháp NGS...........21
Bảng 3.2. Tỷ lệ kiểu gen HCV........................................................................21
Bảng 3.3. Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV.................................................................22
Bảng 3.4. Tỷ lệ kiểu gen HCV........................................................................21
Bảng 3.5. Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV..................................................................22
Bảng 3.6. Kết quả kiểu gen HCV dựa trên phương pháp NGS và Sanger......21

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Phân bố bệnh theo các nhóm tuổi...............................................20
Biểu đồ 3.2. Phân bố bệnh theo giới...............................................................20


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Diễn biến tự nhiên của nhiễm HCV..................................................4
Hình 1.2. Cấu trúc HCV....................................................................................6
Hình 1.3. Cấu trúc bộ gen HCV........................................................................7
Hình 1.4. Cây phát sinh chủng loại HCV..........................................................8

Hình 1.5. Sự phân bố genotype HCV trên toàn thế giới...................................9
Hình 1.6. Đích tác dụng của thuốc DAAs.......................................................11
Hình 1.7. Quy trình giải trình tự gen bằng NGS.............................................15
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu.......................................................................17
Hình 2.2. Thiết kế nghiên cứu.........................................................................18


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm gan virus C là bệnh truyền nhiễm do virus viêm gan C
(HCV) gây ra. Mặc dù biểu hiện lâm sàng của nhiễm HCV cấp thường nhẹ
hoặc không có triệu chứng nhưng HCV có thể gây viêm gan cấp, viêm gan
mạn, tiến triển thành xơ gan, thậm chí ung thư tế bào gan (HCC) dẫn đến tử
vong [1],[2]. Theo ước tính của nghiên cứu về Gánh nặng bệnh tật toàn cầu
của Tổ chức Y tế thế giới (Global Burden of Disease), số ca tử vong do viêm
gan C là 333.000 vào năm 1990, 499.000 vào năm 2010 và 704.000 vào năm
2013 [3],[4]. Năm 2015, tổng kết số người nhiễm HCV mạn tính lên tới 71
triệu người, tương đương với số bệnh nhân viêm gan virus C cần điều trị, là
một gánh nặng bệnh tật cho cả toàn xã hội [5].
Sự ra đời của các thuốc điều trị viêm gan virus C, đặc biệt là các thuốc
tác động trực tiếp tới virus DAAs (Direct Acting Antivirals) đã giúp cải thiện
đáng kể tình trạng bệnh, giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong cũng như giảm chi
phí điều trị. Tuy nhiên, việc lựa chọn phác đồ điều trị HCV liên quan mật
thiết tới kiểu gen của HCV, đặc biệt một số phác đồ đòi hỏi phải xác định tới
kiểu gen phụ của virus [2]. Do tầm quan trọng trong việc xác định kiểu gen
HCV trước khi lựa chọn phác đồ điều trị, nhiều phương pháp xác định kiểu
gen HCV đã ra đời chỉ ngay sau khi phát hiện ra virus viêm gan C một vài
năm. Một số phương pháp thường được sử dụng là lai đầu dò, Realtime PCR,
giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger, phương pháp Sanger được xem

như tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và xác định kiểu gen HCV. Tuy nhiên,
nhược điểm của phương pháp này là cần nhiều mẫu cho một lần chạy, chi phí
cao, thời gian để có kết quả dài hơn so với các phương pháp khác [6]. Bên
cạnh đó, dịch tễ của các bệnh nhân bị nhiễm HCV hiện nay tập trung chủ yếu
vào nhóm nguy cơ cao, bao gồm các bệnh nhân chạy thận nhân tạo, tiêm


2

chích ma túy, truyền máu...[7]. Những đối tượng này rất dễ bị nhiễm nhiều
hơn một kiểu gen HCV. Đây là vấn đề mà phương pháp Sanger không thể
giải quyết được. Trong những năm gần đây, một số phương pháp giải trình tự
gen mới đã ra đời, gọi là phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (Next
Generation Sequencing – NGS), giúp khắc phục một số nhược điểm của
phương pháp Sanger. NGS có khả năng tạo ra khối lượng dữ liệu khổng lồ,
cũng như khả năng cung cấp thông tin về bộ gen chính xác, nhanh chóng, đặc
biệt còn cho phép xác định đa nhiễm nhiều kiểu gen hay kiểu gen phụ HCV
trên cùng một bệnh nhân [7]. Để tìm hiểu về khả năng ứng dụng của NGS
trong giải trình tự gen HCV, chúng tôi tiến hành nghiên “Ứng dụng kỹ thuật
giải trình tự gen thế hệ mới trong xác định kiểu gen của một số chủng virus
viêm gan C tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2015” với 2 mục
tiêu:
1.

Xác định tỷ lệ genotype và subtype HCV dựa trên phương pháp
giải trình tự gen thế hệ mới NGS.

2.

So sánh giải trình tự gen HCV bằng 2 phương pháp NGS và

Sanger.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1.

Tình hình bệnh viêm gan virus C
Bệnh viêm gan virus C là bệnh truyền nhiễm do virus viêm gan C

(HCV) gây ra. HCV có thể gây viêm gan cấp, viêm gan mạn, tiến triển thành
xơ gan, ung thư tế bào gan (HCC). HCV là một trong những căn nguyên hàng
đầu gây bệnh gan mạn tính. Bệnh lây nhiễm qua đường máu, tình dục, mẹ
truyền sang con [1],[2].
Phần lớn bệnh không có triệu chứng lâm sàng cho đến khi có biểu hiện
xơ gan, đôi khi có mệt mỏi, chán ăn, đầy bụng, đau nhẹ hạ sườn phải, rối loạn
tiêu hóa, đau cơ [1],[2]. 15 – 45% số người mắc HCV cấp tính sẽ tự khỏi
trong vòng 6 tháng. 55 – 85% sẽ mắc HCV trong suốt phần đời còn lại hay
còn gọi là nhiễm HCV mãn tính nếu không điều trị. Các kháng thể chống lại
HCV xuất hiện từ giai đoạn cấp tính và tồn tại suốt đời. Ở những người có
kháng thể HCV, cần phải kiểm tra nồng độ acid nucleic (NAT) đối với HCV
RNA, phát hiện sự hiện diện của virus để phục vụ cho chẩn đoán và điều trị
[8],[9]. Trong số những người bị nhiễm HCV mãn tính, nguy cơ xơ gan là 15
– 30% trong vòng 20 năm [10],[11],[12]. Nguy cơ ung thư tế bào gan ở người
bị xơ gan xấp xỉ 2 – 4% mỗi năm [13].


4


Hình 1.1. Diễn biến tự nhiên của nhiễm HCV [2]
Trước đây, số ca tử vong mỗi năm do các bệnh liên quan đến HCV ngày
một gia tăng. Theo ước tính của nghiên cứu về Gánh nặng bệnh tật toàn cầu
của Tổ chức Y tế thế giới (Global Burden of Disease), số ca tử vong do viêm
gan C là 333.000 vào năm 1990, 499.000 vào năm 2010 và 704.000 vào năm
2013 [3],[4]. Một số lượng lớn những người nhiễm HCV từ 30 – 60 năm trước
đang chết vì xơ gan và ung thư tế bào gan vì những biến chứng này thường tiến
triển kéo dài tới hàng thập kỷ. Sự gia tăng số người chết được dự kiến sẽ tiếp tục
trong nhiều thập kỷ nữa trừ khi điều trị được tăng lên đáng kể [14].
Các phân tích gần đây về tỷ lệ hiện nhiễm HCV toàn cầu cho thấy có thể
có ít người nhiễm HCV hơn so với trước đây. Năm 2013, một tổng kết hệ
thống đã kết luận rằng có 184 triệu người có tiền sử nhiễm HCV (có kháng
thể kháng HCV). Trong số đó, khoảng 130 – 150 triệu người có thể bị nhiễm
bệnh mạn tính [15]. Một nghiên cứu khác vào năm 2014 có tính hệ thống
hơn, ước tính rằng 115 triệu người có kháng thể kháng HCV dương tính và
80 triệu người bị nhiễm HCV mạn tính [16]. Gần đây nhất vào năm 2015, số
người nhiễm HCV mạn tính được ước tính giảm xuống còn 71 triệu người.
Số ca tử vong cũng giảm còn trung bình khoảng 399.000 ca/ năm. Ước tính


5

thấp hơn này có thể được giải thích bởi sự giảm tỷ lệ số ca nhiễm cũng như
sự cải thiện các xét nghiệm chẩn đoán HCV giúp giảm tỷ lệ dương tính giả và
sự ra đời của các thuốc điều trị HCV mới [5]. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế
Thế giới, các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HCV cao nằm ở Châu Phi và Châu Á
như Ai Cập (14,7%), Pakistan (4,95%), Thái Lan (3,2 – 5,6%) và Việt Nam
(2 – 9%) [15]. Tại Việt Nam, tỷ lệ hiện nhiễm HCV thay đổi tùy theo vị trí
địa lý và tùy từng đối tượng, từ 1 – 2,9% trong dân số nói chung [18] đến 46

– 87% ở những người tiêm chích ma tuý [19].
Mặc dù tỷ lệ mắc có giảm nhưng số người cần được điều trị HCV hiện
nay vẫn còn cao. Việc nắm được tỷ lệ những người bị xơ hóa giai đoạn cuối
rất quan trọng trong việc lên kế hoạch cho các dịch vụ điều trị HCV. Đây là
những cá nhân cần được ưu tiên điều trị HCV vì họ có nguy cơ cao bị xơ gan
mất bù và ung thư tế bào gan [20]. Năm 1989, sau khi virus HCV được khám
phá ra, thuốc điều trị HCV đầu tiên dựa trên Interferon-alpha, một cytokine
được giải phóng bởi các tế bào chủ ra đời. Thuốc được tiêm dưới da, ức chế
sự nhân lên của HCV và điều chỉnh đáp ứng miễn dịch đối với các tế bào gan
nhiễm HCV. Sự ra đời của Ribavirin, một chất ức chế nucleoside đã làm tăng
tỷ lệ chữa khỏi bệnh. Tuy nhiên, các phác đồ Interferon / Ribavirin được
dung nạp kém, liên quan đến nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng và tỷ lệ chữa
khỏi từ 40 – 65%, tùy thuộc vào kiểu gen của bệnh nhân, tình trạng xơ gan,
HIV và kinh nghiệm điều trị trước đây. Một cải tiến đáng kể trong điều trị
HCV là việc sử dụng các thuốc uống ức chế trực tiếp chu kỳ nhân lên của
HCV. Các thuốc này được gọi là Direct – Acting Antiviral (DAA), nhắm mục
tiêu đến ba vùng quan trọng trong bộ gen của HCV: NS3/ 4A protease,
polymerase NS5A và NS5B, dẫn đến đáp ứng virus dài hơn, thời gian điều trị
ngắn hơn, được dùng đường uống và có ít tác dụng phụ hơn [21]. Sự ra đời
của DAAs đã giúp tăng hiệu quả điều trị lên đáng kể, tỷ lệ đáp ứng virus đối


6

với genotype 1 từ 40% lên tới 90%, giúp giảm tỷ lệ biến chứng, tử vong do
HCV trong những năm gần đây [2].
1.2.

Virus viêm gan C


1.2.1. Cấu trúc hạt virus viêm gan C
Virus viêm gan C thuộc họ Flaviviridae, chi Hepacivirus. HCV có dạng
hình cầu, đường kính 40 – 80 nm trong cơ thể vật chủ [22] hoặc 60 – 75 nm
trong tế bào nuôi cấy [23]. Cấu tạo hạt HCV bao gồm lớp vỏ envelope ở
ngoài cùng có các glycoprotein E1 và E2, một capsid gồm 20 mặt bao bọc
quanh một sợi RNA mạch đơn [23].

Hình 1.2. Cấu trúc HCV [24]
Trong máu, HCV tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau: dạng liên kết
Lipoprotein (LVP) bao gồm Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) và Lipoprotein
tỷ trọng rất thấp (VLDL), dạng liên kết với kháng thể và dạng tự do [25],[26].
Vai trò chính xác của việc hình thành LVP vẫn còn chưa rõ ràng, nhưng
dường như chúng giúp virus xâm nhập vào tế bào chủ (vì các hạt HCV sử


7

dụng thụ thể liên quan đến sự hấp thu lipid) và có khả năng giúp virus trốn
tránh hệ thống miễn dịch của vật chủ (Lipoprotein bao quanh bảo vệ virus
khỏi sự nhận dạng của kháng thể) [27].
1.2.2. Cấu trúc bộ gen virus viêm gan C
HCV có bộ gen là một sợi RNA dương tính bao gồm một khung đọc mở
dài 9,6 kb (ORF) được bắt đầu và kết thúc bởi các vùng không dịch mã 5’ và
3’ (UTRs). Vùng 5’ UTR được bảo toàn cao, 3’ UTR có một chuỗi biến đổi
ngắn poly U và một phần tử được bảo toàn cao.

Hình 1.3. Cấu trúc bộ gen HCV [28]
Core, p7, E1, E2 là các gen protein cấu trúc mã hóa cho các protein
nucleocapsid, protein xuyên màng , gp35 và gp72. Trong quá trình nhân lên,
ORF HCV được chuyển thành một polyprotein mạch đơn (khoảng 3.000 axit

amin), sau đó được cắt bởi protease tế bào chủ và protease virus được mã hoá
bởi các gen không cấu trúc NS2, NS3 và NS4A. Gen NS3 còn mã hoá cho
một helicase đóng vai trò trong quá trình nhân lên của virus. NS5A là một
phosphoprotein đa chức năng. Nó là thành phần quan trọng của phức hợp
nhân bản và liên kết với các thành phần khác của phức hợp, bao gồm RDRP,
RNA, và cyclophilin A – một protein cần thiết cho sự nhân lên của RNA
HCV. NS5A còn đóng vai trò trong việc lắp ráp hạt virus. NS5B là RNA


8

polymerase phụ thuộc RNA (RDRP) thiếu hoạt tính sửa chữa, dẫn đến có tỷ
lệ đột biến cao trong quá trình nhân lên và hình thành nên các biến loài [28].
1.2.3. Các kiểu gen virus viêm gan C
Kể từ khi HCV được phát hiện vào cuối những năm 1980, 6 genotype
chính đã được công nhận, genotype 1 đến 6. Các kiểu gen 1, 2, 3, 4 và 6 lại
được chia nhỏ thành nhiều loại kiểu gen phụ. Các kiểu gen khác nhau ≥ 30%
số nucleotide, trong khi các kiểu gen phụ trong cùng một kiểu gen có sự khác
biệt thường từ 15% đến 25% [29],[30]. Gần đây, một kiểu gen mới có bộ gen
khác với 6 kiểu gen trước đây đã được phát hiện và được đặt tên là kiểu gen
7, đồng thời cũng được phân loại là kiểu gen phụ 7a. Tổng kết lại tới nay
HCV đã được phân ra làm 7 kiểu gen và 67 kiểu gen phụ khác nhau [30].

Hình 1.4. Cây phát sinh chủng loại HCV [30]
Sự phân bố toàn cầu các kiểu gen của HCV rất đa dạng, phản ánh sự
khác biệt về dịch tễ học, bao gồm cả thời gian, phương thức lây truyền và
chủng tộc. Các kiểu gen HCV 1, 2 và 3 phân bố khá rộng, trong khi kiểu gen


9


4, 5 và 6 chỉ tập trung ở một số vùng địa lý cụ thể [31],[32]. Kiểu gen 1 có
phân bố địa lý rộng nhất, nó là kiểu gen phổ biến nhất ở hầu hết các nước Bắc
Mỹ [33], Bắc và Tây Âu [34],[35], Nam Mỹ, Châu Á và Australia [36]. Trước
những năm 1990, ở Đông và Nam Âu, kiểu gen 1b và 2 là nổi bật [37],[38],
[39], nhưng dữ liệu trong thập kỷ qua cho thấy đã có sự biến chuyển. Các
nghiên cứu từ Ba Lan [37], Estonia [38] và Hy Lạp [39] báo cáo tăng tỷ lệ
kiểu gen 3a, giảm kiểu gen 1b và/ hoặc kiểu gen 2 theo thời gian. Sự phân bố
kiểu gen 4, 5, 6 hạn chế hơn. Kiểu gen 4 được tìm thấy chủ yếu ở Châu Phi
[40] và Trung Đông [41],[42]. Kiểu gen 5 hầu như chỉ được tìm thấy ở Nam
Phi [43]. Kiểu gen 6 tập trung chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á , trong đó có
Việt Nam [44] và cũng phổ biến ở Hồng Kông [45], Nam Trung Quốc [46].
Tại Việt Nam, các kiểu gen phổ biến là 1, 2 và 6. Trong một nghiên cứu
về dịch tễ học kiểu gen của HCV tại Việt Nam, tỷ lệ các kiểu gen 1, 2 và 6
chiếm hầu hết các trường hợp và lần lượt là 58,4%; 13,1%; 23,9% [47].

Hình 1.5. Sự phân bố kiểu gen HCV trên toàn thế giới [48]
1.3.

Vai trò xác định kiểu gen HCV trong điều trị


10

Hiện nay lựa chọn đầu tay trong điều trị viêm gan virus C là các thuốc
DAAs, nhắm mục tiêu trực tiếp vào các protein không cấu trúc liên quan
đến sự nhân lên của virus ( NS3 – 4A, NS5A, NS5B). Tuy nhiên, khả năng
đáp ứng của các kiểu gen HCV khác nhau với DAAs cũng có thể khác
nhau. Ví dụ: tỷ lệ đáp ứng virus bền vững sau khi sử dụng Sofosbuvir/
Ribavirin với kiểu gen 2 lớn hơn với kiểu gen 3 ít nhất 30% trên các bệnh

nhân xơ gan và bệnh nhân thất bại điều trị với Interferon α/ Ribavirin [49].
Với kiểu gen 1, việc xác định kiểu gen phụ 1a và 1b cũng rất quan trọng
trong việc lựa chọn DAAs để điều trị. Đáp ứng điều trị với các thuốc ức chế
protease (Simeprevir, Paritaprevir,…) có thể phụ thuộc vào từng loại kiểu gen
phụ này, cụ thể tỷ lệ đáp ứng virus bền vững đối với các thuốc ức chế
protease trên 1b cao hơn 15% so với trên 1a. Bên cạnh đó, các cá nhân bị
nhiễm kiểu gen phụ 1a có thể chứa các virus đột biến có khả năng chống lại
các thuốc ức chế protease, đặc biệt là đột biến điểm trong NS3 dẫn đến sự
thay đổi glutamine – tolysine ở axit amin 80, hoặc trong Q80K, làm cho virus
có khả năng đề kháng với Simeprevir. Bởi vậy, với các bệnh nhân mang kiểu
gen phụ 1a, khuyến cáo thử nghiệm thêm cho Q80K để lựa chọn phác đồ
thuốc điều trị phù hợp cho bệnh nhân [50], [51]. Ngoài ra, việc xác định kiểu
gen của HCV rất quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị bằng thuốc
và tiên lượng về khả năng đáp ứng điều trị đối với Interferon/ Ribavirin, các
thuốc lựa chọn thứ 2 sau DAAs [50].


11

Hình 1.6. Đích tác dụng của thuốc DAAs [52]
1.4.

Các phương pháp xác định kiểu gen HCV
Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định kiểu gen và kiểu gen phụ

của HCV. Các xét nghiệm dựa trên trình tự 5’UTR thường được chấp nhận
đối với việc xác định kiểu gen nhưng xác định kiểu gen phụ lại thường dựa
vào phân tích các gen NS5B, Core, và/ hoặc Core – E1 để đạt độ chính xác
cao hơn.
1.4.1. Phương pháp lai đầu dò (Line Probe Assay – LiPA)

Kỹ thuật lai đầu dò hướng đến gen đích là 5’ – UTR HCV. Sau khi gen
được khuếch đại bằng các mồi đặc hiệu, sản phẩm được lai với một màng có
các đầu dò đặc hiệu gen và được phát hiện bằng máy dò màu hoặc quan sát
bằng mắt.
Mặc dù gen 5’ – UTR có độ bảo tồn cao, việc xác định kiểu gen HCV
dựa trên 5’ – UTR là chính xác cho hầu hết các kiểu gen nhưng đã có nghiên
cứu lưu ý rằng các phương pháp dựa trên việc sử dụng 5’ – UTR xác định sai


12

các kiểu gen phụ 6c đến 6l [28]. Một tỷ lệ đáng kể các kiểu gen phụ 1a phân
lập được bởi LiPA dưới dạng 1b. Phân tích trình tự cho thấy sự khác biệt duy
nhất trong đoạn gen 5’UTR ở các kiểu gen phụ 1a với 1b được phân loại sai
là một nucleotide (A / G) ở vị trí 99 của bộ gen HCV [52]. Phương pháp này
chưa đủ độ tin cậy cho phân loại kiểu gen phụ.
1.4.2. Realtime PCR
Phương pháp này sử dụng Realtime PCR và nhiều đầu dò thủy phân
trong ba phản ứng khác nhau để phát hiện tất cả các HCV, phân biệt các kiểu
gen và kiểu gen phụ. Phản ứng dựa vào các gen đích 5’ – UTR hoặc Core để
phân biệt kiểu gen và NS5B để phân biệt kiểu gen phụ [53]. Với phương
pháp này, có thể xác định được đa nhiễm nhiều kiểu gen. Tỷ lệ không xác
định là khoảng 2% với hầu hết các vấn đề phát sinh từ việc xác định kiểu gen
3. Không thể phân biệt được các kiểu gen phụ của kiểu gen 1 trong khoảng
5% các trường hợp [54].
1.4.3. Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger
Năm 1977, Frederick Sanger phát triển công nghệ giải trình tự DNA dựa
trên phương pháp chấm dứt chuỗi (còn gọi là giải trình tự Sanger). Do hiệu
quả cao và tính phóng xạ thấp nên giải trình tự Sanger đã được công nhận là
công nghệ chính trong "giải trình tự gen thế hệ thứ nhất" ứng dụng trong cả

phòng thí nghiệm và các kit thương mại [55].
Các kiểu gen của HCV được xác định dựa trên phân tích trình tự gen
NS5B. RNA của virus sau khi được tách chiết sẽ được chuyển sang dạng
cDNA nhờ phản ứng sao chép ngược (Reverse Transcription PCR– RT PCR).
Các cDNA sau đó được dùng làm khuôn để nhân đoạn NS5B bằng cặp mồi
Sc2 và Ac2. Sản phẩm PCR vòng một (sử dụng cặp mồi Sc2, Ac2) được tiếp tục
dùng làm khuôn cho phản ứng Nested PCR với cặp mồi S7, A5. Sản phẩm Nested
PCR có kích thước bé hơn sản phẩm PCR vòng 1 và được tinh sạch, dùng làm


13

khuôn cho phản ứng PCR sequencing và giải trình tự gen trên máy giải trình tự.
Trong phản ứng sequencing, quá trình sao chép sợi DNA được tổng hợp
từ đầu 3’, vì có một nhóm OH tại vị trí cacbon số 3 được dùng để nối các
nucleotide tiếp theo thông qua liên kết với nhóm phosphat ở vị trí cacbon số
5. Các nucleotide bị khuyết nhóm OH tại vị trí các bon số 3 được gọi là
dideoxy nucleotide (ddDNA), và những nucleotide này đóng vai trò kết thúc
sự kéo dài của sợi DNA mỗi khi chúng được gắn vào. Mỗi dideoxy nucleotide
(ddCTP, ddATP, ddTTP, ddGTP) đều được gắn một loại dye huỳnh quang có
màu khác nhau nhằm mục đích để phân biệt khi chúng phát quang. Khi bốn
loại ddNTP đã gắn dye huỳnh quang này tiếp xúc với tia UV laser, chúng sẽ
hấp phụ tại các bước sóng khác nhau, sau đó được phát hiện và ghi lại bởi một
sensor đặt trên máy DNA sequencer.
Trong mỗi ống PCR, thành phần phản ứng bao gồm: (1) Bigdye (có
chứa Taq DNA polymerase, dNTPs thông thường, ddNTPs đã được đánh dấu
huỳnh quang và khuyết nhóm OH, (2) một đoạn mồi, (3) DNA khuôn (sản
phẩm PCR đã tinh sạch), và (4) nước. Thông thường, nồng độ của dNTPs
trong ống phản ứng phải cao hơn nồng độ ddNTPs. Nếu bổ sung 100%
ddNTPs, Taq polymerase sẽ gắn một ddNTP vào phía trước đoạn mồi và khi

đó phản ứng kéo dài sợi ADN sẽ dừng lại. Mặt khác, khi bổ sung 100%
dNTPs, sợi ADN sẽ được tổng hợp liên tục mà không có cơ hội để gắn các
ddNTP vào sợi ADN. Do vậy, Big Dye có chứa hỗn hợp dNTPs và ddNTPs
với tỷ lệ tối ưu là 100:1, và với tỷ lệ này, mỗi khi polymerase gắn một
nucleotide vào sợi DNA, cũng sẽ là cơ hội để gắn một ddNTP. Việc lặp lại
nhiều chu kỳ PCR sẽ tạo ra nhiều sợi DNA có chiều dài dao động từ vị trí mồi
cộng thêm một nucleotide tới vị trí mồi cộng tất cả các nucleotide. Do sản
phẩm DNA tổng hợp đã được đánh dấu bằng các loại dye huỳnh quang khác
nhau, trình tự sợi DNA tính từ đầu 3’ được xác định bằng cách phân tách các
đoạn sản phẩm trên gel acrylamide và quét trên máy đọc huỳnh quang để phát


14

hiện các ddNTP gắn huỳnh quang trên sợi DNA. Trình tự DNA sau đó được
xử lý và đưa lên trên hệ thống dữ liệu HCV để tìm ra kiểu gen tương đồng
nhất với mẫu HCV đích.
Phương pháp này là tiêu chuẩn vàng để định type HCV, có thể xác định
chính xác kiểu gen và kiểu gen phụ của HCV, kể cả các kiểu gen hiếm gặp (chiếm
tỷ lệ < 10%). Tuy nhiên, chúng yêu cầu cần có các thiết bị chuyên dụng, phần
mềm phân tích, chi phí cao, thời gian để có kết quả dài hơn so với các phương
pháp khác, và hạn chế khi có đồng nhiễm hay đa nhiễm nhiều kiểu gen HCV [28].
1.4.4. Giải trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing)
Phương pháp Sanger tự động ra đời đã mang đến nhiều thành tựu lớn.
Tuy nhiên, những hạn chế của phương pháp cho thấy cần phải có công nghệ
mới và cải tiến hơn để sắp xếp một số lượng lớn bộ gen của người và các bộ
gen khác. Vào cuối những năm 20 và đầu thế kỷ 21, đã có những nỗ lực nhằm
phát triển các phương pháp mới để thay thế cho phương pháp Sanger, các
phương pháp mới hơn được gọi là NGS (Next Generation Sequencing). Sự
tiến bộ lớn của NGS là khả năng tạo ra khối lượng dữ liệu khổng lồ, cũng như

khả năng cung cấp thông tin về bộ gen chính xác, nhanh chóng và không tốn
kém [57].
1.4.4.1. Nguyên lý
NGS sử dụng nguyên lý khác với phương pháp cổ điển của Sanger. Một
trong những công nghệ hiện nay hay dùng là Illumina với nguyên lý tổng hợp
nucleotid (Sequencing By Synthesis  –  SBS), theo dõi việc bổ sung các
nucleotide đã được gắn nhãn một cách song song, ồ ạt. Một lần chạy có thể
cung cấp dữ liệu đầu ra từ 300 kilobase lên đến 1 terabase, tùy thuộc vào loại
dụng cụ và cấu hình máy.
Đầu tiên, các phân tử DNA sẽ được tinh sạch rồi cắt thành các đoạn ngắn
ngẫu nhiên, gắn adapter vào hai đầu, sau đó gắn lên bề mặt của tế bào dòng
chảy (flow cell), tạo thành các cầu và được khuếch đại lên nhiều lần thành các


15

cụm DNA. Các cầu sẽ được cắt thành mạch thẳng và biến tính tạo mạch đơn.
Từ mạch đơn các nucleotid tự do đã được đánh dấu huỳnh quang sẽ gắn vào
theo nguyên tắc bổ sung, và tín hiệu huỳnh quang từ các nucleotis sẽ được
máy ghi nhận lại. Sau khi một hình ảnh được hoàn thành, các tế bào dòng
chảy di chuyển vào vị trí kế tiếp. Quá trình này được lặp lại cho mỗi chu trình
sắp xếp. Khi quá trình chạy hoàn tất, dữ liệu được tự động phân tích phần
mềm và kết nối với máy tính để thực hiện phân tích.

Hình 1.7. Quy trình giải trình tự gen bằng NGS
1.4.4.2. Ứng dụng NGS trong giải trình tự gen HCV
Các đoạn gen đích hay được ứng dụng để xác định kiểu gen HCV là
5’UTR, Core và NS5B. Tuy nhiên, 5’UTR chỉ cho phép xác định đến kiểu
gen mà không cho ra được kết quả kiểu gen phụ chính xác. Core và NS5B là
2 vùng hay được ứng dụng nhất để xác định kiểu gen HCV. Giải trình tự Core

hay NS5B được xem như tiêu chuẩn vàng trong xác định kiểu gen HCV do có
thể cho kết quả chính xác đến kiểu gen phụ [58]. Trong đó vùng NS5B là
vùng thiếu khả năng sửa chữa, do đó hay xuất hiện các đột biến tạo ra những
biến loài hay type mới hơn [28].
Kỹ thuật NGS đã được ứng dụng thành công trong giải trình tự gen


16

HCV. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng xác định kiểu gen HCV bằng NGS có độ
chính xác như phương pháp Sanger – tiêu chuẩn vàng của định type HCV.
Mặt khác, NGS giúp tiết kiệm chi phí, thời gian và giải trình tự lớn hơn, đồng
thời còn giúp phát hiện đa nhiễm nhiều chủng HCV khác nhau mà Sanger
không làm được [57].

CHƯƠNG 2


17

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
-

Đối tượng: mẫu huyết tương bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt

đới Trung ương năm 2015 được chẩn đoán nhiễm virus viêm gan C.
-

Tiêu chuẩn lựa chọn:

Mẫu huyết tương của bệnh nhân đã được chấn đoán nhiễm virus viêm

gan C bằng phương pháp Realtime RT PCR tự động Cobas Taqman của hãng
Roche có tải lượng virus ≥ 10 3 copies/ ml.
- Cỡ mẫu nghiên cứu: 57 mẫu huyết tương.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
- Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện.
2.3. Quy trình nghiên cứu

B ệnh nhân đến khám
A n t iH C V d ư ơ n g t í n h
Đ o t ả i lư ợ n g v i r u s H C V ≥ 1 0 3 c o p ie s / m l
G i ả i t r ìn h tự g e n H C V b ằ n g S a n g e r v à N G S
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu
Mẫu huyết tương của bệnh nhân đến khám sau khi được chẩn đoán xác
định nhiễm HCV mạn tính sẽ được bác sĩ lâm sàng chỉ định đo tải lượng
virus. Tải lượng HCV của bệnh nhân được xác định bằng phương pháp tự
động Cobas Taqman của hãng Roche. Chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu
huyết tương bệnh nhân có tải lượng virus ≥ 10 3 copies/ ml để giải trình tự


18

đoạn gen NS5B bằng 2 phương pháp Sanger và NGS (Phụ lục 1).
Trình tự gen sau đó sẽ được đưa lên phân tích bằng phần mềm NS5B
DeepCheck HCV trên BasepSpace Illumina.
2.4. Thiết kế nghiên cứu
Quy trình được thực hiện song song bởi 2 người.
Kỹ thuật viên 1

Lô 2

Kỹ thuật viên 2
Lô 3

Lô 4
ô

Chạy lần 1

Chạy lần 2

Hình 2.2. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu viên sẽ tiến hành thực hiện trên 4 lô mẫu huyết tương:
 Có 9 mẫu huyết tương sẽ được lặp lại ở mỗi lô.
 48 mẫu độc lập còn lại được chia đều vào mỗi lô.
Như vậy, với mỗi lô xét nghiệm sẽ có 23 mẫu: 9 mẫu lặp lại, 12 mẫu độc
lập và 1 chứng âm, 1 chứng dương.
- Kiểm soát chất lượng (Nội kiểm):
Bảng 2.1. Nội kiểm quy trình xét nghiệm
Nội dung nội kiểm
So sánh kết quả
Nội kiểm kĩ thuật của kĩ -9 mẫu lặp lại của lô 1 và lô 2 với lô 3 và lô 4
thuật viên
Nội kiểm mỗi lần chạy -9 mẫu lặp lại ở lô 1, lô 2, lô 3 giữa 2 lần chạy 1
và 2.
Nội kiểm lô
-9 mẫu lặp lại ở lô 1 với lô 2, lô 3 với lô 4.
Nội kiểm phương pháp -57 mẫu NGS với Sanger
Kiểm tra nhiễm chéo

-Chứng âm dương tính.