BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

CHÈN §O¸N TR¦íC LµM Tæ MéT Sè BÖNH
DI TRUYÒN LI£N KÕT NHIÔM S¾C THÓ GIíI
TÝNH
B»NG Kü THUËT MICROSATELLTE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

CHÈN §O¸N TR¦íC LµM Tæ MéT Sè BÖNH
DI TRUYÒN LI£N KÕT NHIÔM S¾C THÓ GIíI
TÝNH
B»NG Kü THUËT MICROSATELLTE
Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số: 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Tạ Thành Văn
2. PGS.TS. Trần Vân Khánh


HÀ NỘI - 2018


LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Bùi Thị Minh Phượng, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học
Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của Thầy GS.TS. Tạ Thành Văn và Thầy PGS.TS. Trần Vân Khánh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi
nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này./.
Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018
NGƯỜI VIẾT CAM ĐOAN

Bùi Thị Minh Phượng


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
PGD


Preimplantation Genetic Diagnosis

IVF

In Vitro Fertilization

ICSI

Intracytoplasmic Sperm Injection

DMD

Duchenne Muscular Dystrophy

BMD

Becker Muscular Dystrophy

BVSKTE

Bảo vệ sức khoẻ trẻ em

MLPA

Multiplex Ligation Probe Amplification

FISH

Fluorescent In Situ Hybridization


PCR

Polymerase Chain Reaction

RT – RCR

Reverse Transcription PCR

NST X

Nhiễm sắc thể X

NST Y

Nhiễm sắc thể Y

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

RNA

Ribo Nucleic Acid

CK

Creatine Kinase

KB


Kilo Base

STR

Short Tandem Repeat


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................4
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A....................................4
1.1.1. Định nghĩa.........................................................................................4
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu............................................................................4
1.1.3. Dịch tễ bệnh học................................................................................4
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh Hemophilia A......................5
1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A....7
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh Hemophillia A...............................................7
1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A..............................................9
1.3. NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A......................13
1.3.1. Đặc điêm chung người mang gen bệnh...........................................13
1.3.2. Cơ chế di truyền của người mang gen bệnh hemophillia A............14
1.3.3. Triệu chứng của người mang gen....................................................15
1.3.4. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh.................16
1.4. PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM VÀ QUY
TRÌNH CHẨN ĐOÁN GEN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI......................20
1.4.1. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm.........................................20
1.4.2. Quy trình chẩn đoán gen trước chuyển phôi...................................22
1.4.3. Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng

trong việc sàng lọc phôi......................................................................27
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
VỀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ..................................................39
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam........................39
1.5.2. Tình hình nghiên cứu chẩn đoán trước làm tổ một số bệnh lý di
truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính hemophillia A........................43


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........47
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU...............................................................47
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU......48
2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị.................................................................48
2.2.2. Hoá chất...........................................................................................50
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................................54
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................54
2.3.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................55
2.3.3. Địa điểm nghiên cứu........................................................................55
2.3.4. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.......................55
2.3.5. Quy trình chẩn đoán trước làm tổ....................................................56
2.4. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU TRONG Y HỌC.......................................62
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................63
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MARKER DỊ HỢP TỬ GEN F8 TRÊN BỆNH
NHÂN VÀ NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH BẰNG KỸ THUẬT
MICROSATELLITE DNA...................................................................63
3.1.1. Xác định marker đồng hợp tử và dị hợp tử......................................63
3.1.2. Phân bố tần số alen..........................................................................65
3.2. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN F8 BỊ ĐỘT
BIẾN BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITEDNA.........................69
3.2.1. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
microsatellite DNA ở gia đình HA 09.................................................69

3.2.2. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite
DNA ở gia đình HA16 trên các thành viên gia đình bệnh nhân.................73
3.2.3. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite
DNA ở gia đình HA30 trên các thành viên gia đình bệnh nhân..................77
3.2.4. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
microsatellite DNA ở gia đình HA37..................................................81
3.2.5. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật


microsatellite DNA ở gia đình HA50..................................................83
3.2.6. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
microsatellite DNA ở gia đình HA60..................................................85
3.3. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA..................................87
3.3.1. Kết quả kích thích buồng trứng và thực hiện ICSI..........................87
3.3.2. Kết quả chẩn đoán tiền làm tổ của các gia đình hemophillia A.......90
3.3.3. Kết quả chẩn đoán tiền làm tổ bằng kỹ thuật microsatellite DNA của
gia đình hemophilia A HA 28..............................................................98
3.3.4. Kết quả chẩn đoán tiền làm tổ bằng kỹ thuật microsatellite DNA của
gia đình hemophilia A HA 26............................................................107
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN...........................................................................110
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MARKER DỊ HỢP TỬ GEN F8 TRÊN BỆNH
NHÂN VÀ NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH BẰNG KỸ THUẬT
MICROSATELLITE DNA.................................................................112
4.2. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH
HEMOPHILLIA A..............................................................................116
4.2.1. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophillia A bằng
kỹ thuật Microsatellite-DNA.........................................................116
4.2.2. Tỷ lệ phát hiện được người lành mang gen bệnh..........................126
4.3. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ....................................129

KẾT LUẬN..................................................................................................139
CÁC DANH MỤC CÔNG TRINH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1:

Trình tự các mồi khuếch đại STRs sử dụng trong nghiên cứu....59

Bảng 2.2:

Thành phần hóa chất sử dụng cho điện di mao quản..................61

Bảng 3.1:

Phân bố tần suất alen của 4 locus STR trên nhiễm sắc thể X.....65

Bảng 3.2:

So sánh kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng 2
phương pháp...............................................................................86

Bảng 3.3:

Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
Microsatellite-DNA....................................................................87


Bảng 3.4:

Kết quả đánh giá về tỷ lệ phôi phát triển sau khi thụ tinh..........87

Bảng 3.5:

Kết quả sinh thiết phôi chẩn đoán gen và đánh giá sự phát triển
phôi sau sinh thiết 3 ngày............................................................88


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1:

Tần suất alen của marker FXS 1108........................................66

Biểu đồ 3.2:

Tần suất alen của marker DXS 9897.......................................66

Biểu đồ 3.3:

Tần suất alen của marker F8int22...........................................67

Biểu đồ 3.4:

Tần suất alen của marker DXS9901........................................67

Biểu đồ 3.5:


Kết quả đồng hợp tử và đồng hợp tử của STR........................68


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:
Hình 1.2:
Hình 1.3:
Hình 1.4:
Hình 1.5:
Hình 1.6:
Hình 1.7:
Hình 1.8:
Hình 1.9:
Hình 1.10:
Hình 1.11:
Hình 1.12:
Hình 1.13:
Hình 1.14:
Hình 1.15:
Hình 1.16:
Hình 1.17:
Hình 1.18:
Hình 1.19:
Hình 1.20:
Hình 1.21:
Hình 2.1:
Hình 3.1:
Hình 3.2:


Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophillia A...........5
Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophillia A............6
Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau............................8
Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương....9
Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X............................10
Cấu trúc của gen F8....................................................................10
Cấu trúc của protein yếu tố VIII.................................................11
Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng...............................11
Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh....14
Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh....14
Sơ đồ phả hệ của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường 17
Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh....18
Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm..........................22
Sinh thiết phôi bào giai đoạn blastomere cho chẩn đoán PGD...24
Nguyên lý kỹ thuật của phương pháp FISH...............................25
Ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán xác định giới tính
và số lượng nhiễm sắc thể...........................................................29
Ứng dụng kỹ thuật FISH trong chẩn đoán PGD xác định xóa
đoạn exon trên gen dystrophin....................................................30
Kết quả multiplex PCR sử dụng cặp mồi amel, SYR, FXS1108,
DXS 9798, trên phôi bào sinh thiết chẩn đoán bệnh hemophilia A. 35
Sơ đồ phả hệ của một gia đình mang gen đột biến đảo đoạn
intron22 gây bệnh Hemophillia A...............................................44
Hình ảnh các marker dị hợp tử xác định đột biến gen F8 gây
bệnh Hemophillia A....................................................................45
Kết quả multiplex PCR sử dụng cặp mồi amel, SYR, FXS1108,
DXS 9798, trên phôi bào sinh thiết............................................46
Minh họa kết quả xác định giới tính bằng hai cặp mồi Amel và SRY. .60
Kết quả khuếch đại STR lựa chọn marker đồng hợp tử.............63
Kết quả dị hợp tử khuếch đại các vùng STR.............................64



Hình 3.3:
Hình 3.4.
Hình 3.5.
Hình 3.6:
Hình 3.7.
Hình 3.8.
Hình 3.9.
Hình 3.10.
Hình 3.11:
Hình 3.12:
Hình 3.13.
Hình 3.14.
Hình 3.15.
Hình 3.16.
Hình 3.17:
Hình 3.18:

Hình 3.19.
Hình 3.20.
Hình 3.21.
Hình 3.22.
Hình 3.23.
Hình 3.24.

Sơ đồ phả hệ gia đình HA 09......................................................69
Ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA09.........................70
Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901,
F8in22, DXS9897 của gia đình mã số HA09.............................71

Sơ đồ phả hệ gia đình HA 09 .....................................................72
Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA16..........................................73
Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA16.................74
Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và
DXS9897 của gia đình HA16.....................................................75
Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA16.....................................76
Sơ đồ phả hệ gia đình HA30 trước khi phân tích.......................77
Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số HA3078
Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS1108,
DXS 9901 của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA30..79
Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân HA30.....................................80
Ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA37.........................81
Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và
DXS 9897 của gia đình mã số HA37..........................................82
Hình ảnh giải trình tự gen gia đình HA50..................................83
Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS1108,
DXS 9897 và DXS 9901 của gia đình bệnh nhân hemophilia A
mã số HA50................................................................................84
Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS 9897, và
DXS 9901 của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA60..85
Sơ đồ phả hệ gia đình HA 61......................................................90
Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA61.................91
Kết quả single PCR khuếch đại các vùng STR của người mẹ....92
Kết quả multiplex PCR khuếch đại các vùng STR của người mẹ....92
Kết quả multiplex PCR khuếch đại 3 marker dị hợp tử FXS1108,
DXS9897 và F8int22 và 2 marker giới tính Amel và SRY trên
mẫu bệnh nhân............................................................................93


Hình 3.25.


Hình 3.26:
Hình 3.27.
Hình 3.28.
Hình 3.29:
Hình 3.30.
Hình 3.31.
Hình 3.32.
Hình 3.33.
Hình 3.34.
Hình 3.35.
Hình 3.36.
Hình 3.37.
Hình 3.38.
Hình 3.39.

Kết quả multiplex PCR khuếch đại 3 marker dị hợp tử 3 marker dị
hợp tử FXS1108, DXS9897 và F8int22 của người mẹ so sánh với
bệnh nhân....................................................................................94
Sơ đồ phả hệ gia đình HA 61......................................................95
Kết quả multiplex PCR xác định phôi nam bình thường............96
Kết quả multiplex PCR xác định phôi nam bệnh lý...................97
Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA28.................98
Kết quả single PCR khuếch đại các vùng STR của người mẹ....99
Kết quả multiplex PCR khuếch đại các vùng STR của người mẹ.100
Kết quả multiplex PCR khuếch đại 2 marker dị hợp tử FXS1108,
DXS9897 và 2 marker giới tính Amel và SRY trên mẫu bệnh nhân. .101
Kết quả multiplex PCR khuếch đại 2 marker dị hợp tử FXS1108
và DXS9897 của người mẹ so sánh với bệnh nhân..................102
Kết quả multiplex PCR xác định phôi nam bình thường..........103

Kết quả multiplex PCR xác định phôi nam bệnh lý.................104
Kết quả multiplex PCR xác định phôi nữ mang gen................105
Kết quả multiplex PCR xác định phôi nữ không mang gen....106
Kết quả multiplex PCR xác định phôi nam 1 bình thường với
STR DXS9901 và DXS9897....................................................108
Kết quả multiplex PCR xác định phôi nam 2 bệnh lý với STR
DXS9901 và DXS9897.............................................................109


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày càng gia
tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng. Ra đời vào những năm 1970 của thế
kỷ trước, có thể nói phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm “in vitro
fertilization – IVF” đã trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vô sinh
mong muốn có đứa con [1]. Vào năm 2010 bác sỹ Robert G.Edwards đã vinh
dự trao giải thưởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn và
hiệu quả mà phương pháp này mang lại [2]. Phương pháp này đã mang lại
niềm vui, niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy
nhiên không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh được những đứa con
mong muốn bằng phương pháp này. Bởi tỷ lệ thành công của phương pháp này
chỉ đạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia [3]. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến
sự thành công của phương pháp này như: tuổi bố mẹ, tình trạng sức khỏe, tinh
thần tâm lý, chất lượng tinh trùng và trứng… và đặc biệt chất lượng phôi sau
khi thụ tinh. Các phôi có thể bất thường NST thường hay NST giới tính đều
làm giảm khả năng mang thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung, có thể gây
sảy thai hoặc sinh ra những đứa con không khỏe mạnh [4] [5],[6],[7]. Để làm
giảm tỷ lệ sinh ra những đứa con không khỏe mạnh và làm tăng tỷ lệ thành
công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm, trong thời gian gần đây các

nhà khoa học đã áp dụng quy trình sàng lọc phôi “Pre-Implantion Genetic
Diagnosis, PGD” còn gọi là “chẩn đoán di truyền trước làm tổ” nhằm có được
những phôi tốt nhất cho quá trình chuyển phôi [8],[9],[10].


2

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng những
tiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rất
nhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thường trên NST, cả các đột biến
gen quan trọng gây ung thư đều có thể được sàng lọc bằng kỹ thuật PGD [11],
[12],[13],[14],[15]. Trong đó có bệnh lý di truyền liên kết giới tính có tỷ lệ
mắc cao với bệnh cảnh lâm sàng nặng nề, gây ra những sang chấn lớn về tâm
lý cho gia đình và cho người bệnh. Vì vậy vấn đề đặt ra là chúng ta phải làm
sao giúp cho các cặp vợ chồng hiếm muốn sinh được những đứa con hoàn
toàn khỏe mạnh.
Hemophillia A (bệnh ưa chảy máu) là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc
bất thường chức năng của các yếu tố đông máuVIII [16],[17]. Hemophillia A
là bệnh di truyền allele lặn trên NST X không có allele trên NST Y, nên người
mẹ mang gen bệnh sẽ di truyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng
[18]. Theo thống kê của tổ chức hemophillia A thế giới, hiện nay có khoảng
250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophillia A và chỉ có khoảng 50.000 được
điều trị đặc hiệu [19]. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh
hemophillia A và khoảng 30.000 người mang gen bệnh hemophilia [20]. Biểu
hiện lâm sàng chủ yếu là chảy máu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu
kéo dài: chảy máu khớp, chảy máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong
cổ và ngực… Mức độ biểu hiện trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu
tố VIII trong huyết tương.
Vì vậy việc tầm soát trước sinh bệnh hemophillia A là việc làm hết sức
quan trọng giúp cho việc sinh ra những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh, không là

gánh nặng cho gia đình và toàn xã hội. Việc xác định đột biến gen gây bệnh,
sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh hemophillia A
đã được nghiên cứu rất bài bản ở Việt Nam.Việc quản lý tốt cơ sở dữ liệu đột
biến gen, bệnh nhân và người mang gen của hai bệnh lý này là tiền đề vững chắc


3

để triển khai thành công quy trình PGD trong sàng lọc phôi. Với phương pháp
này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho người mẹ khi mang thai bệnh lý,
giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khi chẩn đoán tiền sản, mang
lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh, đồng thời giảm tỷ
lệ mắc bệnh ở cộng đồng. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, đã có rất
nhiều kỹ thuật được áp dụng để phát hiện các đột biến gây bệnh hemophillia A
như multiplex PCR, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ, FISH. Kỹ thuật
Microsatellite DNA là kỹ thuật còn khá mới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong
chẩn đoán các bệnh lý di truyền. Xuất phát từ thực tế đó đề tài: “Chẩn đoán
trước làm tổ một số bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính bằng
kỹ thuật microsatellte” được đưa vào nghiên cứu với mục tiêu:
1. Nghiên cứu sàng lọc các marker dị hợp tử gen F8 bằng kỹ thuật
microsatellite DNA phục vụ cho xác định tình trạng mang gen và
chẩn đoán trước làm tổ.
2. Xác định tình trạng người lành mang gen bệnh hemophilia A
bằng kỹ thuật microsatellite DNA
3. Chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A trên các bà mẹ có
nguy cơ.


4


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A
1.1.1. Định nghĩa
Bệnh Hemophillia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường
chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương - thiếu hụt yếu tố VIII
gây bệnh hemophilia A; thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh hemophilia B; thiếu hụt
yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A là bệnh rối loạn đông
máu di truyền hay gặp nhất [21-22].
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu
Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kết với giới tính được phát
hiện từ những năm 80 của thế kỷ 19. Vào thời điểm này, các nhà khoa học
nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho
con trai nhưng truyền gen bệnh cho con gái và người con gái này có thể
truyền gen bệnh cho con trai mình. Bệnh hemophilia A còn được biết đến như
căn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang gen bệnh
này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau.
1.1.3. Dịch tễ bệnh học
Theo thống kê của tổ chức Hemophillia thế giới (WFH), hiện nay có
khoảng 500.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophillia và chỉ có khoảng 1/3 được
chẩn đoán [23]. Tỷ lệ mắc bệnh hemophillia A gần giống nhau ở các vùng địa
lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000


5
dân.Tần suất mắc bệnh hemophillia A là 1/4000  1/5.000 trẻ trai [24]. Tại
Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000 bệnh
nhân hemophillia. Số liệu điều tra những năm 19941996 về tình hình bệnh
hemophillia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophillia là
2560/1.000.000 dân. Tại mít tinh hưởng ứng ngày Hemophillia thế giới (174-2016), hội rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máu

Trung ương đã công bố có 6000 người bị bệnh chảy máu di truyền [25].
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh Hemophilia A
1.1.4.1. Đặc điểm chảy máu trong bệnh Hemophilia A
Bệnh đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy
máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có thể tự nhiên
hoặc sau chấn thương nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu dưới da,
tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp [26].
Chảy máu khớp thường gặp nhất ở bệnh nhân hemophillia. Đây là loại
chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp
[27]. Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương. Nếu điều
trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sưng và việc điều trị
bị kéo dài tới vài ngày. Trẻ lớn có thể nhận biết được chảy máu khớp trước khi
đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp. Điều trị sớm
sẽ dự phòng được tình trạng đau mạn tính và biến dạng khớp.

Hình 1.1: Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophillia A
(Nguồn: )


6

Chảy máu trong cơ bao gồm 10-25% các trường hợp xuất huyết nặng
trong hemoglobin. Huyết khối cơ được coi là nguyên nhân chính gây ra tình
trạng khuyết tật trong chứng chảy máu. Chảy máu trong cơ cũng thường gặp
và xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương. Những cơ hay bị chảy máu là:
cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay. Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vài
ngày. Một dấu hiệu quan trọng và kín đáo trong chảy máu cơ là cảm giác
đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì. Nếu không được điều trị sớm cơ sẽ bị phá
huỷ và có thể gây liệt [23].


Hình 1.2. Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophillia A
(Nguồn: )
Ngoài ra bệnh nhân có thể bị chảy máu não, chảy máu ở các vị trí khác
nhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da. Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da có
thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị. Chảy máu miệng,
lợi và mũi cũng hay gặp. Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu.
1.1.4.2. Các xét nghiệm cận lâm sàng để chẩn đoán bệnh
Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân Hemophillia A:
- Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1
giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài…
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm hoặc không có.
+ Yếu tố von- Willebrand trong máu bình thường.
+ Số lượng tiểu cầu trong máu bình thường.


7

1.1.4.3. Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán xác định [21].
- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu.
- Dựa vào tiền sử gia đình
- Dựa vào xét nghiệm máu:
+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (prothrombin time: thời gian
prothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated Partial
Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài
> 1,5 giá trị bình thường.
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%.
+ Yếu tố von Willebrand bình thường
+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.
Chẩn đoán mức độ bệnh

Nồng độ yếu tố VIII
Mức độ

(%) (hoạt tính

Biểu hiện chảy máu

(UI/ml))
Nặng
(Chiếm 70%)

Trung bình
(Chiếm 15%)
Nhẹ
(Chiếm 15%)

Chảy máu tự nhiên không liên
<1% (<0.01)

quan đến chấn thương, thường
chảy máu ở khớp và cơ.
Chảy máu tự nhiên hoặc liên

1-5% (0.01-0.05)

> 5-40% (0.04-0.4)

quan đến chấn thương nhỏ.
Chảy máu nặng sau chấn
thương, phẫu thuật.

Chảy máu sau chấn thương
lớn hoặc phẫu thuật.

1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh Hemophillia A


8

Đây là một bệnh di truyền liên kết với giới tính: Ở nam chỉ có một NST
X nên nếu NST X mang gen bệnh thì lượng yếu tố VIII, IX tạo ra không đủ
và người đó bị bệnh hemophilia [28]. Đối với nữ giới nhờ có hai NST X
nên nếu một NST X mang gen bệnh thì gen bình thường trên NST còn lại vẫn
tổng hợp yếu tố VIII và IX bình thường. Người phụ nữ không bị bệnh nhưng
mang một gen bị bệnh sẽ truyền cho con trai và người con trai sẽ bị bệnh, nếu
truyền cho con gái thì người con gái sẽ trở thành người mang gen bệnh.

Hình 1.3: Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau
1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh
(XHXh) và 100% con trai bình thường (XHY).
2/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thường: trong một gia đình có bố bình
thường (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (người truyền bệnh) thì 50% số con
gái sẽ là người mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thường (XX), 50%
con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thường (XHY).
3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (X hXh) đồng
hợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50% con
trai bình thường (XHY). Như vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen
bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi mang
dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XHXh).



9

4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc
từ người mẹ: thường chiếm khoảng 1/3 các trường hợp hemophillia. Tỉ lệ đột
biến gây bệnh hemophillia xẩy ra là 3 x 10 6 trên gen và trên một giao tử trong
một thế hệ [31]. Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam cao
hơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ. Gần đây, người ta đã chứng
minh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến. Đột biến đảo
đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bào
mầm sinh dục nữ. Hiện tượng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thể
thứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phân
bào giảm nhiễm ở nam.
1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A
Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho thấy những hiểu
biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein yếu tố VIII, mở
đường cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophillia A và các dạng
đột biến gen F8 gây bệnh.
Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồng
yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca 2+ và phospholipid
tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thành
thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ
fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu tố
thành mạch.Việc thiếu hụt hoặc bất thường chức năng yếu tố VIII làm ngừng
trệ dòng thác đông máu theo con đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu
kéo dài, không cầm ở bệnh nhân hemophillia A.


10


Hình 1.4. Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương
1.2.2.1. Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII
Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính
X, là một trong những gen lớn nhất của người, có kích thước 186 Kb gồm 26
exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp đến 262 bp và 2 exon lớn nhất là
exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), mã hóa 9 Kb mRNA. Người đột biến
gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá trình
đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophillia A [29].

Hình 1.5: Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X
(Nguồn: www.hemophilia.com)
Gen mã hóa yếu tố VIII có chuỗi nặng với đầu cuối là N, gồm các
domain A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A 3-C1-C2 và


11

vùng B. Khi thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và
threonin. Vùng B không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình
dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII.

Hình 1.6: Cấu trúc của gen F8
(Nguồn w.w.w. nature.com/revieus/genetics)
1.2.2.2. Protein yếu tố VIII

Hình 1.7: Cấu trúc của protein yếu tố VIII
(Nguồn w.w.w. nature.com/revieus/genetics)
Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3-Cl-C2,
gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước 200 kD, chuỗi nhẹ
là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD. Cấu trúc của phức hợp này được giữ

ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ nước với yếu tố von
Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tố VIII) và Ca 2+.
Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các domain A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối
là C, gồm các domain A3-C1-C2. Vùng B được mã hóa bởi một exon lớn và
không có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết. Khi thủy phân hoàn toàn
domain B tạo thành asparagines, serine và threonine. Vùng B không cần cho


12

chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B bị cắt khỏi
chuỗi nặng của yếu tố VIII.

Hình 1.8: Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng
(Nguồn w.w.w. nature.com/revieus/genetics)
1.2.2.3. Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A
Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A. Nghiên cứu của
Oldenburg và cộng sự đã chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế nucleotid
gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%) tiếp đến là
dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và intron 22 (36,7%), còn lại là
đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 – 15%. Tùy thuộc vào kiểu và vị trí đột
biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặng nhẹ khác nhau nhau [16].
Đột biến điểm
Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen. Nghiên cứu
của Shima và cộng sự chỉ ra rằng đột biến thay thế Arginin thành Histidin tại vị
trí 372 gây biến đổi vị trí cắt của thrombin và làm quá trình hoạt hóa yếu tố
VIII bị rối loạn, hoạt tính yếu tố VIII giảm mạnh còn 3  5% [30]. Năm 2000,
Jacquemin và cộng sự đã chứng minh đột biến thay thế Serin thành Tyrosin tại
vị trí 2119 (vùng C2) làm giảm đột ngột khả năng tương tác giữa yếu tố VIII và
yếu tố vWF, dạng đột biến này thường gặp ở thể nhẹ và trung bình [31].

Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hưởng tới acid
amin Arginin, phần lớn các bệnh nhân mang đột biến này đều ở thể nặng [16-19].