BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY
LAN TỎA DI TRUYỀN

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI- 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY
LAN TỎA DI TRUYỀN
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn

Cho đề tài: Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên
bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số: 62720112
CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI – 2018


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC HÌNH


5

MỞ ĐẦU
Sinh học phân tử là một trong những lĩnh vực thu hút được nhiều sự chú
ý với khả năng áp dụng nhiều các phương pháp nghiên cứu từ các ngành khoa
học khác nhau để nghiên cứu và tìm ra các quy luật của cuộc sống. Nhờ hiểu
biết và các tiến bộ sinh học phân tử, con người đã nắm rõ hơn về cơ chế bệnh
sinh ung thư cũng như xác định được các gen quan trọng trong cơ chế ung
thư.
Ung thư dạ dày là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệ
mắc và tử vong cao. Có nhiều yếu tố gây ung thư dạ dày, trong đó yếu tố di

truyền là một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng. Hiện nay khoa học đã
tìm ra đột biến dòng mầm của gen CDH1, một trong những gen hay gặp nhất,
chiếm 30% số trường hợp mắc ung thư dạ dày di truyền.
Bài chuyên đề sau đây sẽ hệ thống hóa các phương pháp sinh học phân
tử đã và đang được sự dụng để đánh giá đột biến gen CDH1 trong bệnh ung
thư dạ dày di truyền.
1. Tổng quan về sinh học phân tử
1.1. Định nghĩa
Sinh học phân tử là một ngành trong lĩnh vực sinh học tập trung nghiên
cứu về các thành phần, cấu trúc và tương tác của các phân tử trong tế bào và
vai trò của các yếu tố này trong sinh lý bình thường của con người cũng như
trong các bệnh lý như ung thư.
1.2. Lịch sử
Ngành sinh học phân tử (SHPT) bắt đầu phát triển ra từ những năm
1930. Nhưng chỉ đến những năm 1950 thì ngành SHPT mới thực sự bùng nổ.
Trong khoảng 3 thập kỉ này, các nghiên cứu đều tập trung vào cơ chế tự nhân
lên của DNA và giải thích các hoạt động như mã hóa thông tin. Tuy ngành
này đã phát triển từ trước đó, nhưng thuật ngữ này chỉ được chính thức sử
dụng từ năm 1938 bởi nhà khoa học người Mỹ Warren Weaver, giám đốc của


6

Quỹ Rockefeller về khoa học tự nhiên [1]. Ban đầu thuật ngữ sinh học phân
tử chỉ bắt nguồn từ ý tưởng là đưa vật lý và hóa học để giải thích về các hiện
tượng cuộc sống. Bằng việc định nghĩa cuộc sống qua cơ chế lý hóa học,
ngành SHPT đã tập trung nguồn lực vào vấn đề liên quan đến đại phân tử.
Để sinh học phân tử phát triển, rất nhiều các công cụ nghiên cứu của các
lĩnh vực khác được đưa vào như vật lý, toán học, hóa học cũng nhưg các
ngành liên quan đến cuộc sống (gen, mô phôi, sinh lý, vi sinh…) Thực sự,

sinh học phân tử là một cuộc cách mạng vì đã xóa bỏ ranh giới giữa các
ngành khoa học, tạo ra một sự tương tác rộng lớn chưa từng có trong việc tìm
ra các quy luật của cuộc sống. Hai trọng tâm nghiên cứu của SHPT là đại
phân tử - (1) acid nucleic (DNA) cấu thành nên gen và (2) protein
Hiện nay với sự đi lên của các kĩ thuật, hàng loạt những bộ gen đã được
giải mã trong thời gian ngắn hơn với giá thành ngày một giảm. Nếu như đầu
thế kỉ 21, khi dự án Giải mã bộ gen người đã phải tiêu tốn chục tỷ đô la Mỹ
và để giải mã toàn bộ hệ gen cần ít nhất 100 triệu đô la Mỹ thì hiện giờ, chi
phí này đã chỉ còn 1000 đô la Mỹ [2].

Hình 1. Biểu đồ giá thành giải mã toàn bộ hệ gen qua các năm
Một ứng dụng quan trọng của SHPT ngày nay là liệu pháp gen, đặc biệt
là trong lĩnh vực ung thư và các bệnh di truyền phổ biến hoặc hiếm gặp. Sinh
học phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc giúp con người hiểu về các


7

hình thành, hoạt động và sự điều hòa của các cấu trúc trong tế bào. Điều này
giúp cho con người tìm ra những loại thuốc mới, chẩn đoán bệnh và sinh lý
của tế bào. Nhiều trung tâm biobank đã được thiết lập ở nhiều nước để các
nhà khoa học có thể tận dụng được lượng dữ liệu khổng lồ của các ngân hàng
gen này nghiên cứu và hiểu sâu sắc thêm về cơ chế sinh bệnh, từ đó đưa ra
được những phương pháp điều trị trúng đích.
1.3. Một số cột mốc quan trọng trong ngành sinh học phân tử
Những năm 1940: Avery, MacLeod và McCarty tìm ra DNA
1953: Watson và Crick phát hiện ra cấu trúc xoắc kép của DNA
1972: Thực hiện được kĩ thuật tổng hợp gen
1980s: thực hiện tái tổ hợp gen và giải trình tự gen
1983: kĩ thuật PCR được Mullis phát triển, là kĩ thuật nền của shpt

2003: hoàn thành Dự án giải mã bản đồ gen người
2015: phương pháp giải trình tự gen mới (next gen sequencing) giúp
giảm giá thành giải mã toàn bộ hệ gen xuống dưới 1000 đô la Mỹ
1.4. Ứng dụng sinh học phân tử trong ngành ung thư
Ung thư là một trong những vấn đề được quan tâm và dồn rất nhiều
nguồn lực để nghiên cứu trong những thập kỉ gần đây. Với sự phát triển của
SHPT, con người đã hiểu được nhiều các vấn đề hơn và đã ứng dụng được sự
tiến bộ của ngành SHPT trong đẩy lùi căn bệnh này. SHPT đã đóng góp vào
phát triển những các tiến cận mới trong dự phòng, chẩn đoán và điều trị. Ví
dụ như trong ung thư biểu mô tuyến đại tràng, tỉ lệ sống sau 5 năm giảm từ
90% khi khối u con khu trú xuống hơn 60% khi đã di căn vùng và chỉ còn
khoảng 5% khi đã di căn xa. Nhờ có SHPT mà một số bệnh nhân có yếu tố
gia đình được đánh giá và phát hiện đột biến gen ức chế hoặc sinh ung thư,
giúp phát hiện sớm các trường hợp có nguy cơ cao và làm tăng thời gian sống
của bệnh nhân [3]


8

Hình 2. Tỉ lệ sống sau 5 năm của các giai đoạn trong ung thư đại tràng [3]
Các liệu pháp điều trị cũng được hưởng lợi từ sự phát triển của SHPT.
Bên cạnh các biện pháp điều trị truyền thống như hóa trị, xạ trị và phẫu thuật,
liệu pháp gen cũng là một xu hướng mới được xây dựng nhờ sự hiểu biết về
các cơ chế sinh ung thư của các gen bất thường. Một trong những thành tựu
nổi bật có thể kể đến là việc sử dụng trastuzumab, một chất kháng thể đơn
dòng gắn vào receptor HER2 - một yếu tố gặp ở 25% số bệnh nhân ung thư
vú, giúp cải thiện tiên lượng sống của bệnh nhân [4, 5]


9


Hình 3. Một số thành tựu được ứng dụng từ sinh học phân tử [6]
2. Ứng dụng của sinh học phân tử trong nghiên cứu gen CDH1 và HDGC
2.1. Tổng quan về các dạng đột biến gen CDH1 và bệnh HDGC
Ung thư dạ dày (UTDD) là một bệnh do nhiều yếu tố gây nên, trong đó
khoảng 10-30% số trường hợp có tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư và 1-3%
có đột biến gen mầm CDH1 [7]. Năm 1998, Guildford là người đầu tiên chỉ ra
đột biến gen mầm CDH1 mã hóa cho protein E-cadherin trong cơ chế sinh
ung thư của một gia đình người Maori ở New Zealand [8]. Công trình nghiên
cứu của ông dựa trên kĩ thuật RT-PCR và phân tích đa hình sợi đơn (SSCP).
Sau đó một loại các công trình nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra được kết quả
này. Nhờ công sức và tiến bộ của các kĩ thuật trong SHPT, khả năng phát hiện ra
các đột biến gen CDH1 ngày càng cao. Tính đến nay đã có khoảng 155 các dạng
đột biến gây bệnh của gen mầm CDH1 đã được tìm thấy [9]. Các dạng đột biến
gen

mầm

CDH1

được

cập

nhật

/CDH1.

liên


tục

tại

website


10

Không phải cứ xuất hiện đột biện gen CDH1 sẽ biểu hiện bệnh. Nguy cơ
mắc tích lũy UTDD tính đến 80 tuổi là 70% ở nam và 56% ở nữ. Bên cạnh
đó, có thể các trường hợp có đột biến gen nhưng là lành tính, không có khả
năng gây bệnh [9]. Các dạng đột biến thường gặp là cắt đoạn protein (bao
gồm đột biến dịch khung và đột biến vô nghĩa, đột biến chỗ nối) chiếm 75%.
Còn lại 25% là đột biến sai nghĩa gây ảnh hưởng đến chức năng. Phương
pháp phân tích cơ bản có thể phát hiện được phần lớn các dạng đột biến của
gen CDH1. Tuy nhiên vẫn có tỉ lệ nhất định trường hợp không phát hiện được
đột biến khi sử dụng các phương pháp phân tích phổ thông mà cần những
phương pháp phân tích khác bên cạnh PCR thông thường để phát hiện ra
bệnh.
2.2. Tổng quan các phương pháp phân tích, cách tiếp cận chẩn đoán gen
CDH1
Bên cạnh yếu tố lâm sàng, các công cụ sinh học phân tử là điều rất cần
thiết để xác định chính xác các bất thường của hệ gen. Phát hiện đột biến gen
CDH1 và nguyên nhân gây bệnh CDH1 cần cách tiếp cận đa mô thức và vẫn
chưa có giải pháp tối ưu để đánh giá tổng thể [10, 11]. Mỗi phương pháp có
ưu nhược điểm riêng, tùy từng trường hợp mà có thể đánh giá lựa chọn
phương pháp phù hợp. Các yếu tố cần được cân nhắc để đánh giá là khả năng
áp dụng và hạn chế của các phương pháp phân tích, khả năng kinh tế, tính
chất của nghiên cứu... Ngoài ra, do yêu cầu của từng cách tiếp cận và đặc

điểm của từng nghiên cứu mà ngay từ khâu lựa chọn mô bệnh học đã có
những lưu ý nhất định để có thể nghiên cứu các đột biến.
Cách tiếp cận cơ bản để phát hiện các trường hợp có thể có đột biến gen
CDH1 có thể tham khảo biểu đồ 1. Đối tượng là những người thân của bệnh
nhân và chính những bệnh nhân được chẩn đoán HDGC bằng Hướng dẫn
đồng thuận của tổ chức International Gastric Cancer Linkage Consortium


11

(IGCLC) [12]. Những đối tượng này sẽ được tiến hành tư vấn và sàng lọc gen
CDH1. Các phương pháp có thể sử dụng có thể chỉ là PCR và sequencing
thông thường, nhưng cũng có thể cần thêm các phương pháp khác mới hơn
như MLPA, quatitative PCR (qPCR), RT-PCR, multiplex sequencing,
pyrosequencing, bisulfite sequencing … Những trường hợp phát hiện đột biến
gen sẽ cần phải đánh giá loại đột biến là sai nghĩa hay mất đoạn. Các trường
hợp gây đột biến mất đoạn thì đều là những người có nguy cơ cao mắc bệnh
và cần những biện pháp theo dõi và điều trị dự phòng dựa theo khuyến cáo
[12]. Những người có đột biến sai nghĩa thì cần xác định khả năng gây bệnh của
đột biến theo phân độ của trường Cao đẳng về Gen và hệ Gen Hoa Kỳ và Hiệp
hội Bệnh học phân tử [13].

Biểu đồ 1. Các tiếp cận cơ bản với các trường hợp UTDD gia đình [14]
Dựa theo bảng 1 về giá trị của các phương pháp phân tích, có thể thấy
những phương pháp thông thường chỉ xác định được 30% số trường hợp, 4-


12

5% còn lại cần những phương pháp chuyên sâu hơn để có thể tìm ra các đột

biến gây bệnh. Tuy vậy vẫn còn đến 50-70% số trường hợp được chẩn đoán là
HDGC nhưng chưa phát hiện được các gen gây bệnh. Đây là khoảng trống mà
khoa học vẫn chưa tìm ra. Vì vậy các nhà nghiên cứu vẫn cần tiếp tục tìm ra
các cơ chế mới và xác định được các gen gây bệnh.
Bảng 1. Ý nghĩa của các phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 [9]
Gene
CDH1

Phương pháp đánh giá

Tỉ lệ mang đột biến
gen được phát hiện

Giải trình tự gen thông thường
Phân tích đột biến mất/thêm đoạn gene

30%-50%
4%

Chưa rõ NA
3. Các kĩ thuật liên quan đến gen CDH1 và bệnh HDGC
3.1. Lựa chọn mẫu bệnh phẩm
Thông thường, các nghiên cứu có thể sử dụng nhiều dạng mô để phân
tích như máu, mẫu mô (tươi hoặc đúc trong khối nến paraffin), nước bọt, tóc
hoặc vị trí trừ da. Tuy nhiên, HDGC là một bệnh hiếm gặp, cần thu thập mẫu
trong thời gian dài và quy mô lớn. Vì vậy, việc sử dụng mô tươi là điều khá
khó khăn. Do đó bệnh phẩm được sử dụng trong các nghiên cứu thường là mô
đã được đúc trong khối nến parafin (từ mảnh sinh thiết tại vị trí tổn thương
hoặc biểu mô dạ dày bình thường), mẫu máu (có thể là mẫu mới hoặc đã được
lưu trữ) và nước bọt [15-18]. Các mẫu mô này sau đó sẽ tiến hành qua các

bước như phá màng tế bào, màng nhân; loại protein và tủa acid nucleic để lấy
ra vật chất di truyền dùng cho quá trình phân tích. Các mẫu mô thu thập được
nên được tiếp tục lưu trữ nhằm phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về sau.


13

Hình 4. Mẫu mô được bảo quản bằng paraffin
Ưu điểm của mẫu máu là dễ dàng thu thập, lưu trữ lâu dài và có thể tách
DNA cũng như RNA để phân tích [19, 20]… Tuy nhiên mô tươi được xử lý
ngâm parafin và cố định bằng formalin là phương pháp thiết thực hơn để có
thể tiến hành nhiều nghiên cứu. Trước đây khi chưa có kĩ thuật bảo quản thì
các mô thu thập được dễ bị thoái hóa sau một thời gian. Với việc ứng dụng
các hóa chất để xử lý mẫu mô thì hiện nay đã cải thiện chất lượng mẫu và thời
gian bảo quản có thể lên đến hàng thập kỉ. Chất lượng và số lượng DNA được
tách ra phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: loại và số lượng mẫu, cách cố định
mẫu, thời gian cố định, cách bảo quản… Trong đó, bước loại bỏ paraffin là
quan trọng nhất để có thể có được mẫu ưng ý sử dụng cho nghiên cứu [21].
3.2. Khuyếch đại gen
3.2.1. Kĩ thuật PCR thông thường
PCR là một kĩ thuật kinh điển, một trong những phương pháp quan trọng
nhất trong lĩnh vực SHPT để khuyếch đại DNA. Chỉ từ một lượng DNA rất ít
ban đầu, có thể ra hàng triệu bản sao để phục vụ phân tích, giải trình tự và
nhiều kĩ thuật khác trên gen [22]. Kĩ thuật cần sử dụng 2 đoạn mồi cho mỗi


14

đầu của đoạn DNA cần nhân lên, các nucleotid tự do và enzym DNA
polymerase bền với nhiệt để khuếch đại đoạn gen… Nếu chỉ khuếch đại một

lượng nhỏ DNA mẫu thì phương pháp này có độ chính xác rất cao. Ngoài ra
thời gian thực hiện nhanh, giá thành rẻ, dễ áp dụng rộng rãi cho nhiều nghiên
cứu nên được sử dụng trong việc phát hiện đột biến gen CDH1 [15, 23-25].
Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như cần có đoạn mồi
đặc trưng và dễ bị ngoại nhiễm. Một lưu ý nữa trong nghiên cứu gen CDH1 là
phương pháp này cũng không thể dùng được để phát hiện các đột biến mất
đoạn/nhân đoạn lớn, gặp trong 4-5% số trường hợp được chẩn đoán HDGC.

Hình 5. Quá trình nhân đoạn gen trong kĩ thuật PCR
3.2.2. RT-qPCR
Bên cạnh kĩ thuật PCR thông thường, RT-qPCR cũng là một phương
pháp hay được sử dụng trong các nghiên cứu về gen CDH1. Chúng thường
được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của E-cadherin – protein do gen


15

CDH1 mã hóa [20, 26]. Người mang đột biến gen CDH1 có sự giảm mức độ
biểu hiện của E-cadherin và sinh ra ung thư. Trong kĩ thuật này, vật chất di
truyền được sử dụng là mRNA, thường lấy từ mẫu máu/ mô ngấm parafin của
bệnh nhân. Sau đó mẫu bệnh phẩm được xử lý, sử dụng enzym sao chép
ngược (reverse transcriptase) để tạo cDNA, nhân đoạn cDNA mới tạo, gắn
huỳnh quang hoặc đầu dò đặc hiệu và tiến hành phân tích định lượng (hình 6).
Có thể tham khảo kết quả phân tích của một nghiên cứu trong biểu đồ 2. Theo
đó, những người mang đột biến gen mầm có mức độ biểu hiện thấp hơn
khoảng 3 lần so với những người bình thường, sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê. Ngoài ứng dụng trên, RT-qPCR cũng được một nghiên cứu sử dụng để đánh
giá giá trị của đột biến sai nghĩa, đột biến vị trí cắt và đột biến vùng intron trong
quá trình phiên mã [11, 18].


Hình 6. Mô tả quy trình của kĩ thuật RT-qPCR


16

Biểu đồ 2. Mức độ biểu hiện của E-cadherin [20]
3.2.3. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)
30-35% số bệnh nhân được chẩn đoán HDGC có thể phát hiện đột biến
gen CDH1 bằng phương pháp PCR thông thường. Tuy nhiên, nhược điểm của
các phương pháp này là không phát hiện được các đột biến xóa/thêm đoạn lớn
trong các exon, tạo ra các biến thể số lượng bản sao (Copy number variant CNV) vốn chiếm 4-5% số trường hợp HDGC. Vì vậy, với những trường hợp
không phát hiện được các đột biến có ý nghĩa, cần tiến hành phương pháp
MLPA [17].


17

Hình 7. Các dạng biến thể số lượng bản sao (CNV) [27]
Để thực hiện kĩ thuật này, đầu tiên cần biến tính DNA thành dạng sợi
đơn, lai với đoạn dò MLPA ở vị trí nhất định của cấu trúc exon cần nghiên
cứu. Đoạn dò là 2 đoạn oligonucleotid riêng biệt ở 2 đầu 5’ và 3’ có gắn
huỳnh quang của các đoạn cần nghiên cứu. Sau đó hiện tượng gắn xảy ra giữa
2 đoạn dò khi chúng có thể lai được với đoạn gen cần giải mã (hình 8). Phản
ứng PCR sau đó được tiến hành và sản phẩm được tạo ra sẽ được đánh giá
dựa trên lượng huỳnh quang đo được sau khi thực hiện PCR. Kết quả này cần
được đối chứng với một nhóm chứng để phân tích [28].


18


Hình 8. Quy trình của một phản ứng MLPA
Biểu đồ 3 thể hiện kết quả nghiên cứu về mất đoạn gen CDH1 của tác
giả Olivera. Khi đối chiếu với nhóm chứng, kết quả cho thấy ở bệnh nhân này
đã có mất đoạn gen ở exon 14,15 và 16.


19

Biểu đồ 3. Kết quả phân tích MLPA [29]
Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể so sánh với nhóm chứng và phát hiện
được hiện tượng xóa/thêm đoạn lớn. Tuy nhiên do tính chất của kĩ thuật này
mà việc phát hiện chính xác điểm gây đột biến khó chính xác. Ngoài ra kết
quả của phương pháp cũng không giúp khẳng định nguyên nhân gây hiện
tượng lặp đoạn nằm ở cấu trúc nào của DNA [28].
3.2.4. Multiplex PCR
Multiplex PCR là kĩ thuật chuyên sâu với đặc trưng là khả năng nhân lên
nhiều đoạn gen cùng một lúc với chỉ một lượng mẫu bệnh phẩm ban đầu
(hình 8). Nếu như PCR thông thường thì chỉ có thể nhân từng đoạn gen trong
một lần thực hiện kĩ thuật thì Multiplex PCR có thể nhân rất nhiều đoạn gen
phục vụ cho nghiên cứu lớn. Nhờ kĩ thuật này mà chi phí phân tích hệ gen
giảm đi đáng kể so với việc PCR từng đoạn gen đơn lẻ. Ngoài ra, những ưu
điểm quan trọng khác là giảm thời gian thao tác bằng tay, khả năng đối chứng
nội kiểm nhằm đánh giá chất lượng của PCR, xác định được chất lượng
mẫu… Tuy nhiên nhược điểm là phụ thuộc nhiều vào chất lượng của PCR
mastermix, khả năng nhân lên kém hơn và phụ thuộc vào chất lượng DNA.
Thông thường phương pháp này ít được sử dụng đại trà. Ứng dụng quan trọng
nhất của Multiplex PCR là giúp cho các nghiên cứu quy mô lớn cần phân tích
nhiều gen một lúc.



20

Hình 8. Phương pháp multiplex PCR
Tuy CDH1 được xác định là gen gây bệnh chính trong HDGC, nhưng
đột biến gen này mới chỉ chiếm khoảng 30% số trường hợp được chẩn đoán
HDGC. Có đến 50-70% số trường hợp vẫn chưa tìm được đột biến gây bệnh.
Đây có thể là đột biến của các gene khác mà các nhà khoa học vẫn chưa phát
hiện ra. Đối với những trường hợp này, cần phân tích multiplex PCR và giải
trình tự nhằm tìm ra những gen mới gây bệnh HDGC. Một số gen tiềm năng
đang được cho là có liên quan đến bệnh HDGC là CTNNA1, PALB2,
RECQL5, MSH2… [17, 30, 31]. Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào
khẳng định chắc chắn đây là các gen gây bệnh bên cạnh CDH1. Vì vậy, việc
phân tích multiplex PCR cần được thực hiện cho trường hợp HDGC nhưng
CDH1 âm tính nhằm tìm ra các đột biến gen và giúp hiểu thêm về cơ chế gây
bệnh.
3.3. Giải trình tự gen


21

3.3.1. Direct Sequencing
Giải trình tự gen trực tiếp là phương pháp kinh điển để phát hiện đột biến
gen. Các bước tiến hành tương đối tương giản. Đầu tiên DNA sợi kép được
tách thành sợi đơn, sau đó được chia làm 4 ống. Mỗi ống bao gồm một đoạn
mồi oligonucleotid, DNA polymerase và hỗn hợp 4 loại nucleotid dNTP
(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) và 1 trong 4 loại dideoxynucleotid có đánh dấu
đồng vị phóng xạ ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) để tạo các cấu trúc
kép mới. các đoạn gen sẽ được ghép đôi bằng dNTP cho đến khi ddNTP gắn
vào. Quá trình giải trình tự sẽ dừng lại tại vị trí này, tạo các đoạn DNA có độ
dài khác nhau. Sau đó mẫu này được đưa vào điện di trên môi trường gel

Polyacrylamide hoặc Agarose để giải trình tự gen (hình 9).

Hình 9. Kĩ thuật giải trình tự gen trực tiếp


22

Hình 10. Đột biến c.1212delC phát hiện bằng Direct sequencing [32]
Ưu điểm của phương pháp này là giá thành rẻ, dễ thực hiện và khả năng
phát hiện đột biến tốt. Chúng có nhược điểm là thời gian để nhận kết quả lâu,
có thể lên đến vài ngày tùy thuộc vào chiều dài đoạn gen. Ngoài ra, với các
mẫu mô được thu thập từ vị trí khối u thì độ đặc hiệu của phương pháp giảm
đi, dễ gây âm tính giả. Tuy vậy nhờ những ưu thế của phương pháp này mà
phần lớn các nghiên cứu về gen CDH1 nói riêng và gen nói chung mà chúng
vẫn là sự lựa chọn hàng đầu để phát hiện bất thường.
3.3.2. Bisulfite Sequencing
Một trong những cơ chế quan trọng khởi phát ung thư là sự thay đổi của
hệ epigenetic. Epigentic có thể hiểu đơn giản là “những thay đổi kiểu hình di
truyền ổn định ở chromosome mà không do thay đổi ở chuỗi DNA” [33].
Bình thường, epigenetic có khả năng methyl hóa DNA, thay đổi sau dịch mã,
tái cấu trúc nucleosome, điều hòa RNA không mã hóa…[34, 35]. Theo đó,
những người có biến đổi ở hệ này làm thay đổi biểu hiện của gen và mất cân
bằng hệ gen. Sự methyl hóa vùng promoter của gen có thể bật hoạt gen ức chế
sinh u, tạo điều kiện để khối u phát triển.
Một trong những phương pháp đánh giá tác động của hệ epigenetic là
bisulfite sequencing. Cơ chế của bisulphit sequencing là dùng bisulphite để


23


chuyển methyl-Cytosine thành Uracil, mức độ methyl hóa của đoạn DNA
được dựa trên mức độ methyl hóa của các cytosine. Mức độ methyl hóa càng
nhiều thì gen càng dễ bị bất hoạt. Một số nghiên cứu ghi nhận sự bất thường
của hệ này làm bất hoạt gen mầm CDH1 hoặc đóng vai trò cơ chế bất hoạt thứ
2, gây ra ung thư [11, 36, 37]

Hình 11. Các bước của kĩ thuật Bisulfite sequencing
3.3.3. Next Generation Sequencing (NGS)
Với yêu cầu giải trình tự toàn bộ hệ gen hiệu quả hơn, rất nhiều nguồn
lực được đổ vào nhằm nâng cao tốc độ giải trình tự gen và giảm giá thành của
phương pháp này. Một trong những ứng dụng quan trọng đóng góp vào quá
trình này là sự ra đời của Next generation sequencing (NGS). Công nghệ này
thực sự là một cuộc cách mạng. Nhờ ưu thế là công suất cao (high
throughput), thời gian ngắn, chi phí thấp đã giúp giấc mơ giải trình tự toàn bộ
hệ gen người với mức giá dưới 1000 đô la Mỹ thành hiện thực [38].
Trong các sản phẩm trên thị trường thì 4 phương pháp chính dẫn đầu là
454 Pyrosequencing, Ilumina và SOLiD và Ion Torrent. Dù áp dụng công
nghệ khác nhau nhưng đều trải qua 3 bước chính: chuẩn bị thư viện DNA (cắt
DNA thành các đoạn nhỏ) và gắn lên giá bám, khuếch đại và giải trình tự. Tùy


24

theo mục đích mà có thể sử dụng NGS trong việc giải mã toàn bộ hệ gen
(whole genome sequencing), toàn bộ đoạn exon (whole exome sequencing)
hoặc các vị trí đặc biệt cần nghiên cứu (target sequencing) [19].

Hình 12. Hình ảnh minh họa các bước của NGS
3.3.3.1. Whole genome sequencing (WGS) và Whole exome sequencing (WES)
Với khả năng nghiên cứu toàn bộ hệ gen, WGS và WES cũng thường

được áp dụng trong các nghiên cứu SHPT trong ung thư dạ dày [31, 39, 40].
Bên cạnh CDH1 thì còn nhiều gen gây HDGC chưa được tìm ra. WGS và
WES là một trong những phương pháp giúp các nhà khoa học tìm ra được
những khoảng trống đó. Tuy nhiên ưu điểm của NGS cũng chính là nhược
điểm của nó. Dữ liệu khổng lồ mà phương pháp này đưa ra gây khó khăn
trong việc phân tích kết quả, xác định đúng loại đột biến gây bệnh. Ngoài ra
giá thành cao cũng là một cản trở cho việc áp dụng rộng rãi phương pháp này
trong các nghiên cứu và thực hành lâm sàng.
Ngoài những đặc điểm kể trên thì riêng với WES còn một nhược điểm
nữa là không bao phủ hết toàn bộ các exon. Chỉ có khoảng 80-90% số exon
được giải mã nên có thể làm tăng nguy cơ xuất hiện âm tính giả. Ngoài ra
WES cũng không có khả năng phát hiện được hết các biến thể số lượng bản
sao (CNV) [41]. Khả năng ứng dụng rộng rãi cho các bác sĩ lâm sàng cũng là
một yếu tố cần phải lưu ý [42].


25

3.3.3.2. Pyrosequencing
Pyrosequencing là một kĩ thuật NGS với ứng dụng chính là phát hiện bất
thường của hệ epigenetics tương tự như kĩ thuật bisulfite sequencing. Tuy
nhiên, pyrosequencing được cho là phương pháp có độ tin cậy cao hơn.
Phương pháp này ứng dụng cảm ứng quang của protein luciferase tạo ra trong
quá trình tổng hợp. Ngoài ra, chúng còn ưu thế hơn ở khả năng phát hiện
methyl hóa DNA mà không cần tạo dòng DNA như bisulfite sequencing [43].
Tuy nhiên nhược điểm là phương pháp này tốn kém và chiều dài của trình tự
được phân tích ngắn.

Hình 13. Quy trình của kĩ thuật 454 Pyrosequencing