BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





ĐÀO THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ CỐM
PROBIOTICS CHỨA VI KHUẨN
Lactobacillus acidophilus
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





ĐÀO THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ CỐM
PROBIOTICS CHỨA VI KHUẨN
Lactobacillus acidophilus

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ: 60 73 01

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Đàm Thanh Xuân

HÀ NỘI – 2012


LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn
chân thành tới TS. Đàm Thanh Xuân, người đã luôn quan tâm, tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Nguyễn Khắc Tiệp, DS. Lê
Ngọc Khánh, cùng các thầy cô trong Bộ môn Công nghiệp Dược, những
người đã đóng góp những ý kiến quý báu và hỗ trợ tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị kỹ
thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và hết
lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 9 năm 2012.


DS. Đào Thị Hạnh


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN .............................................................................. 3
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTICS......................................................... 3
1.1.1. Khái niệm về probiotics ................................................................ 3
1.1.2.Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm
probiotics trên thế giới và Việt Nam ...................................................... 4
1.1.3. Các vi sinh vật được sử dụng trong các chế phẩm probiotics ........ 8
1.2. Lactobacillus acidophilus .................................................................. 13
1.3. KỸ THUẬT TẠO CỐM .................................................................... 15
1.3.1. Phương pháp xát qua rây............................................................. 15
1.3.2. Phương pháp đùn ........................................................................ 16
1.3.3. Phương pháp phun sấy ................................................................ 17
1.3.4. Kiểm tra chất lượng cốm............................................................. 17
1.3.5. Đánh giá chất lượng cốm probiotics............................................ 18
1.4. KỸ THUẬT LÀM KHÔ ................................................................... 18
1.4.1. Phương pháp sấy tĩnh.................................................................. 18
1.4.2. Phương pháp sấy tầng sôi............................................................ 19
1.4.3. Phương pháp đông khô ............................................................... 19
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 21
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ...................... 21
2.1.1. Nguyên vật liệu........................................................................... 21
2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 21
2.1.3. Thiết bị ....................................................................................... 22
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 23

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 23
2.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống ....................................................... 23


2.3.2. Phương pháp nhân giống ............................................................ 24
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào .................................. 24
2.3.4. Phương pháp xác định sinh khối ướt ........................................... 24
2.3.5. Phương pháp tạo cốm ướt ........................................................... 25
2.3.6. Phương pháp làm khô cốm ướt ................................................... 26
2.3.7. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu
cốm probiotics tạo thành....................................................................... 27
2.3.8. Phương pháp xác định kích thước nguyên liệu cốm .................... 29
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................... 29
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU / THỰC NGHIỆM ........................... 31
3.1. Xác định phương pháp nuôi cấy và xử lý dịch nuôi cấy để thu hỗn
dịch tế bào VSV ....................................................................................... 31
3.1.1. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy thu sinh khối tế bào ................. 31
3.1.2. Xác định các thông số liên quan đến “dược chất” (sinh khối tế
bào) trong quá trình tạo nguyên liệu probiotics ..................................... 34
3.2. Lựa chọn phương pháp và xác định thông số của quá trình tạo
nguyên liệu probiotics dạng cốm chứa L. acidophilus .............................. 39
3.2.1. Lựa chọn phương pháp tạo cốm .................................................. 39
3.2.2. Xác định thông số của quá trình đùn tạo cốm.............................. 41
3.3. Lựa chọn phương pháp và xác định thông số của quá trình làm khô
cốm probiotics chứa L. acidophilus .......................................................... 46
3.3.1 Lựa chọn phương pháp làm khô cốm ........................................... 46
3.3.2. Xác định ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng cốm. ........ 48
3.4. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu cốm probiotics tạo
thành trong thời gian bảo quản ................................................................. 52
Chương 4: BÀN LUẬN ............................................................................... 54

4.1. Xác định phương pháp nuôi cấy và xử lý dịch nuôi cấy thu hỗn dịch
tế bào L. acidophilus ................................................................................ 54


4.2. Lựa chọn phương pháp, xác định thông số của quá trình tạo nguyên
liệu probiotics dạng cốm .......................................................................... 55
4.3. Lựa chọn phương pháp, xác định thông số của quá trình làm khô
cốm probiotics .......................................................................................... 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 57


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Khối lượng sinh khối ướt L. acidophilus trong 100ml MT nuôi cấy
thu được sau 24h. ......................................................................................... 32
Bảng 3.2: Số lượng tế bào L. acidophilus có trong 1ml dịch nhân giống sau
24h nuôi cấy. ................................................................................................ 35
Bảng 3.3: Đánh giá khối bột ẩm khi sử dụng các phương pháp xử lý dịch nhân
giống khác nhau trong quá trình trộn. ........................................................... 36
Bảng 3.4: Số lượng tế bào L. acidophilus có trong 100g bột ẩm sau khi trộn
với 60ml dịch gạn của các bình lên men có dung tích khác nhau. ................. 38
Bảng 3.5: Đánh giá hiệu quả tạo cốm, chất lượng cốm bào chế bằng 2 phương
pháp: xát qua rây và đùn. .............................................................................. 40
Bảng 3.6: Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cốm được bào chế bằng
phương pháp đùn với thời gian ủ khối ẩm khác nhau. .................................. 42
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng các cốm bào chế bằng
phương pháp đùn với tốc độ đùn khác nhau. ................................................ 44
Bảng 3.8: Số lượng, tỷ lệ sống sót L. acidophilus và hàm ẩm của cốm sau khi
làm khô bằng phương pháp đông khô và sấy tầng sôi. .................................. 47
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng cốm sau khi được làm

khô bằng phương pháp sấy tầng sôi. ............................................................. 49
Bảng 3.10: Tỷ lệ L. acidophilus sống sót và hàm ẩm của mẫu cốm nguyên
liệu trong thời gian bảo quản. ....................................................................... 52


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Hình ảnh L. acidophilus trên kính hiển vi điện tử. ........................ 14
Hình 2.1: Quy trình tạo cốm ướt chứa L. acidophilus bằng phương pháp xát
qua rây. ........................................................................................................ 25
Hình 2.2: Quy trình tạo cốm ướt chứa L. acidophilus bằng máy đùn QZJ. ... 26
Hình 3.1: Đồ thị thể hiện lượng sinh khối ướt L. acidophilus trong 100ml MT
nuôi cấy thu được sau 24h. ........................................................................... 32
Hình 3.2: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian ủ khối ẩm lên hiệu suất tạo
cốm. ............................................................................................................. 42
Hình 3.3: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian ủ khối ẩm lên tỷ lệ cốm có
kích thước có kích thước 1,0 ÷ 1,5mm. ........................................................ 43
Hình 3.4: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tốc độ đùn lên hiệu suất tạo cốm khi
sử dụng phương pháp đùn. ........................................................................... 45
Hình 3.5: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tốc độ đùn lên tỷ lệ cốm có kích
thước có kích thước 1,0 ÷ 1,5mm khi sử dụng phương pháp đùn.................. 45
Hình 3.6: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng cốm sau
khi được làm khô bằng phương pháp sấy tầng sôi. ....................................... 50
Hình 3.7: Quy trình bào chế nguyên liệu probiotics dạng cốm chứa L.
acidophilus. .................................................................................................. 51
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm ẩm của cốm probiotics chứa L.
acidophilus trong thời gian bảo quản. ........................................................... 53
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi tỷ lệ sống của L.acidophilus trong cốm
probiotics trong thời gian bảo quản. ............................................................. 53



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CFU (Colony Forming Units):

Số đơn vị khuẩn lạc

L. acidophilus:

Lactobacillus acidophilus

MRS (de Man, Rogosa, Sharpe):

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS

VSV

Vi sinh vật

B. subtilis

Bacillus subtilis

S. boulardii

Saccharomyces boulardii

IDF (International Dairy Federation):

Liên đoàn bơ sữa thế giới


LAB (Lactic acid bateria):

Nhóm vi khuẩn lactic

MT:

Môi trường

WHO

Tổ chức Y tế thế giới

FAO

Tổ chức Lương thực thế giới

Kl/tt

Khối lượng/thể tích

Kl/kl

Khối lượng/khối lượng

Tt/kl

Thể tích/khối lượng


ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự phát triển của công nghệ sinh học mà đỉnh cao là công nghệ gen đã
và đang góp phần tích cực cho sự phát triển nhiều mặt đời sống xã hội con
người. Công nghệ sinh học đã mang đến những công nghệ mới, những
phương pháp chữa bệnh mới, vaccin cho người và động vật… Có thể nói
chúng ta chưa hình dung hết những gì mà công nghệ sinh học có thể mang lại
cho con người trong thập niên tới.
Probiotics là một sản phẩm của công nghệ sinh học truyền thống.
Probiotics là một hay nhiều vi sinh vật sống có tác dụng phục hồi và cân bằng
số lượng vi sinh vật có ích trong đường ruột, từ đó cải thiện và hỗ trợ hệ tiêu
hóa đường ruột.
Vi sinh vật hay được sử dụng nhất trong các chế phẩm probiotics là
nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, trong đó điển hình là Lactobacillus
acidophilus.
Hiện nay, trên thị trường Việt Nam ngày càng xuất hiện nhiều chế
phẩm probiotics như: Biofidin, Biolacto (Mỹ), Biobaby, Antibio (Hàn
Quốc),… trong đó, chiếm lĩnh thị trường dược phẩm probiotics vẫn là các chế
phẩm thuốc ngoại. Đa số các cơ sở sản xuất dược phẩm probiotics trong nước
chỉ đóng gói và phân phối sản phẩm với nguồn nguyên liệu ban đầu chủ yếu
phải nhập khẩu, giá thành cao.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotics chứa vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus”.
Với các mục tiêu:
- Xác định phương pháp nuôi cấy và xử lý dịch nuôi cấy để thu hỗn
dịch tế bào vi sinh vật.

1


- Lựa chọn phương pháp và xác định thông số của quá trình tạo nguyên

liệu và làm khô cốm probiotics chứa Lactobacillus acidophilus.

2


Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTICS
1.1.1. Khái niệm về probiotics
Probiotics bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “sự sống”. Khái niệm
probiotics đầu tiên xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff, trong cuốn
sách “Kéo dài sự sống” của ông đưa ra năm 1908. Ông cho rằng những người
nông dân Bulgary sống lâu là vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa
vi khuẩn lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột. [33]
Thuật ngữ “probiotics” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi
Kollath. Probiotics được định nghĩa là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn,
kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác”. [33]
Năm 1974, Parker đã phát triển định nghĩa này, ông cho rằng probiotics
là “những vi sinh vật và những cơ chất giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường
ruột”. Sau đó vào năm 1989, Fuller đã thay đổi định nghĩa này, ông cho rằng
probiotics là “thực phẩm” bổ sung một số vi sinh vật (VSV) sống có ích cho
vật chủ nhằm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Năm 1998, Salminen đã
định nghĩa probiotics là “những thực phẩm chứa vi khuẩn sống ảnh hưởng có
lợi cho sức khoẻ”. Năm 2002 Marteau đã định nghĩa probiotics hoàn chỉnh
hơn “probiotics là những chế phẩm chứa tế bào vi sinh vật hay những thành
phần của tế bào vi sinh vật mà ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe”. [33], [34]
Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Lương thực thế
giới (FAO) đưa ra định nghĩa probiotics được coi là hoàn chỉnh nhất hiện nay:
“Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với lượng phù hợp sẽ
đem lại lợi ích cho sức khỏe của sinh vật chủ”. [34]


3


1.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotics
trên thế giới và Việt Nam
1.1.2.1. Tình hình sử dụng các chế phẩm probiotics
Việc sử dụng thực phẩm có probiotics (như 1 thành phần tự nhiên
của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng
việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotics mới thực
sự phát triển từ những năm 80 của thể kỷ 20. Những nghiên cứu về đặc
điểm phân loại và quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật
được tiến hành bởi Apajalahti và cs (1998) [9]; Vander Wielen và cs
(2000) [31] đã cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và
Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus.
Bằng kỹ thuật gen, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 ÷
50% số loài vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như
nguồn probiotics. Netherwood và cs (1999) [23]; Gong và cs (2002) [15];
Zhu và cs (2002) [35] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi
cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở
động vật dưới tác động của probiotics. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân
tố nào góp phần tạo nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự
cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ.
Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotics đối với đời sống động
vật như tác động của probiotics đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc
ruột (Schat và Mayer, 1991) [29]; (Hersbberg và Mayer, 2000) [17]; đối
với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (McCracken và Lorenz,
2001) [21]. Những ảnh hưởng có lợi của probiotics thể hiện ở nhiều khía
cạnh khác nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động
của probiotics còn rất hạn chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của
probiotics trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong

đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được

4


thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố
và các sản phẩm trao đổi (các axit béo bay hơi, các chất giống kháng
sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống
miễn dịch ruột. [27]
Hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng có ba dạng
chế phẩm probiotics chủ yếu là: dược phẩm, thực phẩm chức năng và sản
phẩm thủy sản. Chế phẩm probiotics ở dạng dược phẩm, thực phẩm chức
năng được sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh đường tiêu hóa:
phòng ngừa nhiễm trùng đường ruột cấp tính, phối phợp điều trị tiêu
chảy,... Các sản phẩm probiotics được dùng phổ biến trong nuôi trồng
thủy sản nhằm kiểm soát và phòng bệnh cho vật nuôi nhờ bổ sung VSV
sống có lợi vào ao nuôi, gia tăng quần thể VSV làm thức ăn, cải thiện
dinh dưỡng từ đó tăng cường khả năng miễn dịch của vật nuôi với mầm
bệnh, góp phần làm giảm thiểu việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong
phòng và trị bệnh cho vật nuôi.
1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất các chế phẩm probiotics trên thế giới
Hiện nay trên thế giới sản xuất được bốn thế hệ bào chế probiotics
nhằm cải thiện số lượng VSV sống sót trong suốt quá trình sản xuất, bảo quản
và trong đường tiêu hóa. [24]

5


Bảng 1.1: Các thế hệ bào chế chế phẩm probiotics trên thế giới.
Thế hệ

Thế hệ 1
(Non-coated)

Đặc điểm VSV
probiotics

Ưu điểm

VSV sống (trong sữa
chua, phomat, kim
chi,.. ).

Giá rẻ → sử dụng
nhiều.

Bào tử VSV.

Thuận lợi cho Mất nhiều thời
nuôi cấy, sản xuất, gian phát triển
lưu hành.
thành VSV →
chậm tác dụng,
hạn chế khả năng
cạnh tranh với
VSV gây bệnh.

Probiotics đông khô.

VSV có thể chết
rất nhiều khi qua

dạ dày và dịch
mật.

Không khai thác
hết tác dụng của
probiotics sống.

Thế hệ 2

VSV đưa vào dưới Bảo vệ VSV khi
Entericcoated dạng viên nang có lớp đi qua dạ dày và
bao ngoài tan trong dịch mật.
ruột.

Thế hệ 3

Nhược điểm

Dạng bao vi nang.

Mất thời gian
màng bao tan rã
để giải phóng
VSV.

Hoàn thiện ý Chưa khắc phục
tưởng của thế hệ được nhược điểm
2.
của thế hệ 2.


Microencapsu
lated
Thế hệ 4

Lớp bên trong là VSV có tỷ lệ sống
Tạo lớp bao protein, lớp ngoài là cao. Chịu được
polysaccharid.
acid dịch vị và
kép
muối mật. Lớp
Dual - coated
bao kép phóng
thích nhanh VSV.

6

Đòi hỏi công nghệ
cao, kỹ thuật bào
chế hiện đại, trang
thiết bị đắt tiền.
Giá thành cao.


Hiện nay các chế phẩm probiotics chủ yếu là dạng khô (bột, cốm, viên
viên nang,…), nguyên liệu để sản xuất dạng này đều là bột đông khô để đảm
bảo số lượng VSV sống trong quá trình bảo quản. Dạng bột khô là dạng bào
chế tốt nhất so với dạng viên nén và viên nang. [31]
1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotics ở Việt Nam
Ở nước ta, các chế phẩm probiotics đã chiếm lĩnh thị trường hơn 10 năm;
tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất probiotics phục vụ cho đời sống còn rất

mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây. Hiện
nay mới chỉ có khoảng mười xí nghiệp sản xuất các chế phẩm probiotics là
dược phẩm và thực phẩm chức năng.
Không thể không kể đến vai trò quan trọng của Công ty TNHH một thành
viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang, Công ty TNHH một thành viên Pásteur
Đà Lạt là các cơ sở sản xuất chế phẩm probiotics lớn nhất Việt Nam với nhiều
chế phẩm như Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver, Biosubtyl LD – gói 1g
chứa chứa 107 - 108 cfu B. subtilis và L. acidophilus... Công ty Anabio R&D
là nhà máy sản xuất nguyên liệu probiotics thế hệ mới đầu tiên tại Việt Nam,
với triển vọng không chỉ cung cấp nguyên liệu cho cả nước mà còn xuất khẩu
ra nước ngoài.
Tuy nhiên, sản phẩm sản xuất bởi các công ty trong nước vẫn chủ yếu
thuộc thế hệ 1 nên lượng VSV sống sót vẫn còn rất nhỏ.
1.1.2.4. Một số chế phẩm probiotics thông dụng trên thị trường dược phẩm
Việt Nam hiện nay
Các chế phẩm probiotics trên thị trường chủ yếu là dạng thuốc bột, cốm
hoặc nang chứa bột thuốc hay cốm thuốc có thể chứa một hay một số vi sinh
vật được phối hợp với nhau. Dễ nhận thấy L. acidophilus được sử dụng phổ
biến trong các chế phẩm probiotics trên thị trường hiện nay.

7


Bảng 1.2: Một số chế phẩm probiotics trên thị trường hiện nay.
STT
1

2

3

4
5
6

7
8

9
10

Biệt dược
L-Bio-3D

Thành phần

Nhà sản xuất

300mg vi khuẩn: L. acidophilus,
Bifidobacterium
longum,
L.
rhamnosus
Thuốc cốm, 1g chứa 108 cfu L.
acidophilus

Me-Auspharm
Liên
doanh
Việt Nam.
Abiiogran

Dae Han New
Pharm – Hàn
Quốc
8
Antibio
Gói bột uống 1g chứa 10 cfu L. Organon
–
acidophilus
Hàn Quốc
8
9
Antibiophilus Viên nang chứa 2×10 – 2×10 cfu Lyocentre
–
L. acidophilus
Pháp
8
Biolacto
Viên nang chứa ít nhất 10 cfu L. Union - Mỹ
acidophilus và L. bulgaricus
Lactomed
Viên nang 320mg chứa:
II Dong - Hàn
6
2 ×10 cfu L. bifidus
quốc
6
2 × 10 cfu L. acidophilus
2 × 106 cfu Streptococcus faecalis
Ultraflore
Viên nang 0,2g chứa 2 × 109 nấm Sobio – Pháp

men Saccharomyces cerevisiae
Biosubtyl LD Gói 1g chứa 107 - 108 cfu B. subtilis Viện
vaccin
và L. acidophilus
Đà Lạt – Việt
Nam
9
Probio
Gói bột uống chứa 10 cfu L. Imexpharm –
acidophilus
Việt Nam
9
Y-bio
Gói bột chứa 10 cfu L. acidophilus CTCP Dược
Hậu Giang

1.1.3. Các vi sinh vật được sử dụng trong các chế phẩm probiotics
Nếu trước kia sự lựa chọn vi sinh vật cho chế phẩm probiotics dùng
làm thuốc chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thì hiện nay, các nhà khoa học đã

8


đưa ra được các yêu cầu về đặc điểm cần phải có đối với các vi sinh vật sử
dụng làm nguyên liệu probiotics, đó là:
- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ.
- Chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non.
- Không sinh độc tố và không gây bệnh cho vật chủ.
- Có khả năng sống và cư trú trong ruột.
- Dễ nuôi cấy và có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài.

[6], [26]
Nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotics là:
- Nhóm vi khuẩn lactic: gồm 2 chi phổ biến là chi Lactobacillus và
Bifidobacterium.
- Nhóm vi khuẩn không phải vi khuẩn lactic:
+ Chi Propionibacterium: P. freudenreichii, P. cyclohexanicum...
+ Chi Bacillus: B. subtilis, B. clausii...
+ Chi Brevibacillus: B. laterosporus...
+ Chi Sporolactobacillus: S. laevolacticus… [14]
- Nhóm nấm men: chủ yếu là chi Saccharomyces đại diện là S. cerevisiae.
Nhóm vi khuẩn lactic có hình dạng và kích thước tương đối đa dạng có
thể là hình cầu, hình que, có thể là đơn bào đơn độc hoặc tạo chuỗi; có thể
sinh trưởng tốt ở điều kiện pH thấp, có khả năng đồng hòa nhiều loại đường
khác nhau như đường glucose, lactose, mantose, saccarose,… Nhờ những đặc
điểm này mà vi khuẩn lactic có nhiều ưu thế trong bảo quản thực phẩm. [14]
Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong họ vi khuẩn lactic đại diện là L.
acidophilus gồm các vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, có hình que hoặc
lưỡi câu cong xuất hiện đơn lẻ hoặc dưới dạng chuỗi, có khi dạng sợi, di động
hoặc không di động, thành phần G C của genome < 50% (vi khuẩn có G C
thấp). Những vi sinh vật này đòi hỏi môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng, vi

9


hiếu khí đến hiếu khí, catalase âm tính, có thể xảy ra hiện tượng catalase giả ở
một số chủng. Lactobacillus có mặt ở khắp mọi nơi, ở hầu hết các môi trường
có carbohydrat như thức ăn (sữa, thịt lên men, rau quả, nước giải khát), đường
tiêu hóa, đường hô hấp, đường sinh dục của con người và động vật, rác thải...
Sự phân bố của chúng ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nồng độ
oxy, sự tương tác giữa các vi khuẩn...

Vào tháng 9/2008 người ta đã thống kê được có khoảng 116 loài thuộc
chi Lactobacillus. [14]
Có nhiều nghiên cứu và ứng dụng Lactobacillus trong sản xuất cũng
như trong đời sống con người. Chúng có khả năng làm giảm số lượng các vi
sinh vật hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase - một enzym
quan trọng trong chuyển hóa sữa; có liên quan đến quá trình sản xuất một số
vitamin nhóm B như: niacin, acid folic, pyridoxin; tăng cường chức năng của
hệ thống miễn dịch; giảm sự tiêu diệt vi sinh vật có ích do sử dụng kháng sinh
dài ngày... [8]
Chi Lactobacillus gồm 6 đại diện mang đặc tính probiotics: L. acidophilus,
L. paracasei, L. delbrueckii, L. plantarum, L. rhamnosus, L. sporogenes.

Bifidobacterium thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, là vi khuẩn
Gram (+) có thể phân nhánh, không di động, không sinh bào tử và kị khí, có
nhiều hình dạng khác nhau gồm hình que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y.
Các loài thuộc các chi này sử dụng chuỗi chuyển hóa sinh học để phân hủy
đường hexose gọi là “bifid shunt”. Enzym chính dùng để phân loại đồng thời
phân biệt với các loài khác là fructose-6-phosphoketolase.
Đến 8/2008 theo thống kê chi Bifidobacterium có khoảng 30 loài. [14]
Bifidobacteria là loài có vai trò tối quan trọng trong hệ sinh thái phức hợp
và năng động ở đường ruột của người, động vật máu nóng cũng như ong mật.
Chúng phân bố ở các hốc sinh thái khác nhau trong đường tiêu hóa và đường tiết

10


niệu, tỷ lệ thay đổi phụ thuộc vào độ tuổi và khẩu phần ăn. Hệ vi sinh vật tự
nhiên của em bé chủ yếu là Bifidobacteria được hình thành ngay sau khi sinh. Sự
nhân lên của chúng được kích thích bởi các thành phần glycoprotein của kcasein trong sữa non, sữa người. Số lượng Bifidobacteria giảm dần theo tuổi và
cuối cùng trở thành chi có số lượng vi sinh vật nhiều thứ 3 trong hệ vi khuẩn ở

đường tiêu hóa sau chi Lactobacillus và Eubacterium. Đây là một trong những
chi quan trọng trong công nghiệp sản xuất bơ sữa. [14]
Chủng Bifidobacteria mang đặc tính probiotics gồm 5 đại diện: B.
animalis, B. bifidum, B. breve, B. longum và B. adolescentis. [14]
Đại diện cho nhóm nấm men là Saccharomyces, được gọi là nấm men
bia hoặc nấm men bánh mì. Saccharomyces phát triển nhanh chóng và trưởng
thành trong ba ngày, không có khả năng sử dụng nitrat và khả năng lên men
khác nhau carbohydrat. Saccharomyces là những vi sinh vật đơn bào, có
nhiều chi được sử dụng trong y học. S. boulardii có khả duy trì và phục hồi
hệ vi sinh vật trong ruột, phòng ngừa và điều trị rối loạn tiêu hóa. [32]
Enterococcus thuộc nhóm không sinh acid lactic, là vi khuẩn Gram (+),
kỵ khí không bắt buộc, không có khả năng sinh bào tử, sống trên đường tiêu
hóa của con người và động vật có vú khác. [13]
1.1.4. Cơ chế tác dụng và ứng dụng của probiotic
1.1.4.1. Cơ chế tác dụng
* Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám:
Probiotics cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng với các vi khuẩn
gây bệnh để duy trì và phát triển. Bằng cách chiếm lĩnh và bám chặt vào thành
ruột, probiotics ngăn ngừa các vi khuẩn có hại tấn công và phát triển.
* Tăng cường chức năng chống đỡ của niêm mạc ruột.
Probiotics sống tại đường ruột tăng cường chức năng chống đỡ của
niêm mạc ruột và giảm thiểu sự di chuyển của các vi khuẩn và kháng nguyên

11


từ ruột vào mạch máu. Chức năng này giúp giảm sự nhiễm khuẩn và dị ứng
đối với các kháng nguyên có trong thực phẩm.
* Sản sinh ra các chất ức chế.
Một số probiotics sản sinh ra các kháng sinh như bacteriocins giúp

ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh.
Trong quá trình lên men đường, các thành phần khác nhau của
probiotics sản sinh ra acid lactic giúp làm giảm pH của ruột và ngăn cản sự
phát triển của các vi khuẩn không cần thiết.
Một số probiotics sản sinh ra metabolic, butyrat và acid butyric có
khả năng chống ung thư.
* Kích thích đáp ứng miễn dịch.
Vi khuẩn probiotics có khả năng làm tăng cả phản ứng miễn dịch đặc
hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế bào phản ứng miễn dịch
(macrophase, lymphocyte) và tăng cường sự sản xuất các thành phần miễn
nhiễm (cytoline, immunoglobulins, interferon).
* Tăng cường chức năng tiêu hóa.
Probiotics trong ruột non giúp giảm lượng mật trong cơ thể và giảm
cholesterol, sản sinh ra các enzym khắc phục quá trình tiêu hủy carbohydrat
và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hấp thụ năng lượng từ các chất dinh
dưỡng ở ruột, đồng thời lên men những carbohydrat không tiêu hóa được
trong ruột non và sản xuất ra vitamin B, K. [10], [25]
1.1.4.2. Ứng dụng của probiotics
Probiotics được ứng dụng:
•

Trong các bệnh tiêu hóa.
- Tăng khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzym
khác.
- Hỗ trợ trong điều trị tiêu chảy do sử dụng kháng sinh.

12


- Điều trị viêm đường tiêu hóa.

- Tác dụng lên Helicobacter pylori.
- Điều trị ung thư ruột kết.
- Hạn chế nguy cơ sỏi thận.
•

Tăng cường miễn dịnh
- Kích thích miễn dịch niêm mạc.
- Tăng cường miễn dịch, giảm phản ứng dị ứng.

•

Giảm nguy cơ nhiễm vi khuẩn, nấm.

•

Giảm nguy cơ mắc ung thư.

•

Chống tăng huyết áp, giảm cholesterol máu.

•

Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản.
Xu hướng sử dụng probiotics trong nuôi trồng thủy sản ngày càng

tăng lên do các kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng làm tăng năng suất và
ngăn ngừa bệnh của chúng. Probiotics có thể được sử dụng nhằm ngăn ngừa
mùi vị, giảm thành phần tảo lục, tảo lam, giảm nitrat, nitrit, amoni và
phosphat, tăng oxygen hòa tan và nâng cao khả năng phân hủy chất hữu cơ.

Các dòng chọn lọc Bacillus spp. đã được sử dụng qua thực nghiệm để kiềm
chế sự lây nhiễm của các loài Vibrio. [10], [25]
1.2. Lactobacillus acidophilus
L. acidophilus thuộc chi Lactobacillus là đại diện của nhóm vi khuẩn
sinh acid lactic, là trực khuẩn Gram (+), hình que hay hình cầu, kích thước 0,6
- 0,9 x 1,5 - 6,0µm, mọc đơn, đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn. L. acidophilus
không có lông roi, không di động, không sinh bào tử, không ưa muối, ưa acid,
catalase âm tính, kị khí tùy tiện. L. acidophilus phát triển tốt trong điều kiện
sức căng bề mặt thấp và có khả năng kháng lysozym. [4], [6], [11], [19]
Thành tế bào L. acidophilus có loại peptidoglycan là Lys-D Asp, thành
phần cấu tạo của lớp phospholipid và acid techoic là glycerol. Tế bào vi

13


khuẩn không có cytochrom, do đó benzidin âm tính. G + C chiếm tỷ lệ 34 37% trong gen. [11]
Do L. acidophilus vi hiếu khí nên môi trường nuôi cấy thường là kị khí
hoặc giảm áp oxy với 5 - 10% CO2. L. acidophilus có thể sinh trưởng ở nhiệt
độ cao (ở 45oC), tuy nhiên phát triển tối ưu ở 37oC, không phát triển dưới 20 22oC hoặc ở nhiệt độ cao hơn 480C. Vi khuẩn này có thể chịu được acid 0,3 1,9%, với pH tối thích trong khoảng 5,5 – 6,0. Nhu cầu dinh dưỡng của L.
acidophilus tương đối phức tạp. Môi trường nuôi cấy L. acidophilus cần các
loại carbohydrat có thể lên men, protein và các sản phẩm phân giải, hỗn hợp
các vitamin nhóm B, dẫn xuất của acid nucleic, các acid béo tự do chưa bão
hòa, cùng các chất khoáng như magnesi, mangan và sắt. Pepton và trypsin có
tác dụng kích thích khả năng sinh acid của loài vi khuẩn này. Hiện nay, L.
acidophilus thường được nuôi cấy trong môi trường MRS. Ở trong đường
tiêu hóa, L. acidophilus gắn gián tiếp lên niêm mạc ruột qua lectin do chúng
tự tổng hợp hoặc bám trực tiếp lên các tế bào biểu mô ruột. [4], [6], [11]

Hình 1.1: Hình ảnh L. acidophilus trên kính hiển vi điện tử.
L. acidophilus chiếm đa số trong các chế phẩm probiotics nhờ các ưu

thế: củng cố hàng rào miễn dịch và không miễn dịch chống lại các nhiễm
khuẩn đường ruột; cải thiện chức năng miễn dịch; phòng ngừa bệnh tiêu chảy;

14


phòng chống ung thư ruột kết; ngăn ngừa cholesterol máu cao; cải thiện khả
năng dung nạp lactose; phòng chống các bệnh ở đường tiêu hóa trên; ổn định
hàng rào niêm mạc ruột. [19]
L. acidophilus có tác dụng đối kháng lại sự phát triển của các vi khuẩn
gây bệnh đường ruột như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium,
Yersinia enterocolitica và Clostridium perfringens thông qua cơ chế kháng vi
sinh vật, bằng cách cạnh tranh chất dinh dưỡng, năng lượng cũng như vị trí
bám lên niêm mạc ruột của các vi khuẩn gây bệnh. Đồng thời L. acidophilus
cũng sản xuất ra các acid hữu cơ như acid lactic và acid acetic, các bacteriocin
và các sản phẩm chuyển hóa cơ bản khác gồm hydrogen peroxid, carbon
dioxid và diacetyl.
L. acidophilus và Bifidobacterium spp. được công nhận có tác dụng
làm giảm nồng độ các enzym xúc tác cho quá trình chuyển đổi của các amin
gây ung thư ruột kết, như ß-glucuronidase, ß-glucosidase, azoreductase, nitroreductase và urease.
L. acidophilus có tác dụng phân giải các acid mật thành các acid tự do.
Các acid tự do này được đào thải khỏi đường tiêu hóa nhanh hơn nhiều so với
các acid mật dạng kết hợp. Điều này khiến nồng độ acid mật giảm xuống, đòi
hỏi cơ thể phải tổng hợp mới acid mật từ cholesterol, tạo ra tác dụng giảm
nồng độ cholesterol toàn phần trong cơ thể. [19]
1.3. KỸ THUẬT TẠO CỐM
Có ba phương pháp tạo cốm: phương pháp xát qua rây, phương pháp
đùn và phương pháp phun sấy.
1.3.1. Phương pháp xát qua rây
Đây là phương pháp tương đối đơn giản, dễ thực hiện, qua các bước:

Trộn bột kép

15


Tạo khối ẩm – xát hạt
Làm khô cốm – sửa hạt
Thuốc cốm
- Trộn bột kép: Các thành phần ban đầu sau khi qua bước nghiền mịn
được trộn khô theo nguyên tắc đồng lượng để đảm bảo đồng nhất hỗn hợp.
- Tạo khối ẩm- xát hạt: Trộn bột kép với tá dược dính lỏng để liên kết
các tiểu phân bột. Tỷ lệ và loại tá dược dính, thiết bị và thời gian nhào trộn
cần được xác định cho từng công thức cụ thể. Sau khi trộn xong nên để khối
ẩm ổn định trong thời gian thích hợp (30 – 45 phút), rồi xát hạt (hoặc sợi) qua
cỡ rây thích hợp (1,0 – 2,0mm).
- Sấy hạt – sửa hạt: Sấy khô hạt ở nhiệt độ thích hợp (40 – 700C) đến
hàm ẩm dưới 5%. Sửa hạt qua cỡ rây quy định để loại bỏ bột mịn và cục vón,
làm cho kích thước hạt đồng nhất hơn.
1.3.2. Phương pháp đùn
* Được tiến hành sản xuất trên thiết bị đùn qua các bước:
- Tạo khối dẻo – đùn thành sợi: Trộn bột kép với tá dược dính lỏng
trong thiết bị nhào trộn thích hợp để liên kết tiểu phân. Tỉ lệ và loại tá dược
dính, thiết bị và thời gian nhào trộn cần được xác định cho từng công thức cụ
thể. Sau khi trộn xong nên để khối ẩm ổn định trong thời gian thích hợp (30 –
45 phút) rồi đùn thành sợi hình trụ qua cỡ rây thích hợp.
- Làm khô: cốm được làm khô đến độ ẩm quy định bằng các phương
pháp thích hợp.
Ưu điểm: Cốm bào chế theo phương pháp này có độ bền cơ học cao,
năng suất cao.


16