Lec 8 chuong 3 miRNA siRNA
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.14 MB, 38 trang )
VaitròcủacácRNAtrongđiều
hòabiểuhiệngene
miRNA: Thế hệ gene silencer mới
• MicroRNAs (miRNAs): là những phân tử RNA có chiều dài 19-24 bp.
• Tham gia vào quá trình điều hòa quá trình dịch mã của mRNA.
• miRNA là thành viên của nhóm các RNA điều hòa bao gồm cả small
interfering RNA (siRNA)
•
miRNAs điều hòa biểu hiện gene đích theo kiểu “downstream”, bao
gồm các yếu tố điều hòa phiên mã, oncogene, và các gene ức chế
ung thư.
• Người ta đã phát hiện được một số lượng rất lớn các miRNA. Sự có
mặt của các miRNA khác nhau ở các mô và ở các mô ung thư.
Giới thiệu miRNA
• miRNAs là những đoạn RNA sợi đơn, nhỏ, không mã
hóa (non-coding RNA) có chiều dài từ 19-24 nt.
• Gene mã hóa cho miRNA được phiên mã từ DNA nhưng
không được dịch mã thành protein.
• miRNA được tạo thành từ các bản phiên mã ban đầu
(pri-miRNA). Các pri-miRNA tạo thành cấu trúc “stemloop” gọi là pre-miRNA. Sau đó chuyển thành các
miRNA hoạt động.
Giới thiệu miRNA
• miRNA có khả năng tác động đến 1 hoặc nhiều mRNA.
• Có khoảng 1.000 miRNA ở genome người, và khoảng 30%
gene người được điều hòa bởi miRNA.
• Đối với một số gene ở người, có hơn 1 miRNA liên quan đến
sự điều hòa hoạt động.
• Hơn 80% miRNA có tính đặc hiệu mô.
• miRNA làm “câm” gene đích bởi nhiều cơ chế khác nhau.
miRNA ở động vật, thực vật ?
• Ở thực vật miRNA bổ sung với mRNA đích gần như hoàn hảo
với rất ít hoặc không có mismatch.
• Ở động vật đa bào, miRNA bổ sung không hoàn hảo và 1
miRNA có thể tác động đến nhiều vị trí trên cùng một phân tử
mRNA hoặc trên nhiều mRNA khác nhau.
• Ở động vật đa bào, vị trí tấn công của miRNA là trong vùng đầu
3’ UTR của mRNA.
• Ở thực vật có thể vị trí tấn công ở 3’ UTR hoặc trong vùng CDS.
NguồngốcmiRNA
• Hầu hết các gene mã hóa microRNA nằm ở vùng intergenic.
• Gene mã hóa miRNA có promoter điều khiển cũng như các
đơn vị điều hòa riêng.
• Khoảng 40% gene miRNA nằm trong vùng intron của các
gene mã hóa protein và gene không mã hóa protein.
• 6% miRNA người có hiện tượng sửa chữa RNA “RNA editing”
à đa dạng miRNA.
Nguồn gốc
• Gene mã hóa cho miRNAs dài hơn nhiều so với phân tử
miRNA sau khi đã xử lý.
• Nhiều miRNA nằm ở trong intron của các phân tử pre-mRNA
của tế bào chủ à cùng sử dụng chung các yếu tố điều hòa
phiên mã, cùng mô hình biểu hiện (expression profile).
• Các gene mã hóa cho các miRNA còn lại được phiên mã bởi
các promoter riêng của chúng.
Ứng dụng miRNA
• Việc phát hiện các miRNA được xem như tín hiệu để phát
hiện ung thư và dự đoán những bệnh nguy hiểm.
• miRNAs đã được xem như là một công cụ điều trị dựa trên
nguyên lý antisense, hoặc ức chế các oncogene hoặc ức chế
các miRNA.
• Trong tương lai, dữ liệu phân tích bioinformatics về genome,
proteome, transcriptome à tăng cường hiệu quả ứng dụng
phân tử này.
Sinh tổng hợp miRNA
• miRNA được phiên mã bởi RNA pol II thành dạng tiền
miRNA (pri-miRNA), tiếp theo là các bước gắn mũ đầu 5’,
polyadenin hóa 3’.
• pri-miRNA được xử lý bằng phức hợp “microprocessor
complex” chứa enzyme RNase III Drosha, double-strandedRNA-binding protein, Pasha/DGCR8.
• Kết quả tạo ra các pre-miRNAs khoảng 70-nucleotides được
gấp lại thành dạng cấu trúc stem-loop không hoàn hảo.
Sinh tổng hợp miRNA
• pre-miRNA à chuyển vào tế bào chất bởi phức hợp karyopherin
exportin 5 (Exp5) và phức hợp Ran-GTP. Ran (ras-related nuclear
protein) là một phức hợp protein nhỏ gắn GTP (thuộc siêu họ RAS)
cần thiết cho sự chuyển của RNA và proteins thông qua lỗ nhân.
• Ran GTPase gắn Exp5 tạo thành một phức hợp heterotrimer với
pre-miRNAs. pre-miRNAs trải qua một bước xử lý bổ sung bởi
enzyme RNAse III Dicer tạo ra miRNA là một RNA sợi kép khoảng
22 nt.
• Dicer cũng khởi đầu sự hình thành RNA-induced silencing
complex (RISC), RISC chịu trách nhiệm cho việc “câm” gene do sự
biểu hiện của miRNA và RNAi.
GenemãhóamiRNA
RNApolII/III
Phiênmã
Pri-miRNA
Drosha-DGCR8
Phâncắt
Pre-miRNA
Expor
Cơ chế
sinh tổng
hợp miRNA
Vậnchuyểnratếbàochất
miRNAkép(miRNAduplex)
Ago2
PhứchợpRISC
Phângiải
miRNAtrưởngthành
NatureGene*cs37,1163-1165(2005)
Lựachọn1sợitrongdsRNA
Guidestrand
Ago2
PhứchợpRISC
passengerstrand,hoặcmiRNA*
Lựachọn1sợitrongdsRNA
• Khi Dicer cắt pre-miRNA stem-loop, 2 sợi RNA bổ sung ngắn
được tạo thành, nhưng chỉ có 1 sợi “guid strand” kết hợp với
phức hợp RISC. Sợi còn lại “passenger strand “ bị phân giải.
• Việc lựa chọn sợi “guid strand” dựa vào sự ổn định của các đầu
tận cùng của dsRNA.
• Sợi chứa các base có khả năng bắt cặp thấp (2-4 nt) ở đầu 5’ tận
cùng của dsRNA sẽ được ưu tiên kết hợp với RISC và trở thành
miRNA hoạt động.
• Sau khi kết hợp với phức hợp RISC, miRNA sẽ thể hiện chức
năng điều hòa bằng cách gắn bổ sung không hoàn hảo với trong
vùng 3' không được dịch mã (UTR) của mRNA đích.
• Sự hình thành sợi dsRNA (miRNA + mRNA) à ức chế dịch mã.
Orthologs of RNAi Machinery
Component Mammals
Drosophila
C.elegans
Arabidopsis
Dicer
Dicer(siRNA,
miRNA)
Dcr-1(siRNA,
miRNA)
Dcr-2(siRNA)
Dcr-1(siRNA,
miRNA)
DCL1(miRNA,siRNA)
DCL2(siRNA,virus)
DCL3(siRNA,heterochroma
R2D2
TRBP(miRNA;
human)
R2D2(siRNA)
Loqs(miRNA)
RDE-4
HYL1(miRNA)
Ago2(siRNA)
Ago1(miRNA)
RDE-1(siRNA)
ALG-1andALG-2
(miRNA)
AGO1(miRNA,siRNA)
AGO4(heterochroma
(7otherArgonautes:AGO4–
AGO9,ZLL/PNH)
Argonaute Ago1
Ago2
(endonuclease)
Ago3
Ago4
h9p://www.ambion.com/techlib/resources/RNAi/overview/2.html
Dicer
• Là một protein có KLPT khoảng 200 kDa, chứa nhiều
domain:
ü ATPase/RNA helicase domain
ü Domain PAZ bảo thủ (cùng với Argonaute)
ü 2 domain xúc tác RNase III
ü Domain đầu C-terminal gắn với dsRNA (dsRBD)
Dicers
• Là protein lớn (200 kDa) chứa enzyme ATPase/RNA helicase, có
domain là DUF283 và PAZ có khả năng gắn với 2 nucleotide đầu
3’ nhô của miRNA và siRNA. 2 domain xúc tác RNase III (RIIIa và
RIIIb) và một domain ở đầu C-terminal gắn với RNA sợi kép
(dsRBD).
• Mỗi RNase domain cắt độc lập 1 sợi RNA của phức hợp để tạo ra
sản phẩm có 2-nt 3' nhô ra. Ngoài việc cắt pre-miRNA thành
miRNA, enzyme Dicer xử lý dsRNA à siRNA.
• Sau khi Dicer phân cắt, con đường tiếp theo của miRNA và RNAi
là tương tự nhau ở động vật.
CÂU HỎI
• Thế nào là siRNA (short interfering RNA)?
• Thế nào là miRNA (microRNA)?
• Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA?
• Thế nào là shRNA (short interfering hairpin RNA)?
• Thế nào là RNAi (RNA interference)?
• Sự khác nhau giữa siRNa và shRNA?
siRNA, shRNA và miRNA
• Khi phân tử RNA sợi kép (dsRNA) được đưa vào tế bào dưới
dạng oligo gọi là siRNA.
• Khi phân tử này được đưa vào dưới dạng kẹp tóc (hairpin) gọi
là shRNA. Như vậy shRNA cũng là một loại siRNA.
• Hairpin RNA được thạo thành trong quá trình phiên mã từ một
plasmid ngoại lai và sau đó được xử lý bởi Drosha và Dicer và
được đưa vào trong phức hợp RISC cũng được coi là siRNA.
• Khi phân tử RNA được phiên mã từ 1 NST và tạo thành 1 cấu
trúc “stem loop” , được xử lý bởi Drosha và Dicer, sau đó được
đưa vào RISC thì được gọi là miRNA
Sự khác biệt là do nguồn gốc RNA từ đâu
• Phiên mã từ nguồn DNA nội sinh (endogenous DNA) à
miRNA
• Phiên mã từ nguồn RNA ngoại sinh (exogenous DNA) à
siRNA
• Việc đưa vào tế bào cấu trúc oligo dsRNA dạng kẹp tóc à
siRNA
miRNA và siRNA
• Cả miRNA và siRNA kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gene.
• miRNA: sự điều khiển dựa vào việc lựa chọn tự nhiên
• siRNA: tác động khó có thể tiên đoán trước
• RNA nào cũng là RNA cho dù nguồn gốc từ đâu, nhưng các
trình tự nội sinh liên quan tới các mối quan hệ với
transcriptome trong khi RNA ngoại sinh có thể tạo ra những
tác động khó dự đoán.
miRNA và siRNA
Khác biệt giữa siRNA và miRNA:
• Tiền chất của siRNA là “long dsRNA”
• Tiền chất của miRNA là dạng RNA
hairpin
miRNA và siRNA
• siRNAs thường được tổng hợp hóa học sau đó đưa vào
tế bào (21 nt dsRNA). siRNA bắt cặp hoàn toàn với gene
đích.
• miRNAs có nguồn gốc nội sinh, trải qua quá trình xử lý
tạo thành miRNA trưởng thành và gắn vào mRNA. Tuy
nhiên, mức độ bổ sung không phải 100%. Vì vậy miRNA
có xu hướng làm giảm quá trình dịch mã của mRNA hơn
là phá hủy nó.
