B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

B ộ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Đỗ THU TRANG

XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA AMLODIPIN

LUẬN Vă N THẠC s ĩ
•

•

D ư ợ c HỌC
•

•

CHUYÊN N G À N H : KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 607315

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Đình Chi
P G S.T S Thái Nguyễn Hùng Thu
I TRƯỜNG ĐH DƯỢC HA.

Lnấv J>2.lháL%

[s|đ k M

HÀ NỘI, NĂM 2011

^

Crijlocojis j


LỜ3 CẢm OR
Sau một thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp với nhiều cố gắng,
thời điểm hoàn thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn
chân thành cuả mình tới những người thầy đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian qua.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
-

TS. Lê Đình Chi

-

PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu

Là hai người thầy đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt
nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thị Hường Hoa - Trưởng khoa
Mỹ Phẩm cùng toàn thể cán bộ, nhân viên trong khoa Mỹ Phẩm đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ môn Hóa phân tích trường Đại học Dược hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn
này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu,

phòng đào tạo sau đại học và các thầy cô đã dạy dồ tôi trong suốt thời gian
học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bạn bè, đồng nghiệp và
gia đình tôi- những người luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
học tập cũng như thời gian thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2011
Học viên
Đỗ Thu Trang


MỤC LỤC
ĐẢT VẤN Đ Ề ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỎNG Q UAN....................................................................................3
1.1. TÔNG QUAN VỀ AMLODIPIN.......................................................................3
1.1.1. Tính chất...........................................................................................................3
1.1.2. Định tính, định lượng.....................................................................................4
1.1.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng...........................................................4
1.2.

ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG.......................................... 6

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG.............. 7
1.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):............................................................. 9
1.3.2. Điện di mao quản hiệu năng cao (HPCE)................................................. 11

1.4.

TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ u TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC......................14

1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước...............................................................14

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.............................................................. 16

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ..................18
2.1.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u ..................................................................... 18

2.2.

HÓA CHẤT, DỤNG c ụ VÀ THIẾT BỊ.................................................... 18

2.2.1. Hóa chất, chất chuẩn:.................................................................................. 18
2.2.2. Dụng cụ, thiết b ị............................................................................................19

2.3.

NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u ..................................................................... 20

2.3.1. Khảo sát khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipỉn bằng
phương pháp sắc ký ỉỏng hiệu năng cao.............................................................. 20
2.3.2. Khảo sát khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipin bằng
phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao................................................... 20


2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích.........................................................211
2.3.4. ứng dụng để phân tích amlodipin trong các chế phẩm....................... 211

2.4.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .............................................................. 21


2.4.1 .Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên cột sắc ký hoạt quang........................... 21
2.4.2. Điện di mao quản sử dụng các dẫn chất cyclodextrỉn làm chất chọn lọc
đối quang................................................................................................................... 23

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u ..........................................................26
3.1.

XÂY D ựN G PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHẢN ĐỐI

QUANG CỦA AMLODIPIN BẰNG HPLC..........................................................26
3.1.1. Khảo sát khả năng tách các đối quang của pha tĩnh gắn chất chọn lọc
đối quang ................................................................................................................. 26
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng tách đồng phân.................31
3.1.3. Lựa chọn điều kiện sắc ký........................................................................... 33
•

•

•

3.1.4. Thẩm định qui trình phân tích...................................................................33
3.2.

XÂY D ựN G PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHẢN ĐỐI

QUANG CỦA AMLODIPIN BẰNG HPCE....................................................2646
3.2.1. Khảo sát khả năng tách các đối quang bằng C E ..................................466
3.2.2. Lưa chon điều kiên điên di.......................................................................... 51
•


•

•

•

3.2.3. Thẩm định qui trình phân tích ................................................................ 522

3.3. ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP XÂY DựNG ĐƯỢC ĐẾ ĐÁNH GIÁ BẢN
CHẤT ĐỒNG PHÂN CỦA AMLODIPIN ĐƯỢC s ử DỤNG TRONG MỘT

SỐ BIỆT DƯỢC TRÊN THỊ TRƯỜNG.............................................................. 59
3.3.1. Phân tích đồng phân đối quang của amlodỉpin trong một số chế phẩm
bằng HPLC............................................................................................................... 59


3.3.2. Phân tích đồng phân đối quang của amlodipin trong một số chế phẩm
bằng C E .................................................................................................................... 61
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN..................................................................................... 65
KÉT LUẬN VÀ ĐẺ XUẤT................................................................................... 70


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AGP: acid al- glycoprotein
BGE (background electrolyte): Dung dịch điện ly nền
BP (British Pharmacopoeia): Dược điển Anh
BSA (Bovine Serum Albumine): Albumin huyết thanh bò
CE (capillary electrophoresis): Điện di mao quản
CD: cyclodextrin

CMCD: carboxymethyl-P-cyclodextrin
EOF ( Electro-osmotic flow):Dòng điện thẩm
EP (European Pharmacopoeia): Dược điển châu Âu
GLP (Good Laboratory Practice): Thực hành tốt phòng thí nghiệm
HPLC (High Performance Liquid Chromatography): sắc ký lỏng hiệu năng

HSA (Human Serum Albumine): Albumin huyết thanh người
ISO/IEC 17025: Quy chuẩn quốc tế về quản lý phòng thí nghiệm
LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện
LOQ (Limit of Quantitation): Giới hạn định lượng
PDA (Photo Diode Array): Mảng diod quang
RSD (Relative Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tương đối
TRIS: tris (hydroxymethyl) aminomethane
USP (United States Pharmacopoeia): Dược điển Mỹ
UV-VIS (Ultraviolet - visible): Tử ngoại - khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG
Nội dung

Trang

Bảng 3.1. Độ pha loãng của dung dịch chuẩn

34

Bảng 3.2. Độ pha loãng của dung dịch chuẩn amlodipin besỉlat racemỉc

34


Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng S-amlodipỉn và R-amlodỉpỉn trong chuẩn
amlodỉpin besilat racemỉc

35

Bảng 3.4. Ket quả khảo sát khoảng tuyến tính của R-Amlodipin

38

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của S-Amlodỉpin

39

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống

41

Bảng 3 .7. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

43

Bảng 3.8. Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với R-amlodỉpỉn

44

Bảng 3.9. Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với S-amlodipin

45

Bảng 3.10. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ S-amlodipin


54

Bảng 3.11. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích pỉc và nồng độ R-amlodipin

54

Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ lặp lại trên hai đồng phân đối quang
của amlodỉpin

56

Bảng 3.13. Ket quả đánh giá độ đúng với S-amlodipỉn

57

Bảng 3.14. Ket quả đánh giá độ đúng với R-amlodipin

57

Bảng 3.15. Thành phần công thức các chế phẩm chứa amlodipỉn đã
kiểm tra bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC

59

Bảng 3.16. Kết quả xác định hàm lượng amlodỉpỉn trong
chế phẩm bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC

61


Bảng 3.17. Thành phần công thức các chế phẩm chứa amlodipỉn đã kiểm
tra bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp CE

62

Bảng 3.18. Kết quả xác định hàm lượng amlodỉpin trong
chế phẩm bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp CE

64


DANH MỤC CÁC HÌNH
Nội dung
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử amlodỉpin besilat (a), cấu hình tuyệt đối
của S- amlodipỉn besỉỉat (b)
Hình 3.1. Sắc ký đồ thu được với dung dịch chất đổi chiếu amlodipin
besỉlat racemic với cột Cyclobond 1 2000, pha động là Trỉethylamỉn
p H 4,0.
Hình 3.2. Sắc kỷ đồ dung dịch chuẩn amlodipỉn racemic với dung môi
là acetonỉtril
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodỉpỉn racemỉc với dung môi
là methanol
Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipỉn racemỉc với dung môi
là 1-propanol
Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipỉn racemỉc với 1propanol 1%
Hình 3.6. Sắc kỷ đồ dung dịch chuẩn amlodỉpin racemỉc với 1propanol 2%
Hình 3 .7. Sắc kỷ đồ dung dịch chuẩn amlodỉpỉn racemic với 1propanol 3%
Hình 3.8. Sắc ký đồ thu được với dung dịch chuẩn amlodỉpin besilat
racemỉc khỉ phân tích trên cột Chiral AGP khỉ thay đối p H pha động
Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodỉpin racemỉc (a), dung

dịch thử viên nén Amlodỉpỉn amsyn-5(b)
Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn S-amỉodỉpỉn (a), dung dịch thử
viên nén Asomex(b)


Hình 3.11. Chồng phổ dung dịch chuẩn, dung dịch thử S-amlodipin

37

(à), R-amlodỉpỉn (b)
Hình. 3.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pỉc

39

của R-amlodipỉn
Hình. 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích

40

pic của
S-amlodipin
Hình 3.14. Anh hưởng của bản chất của chất hoạt quang tới độ phân

48

giải các đồng phân đối quang của amlodipỉn (a) P-cyclodextrin; (b)
CMCD
Hình 3.15. Anh hưởng của p H dung dịch điện ly nền acid phosphoric
50 mM tới độ phân giải các đồng phân đổi quang của amlodỉpỉn


49

a) p H = 1,6; b) p H = 2,5; c) pH = 3,5
Hình 3.16. Anh hưởng của nồng độ CMCD tới độ phân giải các đồng

50

phân đổi quang của amlodipin a) 0,1% ; b) 0,2%; c) 0,3%
Hình 3.17 .Điện di đồ của dung dịch chuẩn amlodipỉn racemic (a) và

51

dung dịch chuẩn S-amlodipin (b)
Hình 3.18 .Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình phân tích đồng phân
đổi quang của amlodipỉn bằng CE (Điện di đồ của chuẩn S-amlodỉpỉn

53

racemỉc (a), mẫu Asomex 2,5 (b), chuẩn amlodỉpỉn racemỉc (c) và mẫu
Amlodipỉn STADA (d))
Hình. 3.19. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích

54

pỉc của S-amlodipin
Hình. 3.20. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích

55

pỉc của R-amlodỉpỉn

Hình 3.21. Điện di đồ chuẩn amlodỉpỉn besilat racemic ở giới hạn

58


phát hiện (a) và giới hạn định lượng (b)
Hình 3.22. Phân tích định tính amlodỉpỉn trong chế phẩm bang HPLC
(Sắc kỷ đồ của chuẩn amlodipin racemic (a), mẫu Amsyn-5 chứa

60

amlodỉpỉn racemic (b), chuẩn S-amlodỉpin (c) và mẫu Asomex 5 chứa
S-amlodỉpỉn (d))
Hình 3.23. Phân tích định tính amlodỉpỉn trong chế phẩm bằng CE
(Điện di đồ của chuẩn S-amlodipỉn racemỉc (a), mẫu Asomex 2,5 (b),
chuẩn amlodỉpin racemic (c) và mẫu Amlodỉpỉn STADA (b))

63


ĐẶT VẤN ĐÈ
Nhiều hoạt chất đang lưu hành trên thị trường là các hợp chất hoạt quang
[17]. Các nghiên cứu khoa học đã cho thấy việc sử dụng đồng phân tinh khiết
thay thế cho hỗn hợp racemic của cùng hoạt chất đã đem lại nhiều hiệu quả hơn
trong điều trị như giảm liều dùng, giảm tác dụng không mong muốn và giảm độc
tính của thuốc. Thảm họa thalidomid vào những năm 60 của thế kỷ XX gây ra
khoảng 10.000 trường họp quái thai như giống hải cẩu, mất chi, bất thường tim,
thận, tai, mắt, hở mũi hở vòm miệng do dùng thalidomid để gây ngủ cho phụ nữ
mang thai. Các nghiên cứu cho rằng nguyên nhân gây quái thai là do dạng đồng
phân (S) trong hỗn họp racemic này [23]. Levamisol dạng đồng phân tả tuyền là

tetramisol có tác dụng trị giun sán nhưng đồng phân hữu tuyền lại gây độc tính.
Vì những lý do trên đã khiến ngành công nghiệp dược phẩm thế giới chuyển từ
sử dụng hỗn hợp racemic sang dùng riêng đồng phân đối quang tinh khiết.
Amlodipin là chất đối kháng kênh calci thuộc nhóm dehydropyridin. Phân
tử amlodipin có một nguyên tử carbon bất đối nên hợp chất này cũng tồn tại dưới
dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả tuyền (levamlodipin
hay S(-)-amlodipin) đóng vai trò chính để tạo ra tác dụng điều trị tăng huyết áp
và đau thắt ngực. S-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn R-amlodipin 1000 lần [26].
Trên thị trường, amlodipin đã được sử dụng dưới dạng hỗn họp racemic. Gần
đây, sau những nghiên cứu cho thấy sự khác biệt về tác dụng dược lý giữa hai
đồng phân đối quang của hợp chất này, nhiều nhà sản xuất đã đưa ra thị trường
các chế phẩm chỉ chứa S-amlodipin.

1


Phân tích đồng phân đối quang là một trong những kỹ thuật khó trong hóa
phân tích do bản chất lý hóa của hai đồng phân đối quang trong mỗi cặp đồng
phân đối quang là quá gần nhau.
Với cơ quan quản lý việc cấp số đăng ký cho các hoạt chất có bản chất là
đồng phân đối quang tinh khiết sẽ gặp nhiều khó khăn nếu năng lực kiểm nghiệm
của Việt Nam chưa đáp ứng được yêu cầu. Để nâng cao năng lực quản lý chất
lượng của thuốc trong hệ thống kiểm nghiệm nhằm góp phần bảo vệ, chăm sóc
sức khỏe nhân dân cũng như hội nhập với xu hướng phát triển chung của ngành
dược trên thế giới là nhiệm vụ cần và cấp thiết không chỉ của cơ quan quản lý mà
của cả ngành y tế.
Trước tình hình trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp
phân tích đồng phân đối quang của amlodipin” với hai mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp tách các đồng phân đối quang của amlodipin nhằm

định tính và định lượng các dạng đồng phân đối quang của amlodipin trong
các chế phẩm thuốc bằng HPLC và CE.
2. Áp dụng phương pháp xây dựng được để đánh giá bản chất đồng phân
(racemic hay enantiomer tinh khiết) của amlodipin được sử dụng trong một số
biệt dược trên thị trường.
Đây là một phần của đề tài cấp bộ: “Phân tích một số đồng phân đối quang
có tính chất dược lý chọn lọc khác nhau của chlorpheniramin,
dexchlorpheniramin, amlodipin,lamivudin”

2


CHƯƠNG 1. TỎNG QUAN
1.1. TÔNG QUAN VỀ AMLODIPIN

,n h 2
.c h 3

s o 3h

a)
Hình 1.1. Cẩu trúc phân tử amlodipỉn besỉlat (a), cẩu hình tuyệt đối của
S- amlodipin besilat (b)
Tên khoa học : 3-Ethyl-5-methyl(RS)-2-[2-aminoethoxy)methyl-4-(2chlorphenyl)-l, 4-dỉhydro-6-methyl-3,5-pyridindỉcarboxylat
1.1.1. Tính chất
1.1.1.1. Tính chất vật lý
- Bột trắng hay gần như trắng.
- Hơi tan trong nước và 2-propanol, tan tốt trong methanol, ít tan trong ethanol,
- Năng suất quay cực: -0,002° (dung dịch 1% kl/tt trong methanol, đo ở 20°C).
- Hàm lượng nước: 0,05%

1.1.1.2.Tính chất hóa hoc
- Nhân thơm: Hấp thụ u v
- Nhóm chức este: phản ứng thủy phân
- Nhóm NH2: Tính khử và tính base
- Nhân dihydropyridin : tính base và tính khử: bị oxy hóa bởi Ce2+tạo thành

3


pyridin, ứng dụng trong định lượng
1.1.2. Định tính, định lượng
1.1.2.1. Đinh tính
- Phương pháp quang pho hồng ngoại
Nguyên tắc: So sánh phổ hồng ngoại giữa chất thử và chất chuẩn Amlodipin.
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của amlodipin
besỉlat chuẩn (ĐC).
- Phương pháp sắc kỷ lớp mỏng
Nguyên tắc: tiến hành sắc ký lớp mỏng đối với chất thử và chất đổi chiếu
Amlodipin, kết quả phải cho vết chính tương ứng về vị trí, kích thước và màu sắc
với vết chính của dung dịch đối chiếu khi quan sát dưới đèn tử ngoại 366 nm.
- Phưcmg pháp đo quang
Nguyên tắc: Amlodipin có khả năng háp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ của
Amlodipin trong dung môi acid hydrocloric 0,1 N/methanol (TT) là 360 nm.
Tính toán độ hấp thụ riêng trong khoảng 113-121 hoặc so với chất chuẩn.
1.1.2.2. Định lượng
- Phương pháp acid-base trong acid acetic khan: dung dịch chuẩn là HC104
0,1M; chỉ thị đo thế.
- Phương pháp đo Ceri: Dùng dung dịch chuẩn là ceri amoni sulfat 0,1 M (chất
oxy hóa). Trong phản ứng, phần dihydropyridin bị oxy hóa thành pyridin.
- Phương pháp HPLC [5].

1.1.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
Amlodipin là dẫn chất của dihydropyridin có tác dụng chẹn calci qua
màng tế bào. Trong phân tó amlodipin có một nguyên tử carbon bất đối nên
amlodipin tồn tại dưới dạng hỗn họp racemic của 2 đồng phân đối quang. Nhiều

4


nghiên cứu đã chứng minh trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả
tuyền (levamlodipin hay S(-)-amlodipin) đóng vai trò chính để tạo ra tác dụng
điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực. S-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn Ramlodipin 1000 lần [26].
- Amlodipin ngăn chặn kênh calci loại L phụ thuộc điện thế, tác động trên
các mạch máu ở tim và cơ.
- Amlodipin có tác dụng chống tăng huyết áp bằng cách trực tiếp làm giãn
cơ quanh động mạch ngoại biên và có ít tác dụng hơn trên kênh calci cơ tim. Vì
vậy thuốc không làm dẫn truyền nhĩ thất ở tim kém đi và cũng không ảnh hưởng
xấu đến lực co cơ.
- Amlodipin không có ảnh hưởng xấu đến nồng độ lipid trong huyết tương
hoặc chuyển hóa glucose, do đó có thể dùng amlodipin để điều trị tăng huyết áp
ở người bệnh đái tháo đường.
- Tác dụng chống đau thắt ngực: Amlodipin làm giãn các tiểu động mạch
ngoại biên, do đó làm giảm toàn bộ lực cản ở mạch ngoại biên (hậu gánh phải).
Vì tần số tim không bị tác động hậu gánh giảm làm công của tim giảm, cùng với
giảm nhu cầu cung cấp nhu cầu oxy và năng lượng cho cơ tim. Điều này làm
giảm nguy cơ đau thắt ngực. Ngoài ra amlodipin cũng gây giãn động mạch vành
cả khu vực thiếu máu cục bộ và khu vực cung cấp máu bình thường. Sự giãn
mạch này làm tăng cung cấp oxy cho người bệnh đau thắt ngực thể co thắt. Điều
này làm giảm nhu cầu nitroglycerin và bằng cách này, nguy cơ kháng
nitroglycerin có thể giảm.
Chỉ định: Điều trị tăng huyết áp (ở người bệnh có biến chứng chuyển hóa như

đái tháo đường) và điều trị dự phòng ở người bệnh đau thắt ngực ổn định.

5


Chống chỉ định: Không dùng cho những người suy tim chưa được điều trị ổn
định. Quá mẫn với dihydropyridin.
Thận trọng: Với người giảm chức năng gan, hẹp động mạch chủ, suy tim sau
nhồi máu cơ tim cấp.
Tác dụng không mong muốn: Phản ứng phụ thường gặp nhất của amlodipin là
phù cổ chân, từ nhẹ đến trung bình liên quan đến liều dùng. Nhức đầu, chóng
mặt, đỏ bừng mặt, có cảm giác nóng, mệt mỏi, suy nhược, chuột rút, buồn nôn,
đau bụng, khó tiêu, khó thở [6].
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
Đồng phân đối quang (enantiomers) là hai đồng phân không gian dạng ảnh
và vật qua gương. Chúng có công thức hoá học hoàn toàn giống nhau, chỉ khác
về cách bố trí không gian của các nhóm thế quanh carbon bất đối. Đồng phân
quang học là hiện tượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về góc quay
của mặt phẳng ánh sáng phân cực. Điều kiện cho tính hoạt quang chính là: cấu
trúc hình học của phân tử phải như thế nào đó để phân tử không chồng khít với
ảnh trong gương của nó tương tự như quan hệ giữa bàn tay phải và bàn tay trái
(chirality). Ngoài sự khác biệt trong trong cấu trúc phân tá theo kiểu như sự khác
biệt của bàn tay phải và bàn tay trái, khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân
cực theo những góc bằng nhau nhưng ngược chiều nhau, còn lại tất cả các tính
chất lý hóa thông thường của các đồng phân đó là giống nhau. Chất mà có khả
năng làm quay mặt phảng của ánh sáng phân cực một góc a nào đó gọi là chất
hoạt quang. [3]
Cấu hình R và s (cấu hình tuyệt đối): Khi nguyên tử carbon liên kết với 4
nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử khác nhau C*abcd. Thiết lập trình tự un tiên của
nhóm thế carbon bất đối: a>b>c><± Người ta quan sát phân tử theo trục C-d từ


6


phía ngược với d nếu tò a->b->c đi theo chiều kim đồng hồ thì cấu hình là R
(rectus = p h ả i) trường họp ngược chiều kim đồng hồ thì cấu hình là s (sinister^
trái). Trong đấy, thứ tự ưu tiên a, b, c, d theo Cahn- Ingold- Prelog như sau:
-I>Br>Cl>S>F>0>N>C>H
-COOH > -c = 0 > -CHO > - CH2OH > -CH-R > -CH3 (R ở đây là các CH3) [10]
Chính sự khác nhau về cấu trúc không gian này làm cho chúng có tương
tác khác nhau với các thụ thể sinh học, như các chất mang, receptor, enzym. Vì
thế, đặc tính dược động học cũng như đặc tính dược lý của hai đồng phân đối
quang của một số thuốc có thể rất khác nhau. Có tới một nửa các dược chất đang
sử dụng hiện nay có đồng phân đối quang, mà 1/3 trong số đó có các đồng phân
đối quang mang đặc tính dược lý và hoặc dược động học khác nhau.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
Phân tích đồng phân đối quang là một trong những chủ đề khó trong hóa
phân tích do bản chất lý hóa quá gần nhau của hai đồng phân đối quang trong
mỗi cặp đồng phân đối quang. Các đồng phân đối quang có thể được tách bằng 2
cách, trực tiếp hoặc gián tiếp.
Theo cách gián tiếp: hai đồng phân này được tạo dẫn chất với một họp
chất đối quang khác để tạo ra hai sản phẩm là đồng phân quang học, nhưng
không phải là đối quang (diastereoisomers), như vậy chúng sẽ có tính chất vật lý
và hoá lý khác nhau nhiều hơn, do đó sẽ dễ tách ra khỏi nhau hơn.
Theo cách trực tiếp: các đồng phân đối quang được tách bằng một công cụ
phân tích có hiệu năng tách cao, và phải có sự góp mặt của một hoặc nhiều chất chọn
lọc đối quang. Các chất chọn lọc đối quang này có đặc điểm là tương tác khác nhau
vói các đồng phân đổi quang, do cấu trúc không gian của chúng. Có nhiều nhóm chất

7



chọn lọc đối quang, được xếp loại theo cấu trúc của chúng [12], [19]: các
cyclodextrin và dẫn chất, các oligo và polysaccarid, crown ether, các kháng sinh vòng
lớn, các protein, các chất trao đổi ion, chất diện hoạt và các calixaren.
Đặc điểm duy nhất có thể lợi dụng để tách riêng hai đồng phân đối quang
là khả năng tương tác khác nhau của chúng với những chất có ái lực khác biệt
với mỗi đồng phân đối quang của một hỗn họp racemic. Những chất này được
gọi là các chất chọn lọc đối quang (chiral selector). Các chất này được đưa vào
hệ thống tách để tương tác trực tiếp với hỗn họp đồng phân đối quang. Khi mức
độ khác biệt của quá trình tương tác với chất chọn lọc đối quang giữa hai đồng
phân đối quang đủ lớn, chúng sẽ được tách riêng. Các chất chọn lọc đối quang
có bản chất hóa học khá đa dạng, có thể chia thành các nhóm chính sau [14],
[25]:
-Nhóm 1: có bản chất protein (albumin huyết thanh (HSA, BSA), a 1-acid
glycoprotein

(AGP),...),

cyclopeptid,

một

sổ

kháng

sinh

macrocyclic


glycopeptid (vancomycin, teicoplanin, avoparcin, tubocurarin...) đã được dùng
để tách nhiều đồng phân đối quang.
-Nhóm 2: Các oligosaccarid không vòng và dẫn chất polysaccarid, phần
lớn là các phân tử như monosarcharid. Một số phân tử disaccarid, trissaccarit
cũng có thể ảnh hưởng giống như các monosaccarid tự nhiên đó là vị trí liên kết
và loại liên kết tạo nên khả năng nhận biết chất đối quang. Các chất hay dùng là
dan chat maltose, lactose, succrose, amylose, cellulose.
-Nhóm 3: chất chọn lọc đối quang dựa trên cấu trúc tạo thành một “hốc”
chọn lọc đối quang (chiral cavity). Đây là các cyclodextrin (CD) và dẫn chất (Pcyclodextrin, dẫn chất sulfat hóa, alkylhydroxy hóa của Ị3-CD), ether vòng,
polymer.

8


-Nhóm 4: chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện
tử Tí và nhóm nhận điện tử 71 (chất chọn lọc kiểu Pirkle)
-Nhóm 5: trao đổi ligand (ion đồng tạo phức với nhóm hoạt quang)
Sử dụng các chất chọn lọc đối quang kể trên, nhiều phương pháp tách đã
được sử dụng để phân tích các đồng phân đối quang, chủ yếu dựa trên các quá
trình sắc ký (lỏng, khí, pha siêu tới hạn) và điện di [20]. Trong đó, hai kỹ thuật
phổ biến nhất hiện nay để tách đồng phân đối quang làsắc ký lỏng hiệu năng
cao và điện di mao quản hiệu năng cao.
1.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
1.3.1.1. Khái niệm về phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- High Performance Liquid
Chromatography) là một kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các
chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp
suất cao.
Pha tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân, chất lỏng

được bao phủ trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc một chất mang rắn đã được
biến đổi bằng liên kết hóa học với nhóm hữu cơ.
Tùy thuộc vào bản chất các pha, kỹ thuật vàphương tiện sắc kýmà người
ta phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau:
- Sắc ký phân bố
- Sắc ký hấp phụ
- Sắc ký trao đổi ion
- Sắc ký loại trên cỡ
- Sắc ký ái lực
-

Sắc ký các đồng phân quang học

9


Trong đó sắc ký lỏng phân bố được sử dụng phổ biến nhất hiện nay.
1.3.1.2. Sắc kỷ lỏng hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang
Có ba lựa chọn để tách các đồng phân đối quang bằng HPLC:
1/Sử dụng pha tĩnh không gắn chất chọn lọc đối quang và một pha động
chứa chất chọn lọc đối quang.
2/Tạo dẫn chất để biến hai đồng phân đối quang thành hai diastereoisomer
có thể tách được bằng một hệ pha tĩnh-pha động thông thường.
3/Sử dụng pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối quang và pha động không chứa
chất chọn lọc đổi quang.
Lựa chọn thứ nhất không đòi hỏi các cột sắc ký hoạt quang đắt tiền,
nhưng nhược điểm là tiêu thụ nhiều chất chọn lọc đối quang hơn và hiệu quả
tách không lớn bằng áp dụng trên điện di mao quản.
Lựa chọn thứ 2 khó áp dụng do hạn chế trong việc tìm ra dẫn xuất phù
hợp và độ tin cậy của phương pháp bị ảnh hưởng bởi độ lặp lại của phản ứng tạo

dẫn xuất.
Trên thực tế, hiện tại lựa chọn thứ ba là xu thế phổ biến nhất, do số lượng
pha tĩnh thương mại hóa sẵn có lớn, tới khoảng 100 loại cột khác nhau [20] giúp
người làm phân tích có nhiều lựa chọn phù hợp với nhu cầu. Các Pha tĩnh chọn
lọc hoạt quang thương mại sử dụng các chất chọn lọc đối quang thuộc cả 5
nhóm kể trên (ví dụ: nhóm 1: Chiral HSA, Chiral AGP, Chirobiotic V; nhóm 2:
Chiralpak AD, Chiralcel OD; nhóm 3: Crownpack, Cyclobond; nhóm 4: ULMO,
Whelk-O 1; nhóm 5: Chiralpak WH, WM). Trong lĩnh vực phân tích dược
phẩm, đây vẫn là kỹ thuật được áp dụng nhiều nhất với số lượng công trình công
bố rất lớn [13]. So với các kỹ thuật tách đồng phân đối quang khác như kết tinh
chọn lọc, chiết... HPLC là phương pháp có khả năng ứng dụng rộng nhất, cho

10


phép tách các đồng phân đối quang của hầu hết các họp chất hoạt quang có tác
dụng dược lý. Ngoài ứng dụng trong phân tích, HPLC hoạt quang ở quy mô điều
chế cũng là một trong những kỹ thuật cơ bản để sản xuất đồng phân đối quang
tinh khiết ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, các pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối
quang chỉ cho phép tách tổt đồng phân đối quang của một số chất nhất định [20],
Do đó, để tìm ra được điều kiện tối ưu để phân tích đồng phân đối quang của các
dược chất hoạt quang thường gặp thì phòng thí nghiệm cần được trang bị một cơ
số đầy đủ cột hoạt quang với các loại pha tĩnh khác nhau. Đây là hạn chế cơ bản
nhất cho áp dụng rộng rãi HPLC hoạt quang vì các cột gắn Pha tĩnh chọn lọc đối
quang đều có giá thành cao.
1.3.2. Điện di mao quản hiệu năng cao (HPCE)
1.3.2.1. Cơ chế của quá trình diện di trong mao quản
Nguyên tắc của quá trình tách trong điện di mao quản là dựa trên tính chất
điện di khác nhau của các phần tử chất tan. Quá trình này xảy ra trong mao quản
trên nền dung dịch chất điện ly có pH thích họp, dưới tác dụng của một điện

trường E xác định đặt vào hai đầu mao quản.
Cơ chế của điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong mao
quản dưới tác dụng của lực điện trường nhất định (Electric Field Force, được
viết tắt là EFF) và tính chất của dòng điện thẩm ( Electro Osmotic Flow, được
viết tắt là EOF). EOF là một dòng chuyển khối phẳng trong mao quản. Bởi vì
lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng nhất dọc theo mao quản, cho nên
không có sụt áp trong mao quản. Dòng EOF đưa tất cả các tiểu phân có mặt
trong dung dịch điện ly nền, bất kể có điện tích hay không, di chuyển theo cùng
một hướng. Với điều kiện thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng
này di chuyển về catod. Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc độ

11


EOF thường lớn hơn nhiều so với tốc độ điện di. Cation di chuyển nhanh nhất
do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp theo các chất không mang điện tích di
chuyển theo EOF nhưng không tách khỏi nhau được. Cuối cùng là anion. Trên
điện di đồ thứ tự rửa giải theo thời gian như sau: cation có điện tích lớn kích
thước nhỏ ra trước nhất, anion có điện tích lớn và kích thước nhỏ ra cuối cùng.
Điện thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu mao quản được dùng trong
kỹ thuật CE là rất lớn, thông thường tò 10-30 kv. Chính lực điện trường này
làm động lực cho các phần tò chất tan di chuyển theo một hướng nhất định và
các chất có điện tích và độ lớn khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. Do
đó tạo nên sự phân tách của các chất phân tích.
Mao quản sử dụng trong CE thường có độ dài từ 25 đến 100 cm, đường
kính trong 25- 100 |4.m. Loại mao quản có đường kính trong khoảng 50- 75 Ịim
là thích hợp nhất vì hiệu ứng nhiệt nhỏ, dễ khống chế nhiệt độ mao quản. Mao
quản được chế tạo tò vật liệu khác nhau, nhưng phổ biến nhất là silica nung
chảy (fused silica).
1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng

• Điện thế: Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu
mao quản. Tuy nhiên, nếu tăng điện thế lên quá cao sẽ sinh hiệu ứng Joule tạo ra
gradient nhiệt trong mao quản và dẫn đến thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong
mao quản làm cho các phân tử ngay cả một chất tan cũng di chuyển không đồng
nhất dẫn đến sự khuếch tán khác nhau và làm mở rộng vùng mẫu.
• Nhiệt độ: Ảnh hưởng chính của nhiệt độ là làm thay đổi vận tốc và độ
dẫn điện của đệm. Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ trong mao quản tăng là
nguyên nhân thay đổi cấu tạo của protein, làm thay đổi thời gian điện di và hiệu
quả phân tích.

12


• Cột mao quản: Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính)
ảnh hưởng đến thời gian tách và hiệu quả phân tích. Nếu cả hai yểu tố là chiều
dài hiệu dụng và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và tăng
thời gian phân tích.
• Dung dịch đệm:
- Loại đệm và nồng độ: Đệm thích hợp cho CE là đệm có tác dụng tốt nhất
trong dãy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt trong đệm.
-

pH: pH của đệm có tác dụng lên khả năng phân tích và làm thay đổi EOF.
Tăng pH của đệm thường làm tăng EOF.

- Dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có thể làm tăng khả năng tan của một số
chất tan trong đệm. Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm thường làm
giảm EOF.
1.3.2.3. Điện di mao quản hiệu năng cao phân tích đòng phân đối quang
Điện di mao quản hiệu năng cao (HPCE- high performance capillary

electrophoresis) đang là kỹ thuật phân tích ngày càng được áp dụng rộng rãi hơn
trong phân tích đồng phân đối quang. Các chất chọn lọc đối quang sử dụng
trong điện di mao quản cũng chính là các chất chọn lọc đối quang được sử dụng
trong các pha tĩnh của HPLC. Nhưng khác với HPLC, trong điện di mao quản
các chất chọn lọc đối quang được hòa tan vào dung dịch điện ly nền
(background electrolyte-BGE). Các nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tách
đồng phân đối quang bằng CE cho thấy lợi thế lớn nhất của phương pháp này là
sự linh hoạt trong việc điều chỉnh điều kiện phân tích để tối ưu hóa kết quả. Một
ưu thế khác của CE trong phân tích đồng phân quang học là giá thành phân tích.
Các chất chọn lọc đối quang phổ biến nhất đều sằn có trên thị trường với giá
thành hạ hơn rất nhiều so với giá thành các cột sắc ký có gắn cùng chất chọn lọc

13


đối quang đó. Mặt khác, lượng tiêu thụ dung dịch điện ly nền trong điện di mao
quản rất nhỏ, do đó lượng chất chọn lọc đối quang đối quang tiêu thụ cũng nhỏ
hơn so với trường hợp đưa vào pha động để chạy sắc ký. Trong số 5 nhóm chất
chọn lọc đối quang đã liệt kê ở trên, các chất thuộc nhóm 1 và 3 được sử dụng
phổ biến hơn cả trong điện di mao quản [22], [24]. Mặc dù số chất chọn lọc đối
quang đã được dùng trong CE cho tới nay hẹp hơn số chất chọn lọc đối quang
được gắn lên pha tĩnh dùng trong HPLC, khả năng tách đồng phân đối quang
bằng CE hiện hoàn toàn có thể so sánh được với HPLC. Do đó, chỉ với một số
chất chọn lọc đối quang nhất định, người phân tích có thể giải quyết được việc
tách đồng phân đối quang cho một số lượng đối tượng phân tích rất rộng. Giải
pháp này khả thi và kinh tế hơn nhiều so với việc duy trì một cơ số cột sắc ký
hoạt quang cho phổ sử dụng tương đương. Trong các nhóm chất chọn lọc đối
quang đã kể ở trên, chúng tôi nhận thấy nhóm cyclodextrin, đặc biệt là betacyclodextrin và các dẫn xuất của nó, được áp dụng rộng rãi nhất với khả năng
tách đồng phân quang học rất mạnh, cho kết quả tốt trên hầu hết các nhóm dược
chất hoạt quang phổ biến [13], [21]. Loại gốc thế và mức độ thế trên cấu trúc

cyclodextrin vòng đóng vai trò quan trọng trong việc làm tăng mức độ của chất
hoạt quang. Các cyclodextrin có gốc thế mang điện tích âm và mức độ thế nhiều
hơn trên cấu trúc vòng cho độ phân giải tốt hơn khi phân tích hỗn họp đối quang
cation so với các cyclodextrin có gốc thế không mang điện. Đó là do sự di
chuyển ngược dòng của cyclodextrin có các gốc thế mang điện âm so với các
cation phân tích.
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ u TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

14


Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu đã tách hai đồng phân đối
quang bằng phương pháp điện di mao quản và sắc ký. Với sắc ký, mặc dù sắc ký
khí (GC) và sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC) cũng đã được dùng trong phân tách
đồng phân đối quang nhưng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn được sử
dụng nhiều nhất trong lĩnh vực này.
Hai đồng phân đối quang của amlodipin đã được nghiên cứu tách bằng
HPLC sử dụng pha tĩnh nhóm 1 (AGP, vancomycine) [16], [18]. Một số nghiên
cứu [16], [29] khảo sát sử dụng một số pha tĩnh dẫn chất cellulose và amylose
chưa tách được các đồng phân đối quang của amlodipin. B. Streel và cộng sự
khảo sát khả năng tách enatiomers của amlodipin trong máu bằng phương pháp
LC-MS trên các cột hoạt quang Chiral-AGP (150

X

4,0 mm), pha tĩnh chứa chất

chọn lọc đối quang acid a l- glycoprotein, trên cột hoạt quang Chiralcel OD-H
(250


X

4,6 mm), pha tĩnh chứa chất hoạt quang cellulose tris-(3,5-

dimethylphenyl carbamat), cột hoạt quang Chiralcel

OJ

(250

X

4,6 mm), pha tĩnh

chứa chất hoạt quang cellulose tris-4- methylbenzoat và trên cột hoạt quang
Chiralpak AD (250

X

4,6 mm), pha tĩnh chứa chất hoạt quang amylose tris-(3,5-

dimethylphenyl carbamat) với pha động đệm acetat 0,0IM, pH 4,5 - 1-Propanol
(99-1). Kết quả cho thấy enatiomers của amlodipin chỉ được tách trên cột cột
hoạt quang Chiral-AGP. Hệ thống sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ APCI
được trang bị giao diện ion hóa, giới hạn phát hiện của phương pháp này là
0,lr)g/ml. Jluksa và cộng sự đã tách R-amlodipin và S-amlodipin bằng HPLC
trên cột AGP và HPCE

với chất hoạt quang là a-cyclodextrin và methyl


cellulose với đệm pH 3,0 [26]. Ngoài ra, hai đồng phân của amlodipin cũng được
tách bằng pha động acetonitril- NaH2P 0 4 20 mM, pH 3,95 có chứa chất chọn lọc
đối quang sulphobutylether-p-CD 20 mM (35:100), thời gian lưu của S-

15