LÊ THỊ QUỲNH NGA

XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍsCH PHÁT
HIỆN MỘT SỐ CHẤT ứ c CHê MEN
PHOSPHODIẼSTERASE-5 TRỘN TRÁI PHÉP
TRONG THUố C ĐÔNG DƯỢC VÀ THựC PHẨM
CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ
•

•

Dược HỌC
•

•

CHUYÊN NGHÀNH

: KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ

: CH14053

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng


LỜI CẢM ƠN

V ới lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Trần Việt Hùng, người thầy tận tụy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt
quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Đốc Viện Kiểm N ghiệm thuốc
Trung Ương, Ban giám hiệu, Phòng quản lý sau đại học và các thầy cô giáo
trường Đại học Dược H à N ội đã tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt
quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các bạn đồng nghiệp Khoa Kiểm
nghiệm các dạng bào chế và Khoa Vật lý đo lường và đã giúp đỡ, san sẻ công
việc và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn này. Đặc biệt, tôi xin cảm
ơn DS. D ương M inh Tân, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực
hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên,
khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này.

H à Nội, ngày 06 tháng 10 năm 2011
DS. Lê Thị Quỳnh Nga


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỦ VIẾT TÁT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỎ THỊ
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐÒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐẺ

1


CHƯƠNG I. TỎNG QUAN

3

1.1

Vài nét về rối loạn cương dương

3

1.2

Chất ức chế PDE-5

3

1.2.1

Tống quan về chất ức chế PDE-5

3

1.2.2

Sildenafil

4

1.2.3


Vardenafil

5

1.2.4

Tadalafil

6

1.2.5

Các chất ức chế PDE-5 khác

6

1.3

Phương pháp phân tích chất ức chế PDE-5 trộn trái phép

7

trong thuốc và thực phấm chức năng
1.3.1

Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với

6


detector DAD (HPLC-DAD)
1.3.2

Phương pháp phân tích phổ khối (MS)

1.4

Thực trạng trộn trái phép các chất ức chế PDE-5 trong thuốc

12
18

đông dược và thực phẩm chức năng
1.4.1

Tình hình thế giới

18

1.4.2

Tình hình trong nước

18

CHƯƠNG II: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

21

2.1


Đối tượng nehiên cứu

21

2.2

Phương tiện nghiên cứu

21


2.2.1

Hóa chất - thuốc thử

21

2.2.2

Thiết bị - dụna cụ

21

2.3

Phương pháp nghiên cứu

22


2.3.1

Phương pháp phát hiện các chất ức chế PDE-5 bằna phương

22

pháp khối phổ trực tiếp (MS)
2.3.2

Xây dựne chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao (IIPLC)

27

để định tính, định lượng một số chất ức chế PDE-5
2.3.3

Khảo sát một số mẫu thuốc đôrm dược và thực phẩm chức

28

năng điều trị rối loạn cương dương
2.3.4

Phươns pháp xử lý số liệu

29

CHƯƠNG III: KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

31


3.1

31

Xây dựna phương pháp phát hiện một sổ chất ức chế PDE-5
bằng phương pháp khối phổ trực tiếp (MS)

3.1.1

Xây dựna phưcme pháp

31

3.1.2

Đánh 2 Ìá phương pháp

32

3.2

Xây dựns phương pháp định tính, định lượng một số chất

35

ức chế PDE-5 bằnơ phương pháp HPLC
3.2.1

Xây dựng phươne pháp


35

3.2.2

Đánh aiá phương pháp

38

3.3

Ket quả khảo sát một số mẫu thuốc đông dược và thực

50

phâm chức năng
3.3.1

Thuốc đông dược

50

3.3.2

Thực phẩm chức năns

53

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN


62

4.1

Xây dựns phươns pháp phân tích

62

4.2

Ket quả khảo sát một số mẫu thuốc đông dược và thực

63

phấm chức năns điều trị rối loạn cươns dương bằnạ phương
pháp khối phố trực tiếp và phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao với detector DAD


KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ
KÉT LUẬN

64

KIÉN NGHỊ

65

TÀI LIỆU THAM KHẢO


66

PHỤ LỤC


ACPI

: Atmospheric Pressure Chemical Ionization

ADP

: Adenosin diphosphat

ATP

: Adenosin triphosphat

CE-MS

: Capillary electrophoresis - Mass Spectrometry
Điện di mao quản kết hợp khối phổ

c. GMP

: Cyclic guanosine monophosphate

CI

: Chemical ionization (lon hóa hóa học)


DAD

: Diod array detector

El

: Electron Impact (Va chạm điện tử)

ESI

: Electro Spray Ionization (lon hóa bang phun điện tử)

GC-MS

: Gas Chromatogarphy - Mass Spectrometry
Sắc ký khí kết hợp khối phổ

GLP

: Good laboratory practice

HPLC

: High Performance Liquid Chromatogarphy
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IEC

: International Electrotechnical Commission


ISO

: International Standard

LOD

: Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

: Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)

MS

: Mass Spectrometry

Orgnization

Phổ khối lượne, gọi tắt là phổ khối
PDA

: Photodiode Array

PDE-5

: Phosphodiesterase-5

PKG

: Protein kinase


RSD

: Relative Standard Deviation

TT

: Thứ tự

ƯSP

: The United States Pharmacopoeia
Dược điển Mỹ

ƯV

: Ultraviolet


DANH MỤC CÁC BẢNG
«

Tên bảng
Đặc trưng phổ khối của các chất chống rối loạn cương
dương nhóm ức chế PDE-5
Ket quả các eiá trị chiều cao và diện tích pic của dãy chuẩn

23
39


xác định LOD của sildenafil
Ket quả các giá trị chiều cao và diện tích pic của dãy chuẩn

40

xác định LOD của vardenaíìl
Ket quả các giá trị chiều cao và diện tích pic của dãy chuẩn

41

xác định LOD của tadalafil
Ket quả khảo sát tính tuyến tính của sildenafil

43

Ket quả khảo sát tính tuyến tính của vardenaíìl

44

Ket quả khảo sát tính tuyến tính của tadalaíìl

45

Ket quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC (đối với

46

sildenafil)
Ket quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC (đối với


46

vardenafil)
Ket quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC (đối với

47

vardenafil)
Ket quả khảo sát độ lặp lại (đối với sildenafil)

48

Ket quả khảo sát độ lặp lại (đối với vardenaíĩl)

49

Kêt quả khảo sát độ lặp lại (đôi với tadalaíìl)

49


Tên hình
Sơ đồ biểu diễn cơ chế tác dụng của chất ức chế PDE-5

4

Cấu trúc hóa học của Sildenafil

4


Cấu trúc hóa học của Vardenafil

5

Cấu trúc hóa học của Tadalafil

6

Sơ đồ máy HPLC

8

Dòne ion

14

Bộ phận phát hiện ion

14

Hệ thống MS/MS Triple-quadrupole

15

Một số thực phẩm chức năng đã phát hiện bị trộn trái phép

20

chất ức chế PDE-5
Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu


22

Quá trình phân mảnh của phân tử Sildenafil

24

Quá trình phân mảnh của phân tử Vardenafil

25

Quá trình phân mảnh của phân tử Tadalafil

25

Phổ khối MS 1 lần full scan của dung dịch sildenafil 10

32

|ig/ml
Phổ khối MS/MS full scan của dung dịch sildenafil 10

33

ng/ml
Phô khối MS 1 lần full scan của dung dịch vardenafil 10

33

ng/ml

Phố khối MS/MS full scan của dung dịch vardenafil 10

34

|ig/ml
Phổ khối MS 1 lần full scan của dung dịch tadalafil 10

34

(Ig/ml
Phổ khối MS/MS full scan của dung dịch tadalafil 10 Ịig/ml

35

Sắc ký đồ của mẫu trắng phân tích bằng HPLC

38


Hình 3.8

Sắc ký đồ của dung dịch sildenafil 10 ng/ml phân tích bằng

38

HPLC
Hình 3.9

Sắc ký đồ của dung dịch vardenafil 10 |ig/ml phân tích bane


38

HPLC
Hình 3.10

Sắc ký đồ của dune dịch tadalafil 10 ng/ml phân tích bằng

39

HPLC
Hình 3.11

Sắc ký đồ xác định LOD của sildenafil

40

Hình 3.12

Sắc ký đồ xác định LOD của vardenafil

41

Hình 3.13

Sắc ký đồ xác định LOD của vardenaíll

42

Hình 3.14


Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (mcg/ml) và

43

diện tích pic (mAu.s) của sildenafil
Hình 3.15

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa none độ (mcg/ml) và

44

diện tích pic (mAu.s) của vardenafil
Hình 3.16

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (mcg/ml) và
diện tích pic (mAu.s) của tadalaíìl

45


ĐẬT VÁN ĐÈ
Từ năm 1998 đên nay, mới chỉ có 3 dược chất tônơ họfp thuộc nhóm ức chế
men phosphodiesterase-5 (PDE-5) được công nhận làm thuốc điều trị rối loạn
cươna, dươns đó là: sildenafil citrate (Viagra, Pfizer, 1998), vardenafil hydroclorid
(Levitra, Bayer, 2003), tadalafil (Cialis, Lily, 2003)[19], [25],
Tuy nhiên, từ xa xưa con naười đã có nhữne bài thuốc dân eian dùno đế
đièu trị cho đàn ông yêu sinh lý. Do vậy trên thị trườne cũn Si đã tồn tại rất nhiều
loại thuôc đône dược và thực phâm chức năng có nguồn sốc từ dược liệu dùng để
diêu trị rối loạn ciron 11 dương.
Trong những năm íiần đây, trên thế e,iới và cả ở Việt Nam đã phát hiện thấy

cả 3 dược chất trên và nhiều chất tương tự chúns chưa được côna nhận làm thuốc
được trộn trái phép trong nhiều thuốc và thực phâm chức năng [19], [20], [25].
Việc nàv đã và đang đe dọa nghiệm trọna đen sức khởe cộng done. Bơi vì. việc
chỉ định 3 loại thuôc trèn đê điều trị roi loạn cương dươn? cho bệnh nhân cần có
sự theo dõi chặt chỗ của bác sỹ về liều dùng và thời gian sử dụng. Doi với thuốc
đỏng dược và thực phâm chức năng thường, dược mua và điều trị mà không cần sự
kè đơn cua bác sỹ. Vì vậv, nếu nhữna loại thuốc nàv mà bị trộn trái phép các dược
chât trên, n s ư ờ i bệnh không biết sử dụns, lâu dài với lượng lớn thì sẽ Hây ra n h ừ ne

biến chứng và tác dụng phụ rất nguy hiếm.
Viện Kiêm nghiệm Thuốc Trung ưưng - Bộ y tế đã phát hiện một số thực
phâm chức năn 2 , và thuôc đôna dược có chứa các chât ức chê PDH-5 như: Supai
99 Tonskat All Plus (Malaisia) có chứa nor-acctildcnafil, Spartan (Malaisia) cỏ
chứa acetildenaíìl. Mãnh nam (neuyên liệu nhập từ Trune, Quốc) có chứa
acctildenafil.
Hiện nay, Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm đã có quyết định yêu cầu các
thuôc đông dược và thực phẩm chức năne có nguồn ?ốc từ dược liệu dùng để điều
trị rối loạn cươne dương phải được kiểm tra phát hiện sự có mặt của các chất ức
chế PDE-5. Tuy nhiên chưa có một phươnơ pháp phân tích chính thức và thốne
nhất để kiểm tra các chất này.


Vì vậy, chúne tôi tiến hành thực hiện đề tài
“XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN MỘT SÓ CHẤT
ỨC CHẾ MEN PHOSPHODIESTERASE S TRỘN TRÁI PHÉP TRONG
THUÓC ĐÔNG DƯỢC VÀ THỤC PHẨM CHỨC NĂNG ’, với các mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất ức chế PDE-5 trộn trái phép
trong thuốc đône dược và thực phấm chức năng bang MS
2. Xây dựnR phươns pháp định tính, định lượns sildenafil, vardenafil và
tadalafil trone mẫu tự tạo bans, HPLC-DAD

3. ứ n e dụng kiểm tra một số chất ức che PDE-5 trên một số loại thuốc đôna
dược và thực phẩm chức năng.


CHƯƠNG I

TỔ N G Q UAN

1.1. RỐI LOẠN CƯƠNG DƯƠNG [21]
Cương dươns; là một quá trình huvết độne lực học dựa trên nhữna tương tác
phức tạp giữa các yêu tố ngoại biên và các thành phần của hệ thần kinh trune,
ương, làm giãn cơ trơn và mạch máu ở thể hang tối đa. Khi có kích thích tinh
dục, các dây thần kinh ở thê hang và các tế bào nội mô sẽ phóng thích nitric
oxid, thúc đẩy sản sinh cGMP thông qua men guanylat cyclase, kết quả là làm
giảm calcium nội bào. dẫn đến aiãn cơ trơn thô hang. Lưu lượne máu đến
dươne; vật tăng lên, các khoane bên trong căng phone, neăn cản máu tĩnh mạch
trở về và kết quả là dương vật cươnạ lèn. Khi chuỗi tươnẹ tác trên bị phá vỡ bởi
các nguyên nhân vê tâm lý, nội tiêt, thần kinh, mạch máu cũne như tôn thươna
ở thể hang thì gây ra rối loạn cương dương (RLCD) ở nhiều mức độ khác nhau.
1.2. CHÁT ỨC CHÉ PDE-5
1.2.1. Tổng quan về chất ức chế PDE-5 [13]
Chât ức chè PDE-5 đùníỉ trons điều trị rối lọan cươns dươna là chất ức chế
cạnh tranh, chọn lọc trên PDE-5 (là men có nhièu ở the liana; dươne vật). Khi
có kích thích tình dục, nitric oxid từ các đây thân kinh, tế bào nội mô mạch
máu, sẽ phóng thích vào thể hang làm siãn các mạch máu và thể hang dươns
vật gây hiện tương cương dươne. Chất ức che PDE-5 sỗ ngăn chặn quá trình
phân hủy cGMP, từ dó làm tăng cường tác dụne eiãn mạch của nitric oxid và
khôi phục khả năna cươne của dương vật ở nhữne bệnh nhân bị rối lọan cươne,
dương.



T ẻ b à o th ẩ n
k inh h o ặ c nội
m ô m ach máu
■GT P

P rotein
/'A ĨP

N itric
O xide

Guanylyi Cyclase \ rGMP '
I

(

PKG

PDE5

AO P

Protein-P

1

5 '- G M P

Lo w e r C a*’


C h â t ức c h ê

G iãn m ạch

PDE-5

và th ê harm

H ình 1.1. Sơ đồ biêu diên cơ chế tác dim ẹ của chất ức chế PDE-5
Sildenafil đã được dưa vào thử nạhiệm lâm sànơ ở Đức từ năm 1995 và năm 1998
đã được cơ quan dược phâm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận và cho phép lưu hành
rộne rãi . Mặc dù cơ chê tác dụns của các loại thuốc nàv là giống nhau nlurna
chúng khác nhau về dược độna học, cấu trúc phân tử của sildenafil và vardenalìl
tươniĩ đối siốna nhau trong khi tadalaíìl thì lại rất khác với 2 loại này. Chính vì sự
khác biệt mới này trong câu trúc phân tử mà tadalaíĩl có vài ưu đicm hơn sildenafil
như: ức chế chọn lọc PDE5 hơn. thuốc có tác dụng nhanh hơn và kéo dài hưn,
khône, bị ảnh hưởntí bởi thức ăn lên sự hấp thụ của thuốc, và ít tác dụng phụ hưn.
1.2.2. Sildenafil 123]

0

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Sildenafil
Công thức: C 22H3oN60 4S
Tên khoa học: l-[4-ethoxy-3-(6.7-dihydro-l-methyl-7-oxo-3-propyl-l//-pyrazolo
[4.3-cỉ\ pyrimidin-5-yl) phenylsulfonyl]-4-methylpiperazine


Tính chất: Bột kết tinh trắng đến trắna xám nhạt, không mùi, vị đắna, khône tan
trone nước và ethanol.

Tác dụng phụ: Nhức đầu, đỏ bừng mặt, xung huyết mũi, khó tiêu, thị giác thay đổi,
nhìn mờ. Đặc biệt, có thê sâv quen thuốc và phụ thuộc vào thuốc.
Một số biệt dược có hoạt chất là sildenafil: Viagra (Pfizer); Kamaẹra (Ajata
pharma); Evadam (cône ty TNHH dược pham Sao Kim): Adraein (Cons tv Co
phan Cône nehệ Sinh học - Dược phâm ICA): Revatio (Pfizer)...
1.2.3. Vardenafil [23]
0

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Vardenafil
Công thức: C 22H 3()N60 4S

rèn khoa học: 4-[2-Ethoxy-5-(4-ethylpipcrazin-l-yl)sulfonyl-phenyl]-9-methyl-7propyl-3,5.6,8-tetrazabicyclo[4.3.0]nona-3,7.9-trien-2-one
'l ính chất: Bột kết tinh trang đến trắne nhạt, không mùi, vị đang, tan trong nước và
ethanol.
rác dụns phụ: Nhức đầu, đỏ bừng mặt. xung huyết mũi, khó tiêu, thị eiác thay đôi,
nhìn mờ. Trong một sô ít trường hợp, ạây cứng cơ, cương kéo dài, hoặc cương đau
Đặc biệt, có thể uây quen thuốc và phụ thuộc vào thuốc.
Một số biệt dược có hoạt chất là vardenaíìl: Levilra (Bayer); Levivina (cône ty
dược phâm Hà Tây); Staxyn (GlaxoSmithKline)...


1.2.4. Tadatafii Ị23]

Hình 1.4. Câu trúc hóa học của Tadaỉaýìỉ
Công thức: C 22H 19N 3O 4
Tên khoa học: (6/?-/2ữ/?)-6-(l,3-benzodioxol-5-yl)- 2,3.6,7.12,12a-hexahydro-2methyl-pyrazino

1,6] pyrido[3,4-ố]indole-l ,4-dione

Tính chất: Bột két tinh tran 2 ;, hầu như không tan trong nước, tan không dáng kê

trong methanol, acetone và ethanol.
Tác dụng phụ: Nhức đầu. khó tiêu, sưng mí mat. Đặc biệt, có thể eây quen thuốc
và phụ thuộc vào thuốc.
Một số biệt dược có hoạt chất là tadalaíìl: Cialis (Lily); Adcirca (Lily); Cialove
(Côna ty cổ phần sinh học dược phấm Ba Đình); Pycalis (Pymepharco). Tadalaiìl
20 mẹ (cône ty cổ phần dược phẩm Phú Thọ); Fadalafil Stada (Cônơ ty lien doanh
TNIIII Stada - Việt Nam)...
1.2.5. Các chát ức chế PDE-5 khác ị 26Ị
Hiện nay, chỉ có 3 dược chất tông hợp thuộc nhóm chất ức chê PDE-5 được công
nhận làm thuốc điều trị rối loạn cương dương. Ngoài ra các chất tương tự chúne
như: Homosildenafil, Hydroxyhomosildenafil. Acetildenafil. Nor-acetildenafil.
Hydroxyacetildenafil.
Aminotadalafil.

Piperadino

Dimethylsildenafil,

acetildenafil,

Piperadino

Sulfosildenafil,

vardenafil.

Sulfohomosildenafil,

Sulfoaildenafil, Benzamidenafil... chưa được công nhận là thuốc.



1.3. Phuo’ng pháp phân tích chất ức chế PDE-5 trộn trái phép trong thuốc
đông dược và thực phấm chức năng
1.3.1. Phương pháp phân tích bằng sắc kỷ lỏng hiệu năng cao với detector DAD
(HPLC-DAD) Ị1J, [2], /5/, /9/, [15]
1.3.1.1. Khái niệm [2], [9]
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography HPLC) là phương pháp pho biến nhất hiện nay được sử dụng để định tính và định
lượng trong phân tích kiêm nghiệm. Ra đời từ năm 1967 - 1968 trên cơ sở phát
triên và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột co điển, sắc ký lởng hiệu năng cao là
một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong
cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ
lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học
với các nhóm hữu cơ, dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại
theo kích cỡ.
- Detector DAD (Detector mảng diod)
Detector có một hoặc hai mảng diod đế nhận bức xạ đã tản sắc từ một cách tử kẻ
vạch băng laser. Quang phô và săc ký đô có thê hiên thị trên màn hình nhờ phân
mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Mặt khác, hệ thống này có thế cho
đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian
1.3.1.2. H ệ thống H P L C [9], Ị15J
Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ đồ hình 1.5.


1. Bình chứa dung
môi

pha

động


2. Bơm cao áp
3.

Bộ phận

tiêm

mâu
4. Cột HPLC (pha
tĩnh)
5. Detector
6. Mảy ghi tín hiệu

H ình 1.5. Sơ đồ mảy HPLC
a) Cột HPLC (pha tĩnh): Cột thường được làm bằng thép không gỉ, có chiều dài và
đường kính trong (ộ) khác nhau. Phần lớn quá trình phân tách được thực hiện ở
nhiệt độ phònẹ, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn.
Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60°c vì khả năng phân
huỷ của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thế xảy ra.
Sau đây là một sô pha tĩnh điên hình:
- Silcageỉ trung tính'. Dùng để tách các chất không phân cực và ít phân cực.
Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước. Ví dụ:
Lichrosorb Si 40, Si 60, Si 100; Hypersil; M- partisil; Micropack - S i . . .
Pha động dùng cho loại này là những chất không phân cực hay ít phân cực, thường
là các dung môi hữu cơ đơn hay hỗn hợp của vài dung môi hữu cơ không tan trong
nước như: Benzen, tolnen, cloroform, hex an, ethyl aceta t. . .
- Silỉcageỉ đã alkyl hoá: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực,
các chất phân cực có khả năng tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm OI ỉ



đã bị alkyl hoá tức là đã được gắn với mạch carbon thăng (C 8 . C18) hay các
carbon vòng (phenyl) vì thế nó không còn phân cực hay rất ít phân cực.
Ví dụ: Hvpersil ODS, lichrosorb RP18. - RP 8 . C 8 corasiỊ phenyl - corasil .
Pha động dùng cho loại này là các chât hữu cơ phân cực như methanol,
acetonitriì, nước hoặc hôn họp của chủng.
-

Siìicaẹel đã được sulfonic, nỉtro hoả hay amiiì hoá: Dùng đê tách các chât

có cấu tạo ion như các kim loại và hợp chất của chúne, hay các chât khi tan trong
pha độns; thì phân lv thành ion như các acid hay base. Ví dụ: Lichrosorb - NH2:
Lichrosorb - CN; Nucleosil - 5NII2; Partisil - SAX; Micropack; Hypcrasil APS.
b) Pha độne,
Dung môi dùng đề chuẩn bị pha động thường khône được chứa các chất
làm ổn định và phải trone suốt ở vùna bước sóne phát hiện, nêu như sử dụne
detector tử ngoại. Điều chỉnh pH. trong trườnR hợp cần thiết, thực hiện với thành
phần nước của pha động mà khône. điêu chỉnh với hôn hợp.
Pha dộng có thể chứa những thành phần khác, ví dụ như một ion trái dấu
dối với sắc ký tạo cặp ion hoặc một chât chọn lọc dối quang trons trường hợp săc
ký sử dụng, pha tĩnh bất đối. chất đệm pH để ổn định pi I. chất tạo phức đè tạo ra sự
rửa giai chọn lọc. chất điện li...
Các loại tluna mồi thích hợp cho tìm ạ loại pha tĩnh dùng phô biên dã dược
ncu ở phần chọn pha tĩnh.

1.3.1.3. Các đai lương đăc trưng / / / , [9Ị
* Thời gian lun tR (Retention time)
Thời e,ian lưu của một chất là thời gian cần dế chất đó di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sac ký, tới detector và cho píc trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm mau đến
khi xuất hiện đỉnh của píc).


tR = t() X (1 + k')

t(l: thời aian chêt, tức là thời gian lưu của một chất khône bị lưu RÌừ, tốc độ
di chuyển của nó bans tốc độ di chuyên của các phân tử dung môi.
k': hộ số dung lượng


Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian
lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn. Vì vậy, thời gian lưu là
đại lượng để phát hiện định tính các chất.
* Hệ so phân bô K
Là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh c s và trong pha động Cm tại

c
cm

thời điêm cân băng:

K = ——

Khi none độ chất tan không cao quá thì K là một hằng số, chỉ phụ thuộc
vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ. Đối với một chất, K càng lớn thì chất
đó phân bố nhiều vào pha tĩnh nên sẽ di chuyển chậm, và ngược lại.
* Hệ so dung lượng k' (Capacity factor)
Hệ so duns, lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2
pha và được tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan Qs trong
pha tĩnh (hoặc thể tích pha tĩnh Vs) và lượng chất tan Q mtrong pha động (hoặc thể
tích pha động Vm) ở trong thời điểm cân bằng.
Ả -'= -^ = K x ị
Qm


hoặc k '=
t0

^ - 1.
t0

Neu k ' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém, k ' lớn thì píc bị doãng, độ nhạy kém.
Trong thực tế k ' tù' 1 đến

8

là tối ưu.

* Độ chọn lọc a (Selectivity factor )
Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chat A, B có k'A
và

khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biếu thị ở độ chọn lọc a:
a = —^
k'B

t RA

tl 0

với điều kiện k

>k B


a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng ( a từ 1,5 đến 2,0 là tối ưu)
* Sổ đìa lý thuyết N (Theoretical plates)
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biêu thị hiệu năng của cột trong một điêu kiện sắc
ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiêu
cao là H, tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách


mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình
của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo một trong 3 công thức sau:
N = 16 X (7 ^ Ý
w

hoặc
'

5,54 X (Z7T Ý
w 05

hoặc

(% )2
O

W: Độ rộng đáy píc
W 0 5 : Độ rộng píc ở điêm ứng với 0,5 chiêu cao píc
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000.
* Độ phân giải R (Resolution)
Độ phân giải là đại lượne biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một
điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai píc cạnh nhau được tính theo công

thức:
R= Ĩ

1

( w .,+ w „ )

hoặc 1.18x7 t e a z O
(W „A+ W „ B)

Trong thực tế nếu các píc cân đối (Gauss) thì độ phân ẹiải để 2 píc tách tối
thiếu là R = 1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp. Neu R nhỏ thì các píc
chưa tách hẳn, việc tính diện tích píc sẽ không chính xác.
* Hệ sô bát đôi xứng T (Tailing, factor)
Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của píc trên sắc đồ
thu được.
T được tính bằng íỷ so độ rộng của 2 nửa píc tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều
cao píc.
Píc dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được, vì vậy phải quan
tâm đến hệ số không đối xứng T. khi T nằm trong khoảng 0,8 —2,0 thì phép định
lượng được chấp nhận.
1.3.1.4. ứ ng dụng của HPLC-DAD trong kiếm nghiệm phát hiện các chất trộn
trái phép trong các săn phẩm thuốc [5], [9]
* Định tỉnh:


Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc ký đồ của chuẩn và thử là cơ sở của
phép thử định tính. Trên máy HPLC với Detector Diod Array ta có thể vẽ phổ UVVIS của píc chuan và píc thử rồi chồng 2 phố với nhau đế thấy sự giống nhau về
dạng phổ thông qua hệ số match. Khi hệ số match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ
định tính giống nhau hoàn toàn.

Hệ so match > 0,900 chỉ ra 2 phổ tương tự nhau. Hệ so match càng gần
1 .0 0 0

thì sự tươne tự của phổ càng cao.
Hệ so match < 0,800 chỉ ra 2 phổ khác nhau.
Hệ so match từ 0,800 đến 0,899 cần làm thêm các phép thử khác trước khi

kết luận.
* Định lượng:
Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ píc chuẩn và píc thử (diộn tích
hoặc chiều cao píc) trong một điều kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép thử định
lượng. Khi mẫu thử là hồn hợp đa thành phần thì ta có thể định lượne đồníĩ thời
các hoạt chất được tách ra nếu sự tách đạt yêu cầu quy định.
1.3.2. Phương pháp phân tích phổ khối (MS) [1], [3], [8 ], [11]
1.3.2.1. Nguyên tắc [1]
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ sổ này được
biêu thị bằng đơn vị khôi lượng nguyên tử hoặc bang Dalton.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được aia tốc và tách riêng nhờ
bộ phận phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra
trong hệ thiết bị chân khônẹ: áp suất trong hệ dao động lừ 10 ’ Pa đến 10~6 Pa. tín
hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ
khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Nó cuns cấp thông tin
định tính (khối lượng phân tử, nhận dạns các chất) xác định cấu trúc và định lượng
các chất.
1.3.2.2. Cấu tạo mảy khối phổ Ị1], [8], [11]
Máy khối phổ gồm các bộ phận sau:


* Bộ nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy. Neu mẫu ở dạns; lỏng hoặc dạne rắn thì cần

phải chuyến sang dạng hơi bằng cách thích hợp.
* Bộ n^uồn ion: lon hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi.
Có nhiều phương pháp đê ion hóa phân tử và nguyên tử của mầu ở trạníi
thái khí hoặc hơi. Các phương pháp chủ vếu là:
- Va chạm electoron (Electron Impact - EI):
Va chạmđiện tử (Electron Impact. EI), dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác
dụng của chùm

điện tử hoặc ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là

70eV. Trước đây, phổ EI-MS được sử dụng phổ biến, nhưns hiện nay, khi phân
mảnh nhẹ nhàne (soft fragmentation) bănạ kỳ thuật ion hóa phun điện tử ESI MS, cho phép eiữ được các đặc trim® phân mảnh thì EI-MS ít sử dụng hơn. EI-MS
có lợi điẻm là hiện có thư viện phô các hợp chất hữu cơ và dược chất rất phong
phú. lên tới hàns trăm neàn chất.
- lon hóa hóa học (Chemical ionization - CI)
Cỉ là kỳ thuật ion hóa dùng một thuốc Ihử (metan, ammoniac) va chạm với
chùm tia electron năng lượng cao đê tạo ra các ion hoặc aôc tự do.
- lon hóa bằng phun sươne khử sovat (dissolvation nebulization sources)
Kỹ thuật

này tạo ra ion từ phân tử trona duna dịch. Dung dịch ở trons cột

mao quản kim loại (tốc độ dòng dao độne từ

lml đến 10 ml/phút). Neười tadặt

một trường điện eiữa đầu mao quản và một điện cực (diện thế có thể đến +4000V)
các giọt mịn (hạt sương) mang điện tích được tạo thành và e,ia tốc đến điộn cực.
Đây là ion hóa bằng tia điện (elcctrospray ionization - ESI). ESI thích hợp dể ion
hóa các chất phân cực và các phân tử có khối lượns phàn tử lớn.

- Nguồn ion hóa bằng aiải hap (Ionization desorption sources)
Neuyên tắc của kỹ thuật nàv dựa trên quá trình phát thứ cấp, bắn phá một
mẫu ở dạns lỏne hoặc ran bane một chùm tia sơ cap: electron,

ion hoặcphoton.

Các hạt thứ câp như electron, ion hoặc phân tử trung hòa sỗ được tạo thành. Chỉ
các hạt này được phân tích bằng khối phổ.


* Bộ phân tích khối: Tách các ion theo tỷ số m/z.. Các ion được gia tốc và tách
riêne nhờ tác dụng của từ trườne. điện trườne để đi đến detector.
- Bơm chân không
Các ion được tạo ra ở mặt phân eiới khi vào trong máy phân tích MS sỗ
không thể tồn tại được nếu va đập với các phân tử không khí. Vì vậy yêu càu
đầu tiên để vận hành máy MS là phải đạt môi trường chân không cao.
Có 2 loại bơm tạo chân khỏna:
+ Bơm dầu: tạo áp suất chân khône ban đầu 1,4 torr ở mặt phân giới và
10"4 torr ờ bộ phận dẫn đường ion. Trong trường hợp máy đang chạy mà mất
điện đột ngột thì dầu có thể tràn vào buồng chân không gây bân, hỏng thiết bị.
+ Bơm tua - bin:

2 ồm

hệ thống nhiều bơm phân tử tua - bin được kết nối

để tạo ra mức chân khônẹ cao hơn 10"6. Các bơm tua - bin có nhiều van dược
dặt trôn một trục quay ở tốc độ cao. Các van này loại bỏ không khí từ buồn 2 ,
chân không và hút không khí ra khỏi bơm. Bơm này cỏ ưu điếm là không, làm
bẩn máy. nhưn£ tuồi thọ kém.

* Detector:
Chuyển các ion thành tín hiệu điện. Mầu sau khi bị ion hoá dược hirớns,
tới máy phân tích MS. các kiêu ion tươna: tự nhau được tập trung lại thành dòng
(í lình 1 .2 ).
Draw out
p la te

Ent ranee
le n s

Q uad rt_j pol e rods

; ệ

1

1

Q -.Q -

Focusing iens
FtR/dc generator
Power supply

F IC L R i :

7 .2.

Focus len-


Hình 1.6. Dònẹ ion
Bê mặt tích điện trực tiếp (The direct-current dc) của máy phân tích được quét vứi


các tần số tín hiệu (radio-frequency RF), mồi tần số quét lựa chọn những ion có số
khối khác nhau, cho phép chúne đi theo đường ổn định tới detector. Các ion ôn
định tại mỗi tần số được tống ra để đập vào detector ion. ở đây các ion được đếm
về sổ lượne lạo ra tín hiệu rồi chuyển đến máy tính. Nhữne ion không được lựa
chọn sẽ bị loại bở trong quá trình di chuyên.
Khi hạt mang điện đập vào bề mặt màns detcctor làm cho mặt bên kia của
detector giải phóng electron. Các electron này tới đập vào thành của detector làm
giải phóng nhiều electron hơn sau mồi lần va đập. Từng đợt va đập electron làm
tăng cường tín hiệu rồi được chuyến về hệ thong dừ liệu (Hình 1.3).
Ouadrupole

Amư

H ình 1.7. Bộ phận phát hiện ion

Máy phân tích MS/MS thường kết hợp 2 máy phân tích MS có tế bào va
dập (a collision cell). Ion đích được lựa chọn từ máy phân tích MS đầu tiên dược
phép va đập với phân tử khí trơ đè kích thích phân mảnh. Sau đó các ion mảnh đi
vào trong máy phân tích MS thứ 2 đe phân tách và xác định (Hình 1.4).

Q1

Q2

Q3


dc/RF

RF only.
no dc

dc/RF

Hình 1.8. Hệ thông MS/MS Triple-quadrupole


* Bộ xử /ý í/ỉ7’ liệu: Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyên
thành tín hiệu sô phục vụ xử lý dữ liệu theo yèu câu khác nhau như: ehi pho khối,
định lượna...
1.3.2.3. M ột sổ kỹ thuật khối phổ sử dụng để phát hiện sildenafil, tadala/ĩl và
vardenafil và các dân chất của chúng Ị4Ị
* K ỹ thuật MS một lần Full scan (Scan toàn thang) :
Giả sử ta có một hồn hợp A, B, c được tách ra sau khi qua cột sắc ký lỏng
và lần lượt đưa vào khôi phô với kỹ thuật APCI (+)
A

—>

B
c

A + l. Aị. A 2. A3...
B+l, B,, B2, B3...

->


C + l,C i. c 2 , c 3...

Khối pho kế ehi nhận tons cườna độ các ion sinh ra từ A. B. c . Ta có một sắc đồ
toàn ion TIC (Total ion chromatogram) và khôi phô được lấy theo Full Scan MS
trong khoảng khối lượne; ghi hết tất cả các ion sinh ra từ A. B. c.