BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ HỒNG VÂN

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TIÊU
CHUẨN VIÊN NANG MỀM CEBRATON
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ HỒNG VÂN

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TIÊU
CHUẨN VIÊN NANG MỀM CEBRATON

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ 60 73 15

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2012


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời biết ơn chân thành, lòng kính
trọng tới PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – người Cô trực tiếp hướng dẫn, người đã
dành nhiều thời gian và tâm huyết, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn Công ty Cổ phần Dược Phẩm Traphaco đã cung cấp
sản phẩm, nguyên liệu và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi hoàn thành đề tài này.
Xin cảm ơn các cô, các chú, các anh chị đang công tác tại phòng Thí nghiệm
trung tâm, Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia, những người luôn tận tình giải đáp
những thắc mắc trong công việc và đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
luận văn tốt nghiệp.
Xin gửi lời biết ơn tới ban lãnh đạo Trường Đại học Dược Hà Nội và các thầy
cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại
trường.
Và cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với người thân, bạn bè, những
người luôn sát cánh, chia sẻ, động viên giúp tôi hoàn thành khóa học và luận văn tốt
nghiệp.
Hà Nội, tháng 09 năm 2012
Học viên

Ngô Thị Hồng Vân


MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................. 1
PHẦN I. TỔNG QUAN ............................................................................................... 3
1.1.

Tổng quan về cây Đinh lăng ............................................................................ 3

1.1.1.

Đặc điểm thực vật ..................................................................................... 3

1.1.2.

Tác dụng dược lý của Đinh lăng ............................................................... 3

1.1.3.

Bộ phận sử dụng và thu hái ....................................................................... 3

1.1.4.

Thành phần hóa học .................................................................................. 4

1.2 Tổng quan về cây Bạch quả. ................................................................................ 4
1.2.1.

Đặc điểm thực vật ..................................................................................... 4

1.2.2.

Tác dụng dược lý của Bạch quả ................................................................ 5


1.2.3.

Bộ phận dùng và thu hái ........................................................................... 6

1.2.4.

Thành phần hóa học .................................................................................. 6

1.3.

Tổng quan các chất hóa học được định lượng trong chế phẩm Cebraton .......... 7

1.3.1.

Acid oleanolic ........................................................................................... 7

1.3.2.

Flavonol glycosid trong cao bạch quả ..................................................... 11


1.4.

Một số chế phẩm có chứa Đinh lăng và cao Bạch quả trên thị trường Việt Nam
...................................................................................................................... 17

1.5.

Tình hình tiêu chuẩn hóa chế phẩm đông dược .............................................. 18


1.6.

Vài nét về sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................. 19

1.6.1.

Nguyên tắc của HPLC ............................................................................ 19

1.6.2.

Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký ........................................... 20

1.7.

Các phương pháp định lượng bằng HPLC ..................................................... 21

PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 24
2.1.

Đối tượng, nguyên vật liệu và trang thiết bị ................................................... 24

2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 24

2.1.2.

Dụng cụ, thiết bị ..................................................................................... 24


2.1.3.

Hóa chất và thuốc thử ............................................................................. 25

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 25

2.2.1.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc ................................................................ 25

2.2.2.

Phương pháp chiết và định lượng acid oleanolic trong viên nang mềm
Cebraton ................................................................................................. 26

2.2.3.
2.3.

Định lượng flavonol glycosid trong chế phẩm nang mềm Cebraton ........ 31

Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 34

PHẦN III. THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ .................................................................. 35


3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid oleanolic trong viên nang
mềm Cebraton ................................................................................................. 35
3.1.1.


Khảo sát phương pháp xử lý mẫu định lượng acid oleanolic ................... 35

3.1.2.

Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic trong chế phẩm
Cebraton bằng HPLC .............................................................................. 38

3.1.3.

Thẩm định phương pháp phân tích acid oleanolic trong chế phẩm
Cebraton ................................................................................................. 39

3.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonol glycosid trong chế
phẩm viên nang mềm Cebraton ........................................................................ 47
3.2.1.

Phương pháp xử lý mẫu để định lượng flavonol glycosid ........................ 47

3.2.2.

Điều kiện sắc ký ..................................................................................... 49

3.2.3.

Thẩm định phương pháp định lượng flavonol glycosid trong chế phẩm
Cebraton ................................................................................................. 50

3.3. Ứng dụng định lượng acid oleanolic và flavonol glycoside trong một số lô chế
phẩm Cebraton................................................................................................. 62

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ......................................................................................... 63
4.1.

Phương pháp xử lý mẫu ................................................................................. 63

4.1.1.

Phương pháp xử lý mẫu định lượng acid oleanolic .................................. 63

4.1.2.

Phương pháp xử lý mẫu định lượng flavonol glycoside ........................... 63

4.2.

Phương pháp phân tích .................................................................................. 64

4.2.1.

Phương pháp phân tích acid oleanolic ..................................................... 64


4.2.2.
4.3.

Phương pháp phân tích flavonol glycosid................................................ 65

Kết quả định lượng ........................................................................................ 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 68

1. Kết luận ............................................................................................................ 68
2. Kiến nghị .......................................................................................................... 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

DAD

Detector mảng diod
(Diode Array Detector)

DDVN

Dược điển Việt Nam

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance liquid chromatography)

IR

Hồng ngoại
(Infrared)


IUPAC

Liên minh quốc tế về hóa học thuần túy và
ứng dụng
(International Union of Pure and Applied
Chemistry)

LC-MS

Sắc ký lỏng khối phổi
(Liquid chromatography- mass spectrometry)

MeOH

Methanol

mtb viên

Khối lượng trung bình viên

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối
(Relative standard)

RRT

Thời gian lưu tương đối
(Relative retention time)



Spic

Diện tích pic

tR

Thời gian lưu
(Retention time)

TEA

Triethyl amin

THF

Tetrahydrofuran

tt

Thể tích

USP

Dược điển Mỹ
(United state pharmacopoeia)

UV-VIS

Tử ngoại khả kiến

(Ultraviolet visible)


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic................................................ 9
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng flavonol glycosid ........................................ 14
Bảng 1.3. Các sản phẩm lưu hành trên thị trường ....................................................... 17
Bảng 2.1. Danh mục chất chuẩn ................................................................................. 25
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống phương pháp định lượng acid
oleanolic ..................................................................................................................... 39
Bảng 3.2. Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic .......................... 43
Bảng 3.3. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp định lượng acid oleanolic ..... 45
Bảng 3.4. Kết quả xác định độ đúng phương pháp định lượng acid oleanolic ............. 46
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống sắc ký định lượng Quercetin,
Kaempferol, và Isorhamnetin...................................................................................... 51
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ Quercetin, Kaempferol,
Isorhamnetin............................................................................................................... 58
Bảng 3.7. Kết quả xác định độ lặp lại định lượng flavonol glycosid............................ 59
Bảng 3.8. Kết quả xác định độ đúng định lượng flavonol glycoside ............................ 61
Bảng 3.9. Kết quả định lượng acid oleanolic và flavonol glycosid trong một số lô chế
phẩm Cebraton ........................................................................................................... 62


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Quy trình xử lý mẫu để định lượng acid oleanolic ....................................... 37
Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định độ phù hợp hệ thống định lượng acid oleanolic ............. 40
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu trắng .................................................................................... 41
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu placebo ................................................................................ 41
Hình 3.5. Sắc ký đồ acid oleanolic chuẩn ................................................................... 42
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu thử định lượng acid oleanolic .............................................. 42

Hình 3.7. Đường biểu diễn mối tương quan giữa Spic và nồng độ acid oleanolic chuẩn 44
Hình 3.8. Chồng phổ sắc ký đồ tính tuyến tính định lượng acid oleanolic ................... 44
Hình 3.9. Quy trình xử lý mẫu định lượng flavonol glycosid ...................................... 48
Hình 3.10. Phổ hấp thụ UV-VIS của Quercetin .......................................................... 49
Hình 3.11. Phổ hấp thụ UV-VIS của Kaempferol ....................................................... 49
Hình 3.12. Phổ hấp thụ UV-VIS của Isorhamnetin ..................................................... 49
Hình 3.13. Sắc ký đồ xác định độ phù hợp hệ thống sắc ký định lượng Quercetin,
Kaempferol và Isorhamnetin ...................................................................................... 51
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu placebo .............................................................................. 53
Hình 3.15. Sắc ký đồ Quercetin chuẩn ........................................................................ 53
Hình 3.16. Sắc ký đồ Kaempferol chuẩn ..................................................................... 53
Hình 3.17. Sắc ký đồ Isorhamnetin chuẩn ................................................................... 54


Hình 3.18. Sắc ký đồ hỗn hợp Quercetin, Kaempferol, và Isorhamnetin chuẩn ........... 54
Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu thử định lượng Quercetin, Kaempferol, và Isorhamnetin ... 54
Hình 3.20. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ Quercetin 56
Hình 3.21. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ Kaempferol
................................................................................................................................... 56
Hình 3.22. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
Isorhamnetin............................................................................................................... 57


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội ngày càng phát triển, mọi người bắt đầu quan tâm hơn đến sức khỏe bản
thân, đặc biệt là sức khỏe tâm thần, thần kinh. Vì vậy nhu cầu về các thuốc tăng cường
tuần hoàn não, bổ thần kinh ngày càng tăng lên, trong khi các sản phẩm thuốc nhập
khẩu với tác dụng tương tự có giá thành khá cao và có xu hướng tăng giá, nên việc đa
dạng hoá sản phẩm Hoạt huyết dưỡng não nói chung và chế phẩm Cebraton nói riêng
có ý nghĩa lớn về khoa học và kinh tế.

Sản phẩm Hoạt huyết dưỡng não chứa hai thành phần chính là cao rễ Đinh lăng
và cao lá Bạch quả đã được công ty Traphaco sản xuất dưới các dạng bào chế: viên bao
đường, bao phim, viên nang mềm hoặc thuốc nước phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng
đồng. Doanh thu các dạng sản phẩm Hoạt huyết dưỡng não hàng năm đạt hàng trăm tỷ
đồng. Do đó việc mở rộng và nâng cao chất lượng của sản phẩm là việc hết sức cần
thiết.
Thành phần chính của Cebraton là cao rễ Đinh lăng và cao lá Bạch quả, công
thức viên:
-

Cao rễ Đinh lăng: 300mg

-

Cao lá Bạch quả: 100mg

-

Tá dược: vừa đủ

Việc kiểm tra chất lượng chế phẩm còn tương đối đơn giản: đối với Đinh lăng mới chỉ
dừng lại ở bước định tính thành phần saponin; đối với Cao bạch quả đã thực hiện định
lượng hàm lượng flavonol glycosid dựa trên một thành phần duy nhất là Quercetin. Do
đó chúng tôi thực hiện đề tài này với mong muốn nghiên cứu, cải tiến phương pháp
định lượng các hoạt chất chính trong chế phẩm.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu nâng cao tiêu chuẩn chất
lượng của viên mang mềm Cebraton” với 2 mục tiêu chính như sau:

1



1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic trong cao Đinh lăng
và các aglycol của các glycosid trong cao Bạch quả của viên nang mềm
Cebraton bằng HPLC với detector UV.
2. Ứng dụng phương pháp định lượng này để kiểm tra chất lượng một số lô chế
phẩm viên nang mềm Cebraton.

2


PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về cây Đinh lăng

1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms.), họ Nhân sâm (Araliaceae) là
một loại cây nhỏ, thân nhẵn, không có gai, thường cao 0,8 đến 1,5m. Lá kép 3 lần, xẻ
lông chim dài 20 – 40 cm, không có lá kèm rõ. Lá chét có cuống gầy dài 3-10 mm,
phiến lá chét có răng cưa không đều, lá có mùi thơm. Cụm hoa hình chuỳ ngắn 7-18
mm gồm nhiều tán, mang nhiều hoa nhỏ. Tràng 5, nhị 5 với chỉ nhị gầy, bầu hạ 2 ngăn
có dìa trắng nhạt. Quả bẹt dài 3-4 mm, dày 1 mm có vòi tồn tại [2].
1.1.2. Tác dụng dược lý của Đinh lăng
Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình. Lá vị nhạt, hơi đắng, tính bình, có tác dụng
bổ năm tạng, giải độc, bổ huyết, tăng sữa, tiêu thực, tiêu sưng viêm.
Đinh lăng là thuốc có tác dụng tăng lực, làm tăng sức chịu đựng của cơ thể đối
với các yếu tố bất lợi như kiệt sức, mệt mỏi, nóng. Hơn nữa, đinh lăng làm cho nhịp
tim trở lại bình thường sau khi chạy dai sức và làm cho cơ thể chịu được nóng. Người
bệnh bị suy mòn uống Đinh lăng chóng phục hồi cơ thể, ăn ngon, ngủ tốt, tăng cân, và
làm tử cung co bóp mạnh hơn. Đinh lăng ít độc hơn cả nhân sâm và khác với nhân

sâm, nó không làm tăng huyết áp [4], [10].
1.1.3. Bộ phận sử dụng và thu hái
Rễ, thân cành và lá của cây Đinh lăng
Dược liệu sử dụng là phần dưới mặt đất của cây Đinh lăng (củ), được rửa sạch,
thái lát mỏng ngang, phơi sấy khô. Lát cắt có độ dày 0,5cm; màu trắng ngà, trên mặt
vết cắt nhìn rõ gỗ xếp thành tia từ giữa toả ra. Lớp vỏ rễ dày, mặt ngoài vỏ rễ màu trắng
đục, có nhiều nếp nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con còn sót
lại. Dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm, nhấm có bột, mùi thơm, vị ngọt hơi mặn [2].

3


Thu hái: Đinh lăng có thể thu hoạch quanh năm, tốt nhất là vào tháng 11-12. Củ
và rễ tươi đã thu hoạch cần chế biến ngay, không để quá 5 ngày [4], [10].
1.1.4. Thành phần hóa học
Các thành phần hóa học chính trong Đinh lăng: glucosid, alcoloid, saponin triterpen,
tanin, acid amin, vitamin…
Hai hợp chất quan trọng chính là polyacetylene và saponin (triterpenoid), đặc biệt có
nhiều trong rễ và lá [4], [10].
Để đảm bảo chất lượng dạng bào chế, dược liệu đưa vào sản xuất phải được tiêu
chuẩn hóa. Trong họ nhân sâm, tam thất, ngũ gia bì, saponin được coi là một trong
những thành phần có tác dụng chính của dược liệu. Hơn nữa, theo các tài liệu đã công
bố thì Đinh lăng có chứa alcaloid, saponin, acid amin, vitamin… nhưng các nghiên cứu
này chỉ mới ở mức định tính [2].

1.2.

Tổng quan về Bạch quả

1.2.1. Đặc điểm thực vật

Bạch quả (Ginkgo biloba, họ Ginkgoaceae) là cây thân gỗ rất lớn, thông
thường đạt tới chiều cao 20–35 m. Cây có tán nhọn và các cành dài, gồ ghề, thông
thường có rễ ăn sâu có khả năng chống chịu sự tàn phá của gió, tuyết. Các cây non
thường cao và mảnh dẻ, ít phân cành; tán lá trở nên rộng hơn khi cây lớn. Trong mùa
thu, lá đổi màu thành vàng sáng và sau đó bị rụng, đôi khi chỉ trong một khoảng thời
gian ngắn (1–15 ngày) [2].
Sự kết hợp giữa khả năng kháng chịu sâu bệnh, gỗ có sức đề kháng mối mọt và
khả năng sinh ra các chồi và rễ làm cho Bạch quả có khả năng trường thọ [19].
Các cành Bạch quả phát triển theo chiều dài bằng cách phát triển các cành non
với các lá mọc cách đều đặn. Các cành non ngắn có các gióng rất ngắn và các lá của
chúng thông thường không có thùy.

4


Lá Bạch quả có dạng hình quạt với các gân lá tỏa ra thành phiến lá, đôi khi chia
hai nhánh nhưng không bao giờ nối lại thành một hệ thống. Hai gân lá đi vào phiến lá
tại gốc lá và chia nhánh lặp lại thành hai; theo kiểu gọi là hệ gân lá phân đôi. Các lá
thông thường dài 5-10 cm, nhưng đôi khi tới 15 cm [14].
Bạch quả là loài cây đơn tính khác gốc, với các cây mang các giới tính khác
nhau, một số cây là cây đực và những cây khác là cây cái. [2].
1.2.2. Tác dụng dược lý của Bạch quả
Bạch quả tính khí ôn, vị ngọt, hơi đắng. Bạch quả chín có tác dụng ích khí, ích
phổi, tiêu đờm, trừ hen, ho, điều trị khí hư tiểu tiện, bạch đới [2].
-

Bạch quả ăn sống có tác dụng giáng đờm, giải say rượu, tiêu độc. Nhưng không

nên ăn nhiều vì tính thu liễm quá mạnh, nên hay sinh chứng đầy tức khó chịu.
-


Bạch quả có tác dụng trên thiểu năng tuần hoàn não và bệnh tuần hoàn ngoại

biên.
-

Bạch quả có tác dụng bảo vệ chống thương tổn mô não do giảm oxy không khí

thở.
-

Bạch quả cải thiện lưu thông máu đến phần lớn các mô và cơ quan; bảo vệ tổn

thương tế bào do ôxi hóa các gốc tự do; và ngăn chặn nhiều tác động của tác nhân hoạt
hóa tiểu huyết cầu (tụ tập tiểu huyết cầu, vón cục máu) có liên quan tới sự phát triển
của một loạt các rối loạn tim mạch, thận, hô hấp và hệ thần kinh trung ương [32].
-

Bạch quả cũng có thể dùng để điều trị chứng tê liệt rời rạc.

-

Bạch quả có thể cải thiện đáng kể sự tập trung ở các cá nhân mạnh khỏe. Tác

dụng gần như là ngay tức thì và đạt tới đỉnh điểm trong vòng 2,5 giờ sau khi dùng [18].
-

Tác dụng trên tiền đình và thính giác: cao Bạch quả làm giảm tổn thương ở ốc

tai trên chuột lang.

-

Tác dụng đối kháng với yếu tố hoạt hóa tiểu cầu.

5


-

Tác dụng đối với hệ hô hấp: Nước sắc hoặc dịch chiết Bạch quả có tác dụng tan

đờm, giảm ho.
-

Tác dụng miễn dịch, kháng dị ứng, chống lão hóa, kháng trực khuẩn lao.

-

Bạch quả có tác dụng chống ung thư do các chất acid anacardic, bilobol,

cardanol.
-

Bạch quả có tác dụng làm chắc thành mạch, tăng tuần hoàn vi mạch, nhất là

tăng tuần hoàn máu đến não, chống thiếu máu não, chống thoái hóa điểm vàng, trị ù tai,
chóng mặt do tuổi già, chống mỏi chân, nặng chân.
-

Bạch quả có tác dụng tăng trí nhớ [28].


1.2.3. Bộ phận dùng và thu hái
-

Hạt chín: thu hái vào mùa thu. Hạt rửa sạch và phơi nắng hoặc sấy khô, bỏ vỏ,
lấy hạt, nghiền thành bột.

-

Lá: thu hái, sấy khô đóng bao chuyển tới nơi chế biến sản phẩm [2].

1.2.4. Thành phần hóa học
-

Lá có chứa: terpenoid, flavonoid và nhiều thành phần khác như tinh bột, sáp
brom.

-

Flavonoid gồm flavon, biflavon, flavonol.

-

Nhân quả có chứa: protein, chất béo, tinh bột, tro, đường, 8-hydroxy-3-alk
(en)yl-3,4-dihydroisocoumarin.

-

Vỏ quả: chứa acid ginkgolic, bilobol, ginnol.


-

Hạt chứa lipid, acid béo, và nhiều sterol.

-

Vỏ rễ chứa ginkgolic A, ginkgolic B, ginkgolic C [2].

6


1.3.

Tổng quan các chất hóa học được định lượng trong chế phẩm
Cebraton

1.3.1. Acid oleanolic
1.3.1.1.

Công thức hóa học

Tên IUPAC: (4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS) – 10 – hydroxy -2,2,6a,6b,9,9,12a
– heptamethyl -1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b –tetradecahydropicene - 4a carboxylic acid
Tên khác:

3beta-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid
Oleanic acid [29], [34].

1.3.1.2.


Tính chất hóa lý

Bột kết tinh màu trắng, không tan trong nước, tan trong 65 phần ether, 108 phần
alcol 95%, 35 phần alcol 95% sôi, 118 phần cloroform, 118 phần aceton, 235 phần
aceton, 235 phần methanol.
Nhiệt độ nóng chảy: 3100C
Góc quay cực=+ 83,30
pKa = 2,52 [29], [34].

7


1.3.1.3.

Các phương pháp phân tích acid oleanolic

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về phân tích định tính và định lượng acid
oleanolic bằng nhiều phương pháp khác nhau:
Những năm 90 các nghiên cứu về thành phần hoá học ở mức độ cao hơn đã
được tiến hành, đã xác định cấu trúc phân tử của các hoạt chất bằng các phương tiện
thiết bị hiện đại như UV, IR, 1H-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton), 13C-NMR
(phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13), các nghiên cứu này đều cho thấy trong đinh
lăng có chứa các saponin triterpenoid với một genin đã được xác định rõ là acid
oleanonic [15], [9].
Tuy nhiên các nghiên cứu này mới chỉ đưa ra kết luận là có chứa các hoạt chất
nào đó mà chưa đề cập đến phương pháp định lượng thành phần hoạt chất, cũng như sự
biến động hàm lượng hoạt chất theo các yếu tố có thể gây ảnh hưởng.
Trong công trình nghiên cứu về saponin trong Đinh lăng và các dạng bào chế từ
Đinh lăng, GS TS Võ Xuân Minh đã dùng dung môi ethanol 80% chiết dược liệu đinh
lăng, dùng butanol bão hòa nước để hòa tan saponin. Sau đó sử dụng phương pháp thu

hồi dung môi, thêm ether vào dịch nước còn lại để làm lạnh thu lấy tủa saponin [7].
Ngoài ra, theo Nguyễn Thị Hương và cộng sự[4], saponin trong dược liệu được
chiết bằng MeOH bằng phương pháp đun sôi hồi lưu cách thủy. Sau đó sử dụng dung
dịch HCl để thủy phân. Hòa tan tủa bằng cloroform thu lấy dịch chiết chứa saponin.
Một số nghiên cứu phân tích acid oleanolic được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:

8


Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic
Tài liệu

Loại mẫu

Pha tĩnh

Tốc độ dòng

Pha động

Detector

Bước
sóng

Xử lý mẫu

Chiết
ngấm
kiệt

bằng
ethanol

[13]

Lá loài Perilla Spherisob
ODS Methanol và acid phosphoric 0,5 mL/phút
frutescens.
(250 mm x 4,6 mm, 1,25% (86:14, tt/tt)
5 µm)

UV

206 nm

[20]

Vỏ hạt, hạt, quả Cột Hypersil BDS Kênh A: ACN: nước (30/70, 1,0 mL/ phút
của một số loài C8 (200 mm x 4,6 tt/tt)
thực
vật mm, 5 µm)
Kênh B: ACN
(Chaenomeles
Gradient:
sinensis,
Phút
A
B
Ziziphus
sp.,

0
40%
60%
…)
20
20%
80%

Detector
huỳnh
quang

404 nm, Chiêt siêu âm
440 nm
bằng ethanol

[21]

Rễ, thân, lá loài Cột Hypersil BDS Kênh A: ACN/nước (20/80, 1,0 mL/ phút
Swertia sp.
C8 (200 mm x 4,6 tt/tt)
mm, 5 µm)
Kênh B: ACN

Detector
huỳnh
quang

272
và


UV

210 nm

[30]

Phút

A

B

0

25%

75%

15

15%

85%

Phần trên mặt Cột ODS (250 mm Methanol và dung dịch đệm 1 mL/phút

9

nm Chiết siêu âm

bằng ethanol

505 nm

Chiết siêu âm


đất của
Gentiana
olivieri

cây x 4,6 mm, 5 µm)

phosphat ,03 mol/L (85:15,
tt/tt)

bằng ethanol.

[33]

Thân, rễ lá loài Cột Kromasil C 18 Methanol, dung dịch đệm 0,5 mL/phút
Ziziphora
(150 mm x 4,6 mm, phosphat 0,03M (90:10, tt/tt)
clinopodioides 10 µm)

UV

214 nm

Chiết siêu âm

bằng methanol

[35]

Rễ, thân, lá

Cột Kromasil C18 ACN và dung dịch acid 1,0 mL/ phút
(150 mm × 4,6 mm, phosphoric 0,1% với γCD
5 μm)
2mM (60:40, tt/tt)

UV

210 nm

Chiết Soxhlet
bằng
ethylether

[36]

Quả

C18
(4,6 mm × MeOH – dung dịch H3PO4 1,0 mL/ phút
250 mm, 5 µm
đặc – nước (88:0,05:11,95;
tt/tt/tt)

UV


210 nm

Chiết siêu âm
bằng
cloroform

[42]

Rễ, thân, lá

Lichrosorb
RP18 Methanol - nước - THF 1mL/phút
(250 mm x 4,6 mm, (94:5:1, tt/tt/tt)
5 µm)

UV

220 nm

Chiết Soxhlet
bằng methanol

[46]

Quả

Cột C18 (250 mm x Methanol và dung dịch đệm 1,0 mL/ phút
4,6 mm, 5 µm)
phosphat 0,03M (88:12, tt/tt)


UV

210 nm

Chiết siêu âm
bằng ethanol

[47]

Lá, thân rễ loài Cột Kromasil 100 Methanol và dung dịch 0,8 mL/ phút
P. frutescens
C18 (250 mm x 4,6 phosphat 0,5% (88:12, tt/tt)
mm, 5 µm

UV

210 nm

Chiết siêu âm
bằng methanol

10


1.3.2. Phần aglycol của các flavonol glycosid trong cao bạch quả
1.3.2.1.

Quercetin


Công thức phân tử: C15H10O7
Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one
Khối lượng phân tử: 302,326 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 3160C [29], [34].
Độ tan: không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol
Quercetin là một flavonoid được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, tìm thấy nhiều trong
các cây họ tỏi, họ cam [16], [31].
Quercetin có tác dụng chống viêm, hỗ trợ điều trị ung thư và có tác dụng trên một số
virus [24], [27], [39], [40].
1.3.2.2.

Kaempferol

11


Công thức phân tử: C15H10O6
Tên IUPAC: 3,5,7-Trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one
Khối lượng phân tử: 286,23g/mol [29], [34].
Độ tan: tan ít trong nước nhưng tan trong ethanol và diethyl ether nóng
Tương tự Quercetin, Kaemferol là một flavonoid được phân bố rộng rãi trong tự
nhiên, tìm thấy nhiều trong các cây họ chè, họ cam [28].
Kaempferol và một số glycosid trong nhóm có tác dụng kháng khuẩn, chống
viêm, chống oxy hóa, hỗ trợ trong điều trị các loại ung thư vú, ung thư gan, ung thư
tuyến tụy, ung thư phổi, hỗ trợ trong điều trị cho bệnh nhân tim mạch và giải độc gan
[12].
1.3.2.3.

Isorhamnetin


Công thức phân tử: C16H12O7
Tên IUPAC: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)chromen-4-one
Khối lượng phân tử: 316,26 g/mol [29], [34].
Độ tan: tan ít trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như methanol, aceton, ethylacetat,
dimethyl sulfoxid. Isorhamnetin được dùng để hỗ trợ điều trị các bệnh về tim, hạn chế
các tổn thương màng trong do sự oxi hóa của low-density lipoprotein, ngoài ra
Isorhamnetin có tác dụng chống oxi hóa [23], [45].

12


1.3.2.4.

Một số phương pháp phân tích Quercetin, Kaempferol và Isorhamnetin

Có rất nhiều tác giả trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu về phân tích flavonol
glycosid trên các đối tượng mẫu khác nhau.
Trong đó, hai phương pháp được sử dụng chủ yếu là phương pháp HPLC và
LC-MS.
Các nghiên cứu tập trung trên đối tượng thực vật làm thuốc: thân, rễ, lá, hoa,
quả, hạt,…. Nguyên liệu thô sẽ được chiết theo nhiều phương pháp: chiết siêu âm,
chiết hồi lưu, bằng nhiều loại dung môi. Sau đó được phân tích sắc ký theo nhiều
chương trình khác nhau.
Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC để phân tích flavonol glycosid
được trình bày trong bảng 1.2.

13