BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ PHƯƠNG NHUNG

NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES
155.29

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2012


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ PHƯƠNG NHUNG

NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES
155.29

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ: 60.73.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Văn Thu

HÀ NỘI - 2012


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS. TS Cao
Văn Thu, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên đến khi hoàn thành
luận văn tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng
dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học
Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân, Viện Hóa
Học, và Phòng Cấu trúc, Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ
Viêt Nam, khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời
gian làm thực nghiệm.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy
cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Với điều kiện hạn hẹp về thời gian, về phương tiện nghiên cứu và trình độ của bản
thân, luận văn chắc chắn còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các
thầy cô, bạn bè để luận văn được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 8 năm 2012
Học viên

Trần Thị Phương Nhung



MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ - 2 1.1.

Đại cương về kháng sinh ............................................................................ - 2 -

1.1.1.

Khái niệm kháng sinh .......................................................................... - 2 -

1.1.2.

Cơ chế tác dụng của kháng sinh ........................................................... - 2 -

1.1.3.

Các ứng dụng của kháng sinh .............................................................. - 2 -

1.2.

Đại cương về xạ khuẩn ............................................................................... - 3 -

1.2.1.

Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: ........................................................ - 3 -

1.2.2.

Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ............................................. - 4 -


1.3.

Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh .................................................. - 4 -

1.4.

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ........................................ - 6 -

1.4.1.

Mục đích.............................................................................................. - 6 -

1.4.2.

Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên .................. - 6 -

1.4.3.

Đột biến cải tạo giống .......................................................................... - 6 -

1.4.4.

Bảo quản giống xạ khuẩn ..................................................................... - 7 -

1.5.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ............................................................. - 7 -

1.6.


Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ...................................... - 9 -

1.7.

Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .................................................................. - 9 -

1.7.1.

Phổ tử ngoại - khả kiến ........................................................................ - 9 -

1.7.2.

Phổ hồng ngoại .................................................................................. - 10 -

1.7.3.

Phổ khối lượng .................................................................................. - 10 -


1.7.4.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân............................................................... - 10 -

1.8. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 Streptomyces microflavus ................................................................................... - 11 1.9. Actinomycin X2, chất kháng sinh được lên men từ quá trình sinh tổng hợp. - 12 1.10. Sự phát triển của phương pháp sinh học trong sản xuất Actinomycin D .... - 13 1.11. Nghiên cứu tối ưu hóa các thành phần môi trường trong quy trình sinh tổng hợp
Actinomycin X2 từ Streptomyces spp JAU4234 ................................................. - 15 1.12. Nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện trong không gian đến quá trình sinh tổng
hợp Actinomycin từ xạ khuẩn Streptomyces plicatus.......................................... - 16 1.13. Nghiên cứu về ảnh hưởng của quá trình sốc nhiệt đến sự hình thành và thành phần
nhóm Actinomycin ............................................................................................. - 16 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... - 18 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................... - 18 2.1.1.

Nguyên vật liệu .................................................................................. - 18 -


2.1.2.

Máy móc thiết bị ................................................................................ - 21 -

2.2. Phương pháp thực nghiệm ........................................................................... - 22 2.3.1.

Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ......................................................... - 22 -

2.3.2.

Phân loại xạ khuẩn theo ISP ............................................................... - 22 -

2.3.3.

Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ............ - 24 -

2.3.4.

Sàng lọc ngẫu nhiên ........................................................................... - 25 -

2.3.5.

Đột biến bằng ánh sáng UV .............................................................. - 25 -

2.3.6.

Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ................................................... - 27 -

2.3.7.


Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ................... - 27 -


2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ................ - 28 2.2.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay .................................... - 29 2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ............................................. - 29 2.3.11. Xác định cấu trúc hóa học thành kháng sinh chính tinh khiết thu được - 29 Chương 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT .................................... - 31 3.1. Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn ............................................................. - 31 3.1.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 155.29 ................................... - 31 3.1.2. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên .................................................................. - 32 3.1.3. Kết quả đột biến lần thứ nhất ................................................................. - 33 3.1.4. Kết quả đột biến lần thứ hai................................................................... - 35 3.2. Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu ............................ - 37 3.2.1. Kết quả chọn chủng lên men ................................................................ - 37 3.2.2. Kết quả khảo sát dung môi chiết và pH chiết ......................................... - 38 3.2.3. Kết quả lên men, chiết và cất quay thu kháng sinh thô........................... - 39 3.2.4. Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ nhất ......................... - 39 3.2.5. Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ nhất ............................................... - 41 3.2.6. Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ hai ........................... - 43 3.2.7. Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ hai ................................................. - 44 3.3. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ................................................................... - 46 3.3.1. Kết quả đo độ nóng chảy ....................................................................... - 46 3.3.2. Kết quả phổ tử ngoại ............................................................................. - 47 3.3.3. Kết quả phổ hồng ngoại......................................................................... - 47 -


3.3.4. Kết quả đo phổ khối .............................................................................. - 47 3.3.5. Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ................................................ - 48 Chương 4. BÀN LUẬN ......................................................................................... - 49 4.1. Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn ............................................................. - 49 4.2. Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu ............................ - 49 4.3. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ................................................................... - 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... - 54 -


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid 2’- deoxyribonucleic

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

ĐB

Đột biến

IR

Hồng ngoại - Infrared

KS

Kháng sinh


MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

VSV

Vi sinh vật

UV

Tử ngoại – Ultraviolet

Gr(+)

Gram dương

Gr(-)

Gram âm

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

HTKS


Hoạt tính kháng sinh

ISP

International Streptomyces Project

NMR

Nuclear Magnetic Resonance


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định ……………………...……………………………….. 18
Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn……………………………………………………18
Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định…………………………………………….19
Bảng 2.4: Các dung môi sử dụng………………………………………………………...21
Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 155.29 và S. krainskii …….....31
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………...32
Bảng 3.3. Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ nhất ………………...………….33
Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS sau đột biến lần thứ nhất ………………………………...34
Bảng 3.5. Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ hai ……………………………..36
Bảng 3.6. Kết quả thử HTKS sau đột biến lần thứ hai ………………………………….36
Bảng 3.7. Kết quả chọn chủng lên men …………………………………………………38
Bảng 3.8. Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên P. mirabilis) ……………………...39
Bảng 3.9. Thành phần các hệ dung môi …………………………………………………40
Bảng 3.10. Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM ……………………..41
Bảng 3.11. Kết quả sắc ký cột lần thứ nhất ……………………………………………..42
Bảng 3.12. Tỷ lệ các thành phần hệ dung môi 5 cải tiến ………………………………..44
Bảng 3.13. Kết quả SKLM với các hệ dung môi 5 cải tiến ……………………………..44

Bảng 3.14. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau tinh chế lần 2. ………………………45
Bảng 3.15. Kết quả SKLM các phân đoạn sau tinh chế lần thứ hai …………………….46


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh ………………………………….5
Hình 1.2. Cấu tạo hóa học của Actinomycin D …………………………………………14


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một nước khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa có nền kinh tế đang phát triển,
tỷ lệ bệnh nhiễm trùng trong cơ cấu bệnh còn rất cao. Do đó, kháng sinh là một nhóm thuốc
không thể thiếu trong phòng và điều trị bệnh cho người dân. Tuy nhiên, trên thị trường dược
phẩm nước ta hiện nay, hầu hết các thuốc kháng sinh đều được nhập khẩu ở dạng thành
phẩm hoặc bán thành phẩm, ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa thực sự hình
thành. Vì vậy, đẩy mạnh nghiên cứu phát triển, sản xuất các kháng sinh có hiệu quả điều trị
cao, độc tính thấp và ít bị kháng thuốc là một yêu cầu tất yếu trong phát triển y tế.
Tổng hợp hoá học, bán tổng hợp và sinh tổng hợp là ba hướng phát hiện và tổng hợp
kháng sinh. Trong đó sinh tổng hợp kháng sinh là hướng cơ bản với nhiều ưu điểm được sử
dụng chủ yếu để tìm ra kháng sinh mới.
Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội đã đầu tư nghiên cứu và
phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn phân lập từ đất, bùn, … của Việt Nam có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh, trong đó có chủng xạ khuẩn Streptomyces 155.29. Năm 2009-2010 bộ
môn đã nghiên cứu về chủng xạ khuẩn này và thu được một số kết quả nhất định, kháng
sinh tổng hợp được có tác dụng tốt trên nhiều vi khuẩn nhưng hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh còn thấp, kháng sinh tinh chế thu được có độ tinh khiết chưa cao. Bởi vậy, chúng tôi
lựa chọn đề tài “Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155.29”
làm luận văn thạc sĩ. Mục tiêu luận văn hướng đến là: nghiên cứu tìm hiểu chất kháng sinh
do Streptomyces 155.29 sinh ra.


-1-


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Khái niệm kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự
nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc
lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung
thư ở nồng độ thấp [8,11,22].
Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi là kháng
sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật khác không mang
tính chọn lọc và ở nồng độ cao [19,20].
1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau
của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích
của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các
đích khác nhau. Có 6 kiểu chủ yếu:
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất
- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian [8,20,22].
1.1.3. Các ứng dụng của kháng sinh
Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
khác nhau:

-2-



- Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật:
Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng
như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng
trứng ở gà, vịt.
- Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh
cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa
rất hiệu quả.
- Trong công nghiệp thực phẩm: Kháng sinh được dùng để bảo quản thực phẩm nhờ
tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có trong thực phẩm: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis
tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra), tylosin, pimaricin... [11]
1.2. Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn
Gram dương phát triển dạng sợi phân nhánh.Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa
hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh. Do có thể
sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều [6, 7].
Trong số hơn 16,000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 60% là do
xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase,
celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác [6,7,12,20,34].
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
- Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm các vi khuẩn thật (Eubacteria) nhưng phát
triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có
dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.
- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm. Đa
số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú:
da cam, đen đỏ, nâu, trắng, vàng, xám… [7,10,20,34,35]


-3-


1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Các loại xạ khuẩn phổ biến nhất thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều
kháng sinh có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ
khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces.
- Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí
sinh:
+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá
trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc
tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một
thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ.
+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu,
xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ
khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai hoặc có tóc.
- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát
triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng
thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại
xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của chúng là 25-30°C, pH tối ưu thường là 6,87,5.
- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố
hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid
[7,20,24,25,36].
1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh
Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được thể
hiện trong hình 1.1 dưới đây.

-4-



Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm

Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm

Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống

Bình lên men tạo kháng sinh

Dịch lên men

Sinh khối

Dịch lọc

Sinh khối thô

Dịch chiết kháng sinh

Dịch chiết sinh khối

Dịch chiết đậm đặc

Sản phẩm tinh chế

Sản phẩm tinh chế

Sản phẩm đã kiểm nghiệm

Sản phẩm được đóng gói

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh

-5-


1.4.

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.4.1. Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô thực
vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó, để thu được các
chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương
pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp [11,16].
1.4.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30 % so với những cá thể khác. Cần phải
chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [11].
Trong thực tế, việc chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu
ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng
siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.
1.4.3. Đột biến cải tạo giống
1.4.3.1. Định nghĩa
Đột biến (Mutation) là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền dẫn đến sự
biến đổi đột ngột của một hay một số tính trạng, những biến đổi này có thể di truyền đến thế
hệ sau.
Đột biến gen là những biến đổi đột ngột trong số lượng, thành phần, trật tự các cặp
nucleotid, xảy ra tại một điểm nào đó trên phân tử AND [11,16].
1.4.3.2. Các tác nhân gây đột biến
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:

-

Tác

nhân

hóa

học:

ethylenimin,

acid

nitrơ

(HNO2),

hydroxylamin,

dimethylsulphat…
- Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tác nhân vật lý hay
được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng
cách chiếu, thời gian chiếu, bước sóng, cường độ bức xạ.

-6-


- Tác nhân sinh học.
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu

hết các vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các
tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu
suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương).
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột
biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng các
gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần [11,16].
1.4.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: bảo
quản trong tủ lạnh (2º-4ºC) định kỳ cấy truyền và sàng lọc, làm khô (trộn tế bào VSV với
giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo
quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo
quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp) [15,17].
Trong đó, đông khô là phương pháp hiệu quả nhất để giữ giống xạ khuẩn trong
phòng thí nghiệm. Nhưng cũng có thể sử dụng cách đơn giản hơn là: nuôi cấy xạ khuẩn trên
môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2oC và định kỳ 3
tháng cấy lại 1 lần [11, 15, 17].
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh
vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung
gian cho chúng. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết
thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng.
Phương pháp lên men chìm là phương pháp lên men ái khí trong đó VSV được nuôi
trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều.
Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

-7-


+ Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với 1
thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc quá trình,

người ta thu lấy sản phẩm.
+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh
dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình
lên men. Mặt khác, cũng có thể bổ sung tiền chất cho quy trình lên men.
+ Lên men liên tục: Quá trình lên men như một hệ mở: khi VSV đã phát triển đến
một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng thời bổ sung thêm
MT mới vào bình.
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng
và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời
gian nhất định.
Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:
- pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của
các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng gián
tiếp.
- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế
bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy thích hợp với tốc độ sử dụng oxy
của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha
tiếm phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh trưởng cũng không
giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí vừa đủ
là tốt.
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá
trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh
tổng hợp chất mong muốn [3,11,13,32].

-8-


1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên
men thường có hàm lượng kháng sinh thấp. Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp

chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều
trị. Công đoạn tinh chế sẽ quyết định tới giá thành của sản phẩm.
Các phương pháp tách chiết tinh chế kháng sinh:
- Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp lọc, bã được giữ lại
trên lớp lọc, dung dịch chui qua do chênh lệch áp suất trên và dưới lớp lọc.
- Ly tâm: là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhau, thường là
tách pha rắn khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm.
- Chiết bằng dung môi hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách (đang hòa tan trong dịch
lọc) sang pha dung môi hữu cơ không đồng tan.
- Các phương pháp sắc ký:
+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng
bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ).
Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại lượng đặc trưng
cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf.
+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách riêng các chất dựa trên sự phân bố khác
nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành lớp màng mỏng trên
bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là
dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh [1,4,23].

1.7. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.7.1. Phổ tử ngoại - khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi mức năng
lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa cấu trúc hóa học
của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ (Ví dụ:

-9-


Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài
hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị

tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS [1,2,9,18,21].
1.7.2. Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái năng
lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử. Phổ IR được sử
dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại
trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức [1,2,9,18].
1.7.3. Phổ khối lượng
Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác
khối lượng phân tử của chất đó. Chất nghiên cứu trước tiên được chuyển thành trạng thái
hơi sau đó được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ, sử dụng kỹ
thuật ESI MS để nghiên cứu.
Nguyên tắc chung: Khi các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron
có năng lượng cao thì các phân tử sẽ tách ra 1 hay 2 electron và trở thành các ion có điện
tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) hoặc +2. Loại ion này gọi là ion gốc hay ion phân tử. Nếu các ion
phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn thì chúng sẽ bị phá vỡ thành
nhiều mảnh ion, thành các gốc hoặc các phân tử trung hòa khác nhau. Quá trình biến các
phân tử trung hòa thành các ion được gọi là sự ion hóa.
Các ion có khối lượng m và điện tử e. Tỷ lệ m/e được gọi là số khối z. Khi tách các
ion có số khối khác nhau và xác định được xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z, đó
là phổ khối lượng [1,2,9,18,21,31].

1.7.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật ưu việt trong xác định cấu trúc các
hợp chất hữu cơ, là phương pháp triệt để nhất trong phân tích và biện giải toàn bộ phổ. Kỹ
thuật NMR có thể nghiên cứu nhiều nguyên tử, nhưng hydro và carbon là phổ biến nhất.

- 10 -


* Nguyên lý:

-

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do sự phụ thuộc

cường độ tín hiệu theo từ trường H hay tần số μ của từ trường biến thiên.
-

Hạt nhân nguyên tử có từ tính đặt trong một từ trường, khi thay đổi từ trường sẽ dẫn

đến hấp thụ năng lượng của từ trường biến thiên, và xuất hiện phổ NMR
-

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối lượng là

số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có moment từ và cho tín hiệu cộng hưởng hạt
nhân.
-

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự là số chẵn thì không có

moment từ và không cho tín hiệu NMR.
-

Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện

tử ở vùng lân cận quanh proton đó.

* Biện giải phổ NMR: thông qua việc phân tích các yếu tố sau:
- Độ chuyển dịch hóa học (vị trí của tín hiệu cộng hưởng): của phổ 1H-NMR nằm trong
khoảng từ 0-12ppm

- Tương tác spin-spin: cho biết số lượng H ở nguyên tử C bên cạnh và mối tương quan lập
thể của các nguyên tử H với nhau. Trong đó người ta quan tâm tới: Đội bội của tín hiệu
cộng hưởng; Tỷ lệ cường độ của các vạch tín hiệu; Hằng số tương tác spin-spin.
- Diện tích dưới tín hiệu: cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu.
* Phổ 13C-NMR: Về nguyên lý cũng giống như 1H-NMR nhưng ở đây hạt nhân cho tín
hiệu cộng hưởng là 13C. Thang độ chuyển dịch hóa học từ 0-200ppm [18,21,27,31].
1.8. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 Streptomyces microflavus
Đề tài thực hiện nghiên cứu về chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.29. Đây là một
chủng xạ khuẩn ổn định, có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng trên cả vi khuẩn

- 11 -


Gram dương và vi khuẩn Gram âm và có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực phòng bệnh và
chữa bệnh.
Tiến hành phân loại Streptomyces 15.29 theo khóa phân loại ISP thì nhận thấy: các
đặc trưng phân loại của Streptomyces 15.29 giống với Streptomyces sinensis (92.86% trùng
khớp). Tuy nhiên khi giải trình tự gen 16s rADN ứng dụng PCR fingerprinting sử dụng mồi
MST1 của Streptomyces 15.29 cho thấy hệ gen của Streptomyces 15.29 hoàn toàn trùng với
gen của Streptomyces microflavus. Do đó kết luận tên khoa học của Streptomyces 15.29 là
Streptomyces microflavus.
Qua sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến ánh sáng UV, chủng xạ khuẩn được nâng cao
hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. Biến chủng Streptomyces 15.29.21.23 là biến chủng tốt
nhất, được sử dụng để lên men chìm tạo kháng sinh. Lên men chìm được thực hiện trong
máy lắc và trong bình lên men 5 lít và 500 lít. Kết quả cho thấy: lên men trên máy lắc cho
kết quả tốt nhất, còn lên men trong bình 5 lít và 500 lít cho kết quả tương đương nhau tuy
nhiên kém hơn lên men trên máy lắc.
Dịch lọc dịch lên men được đem chiết bằng Ethylacetat ở pH 5.0. Dịch chiết dung
môi hữu cơ được đem cất quay thu kháng sinh thô.
Quá trình tách bằng SKLM và sắc ký cột cho thấy hỗn hợp kháng sinh thô có ít nhất

4 thành phần. Trong đó thành phần chính được tinh chế bằng sắc ký cột Silica gel, cột oxyt
nhôm, YMC và cột Shephadex có hiệu suất 66%. Bước đầu xác định giá trị MIC của KS
này khá thấp: từ 0,11-0,30 µg/ml đối với S. aureus, P. mirabilis, S. flexneri, S. typhi[19].
1.9. Actinomycin X2, chất kháng sinh được lên men từ quá trình sinh tổng hợp
Chủng Streptomyces 15.29 (Streptomyces microflavus) được phân lập từ đất ở Việt
Nam tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật học, Bộ môn vi sinh và Sinh học, trường Đại học
Dược Hà Nội. Tên khoa học đã được xác định chính xác bằng giải trình tự gen 16s rADN.
Dịch chiết ethyl acetat của dịch lên men kháng sinh Streptomyces microflavus được
loại dung môi (thu được 5,0 gam cặn chiết) và phân lập bằng các phương pháp sắc ký kết

- 12 -


hợp sử dụng chất hấp phụ là silicagel pha thường, pha đảo với các hệ dung môi thích hợp
thu được chất KS chính 1 (1,0 g).
Actinomycin X2 (1): Chất rắn có màu hồng sẫm, Phổ khối lượng ESI-MS m/z 1292
[M+Na]+ C62H84N12O17.
Nhiệt độ nóng chảy: 249 - 250oC.
Độ quay cực: []22D -360o (c, 0,5 trong MeOH).
Tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ, tác giả xác định được hợp
chất 1 là actinomycin X2, một hợp chất cũng được phân lập từ chủng Streptomyces spp. và
có hoạt tính chống ung thư cũng như hoạt tính kháng sinh rất mạnh. Đây là lần đầu tiên dữ
kiện phổ NMR của actinomycin X2 được công bố [18].
1.10. Sự phát triển của phương pháp sinh học trong sản xuất Actinomycin D
Actinomycin D (hay Dactinomycin) là kháng sinh đầu tiên được phát hiện có tác
dụng chống ung thư và đã được sử dụng trong y học từ khá lâu [26]. Kháng sinh này được
Selman Waksmen và cộng sự phân lập lần đầu vào năm 1940 từ xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces [35] và được Merck Sharp and Dohme đưa ra thị trường lần đầu vào năm
1964 dưới tên thương mại là Cosmegen.


Cấu tạo hóa học của Actinomycin D gồm 2 vòng giống nhau, nối với nhau qua vòng
phenoxazone. (Hình 1.2)

- 13 -


Hình 1.2. Cấu tạo hóa học của Actinomycin D
Actinomycin D kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư dựa trên cơ chế ngăn chặn
quá trình phiên mã: gắn với ADN tạo thành chuỗi xoắn kép, ngăn cản sự kéo dài của chuỗi
ARN trên ADN khuôn [33].
Kháng sinh này có thể được tổng hợp bởi các loài Streptomyces khác nhau, là một
phần của một hỗn hợp của một số actinomycins (Korzybski et al, 1967). Một số nghiên cứu
đã được thực hiện về sản xuất actinomycin-D (Williams và Katz, 1977; Dalili và Châu,
1988).
Trong một nghiên cứu chuyên sâu, các tác giả thực hiện nghiên cứu với mục đích sản
xuất được lượng lớn nhất Actinomycin D từ 3 biến chủng Streptomyces: S.parvulus
DAUFPE 3124, S.felleus DAUFPE 3079, S.regenesis DAUFPE 3053. Môi trường phát triển
được sử dụng giống nhau gồm có thành phần sau: tryptone 5 g/L và cao nấm men 5 g/L. Để
đánh giá mức độ sản xuất các actinomycin của loài Streptomyces, trung bình với các thành
phần sau đây: glucose 20 g/L, sữa đậu nành 20 g/L, NaCl 5 g/L, K2HPO4 1,5 g/L và CaCO3
2 g/L. Đối với thí nghiệm được thực hiện trong bình lên men, tối ưu hóa với các thành phần
sau: fructose 30 gam/L, sữa đậu nành 30 g/L và CaCO3 2 g/L. Trong tất cả các thí nghiệm,
độ pH được điều chỉnh từ 7,0-7.2.

- 14 -


S. parvulus ATCC 12434 sinh ra Actinomycin, có hoạt tính sinh học lớn nhất
(152mg/l) và chỉ cung cấp Actinomycin D. Nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng sản xuất
kháng sinh trong các bình lắc bằng việc thay thế glucose bằng fructose nồng độ 20, 30 và

40g/l. Sự thay thế này làm gia tăng khả năng sản xuất kháng sinh, đạt nồng độ cao nhất
635mg/l với nồng độ fructose 30g/l. Thí nghiệm trong bình lên men với các mức cấp khí
khác nhau (0,5; 1 và 1,5vvm), tốc độ khuấy khác nhau (300 và 500 rpm). Môi trường lên
men cho thấy hoạt động lưu biến của dung dịch dạng chất dẻo.
Kết quả cho thấy lượng kháng sinh được sản xuất lớn nhất (1530 mg/l) với vận tốc
cấp khí là 1,5vvm và tốc độ khuấy 500rpm phần lớn sản phẩm thu được từ chủng S.parvulus
DAUFPE 3124 khi nuôi cấy trong trong bình lắc [30].
1.11. Nghiên cứu tối ưu hóa các thành phần môi trường trong quy trình sinh tổng hợp
Actinomycin X2 từ Streptomyces spp JAU4234
Nghiên cứu này được tiến hành bởi các nhà khoa học tại viện Khoa học và công nghệ
cuộc sống, thuộc Đại học Nông nghiệp Giang Tây (Trung Quốc). Tiến hành khảo sát những
ảnh hưởng của các thành phần môi trường trong quy trình sinh tổng hợp Actinomycin X2 từ
một loài Streptomyces có số hiệu JAU4234 theo phương pháp đáp ứng bề mặt, chương trình
thống kê Minitab. Các thành phần môi trường được khảo sát gồm có: bột đậu tương, tinh bột
bắp, pepton, dầu đậu nành. Mục đích là tìm kiếm những yếu tố quyết định cho hiệu suất sinh
tổng hợp kháng sinh. Kết quả thực nghiệm cho thấy: dầu đậu nành và bột bắp có tác động
tiêu cực đến việc sản xuất Actinomycin X2. Ngược lại, bột đậu tương và peptone đóng vai
trò quan trọng trong quá trình này nên được sử dụng để tiếp tục khảo sát tìm tỷ lệ tối ưu cho
được nhiều sản phẩm nhất. Kết quả là với tỷ lệ bột đậu tương và pepton trong môi trường
dinh dưỡng lần lượt là: 21,65 g/ml và 9,41g/ml thì hiệu suất tạo Actimomycin X2 đạt cao
nhất (617,4 mg/l). Như vậy, hiệu suất của quy trình sinh tổng hợp Actinomycin X2 đã tăng
lên được 36,9% so với trong nghiên cứu trước về loài Streptomyces này [37].

- 15 -