BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THU TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI
QUANG CỦA AMLODIPIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THU TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA AMLODIPIN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 607315

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Đình Chi
PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

HÀ NỘI, NĂM 2011


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp với nhiều cố gắng, thời
điểm hoàn thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành
cuả mình tới những người thầy đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian qua.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- TS. Lê Đình Chi
- PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
Là hai người thầy đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thị Hường Hoa – Trưởng khoa Mỹ
Phẩm cùng toàn thể cán bộ, nhân viên trong khoa Mỹ Phẩm đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ môn Hóa phân tích – trường
Đại học Dược hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu, phòng
đào tạo sau đại học và các thầy cô đã dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập tại
trường.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bạn bè, đồng nghiệp và gia
đình tôi- những người luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập
cũng như thời gian thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2011
Học viên
Đỗ Thu Trang


1


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN ................................................................... 3
1.1.1. Tính chất ..................................................................................................... 3
1.1.2. Định tính, định lượng ................................................................................. 4
1.1.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng ....................................................... 4
1.2.

ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ........................................ 6

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ............. 7
1.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): ......................................................... 9
1.3.2. Điện di mao quản hiệu năng cao (HPCE) .............................................. 11
1.4.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC..................... 14

1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................... 14
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................... 16
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 18
2.1.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................... 18

2.2.


HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ .................................................. 18

2.2.1. Hóa chất, chất chuẩn: .............................................................................. 18
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................... 19
2.3.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...................................................................... 20

2.3.1. Khảo sát khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipin bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. ........................................................ 20
2.3.2. Khảo sát khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipin bằng
phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao. ............................................. 20

2


2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ..................................................... 211
2.3.4. Ứng dụng để phân tích amlodipin trong các chế phẩm ..................... 211
2.4.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 21

2.4.1 .Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên cột sắc ký hoạt quang ......................... 21
2.4.2. Điện di mao quản sử dụng các dẫn chất cyclodextrin làm chất chọn lọc
đối quang. ............................................................................................................ 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 26
3.1.

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI


QUANG CỦA AMLODIPIN BẰNG HPLC ....................................................... 26
3.1.1. Khảo sát khả năng tách các đối quang của pha tĩnh gắn chất chọn lọc
đối quang ............................................................................................................ 26
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng tách đồng phân ............... 31
3.1.3. Lựa chọn điều kiện sắc ký ....................................................................... 33
3.1.4. Thẩm định qui trình phân tích ............................................................... 33
3.2.

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI

QUANG CỦA AMLODIPIN BẰNG HPCE ................................................... 2646
3.2.1. Khảo sát khả năng tách các đối quang bằng CE ................................ 466
3.2.2. Lựa chọn điều kiện điện di ...................................................................... 51
3.2.3. Thẩm định qui trình phân tích ............................................................. 522
3.3. ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ ĐÁNH GIÁ BẢN
CHẤT ĐỒNG PHÂN CỦA AMLODIPIN ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG MỘT
SỐ BIỆT DƯỢC TRÊN THỊ TRƯỜNG ............................................................. 59
3.3.1. Phân tích đồng phân đối quang của amlodipin trong một số chế phẩm
bằng HPLC ......................................................................................................... 59

3


3.3.2. Phân tích đồng phân đối quang của amlodipin trong một số chế phẩm
bằng CE ............................................................................................................... 61
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 65
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................... 70

4



DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AGP: acid α1- glycoprotein

BGE (background electrolyte): Dung dịch điện ly nền
BP (British Pharmacopoeia): Dược điển Anh
BSA (Bovine Serum Albumine): Albumin huyết thanh bò
CE (capillary electrophoresis): Điện di mao quản
CD: cyclodextrin
CMCD: carboxymethyl-β-cyclodextrin
EOF ( Electro-osmotic flow):Dòng điện thẩm
EP (European Pharmacopoeia): Dược điển châu Âu
GLP (Good Laboratory Practice): Thực hành tốt phòng thí nghiệm
HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HSA (Human Serum Albumine): Albumin huyết thanh người
ISO/IEC 17025: Quy chuẩn quốc tế về quản lý phòng thí nghiệm
LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện
LOQ (Limit of Quantitation): Giới hạn định lượng
PDA (Photo Diode Array): Mảng diod quang
RSD (Relative Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tương đối
TRIS: tris (hydroxymethyl) aminomethane
USP (United States Pharmacopoeia): Dược điển Mỹ
UV-VIS (Ultraviolet - visible): Tử ngoại - khả kiến

5


DANH MỤC CÁC BẢNG
Nội dung


Trang

Bảng 3.1. Độ pha loãng của dung dịch chuẩn

34

Bảng 3.2. Độ pha loãng của dung dịch chuẩn amlodipin besilat racemic

34

Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng S-amlodipin và R-amlodipin trong chuẩn
amlodipin besilat racemic

35

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của R-Amlodipin

38

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của S-Amlodipin

39

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống

41

Bảng 3.7. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp


43

Bảng 3.8. Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với R-amlodipin

44

Bảng 3.9. Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với S-amlodipin

45

Bảng 3.10. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ S-amlodipin

54

Bảng 3.11. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ R-amlodipin

54

Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ lặp lại trên hai đồng phân đối quang
của amlodipin

56

Bảng 3.13. Kết quả đánh giá độ đúng với S-amlodipin

57

Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ đúng với R-amlodipin

57


Bảng 3.15. Thành phần công thức các chế phẩm chứa amlodipin đã
kiểm tra bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC

59

Bảng 3.16. Kết quả xác định hàm lượng amlodipin trong
chế phẩm bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC

61

Bảng 3.17. Thành phần công thức các chế phẩm chứa amlodipin đã kiểm
tra bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp CE
Bảng 3.18. Kết quả xác định hàm lượng amlodipin trong

6

62


chế phẩm bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp CE

7

64


DANH MỤC CÁC HÌNH
Nội dung


Trang

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử amlodipin besilat (a), cấu hình tuyệt đối
3

của S- amlodipin besilat (b)
Hình 3.1. Sắc ký đồ thu được với dung dịch chất đối chiếu amlodipin
besilat racemic với cột Cyclobond I 2000, pha động là Triethylamin

27

pH 4,0.
Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipin racemic với dung môi

29

là acetonitril
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipin racemic với dung môi

29

là methanol
Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipin racemic với dung môi

29

là 1-propanol
Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipin racemic với 1-

30


propanol 1%
Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipin racemic với 1-

30

propanol 2%
Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipin racemic với 1-

30

propanol 3%
Hình 3.8. Sắc ký đồ thu được với dung dịch chuẩn amlodipin besilat

32

racemic khi phân tích trên cột Chiral AGP khi thay đổi pH pha động
Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipin racemic (a), dung

36

dịch thử viên nén Amlodipin amsyn-5(b)
Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn S-amlodipin (a), dung dịch thử
viên nén Asomex(b)

8

37



Hình 3.11. Chồng phổ dung dịch chuẩn, dung dịch thử S-amlodipin

37

(a), R-amlodipin (b)
Hình. 3.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic

39

của R-amlodipin
Hình. 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích

40

pic của
S-amlodipin
Hình 3.14. Ảnh hưởng của bản chất của chất hoạt quang tới độ phân

48

giải các đồng phân đối quang của amlodipin (a) β-cyclodextrin; (b)
CMCD
Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH dung dịch điện ly nền acid phosphoric
50 mM tới độ phân giải các đồng phân đối quang của amlodipin

49

a) pH = 1,6; b) pH = 2,5; c) pH = 3,5
Hình 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ CMCD tới độ phân giải các đồng


50

phân đối quang của amlodipin a) 0,1% ; b) 0,2%; c) 0,3%
Hình 3.17 .Điện di đồ của dung dịch chuẩn amlodipin racemic (a) và

51

dung dịch chuẩn S-amlodipin (b)
Hình 3.18 .Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình phân tích đồng phân
đối quang của amlodipin bằng CE (Điện di đồ của chuẩn S-amlodipin

53

racemic (a), mẫu Asomex 2,5 (b), chuẩn amlodipin racemic (c) và mẫu
Amlodipin STADA (d))
Hình. 3.19. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích

54

pic của S-amlodipin
Hình. 3.20. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích
pic của R-amlodipin

9

55


Hình 3.21. Điện di đồ chuẩn amlodipin besilat racemic ở giới hạn


58

phát hiện (a) và giới hạn định lượng (b)
Hình 3.22. Phân tích định tính amlodipin trong chế phẩm bằng HPLC
(Sắc ký đồ của chuẩn amlodipin racemic (a), mẫu Amsyn-5 chứa

60

amlodipin racemic (b), chuẩn S-amlodipin (c) và mẫu Asomex 5 chứa
S-amlodipin (d))
Hình 3.23 . Phân tích định tính amlodipin trong chế phẩm bằng CE
(Điện di đồ của chuẩn S-amlodipin racemic (a), mẫu Asomex 2,5 (b),
chuẩn amlodipin racemic (c) và mẫu Amlodipin STADA (b))

10

63


11


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiều hoạt chất đang lưu hành trên thị trường là các hợp chất hoạt quang
[17]. Các nghiên cứu khoa học đã cho thấy việc sử dụng đồng phân tinh khiết
thay thế cho hỗn hợp racemic của cùng hoạt chất đã đem lại nhiều hiệu quả hơn
trong điều trị như giảm liều dùng, giảm tác dụng không mong muốn và giảm độc
tính của thuốc. Thảm họa thalidomid vào những năm 60 của thế kỷ XX gây ra
khoảng 10.000 trường hợp quái thai như giống hải cẩu, mất chi, bất thường tim,
thận, tai, mắt, hở mũi hở vòm miệng do dùng thalidomid để gây ngủ cho phụ nữ

mang thai. Các nghiên cứu cho rằng nguyên nhân gây quái thai là do dạng đồng
phân (S) trong hỗn hợp racemic này [23]. Levamisol dạng đồng phân tả tuyền là
tetramisol có tác dụng trị giun sán nhưng đồng phân hữu tuyền lại gây độc tính.
Vì những lý do trên đã khiến ngành công nghiệp dược phẩm thế giới chuyển từ
sử dụng hỗn hợp racemic sang dùng riêng đồng phân đối quang tinh khiết.
Amlodipin là chất đối kháng kênh calci thuộc nhóm dehydropyridin. Phân
tử amlodipin có một nguyên tử carbon bất đối nên hợp chất này cũng tồn tại dưới
dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả tuyền (levamlodipin
hay S(-)-amlodipin) đóng vai trò chính để tạo ra tác dụng điều trị tăng huyết áp
và đau thắt ngực. S-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn R-amlodipin 1000 lần [26].
Trên thị trường, amlodipin đã được sử dụng dưới dạng hỗn hợp racemic. Gần
đây, sau những nghiên cứu cho thấy sự khác biệt về tác dụng dược lý giữa hai
đồng phân đối quang của hợp chất này, nhiều nhà sản xuất đã đưa ra thị trường
các chế phẩm chỉ chứa S-amlodipin.

1


Phân tích đồng phân đối quang là một trong những kỹ thuật khó trong hóa
phân tích do bản chất lý hóa của hai đồng phân đối quang trong mỗi cặp đồng
phân đối quang là quá gần nhau.
Với cơ quan quản lý việc cấp số đăng ký cho các hoạt chất có bản chất là
đồng phân đối quang tinh khiết sẽ gặp nhiều khó khăn nếu năng lực kiểm
nghiệm của Việt Nam chưa đáp ứng được yêu cầu. Để nâng cao năng lực quản lý
chất lượng của thuốc trong hệ thống kiểm nghiệm nhằm góp phần bảo vệ, chăm
sóc sức khỏe nhân dân cũng như hội nhập với xu hướng phát triển chung của
ngành dược trên thế giới là nhiệm vụ cần và cấp thiết không chỉ của cơ quan
quản lý mà của cả ngành y tế.
Trước tình hình trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp

phân tích đồng phân đối quang của amlodipin” với hai mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp tách các đồng phân đối quang của amlodipin nhằm
định tính và định lượng các dạng đồng phân đối quang của amlodipin trong
các chế phẩm thuốc bằng HPLC và CE.
2. Áp dụng phương pháp xây dựng được để đánh giá bản chất đồng phân
(racemic hay enantiomer tinh khiết) của amlodipin được sử dụng trong một
số biệt dược trên thị trường.
Đây là một phần của đề tài cấp bộ: “Phân tích một số đồng phân đối quang
có tính chất dược lý chọn lọc khác nhau của chlorpheniramin,
dexchlorpheniramin, amlodipin,lamivudin”

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN

H3C
H3C

H
N

O

O
O

*


NH2

O

SO3H

CH3

O
Cl

a)

b)

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử amlodipin besilat (a), cấu hình tuyệt đối của
S- amlodipin besilat (b)
Tên khoa học : 3-Ethyl-5-methyl(RS)-2-[2-aminoethoxy)methyl-4-(2chlorphenyl)-1,4-dihydro-6-methyl-3,5-pyridindicarboxylat
1.1.1. Tính chất
1.1.1.1. Tính chất vật lý
- Bột trắng hay gần như trắng.
- Hơi tan trong nước và 2-propanol, tan tốt trong methanol, ít tan trong ethanol,
- Năng suất quay cực: -0,0020 (dung dịch 1% kl/tt trong methanol, đo ở 200C).
- Hàm lượng nước: 0,05%
1.1.1.2.Tính chất hóa học
- Nhân thơm: Hấp thụ UV
- Nhóm chức este: phản ứng thủy phân
- Nhóm NH2: Tính khử và tính base
- Nhân dihydropyridin : tính base và tính khử: bị oxy hóa bởi Ce2+tạo thành


3


pyridin, ứng dụng trong định lượng
1.1.2. Định tính, định lượng
1.1.2.1. Định tính
- Phương pháp quang phổ hồng ngoại
Nguyên tắc: So sánh phổ hồng ngoại giữa chất thử và chất chuẩn Amlodipin.
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của amlodipin
besilat chuẩn (ĐC).
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc: tiến hành sắc ký lớp mỏng đối với chất thử và chất đối chiếu
Amlodipin, kết quả phải cho vết chính tương ứng về vị trí, kích thước và màu
sắc với vết chính của dung dịch đối chiếu khi quan sát dưới đèn tử ngoại 366 nm.
- Phương pháp đo quang
Nguyên tắc: Amlodipin có khả năng hấp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ của
Amlodipin trong dung môi acid hydrocloric 0,1 N/methanol (TT) là 360 nm.
Tính toán độ hấp thụ riêng trong khoảng 113-121 hoặc so với chất chuẩn.
1.1.2.2. Định lượng
- Phương pháp acid-base trong acid acetic khan: dung dịch chuẩn là HClO4
0,1M; chỉ thị đo thế.
- Phương pháp đo Ceri: Dùng dung dịch chuẩn là ceri amoni sulfat 0,1 M (chất
oxy hóa). Trong phản ứng, phần dihydropyridin bị oxy hóa thành pyridin.
- Phương pháp HPLC [5].
1.1.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
Amlodipin là dẫn chất của dihydropyridin có tác dụng chẹn calci qua
màng tế bào. Trong phân tử amlodipin có một nguyên tử carbon bất đối nên
amlodipin tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang. Nhiều

4



nghiên cứu đã chứng minh trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả
tuyền (levamlodipin hay S(-)-amlodipin) đóng vai trò chính để tạo ra tác dụng
điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực. S-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn Ramlodipin 1000 lần [26].
- Amlodipin ngăn chặn kênh calci loại L phụ thuộc điện thế, tác động trên
các mạch máu ở tim và cơ.
- Amlodipin có tác dụng chống tăng huyết áp bằng cách trực tiếp làm giãn
cơ quanh động mạch ngoại biên và có ít tác dụng hơn trên kênh calci cơ tim. Vì
vậy thuốc không làm dẫn truyền nhĩ thất ở tim kém đi và cũng không ảnh hưởng
xấu đến lực co cơ.
- Amlodipin không có ảnh hưởng xấu đến nồng độ lipid trong huyết tương
hoặc chuyển hóa glucose, do đó có thể dùng amlodipin để điều trị tăng huyết áp
ở người bệnh đái tháo đường.
- Tác dụng chống đau thắt ngực: Amlodipin làm giãn các tiểu động mạch
ngoại biên, do đó làm giảm toàn bộ lực cản ở mạch ngoại biên (hậu gánh phải).
Vì tần số tim không bị tác động hậu gánh giảm làm công của tim giảm, cùng với
giảm nhu cầu cung cấp nhu cầu oxy và năng lượng cho cơ tim. Điều này làm
giảm nguy cơ đau thắt ngực. Ngoài ra amlodipin cũng gây giãn động mạch vành
cả khu vực thiếu máu cục bộ và khu vực cung cấp máu bình thường. Sự giãn
mạch này làm tăng cung cấp oxy cho người bệnh đau thắt ngực thể co thắt. Điều
này làm giảm nhu cầu nitroglycerin và bằng cách này, nguy cơ kháng
nitroglycerin có thể giảm.
Chỉ định: Điều trị tăng huyết áp (ở người bệnh có biến chứng chuyển hóa như
đái tháo đường) và điều trị dự phòng ở người bệnh đau thắt ngực ổn định.

5


Chống chỉ định: Không dùng cho những người suy tim chưa được điều trị ổn

định. Quá mẫn với dihydropyridin.
Thận trọng: Với người giảm chức năng gan, hẹp động mạch chủ, suy tim sau
nhồi máu cơ tim cấp.
Tác dụng không mong muốn: Phản ứng phụ thường gặp nhất của amlodipin là
phù cổ chân, từ nhẹ đến trung bình liên quan đến liều dùng. Nhức đầu, chóng
mặt, đỏ bừng mặt, có cảm giác nóng, mệt mỏi, suy nhược, chuột rút, buồn nôn,
đau bụng, khó tiêu, khó thở [6].
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
Đồng phân đối quang (enantiomers) là hai đồng phân không gian dạng ảnh
và vật qua gương. Chúng có công thức hoá học hoàn toàn giống nhau, chỉ khác
về cách bố trí không gian của các nhóm thế quanh carbon bất đối. Đồng phân
quang học là hiện tượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về góc quay
của mặt phẳng ánh sáng phân cực. Điều kiện cho tính hoạt quang chính là: cấu
trúc hình học của phân tử phải như thế nào đó để phân tử không chồng khít với
ảnh trong gương của nó tương tự như quan hệ giữa bàn tay phải và bàn tay trái
(chirality). Ngoài sự khác biệt trong trong cấu trúc phân tử theo kiểu như sự khác
biệt của bàn tay phải và bàn tay trái, khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân
cực theo những góc bằng nhau nhưng ngược chiều nhau, còn lại tất cả các tính
chất lý hóa thông thường của các đồng phân đó là giống nhau. Chất mà có khả
năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực một góc α nào đó gọi là chất
hoạt quang. [3]
Cấu hình R và S (cấu hình tuyệt đối): Khi nguyên tử carbon liên kết với 4
nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử khác nhau C*abcd. Thiết lập trình tự ưu tiên của
nhóm thế carbon bất đối: a>b>c>d. Người ta quan sát phân tử theo trục C-d từ

6


phía ngược với d nếu từ a->b->c đi theo chiều kim đồng hồ thì cấu hình là R
(rectus = phải ) trường hợp ngược chiều kim đồng hồ thì cấu hình là S (sinister=

trái). Trong đấy, thứ tự ưu tiên a, b, c, d theo Cahn- Ingold- Prelog như sau:
- I > Br > Cl > S > F > O > N > C > H
-COOH > -C=O > -CHO > - CH2OH > -CH-R > -CH3 (R ở đây là các CH3) [10]
Chính sự khác nhau về cấu trúc không gian này làm cho chúng có tương
tác khác nhau với các thụ thể sinh học, như các chất mang, receptor, enzym. Vì
thế, đặc tính dược động học cũng như đặc tính dược lý của hai đồng phân đối
quang của một số thuốc có thể rất khác nhau. Có tới một nửa các dược chất đang
sử dụng hiện nay có đồng phân đối quang, mà 1/3 trong số đó có các đồng phân
đối quang mang đặc tính dược lý và hoặc dược động học khác nhau.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
Phân tích đồng phân đối quang là một trong những chủ đề khó trong hóa
phân tích do bản chất lý hóa quá gần nhau của hai đồng phân đối quang trong
mỗi cặp đồng phân đối quang. Các đồng phân đối quang có thể được tách bằng 2
cách, trực tiếp hoặc gián tiếp.
Theo cách gián tiếp: hai đồng phân này được tạo dẫn chất với một hợp
chất đối quang khác để tạo ra hai sản phẩm là đồng phân quang học, nhưng
không phải là đối quang (diastereoisomers), như vậy chúng sẽ có tính chất vật lý
và hoá lý khác nhau nhiều hơn, do đó sẽ dễ tách ra khỏi nhau hơn.
Theo cách trực tiếp: các đồng phân đối quang được tách bằng một công cụ
phân tích có hiệu năng tách cao, và phải có sự góp mặt của một hoặc nhiều chất chọn
lọc đối quang. Các chất chọn lọc đối quang này có đặc điểm là tương tác khác nhau
với các đồng phân đối quang, do cấu trúc không gian của chúng. Có nhiều nhóm chất

7


chọn lọc đối quang, được xếp loại theo cấu trúc của chúng [12], [19]: các
cyclodextrin và dẫn chất, các oligo và polysaccarid, crown ether, các kháng sinh
vòng lớn, các protein, các chất trao đổi ion, chất diện hoạt và các calixaren.
Đặc điểm duy nhất có thể lợi dụng để tách riêng hai đồng phân đối quang

là khả năng tương tác khác nhau của chúng với những chất có ái lực khác biệt
với mỗi đồng phân đối quang của một hỗn hợp racemic. Những chất này được
gọi là các chất chọn lọc đối quang (chiral selector). Các chất này được đưa vào
hệ thống tách để tương tác trực tiếp với hỗn hợp đồng phân đối quang. Khi mức
độ khác biệt của quá trình tương tác với chất chọn lọc đối quang giữa hai đồng
phân đối quang đủ lớn, chúng sẽ được tách riêng. Các chất chọn lọc đối quang
có bản chất hóa học khá đa dạng, có thể chia thành các nhóm chính sau [14],
[25]:
-Nhóm 1: có bản chất protein (albumin huyết thanh (HSA, BSA), α1-acid
glycoprotein (AGP),...), cyclopeptid, một số kháng sinh macrocyclic
glycopeptid (vancomycin, teicoplanin, avoparcin, tubocuracin…) đã được dùng
để tách nhiều đồng phân đối quang.
-Nhóm 2: Các oligosaccarid không vòng và dẫn chất polysaccarid, phần
lớn là các phân tử như monosarcharid. Một số phân tử disaccarid, trissaccarit
cũng có thể ảnh hưởng giống như các monosaccarid tự nhiên đó là vị trí liên kết
và loại liên kết tạo nên khả năng nhận biết chất đối quang. Các chất hay dùng là
dẫn chất maltose, lactose, succrose, amylose, cellulose.
-Nhóm 3: chất chọn lọc đối quang dựa trên cấu trúc tạo thành một “hốc”
chọn lọc đối quang (chiral cavity). Đây là các cyclodextrin (CD) và dẫn chất (βcyclodextrin, dẫn chất sulfat hóa, alkylhydroxy hóa của β-CD), ether vòng,
polymer.

8


-Nhóm 4: chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện
tử π và nhóm nhận điện tử π (chất chọn lọc kiểu Pirkle)
-Nhóm 5: trao đổi ligand (ion đồng tạo phức với nhóm hoạt quang)
Sử dụng các chất chọn lọc đối quang kể trên, nhiều phương pháp tách đã
được sử dụng để phân tích các đồng phân đối quang, chủ yếu dựa trên các quá
trình sắc ký (lỏng, khí, pha siêu tới hạn) và điện di [20]. Trong đó, hai kỹ thuật

phổ biến nhất hiện nay để tách đồng phân đối quang là sắc ký lỏng hiệu năng
cao và điện di mao quản hiệu năng cao.
1.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
1.3.1.1. Khái niệm về phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- High Performance Liquid
Chromatography) là một kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các
chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp
suất cao.
Pha tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân, chất lỏng
được bao phủ trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc một chất mang rắn đã được
biến đổi bằng liên kết hóa học với nhóm hữu cơ.
Tùy thuộc vào bản chất các pha, kỹ thuật và phương tiện sắc ký mà người
ta phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau:
- Sắc ký phân bố
- Sắc ký hấp phụ
- Sắc ký trao đổi ion
- Sắc ký loại trên cỡ
- Sắc ký ái lực
- Sắc ký các đồng phân quang học

9


Trong đó sắc ký lỏng phân bố được sử dụng phổ biến nhất hiện nay.
1.3.1.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang
Có ba lựa chọn để tách các đồng phân đối quang bằng HPLC:
1/Sử dụng pha tĩnh không gắn chất chọn lọc đối quang và một pha động
chứa chất chọn lọc đối quang.
2/Tạo dẫn chất để biến hai đồng phân đối quang thành hai diastereoisomer
có thể tách được bằng một hệ pha tĩnh-pha động thông thường.

3/Sử dụng pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối quang và pha động không chứa
chất chọn lọc đối quang.
Lựa chọn thứ nhất không đòi hỏi các cột sắc ký hoạt quang đắt tiền,
nhưng nhược điểm là tiêu thụ nhiều chất chọn lọc đối quang hơn và hiệu quả
tách không lớn bằng áp dụng trên điện di mao quản.
Lựa chọn thứ 2 khó áp dụng do hạn chế trong việc tìm ra dẫn xuất phù
hợp và độ tin cậy của phương pháp bị ảnh hưởng bởi độ lặp lại của phản ứng tạo
dẫn xuất.
Trên thực tế, hiện tại lựa chọn thứ ba là xu thế phổ biến nhất, do số lượng
pha tĩnh thương mại hóa sẵn có lớn, tới khoảng 100 loại cột khác nhau [20] giúp
người làm phân tích có nhiều lựa chọn phù hợp với nhu cầu. Các Pha tĩnh chọn
lọc hoạt quang thương mại sử dụng các chất chọn lọc đối quang thuộc cả 5
nhóm kể trên (ví dụ: nhóm 1: Chiral HSA, Chiral AGP, Chirobiotic V; nhóm 2:
Chiralpak AD, Chiralcel OD; nhóm 3: Crownpack, Cyclobond; nhóm 4:
ULMO, Whelk-O 1; nhóm 5: Chiralpak WH, WM). Trong lĩnh vực phân tích
dược phẩm, đây vẫn là kỹ thuật được áp dụng nhiều nhất với số lượng công
trình công bố rất lớn [13]. So với các kỹ thuật tách đồng phân đối quang khác
như kết tinh chọn lọc, chiết… HPLC là phương pháp có khả năng ứng dụng

10


rộng nhất, cho phép tách các đồng phân đối quang của hầu hết các hợp chất hoạt
quang có tác dụng dược lý. Ngoài ứng dụng trong phân tích, HPLC hoạt quang
ở quy mô điều chế cũng là một trong những kỹ thuật cơ bản để sản xuất đồng
phân đối quang tinh khiết ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, các pha tĩnh gắn
chất chọn lọc đối quang chỉ cho phép tách tốt đồng phân đối quang của một số
chất nhất định [20]. Do đó, để tìm ra được điều kiện tối ưu để phân tích đồng
phân đối quang của các dược chất hoạt quang thường gặp thì phòng thí nghiệm
cần được trang bị một cơ số đầy đủ cột hoạt quang với các loại pha tĩnh khác

nhau. Đây là hạn chế cơ bản nhất cho áp dụng rộng rãi HPLC hoạt quang vì các
cột gắn Pha tĩnh chọn lọc đối quang đều có giá thành cao.
1.3.2. Điện di mao quản hiệu năng cao (HPCE)
1.3.2.1. Cơ chế của quá trình diện di trong mao quản
Nguyên tắc của quá trình tách trong điện di mao quản là dựa trên tính chất
điện di khác nhau của các phần tử chất tan. Quá trình này xảy ra trong mao quản
trên nền dung dịch chất điện ly có pH thích hợp, dưới tác dụng của một điện
trường E xác định đặt vào hai đầu mao quản.
Cơ chế của điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong mao
quản dưới tác dụng của lực điện trường nhất định (Electric Field Force, được
viết tắt là EFF) và tính chất của dòng điện thẩm ( Electro Osmotic Flow, được
viết tắt là EOF). EOF là một dòng chuyển khối phẳng trong mao quản. Bởi vì
lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng nhất dọc theo mao quản, cho nên
không có sụt áp trong mao quản. Dòng EOF đưa tất cả các tiểu phân có mặt
trong dung dịch điện ly nền, bất kể có điện tích hay không, di chuyển theo cùng
một hướng. Với điều kiện thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng
này di chuyển về catod. Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc độ

11


EOF thường lớn hơn nhiều so với tốc độ điện di. Cation di chuyển nhanh nhất
do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp theo các chất không mang điện tích di
chuyển theo EOF nhưng không tách khỏi nhau được. Cuối cùng là anion. Trên
điện di đồ thứ tự rửa giải theo thời gian như sau: cation có điện tích lớn kích
thước nhỏ ra trước nhất, anion có điện tích lớn và kích thước nhỏ ra cuối cùng.
Điện thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu mao quản được dùng trong
kỹ thuật CE là rất lớn, thông thường từ 10-30 kV. Chính lực điện trường này
làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo một hướng nhất định và
các chất có điện tích và độ lớn khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. Do

đó tạo nên sự phân tách của các chất phân tích.
Mao quản sử dụng trong CE thường có độ dài từ 25 đến 100 cm, đường
kính trong 25- 100 µm. Loại mao quản có đường kính trong khoảng 50- 75 µm
là thích hợp nhất vì hiệu ứng nhiệt nhỏ, dễ khống chế nhiệt độ mao quản. Mao
quản được chế tạo từ vật liệu khác nhau, nhưng phổ biến nhất là silica nung
chảy (fused silica).
1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng
• Điện thế: Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu
mao quản. Tuy nhiên, nếu tăng điện thế lên quá cao sẽ sinh hiệu ứng Joule tạo ra
gradient nhiệt trong mao quản và dẫn đến thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong
mao quản làm cho các phân tử ngay cả một chất tan cũng di chuyển không đồng
nhất dẫn đến sự khuếch tán khác nhau và làm mở rộng vùng mẫu.
• Nhiệt độ: Ảnh hưởng chính của nhiệt độ là làm thay đổi vận tốc và độ
dẫn điện của đệm. Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ trong mao quản tăng là
nguyên nhân thay đổi cấu tạo của protein, làm thay đổi thời gian điện di và hiệu
quả phân tích.

12