BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Nguyễn Trung Anh

“Nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại
(coban, bạc, sắt và đồng) đến quá trình chuyển gen
vào giống đậu tương Việt Nam”

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng
PGS.TS. Đỗ Thị Hoa Viên

Hà Nội – Năm 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được
cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Trung Anh

1


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Văn
Đồng, Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật,
Viện Di truyền Nông nghiệp – người thầy luôn kiên nhẫn và hết lòng hướng dẫn, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi tới PGS.TS. Đỗ Thị Hoa Viên, Viện Công nghệ Sinh học & Công
nghệ Thực phẩm lời cảm ơn chân thành, người đã luôn hỗ trợ và giúp đỡ để tôi hoàn
thành luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình, những ý
kiến đóng góp quý báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS. Hà Văn Chiến trong
suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn cùng tập thể cán bộ Phòng Thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp về sự
nhiệt tình giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể thực hiện được đề tài
này một cách suôn sẻ và thuận lợi.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Công nghệ
Môi trường đã hỗ trợ và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn
Cuối cùng, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân cùng bạn bè lời cảm ơn
thân thương nhất - những người đã luôn sát cánh, quan tâm và dành cho tôi tình cảm
chân thành trong suốt thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn này cũng như đã
luôn luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Học viên cao học

Nguyễn Trung Anh


2


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ 1
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................. 11
1.1.

Giới thiệu chung về cây đậu tương ......................................................................... 11

1.1.1.

Nguồn gốc và tình hình sản xuất đậu tương ........................................................ 11

1.1.2.

Giá trị của cây đậu tương đối với con người ....................................................... 14

1.1.3.

Một số giống đậu tương ở Việt Nam ................................................................... 15

1.2.

Hạt nano kim loại và vai trò của các hạt kim loại lên cây trồng ............................. 17

1.2.1.


Định nghĩa về vật liệu hạt nano ........................................................................... 17

1.2.2.

Ảnh hưởng của hạt kim loại nano tới cây trồng................................................... 17

1.3.

Gen bar .................................................................................................................... 20

1.4.

Chọn tạo giống đậu tương bằng phương pháp chuyển gen ..................................... 21

1.5.

Thực trạng nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương ............................................... 23

1.6.

Các nghiên cứu về ứng dụng hạt nano trong nông nghiệp tại Việt Nam ................ 25

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 27
2.1.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................... 27

2.2.

Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 27


2.2.1. Vật liệu .................................................................................................................... 27
2.2.2. Hóa chất và môi trường .......................................................................................... 28
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................. 29
2.2.4. Trình tự mồi và enzyme cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu ............................. 29
3


2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 30
2.3.1. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ........... 30
2.3.2. Chọn lọc cây con ra đất bằng Basta......................................................................... 32
2.3.3. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá ..................................................... 32
2.4.4. Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR ...................................... 33
2.5. Các chỉ tiêu đánh giá .................................................................................................. 34
2.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu ...................................................................... 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 36
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano đến quá trình chuyển gen vào giống
đậu tương ĐT22 ................................................................................................................. 36
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano đơn lẻ đến từng giai đoạn trong
quá trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22 bằng A. tumefaciens ..................................... 36
3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano kết hợp đôi lên quá trình chuyển
gen vào đậu tương ĐT22 bằng Agrobecterium tumefaciens ............................................. 44
3.2. Phân tích hiệu quả tiếp nhận gen của đậu tương ĐT22 dưới tác động của hạt nano
đơn lẻ và nano kết hợp đôi bằng phương pháp PCR ......................................................... 52
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................... 56
4.1. Kết luận....................................................................................................................... 56
4.2. Kiến nghị .................................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 57
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 64


4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tình hình sản xuất đậu tương của 4 quốc gia đứng đầu thế giới trong
những năm gần đây ..................................................................................................12
Bảng 1.2: Sản lượng đậu tương của Việt Nam trong những năm gần đây ..............13
Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm .............................................29
Bảng 2.2:Thành phần phản ứng PCR .......................................................................33
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các hạt nano đơn lẻ đến khả năng phát sinh đa chồi của
đậu tương ..................................................................................................................36
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các loại hạt nano đơn lẻ ở giai đoạn sống sót sau chọn
lọc của đậu tương trong quá trình chuyển gen .........................................................39
Bảng 3.3: Tỉ lệ cây con sống sót sau khi phun basta ................................................42
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hạt nano kết hợp đôi tới việc tạo đa chổi trong chuyển
gen vào đậu tương ĐT22 ..........................................................................................45
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của hạt nano kết hợp đôi đến khả năng sống sót sau chọn lọc
của đậu tương trong quá trình chuyển gen ...............................................................47
Bảng 3.6: Tỉ lệ cây con sống sót sau khi phun basta ................................................50
Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tương chuyển gen.........................53

5


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn ....................... 19
Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc vector pZY101 .................................................................. 28
Hình 3.1: Khả năng phát sinh đa chồi của đậu tương ở các công thức thí nghiệm... 37
Hình 3.2: Khả năng đa chồi sống sót trong môi trường chọn lọc của đậu tương ở các
công thức thí nghiệm ................................................................................................. 40

Hình 3.3: Các chồi của đậu tương được kéo dài trên môi trường SEM ................... 41
Hình 3.4: Cây đậu tuơng chuyển gen trên môi trường ra rễ RM .............................. 42
Hình 3.5: Cây đậu tuơng chuyển gen và đối chứng trước khi phun và sau 6 ngày
phun Basta nồng độ 100 mg/l.................................................................................... 43
Hình 3.6: Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đơn lẻ (Ag, Co, Fe, Cu) trong quá trình
chuyển gen................................................................................................................. 44
Hình 3.7: Khả năng phát sinh đa chồi của đậu tương ở các công thức thí nghiệm sau
14 ngày trên môi trường kích thích ra chồi ............................................................... 46
Hình 3.8: Khả năng đa chồi sống sót trong môi trường chọn lọc của đậu tương ở các
công thức thí nghiệm ................................................................................................. 48
Hình 3.9: Các chồi của đậu tương trong môi trường kéo dài và môi trường ra rễ.... 49
Hình 3.10: Cây đậu tuơng chuyển gen và đối chứng trước khi phun và sau 6 ngày
phun Basta nồng độ 100 mg/l.................................................................................... 50
Hình 3.11: Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đơn lẻ (Ag, Co, Fe, Cu) trong quá trình
chuyển gen................................................................................................................. 51
Hình 3.12: Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng đậu tương chuyển gen To
................................................................................................................................... 52

6


Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar trong cây đậu tương chuyển
gen T0 ........................................................................................................................ 53

7


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A.tumefaciens


Agrobacterium tumefaciens

ADN

Axit deoxyribonucleic

AS

Acetosyringone

BAP

6 – benzylaminopurine

Bar

Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase

BGĐ

Biến đổi gen

Bp

Base pair

CCM

Cocultivation medium – môi trường đồng nuôi cấy


Cs

Cộng sự

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

ĐT22

Giống đậu tương ĐT22

ĐT26

Giống đậu tương ĐT26

DT84

Giống đậu tương DT84

ĐVN9

Giống đậu tương ĐVN9

EDTA

Ethylene Diamine Tetra Acetic

GA3


Gibberelic acid

GM

Germination medium – môi trường nảy mầm hạt

IBA

Indole-3-butyric acid

Kb

Kilo base

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase

RM

Rooting medium – môi trường ra rễ

SDS

Sodium dodecysulfat


SEM

Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi

SIM

Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi

T0

Cây chuyển gen

TAE

Tris – acetate – EDTA

v/p

vòng/phút

YEP

Yeast extract peptone

GSO

Tổng cục Thống kê Việt Nam
8



MỞ ĐẦU
Đậu tương (Glycine max L. Merr) hay còn gọi là đỗ tương, là cây trồng có giá trị
dinh dưỡng cao được các nhà khoa học xếp vào một trong những “thực phẩm chức
năng” [2] và đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con người ở
những nước đang phát triển trong tình trạng thiếu hụt protein [26]. Lượng dầu của cây
đậu tương đứng ở vị trí thứ nhất trong tổng số dầu thực vật được tiêu thụ ở thế giới
(http://worldvegetableoil). Đây cũng là loại cây trồng có tác dụng trong việc luân xen
canh, cải tạo đất rất hiệu quả.
Ngày nay, công nghệ nano đã được triển khai nghiên cứu rộng rãi trên phạm vi
toàn cầu, trong nhiều lĩnh vực khác nhau và bước đầu tạo ra những sản phẩm được
ứng dụng trong đời sống của con nguời, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp. Một số
những nghiên cứu đã ứng dụng các hạt nano để xử lý hạt giống nhằm cải thiện tốc độ
nảy mầm và sinh trưởng, chất lượng và năng suất thu hoạch của nông sản [20]. Công
nghệ nano cũng được ứng dụng trong phân bón lá bao gồm các nguyên tố vi lượng cần
thiết trong từng giai đoạn phát triển của cây trồng. Việc sử dụng các công cụ hỗ trợ
như cảm biến, công nghệ nano cũng có thể phát hiện và chẩn đoán nhanh các chứng
bệnh do vi sinh vật gây ra cho cây trồng. Trong các nghiên cứu ứng dụng của các hạt
nano trong nông nghiệp, phương pháp được sử dụng nhiều là xử lý hạt giống cây
trồng với hạt nano trước khi trồng. Năm 2010, Roghayyeh và cộng sự đã nghiên cứu
và thấy rằng các hạt nano sắt (Fe) có ảnh hưởng lên các đặc điểm sinh học ở đậu
tương [49]. Ngoài ra, các hạt nano sắt (Fe), coban (Co) và đồng (Cu) cũng cho hiệu
quả lớn khi xử lý hạt giống cây trồng, trong đó có các cây họ đậu.
Hiện nay, việc tạo ra cây trồng biến đổi gen bằng kỹ thuật chuyển gen để ứng
dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng (trong đó có cây đậu tương)
đem lại lợi ích cho nền nông nghiệp là vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, hiệu suất
chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 đang trồng phổ biến tại Việt Nam hiện nay chỉ
đạt dưới 1% [13]. Ở quy trình chuyển gen vào đậu tương bằng phương pháp tạo cụm
chổi thông qua nuôi cấy in vitro nốt lá mầm của một vài giống đậu tương mô hình
(William. Mark, Thom...) đã được triển khai ở một số phòng thí nghiệm, bước đầu đã
cho kết quả. Tuy nhiên các giống đậu tương mô hình (William, Mark, Thom...) rất khó

trồng phổ biến tại các mùa vụ ở Việt Nam, đặc biêt tại các tỉnh thuộc miền Bắc Việt
9


Nam tỉ lệ đậu quả của các giống đậu tương mô hình này còn rất hạn chế. Do đó, với
mong muốn nâng cao hiệu suất chuyển gen vào đậu tương Việt Nam, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại lên quá trình chuyển
gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Xuất
phát từ yêu cầu thực tiễn và các nghiên cứu đã tiến hành, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt và đồng) đến
quá trình chuyển gen vào giống đậu tương Việt Nam”.
Với mong muốn phát triển và tăng hiệu quả của quy trình chuyển gen vào giống
đậu tương thương mại Việt Nam
Mục tiêu của đề tài
Chuyển thành công gen chỉ thị kháng thuốc diệt cỏ (bar) vào giống đậu tương
ĐT22 của Việt Nam và xác định ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến quá trình
chuyển gen.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng của hạt nano kim loại đơn lẻ (coban, bạc, sắt,
đồng) đến quá quá trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng của hỗn hợp các hạt nano kim loại (coban, bạc,
sắt, đồng) ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Nội dung 3: Phân tích cây chuyển gen và đánh giá hiệu quả chuyển gen của
quy trình.

10



CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu chung về cây đậu tương

1.1.1. Nguồn gốc và tình hình sản xuất đậu tương
Nguồn gốc đậu tương
Đậu tương hay còn gọi là đỗ tương là loại cây họ Đậu Fabaceae, có tên khoa
học (Glycine max L. Merr) và là loài có hàm lượng protein cao được trồng để làm
thức ăn cho người và gia súc [18]. Các bằng chứng về lịch sử, địa lý, khảo cổ học chỉ
ra rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước công
nguyên và được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỉ thứ VIII, sau đó du nhập
vào nhiều nước Châu Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt
Nam,… vài thế kỷ sau đó. Đậu tương là nguồn dầu thực vật và protein lớn nhất trên
thế giới với quy mô canh tác lớn và tập trung ở vài quốc gia như Mỹ, Argentina,
Brazil, Canada, Trung Quốc, Ấn Độ và Paraguay. Ngay cả đến ngày nay đậu tương
cung cấp một nguồn protein rất quan trọng trong khẩu phần của nhiều quốc gia ở Châu Á
và là một thực phẩm và sản phẩm công nghiệp cực kỳ có giá trị trên khắp Châu Á.
Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương
Trên thế giới
Cây đậu tương là cây trồng có khả năng thích ứng rộng nên được phân bố ở
khắp các châu lục và được trồng ở nhiều nước trên thế giới, tập trung ở các nước có
480 vĩ độ Bắc đến 300 vĩ độ Nam. Theo báo cáo hàng năm của ISAAA, các loại cây
trồng chuyển gen được thương mại hóa ngày càng tăng qua các năm. Tính riêng năm
2016, cây trồng biến đổi gen (BĐG) được trồng rộng rãi ở các nước với tổng diện tích
khoảng 185,1 triệu ha (là năm cây trồng BĐG bắt đầu thương mại hóa) và tăng 5,4
triệu ha so với năm 2015. Năm 2016, có 26 quốc gia, gồm 19 quốc gia đang phát triển
và 7 nước công nghiệp, đã canh tác cây trồng BĐG. Trong đó, 54% diện tích được
trồng tại các quốc gia đang phát triển và 46% diện tích tại các nước công nghiệp. Các
quốc gia dẫn đầu trong việc canh tác cây trồng BĐG là Mỹ, Brazil, Argentina, Canada

và Ấn Độ. Diện tích canh tác cây trồng BĐG tại 5 quốc gia này chiếm tới 91% tổng
diện tích canh tác toàn cầu. Đứng đầu trong việc trồng cây trồng BĐG là Mỹ (72,9
triệu ha) tiếp đến là Brazil (49,1 triệu ha), Argentina (23,8 triệu ha), Canada (11,6
triệu ha), Ấn Độ (10,8 triệu ha). Trong số các cây trồng biến đổi gen, đậu tương luôn
11


là cây được nghiên cứu, trồng thử nghiệm và thương mại hóa với quy mô và diện tích
lớn. Trong tổng số 181,1 triệu ha cây trồng BĐG thì diện tích trồng các giống đậu
tương BĐG chiếm 50% diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen trên toàn thế giới
(ISAAA, 2016). Đây là sự đóng góp to lớn của các nhà chọn tạo giống đậu tương thế
giới góp phần vào sự phát triển của ngành nông nghiệp toàn cầu. Theo thống kê của
Tổ chức Quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong Nông nghiệp
(ISAAA 2016), diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen đã tăng gấp 110 lần sau 21
năm thương mại hoá
Trong năm 2016 diện tích đậu tương công nghệ sinh học chiếm 50% tổng số
diện tích cây trồng trong công nghệ sinh học trên thế giới giảm 1% so với năm 2015
nhưng diện tích trồng cây đậu tương chống chịu được thuốc trừ cỏ trong năm 2016 là
23,4 triệu ha, tăng khoảng 82% so với năm 2015. Hiện nay, có 3 quốc gia sản xuất đậu
tương lớn nhất thế giới là Mỹ, Brazil, Argentina. Trong đó, năm 2016 Brazil là nước
sản xuất, tiêu thụ và xuất khẩu đậu tương lớn nhất cụ thể ở bảng 2.
Bảng 1.1: Tình hình sản xuất đậu tương của 4 quốc gia đứng đầu thế giới trong
những năm gần đây
2015

Năm

2016
Diện tích


Diện tích gieo

Sản lượng

trồng (triệu ha)

(triệu tấn)

Mỹ

32,39

57,2

31,84

106,9

Brazil

30,3

96,2

32,7

101

Argentina


21,1

61,4

18,7

58,5

Quốc
Gia

gieo trồng
(triệu ha)

Sản lượng
(triệu tấn)

(Nguồn FAOSTAT, 2016)
Trên thế giới có 28 nước đã báo cáo việc tăng năng suất của cây đậu tương
công nghệ sinh học có khả năng chịu được thuốc diệt cỏ. Ba nước phát triển lớn nhất
như Mỹ, Braxin, Argentina có khu vực trồng giống đậu tương chống chịu thuốc diệt
cỏ lần lượt trong năm 2016 là: Mỹ (31,84 triệu ha) giảm nhẹ so với năm 2015 là 1,7%,
Braxin (12,43 triệu ha) và Argentina (18,6 triệu ha) ( Báo cáo
ISAAA 2016). Có nhiều nguyên nhân gây ra sự không ổn định về năng suất và sản

12


lượng đậu tương , một trong những nguyên nhân là do diện tích đất canh tác đậu
tương ở một số nước giảm nhẹ nhưng chỉ riêng Braxin là tăng diện tích trồng đậu

tương. Đáng chú ý là do tình hình biến đổi khí hậu và hạn hán là yếu tố có ảnh hưởng
lớn nhất đến năng suất đậu tương trên toàn thế giới.
Ở Việt Nam
Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, cục trồng trọt năm
2016 cho thấy: Năm 2016, là mô ̣t năm vô cùng khó khăn với ngành Nông nghiệp nói
chung và liñ h vực trồ ng tro ̣t nói riêng. Việc ảnh hưởng của điều kiện khí hậu tới năng
suất của cây trồng trên cả nước trong đó có đậu tương là yếu tố quan trọng. Nhưng do
những giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như giá trị về mặt công nghiệp của cây đậu
tương rất lớn nên hằng năm Việt Nam nhập khẩu một lượng lớn đậu tương từ các quốc
gia khác trên thế giới (Năm 2016 diện tích trồng đậu tương đạt khoảng 98 ngàn ha,
giảm 2 ngàn ha so với năm 2015, sản lượng đạt 145 ngàn tấn giảm khoảng hơn 1
nghìn tấn so với năm 2015. Dự báo trong năm 2017 Việt Nam sẽ nhập 5,2 triệu tấn
đậu tương và là nước nhập khẩu đậu tương nhiều nhất thế giới).
Theo tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, mưa bão nặng nề và kéo dài suốt năm đã khiến năng suất cây trồng và diện tích
thu hoạch đậu tương giảm và được thống kê ở bảng 2.
Bảng 1.2: Sản lượng đậu tương của Việt Nam trong những năm gần đây
Năm
Diện tích gieo
trồ ng (nghìn ha)
Năng suất (tấn/ha)
Tổng sản lượng
(nghìn tấn)

2013

2014

2015


2016

117,2

110,2

100

98

1,44

1,43

1,46

1,48

168,2

157,9

146

145

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, số liệu dự báo của USDA
Ở nước ta, việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng đã
được triển khai nghiên cứu một cách đầy đủ từ khá lâu. Trong lĩnh vực biến nạp gen ở

đậu tương thuộc đề tài: “Tạo các dòng đậu tương biến đổi gen kháng sâu” đã được

13


triển khai bởi nhóm nghiên cứu của TS. Trần Thị Cúc Hòa (Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long) [16]. Ngoài ra, Viện Công nghệ Sinh học cũng đã thực hiện các
nghiên cứu cấp cơ sở: “Nghiên cứu và hoàn thiện kỹ thuật biến nạp gen ở đậu tương
(2005 - 2006)”; phát triển hệ thống tái sinh in-vitro ở đậu tượng phục vụ cho biến nạp
gen của Nguyễn Thị Thúy Hường và cs, “tạo dòng đậu chịu hạn” tại Viện Di truyền
Nông nghiệp [11]. Tuy nhiên khả năng ứng dụng triển khai để tạo cây đậu tương biến
đổi gen ở Việt Nam vẫn còn hạn chế. Do có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến
nạp gen. Tuy nhiên, việc cải tiến các yếu tố nhằm tăng hiệu quả của quy trình biến nạp
gen là cần thiết để đạt được tỷ lệ gen chuyển thành công cao vào giống đậu tương
thương mại Việt Nam.
1.1.2. Giá trị của cây đậu tương đối với con người
Đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao và mang lại nhiều
lợi ích khác nhau. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia
súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Vì thế cây
đậu tương được gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu". Do vậy, cây đậu tương
được đánh giá là cây trồng có giá trị trong nhiều lĩnh vực như:
*

Giá trị về dinh dưỡng
Đậu tương là một trong những cây trồng thương mại được trồng phổ biến ở nhiều

nước trên thế giới. Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao với protein chiếm
khoảng 35,5 - 40%, lipit dao động từ 12-24%, carbohydrate từ 10-16%. Trong khi đó
protein của gạo chỉ đạt 6,2 - 12%; ngô: 9,8 - 13,2%; thịt bò: 21%; thịt gà: 20%; cá là
17 - 20%; trứng là 13 - 14%. Như vậy, protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất

trong các protein có nguồn gốc động vật, thực vật khác [8].
Bên cạnh hàm lượng lớn về protein và lipit, hạt đậu tương còn chứa nhiều loại
axit amin trong đó có 8 axit amin không thay thế như: Valine; Leucine; Isoleucine;
Methionine; Tryptophan; Threonine; Lysine; Phenylalanine. Điều này cho thấy đây là
loại hạt mà có đầy đủ các loại axit amin cần thiết. Ngoài ra, đậu tương là cây cung cấp
dầu thực vật quan trọng nhất thế giới. Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao
hơn các loại đậu khác. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin đặc biệt là
vitamin B1, B2, A, C... (vitamin C có nhiều trong giá đậu tương) [6]. Hạt đậu tương có

14


chứa nhiều hợp chất phenolic như axit chlorogenic, axit caffeic, axit ferulic acid pcoumaric. Đây là những chất chống oxy hóa tác dụng có lợi cho sức khỏe con người.
Giá trị về nông nghiệp

*

- Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc (1 kg hạt
đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi). Cây đậu tương gồm: thân, lá,
quả, hạt có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể
làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc. Sản
phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N2: 6,2%,
P2O5: 0,7%, K2O: 2,4%, vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [6]
- Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt (1 ha trồng đậu tương
nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N2). Trong hệ thống luân
canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với
cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho
việc bón N2. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm
lượng N2 trong thân chiếm 0,05%, trong lá: 0,19% [18].
*


Giá trị về công nghiệp
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế

biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, vv…, nhưng chủ yếu đậu tương được
dùng để ép dầu. Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên
liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. Đặc điểm của dầu
đậu tương: khô chậm, chỉ số iốt cao: 120- 127; ngưng tụ ở nhiệt độ: -15 đến -18oC. Từ
dầu này người ta chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà
phòng, v.v... [18].
1.1.3. Một số giống đậu tương ở Việt Nam
Giống đậu tương ĐT22
Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Hoàng Minh Tâm, Quách Ngọc
Truyền, Nguyễn Thị mỹ Hạnh, Nguyễn Thị Chúc, Lê Tuấn phong, Nguyễn Đạt
Thuần. Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực
phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
Giống ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột
biến của hạt lai (DT95 x ĐT12) và được Hội đồng Khoa học Công nghệ (Bộ
15


NN&PTNT) công nhận là giống mới. Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày
19/01/2006.
Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng trung bình từ 85-90 ngày. Hoa màu
trắng, hạt vàng, rốn nâu đâm, quả chín có màu nâu. Khối lượng 1000 hạt khoảng 155160g. Có khả năng kháng bệnh phấn trắng. Năng suất từ 18-27 tạ/ha, tùy thuộc vào
mùa vụ và điều kiện thâm canh. ĐT22 thích hợp gieo trồng trong cả 3 vụ trong năm.
Giống đậu tương ĐVN9
Giống đậu tương ĐVN9 do nhóm các nhà khoa học của Viện nghiên cứu Ngô lai
tạo và chọn lọc từ tổ hợp lai ĐT12 x VN205
Những đặc tính chính: ĐVN9 là giống đậu tương chín sớm: vụ xuân khoảng 8890 ngày, vụ hè: từ 75 – 77 ngày, vụ đông: 78-80 ngày. Dạng cây đứng, lá hình trứng

nhọn, hoa tím, vỏ quả chín màu vàng rơm, hạt vàng, rốn hạt nâu nhạt. Chiều cao cây
trung bình 27,3 - 56,5 cm; phân cành mạnh khoảng 1,7 – 3,1 cành cấp 1 trên một cây;
sai quả khoảng 22,9 – 49,5 quả trên một cây. Khối lượng 1000 hạt khoảng 148,5 –
171,8 gam. Năng suất trung bình ở vụ xuân đạt 17 tạ/ha, vụ hè đạt 21 tạ/ha.
Giống đậu tương ĐT26
Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Nguyễn Thị Loan, Nguyễn Thị
Chinh, Nguyễn Văn Thắng, Trần Thanh Bình và CTV. Trung tâm Nghiên cứu và Phát
triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp
Việt Nam.
Giống đậu tương ĐT26 được chọn từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12. Được công
nhận cho sản xuất thử theo Quyết định số 111/QĐ-TT-CCN ngày 3 tháng 6 năm 2008.
Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trường trung bình từ 90-95 ngày. Chiều
cao cây 45-60 cm, hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chính có màu nâu, phân
cành khá nhiều từ 2-3 cành/cây, có 30-35 quả chắc/cây, tỷ lệ quả 3 hạt 20-40%. Khối
lượng 1000 hạt 180-190g. Năng suất 21-29 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện
thâm canh. Giống thích hợp trong vụ xuân và vụ đông.
Giống đậu tương DT84
Giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo bằng phương
pháp xử lý đột biến dòng 33-3 (tổ hợp lai ĐT80 x ĐH4) được công nhận giống Quốc
gia năm 1995 và đưa vào khảo nghiệm, sản xuất từ năm 1995.
16


Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng 85 – 90 ngày. Chiều cao cây từ 50
– 60 cm, cây sinh trưởng khỏe, ít phân cành. Hạt to, màu vàng sáng, hoa màu tím,
khối lượng 1000 hạt 160 – 180 hạt, năng suất đạt 15 – 20 tạ/ha. Giống được trồng cả 3
vụ: xuân, hè, đông, thích hợp trồng thâm canh.
Trong đề tài nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen vào các giống đậu tương của
Việt Nam của Ths. Đỗ T.Như Quỳnh tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế
bào Thực vật, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã chỉ ra trong các giống đậu tương của

Việt Nam bao gồm giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26, DT84 cho thấy giống đậu tương ĐT22
có khả năng tái sinh cụm chồi cao và có tiềm năng tiếp nhận gen tốt nhất trong 4
giống đậu tương nghiên cứu [3]. Do vậy, chúng tôi chọn giống ĐT22 làm nguyên liệu
cho đề tài nghiên cứu.
1.2.

Hạt nano kim loại và vai trò của các hạt kim loại lên cây trồng

1.2.1. Định nghĩa về vật liệu hạt nano
Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có hình dáng, kích thước trên
quy mô nanomet (nm, 1nm = 10-9 m) được tạo thành từ các kim loại. Hạt nano là vật
liệu trong đó ít nhất có một chiều có kích thước nm. Về trạng thái của vật liệu nano,
người ta phân chia thành ba trạng thái, rắn, lỏng và khí. Vật liệu nano được tập trung
nghiên cứu hiện nay, chủ yếu là vật liệu rắn, sau đó đến chất lỏng và khí. Về hình
dáng của hạt nano người ta chia thành các loại sau:
Vật liệu nano không chiều: Là cả ba chiều đều có kích thước nano, không còn
chiều tự do nào cho điện tử. Ví dụ: đám nano, hạt nano…
Vật liệu nano một chiều: Là vật liệu trong đó có hai chiều có kích thước nano,
điện tử được tự do trên một chiều. Ví dụ; dây nano, ống nano…
Vật liệu nano hai chiều: Là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, hai
chiều tự do. Ví dụ: màng mỏng …
Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có
một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều,
một chiều hoặc hai chiều đan xen lẫn.
1.2.2.

Ảnh hưởng của hạt kim loại nano tới cây trồng

Kim loại đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của tế bào,
trong đó có các tế bào nuôi cấy. Mỗi loại kim loại có các đặc tính riêng biệt với từng

17


loài, từng mô và từng giai đoạn sinh trưởng riêng biệt. Trong đất tồn tại lượng kim
loại rất lớn, có những yếu tố từ 1 - 10% trọng lượng đất khô như Al, Fe; có yếu tố từ
0,01 - 0,1% đất khô như Zn, Cu; có yếu tố chiếm 0,001 - 0,01% đất khô như Co, Mo.
Nhưng hàm lượng kim loại cây cần dùng thường rất ít (dưới 0,001%). Nhưng phần
lớn cây đều không hấp thụ đủ lượng kim loại cần dùng. Theo các nhà khoa học, thì
nguyên nhân chính của hiện tượng này là do lượng kim loại nằm trong đất thường là
dạng khó hấp thu nhưng đây cũng là những chất vi lượng cần thiết để cây phát triển
và làm tác nhân hoạt hoá trong các hệ thống enzyme của cây trồng.
Đối với các kim loại ở dạng tinh thể có (kích thước 40 – 100 nm) là những hạt nano
được biết đến là trạng thái siêu phân tán thì các hạt nano kim loại dễ dàng được hấp
thụ bởi tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy. Hạt nano kim loại có khả năng tạo sức
căng bề mặt lớn có tác dụng tăng cường trao đổi chất.
Nano kim loại bạc (Ag): Bạc (Ag) và các hợp chất của bạc thể giúp tăng hiệu suất
quang hợp thúc đẩy quá trình tổng hợp đường giúp cây trồng tăng trưởng nhanh, khỏe
mạnh, tăng khả năng chống chịu bệnh tốt hơn. Đặc biệt, đối với hạt nano bạc (Ag) khi
gặp các vi khuẩn, virus sẽ thì tương tác với lớp protein trên bề mặt vi khuẩn, virus rồi
từ đó phá hủy màng tế bào làm ức chế phát triển.
Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so
với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn.
Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+.
Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế
bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến
làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng
hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có thành tế bào,
vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này.
Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả như
sau: Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi

vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sunfuahydrin – SH của phân tử enzym
chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi
khuẩn.
-SAg+

-SH
18


Men hoạt hóa

Men thụ động

+ 2 Ag+

+ 2H+

- SAg+

-SH

Hình 1.1: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn
Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa
điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA.
Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo
nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các
màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano [9].
Nano kim loại sắt (Fe): Sắt là một yếu tố tác động đến sự phát triển của thực vật.
Đối với cây trồng sắt (Fe) tham gia hỗ trợ và xây dựng enzyme trong dây truyền tổng
hợp sắc tố diệp lục, tham gia vào quá trình phân ly nước, photphoryl hóa quang hóa và

là thành phần bắt buộc trọng hệ enzyme oxy-hóa khử (cytocrom). Kim loại sắt (Fe)
tồn tại nhiều trong đất, nhưng hàm lượng sắt có trong cây trồng lại rất thấp. Do đó
việc thiếu sắt trong nông nghiệp là một vấn đề khá phổ biến.
Thực vật có thể hấp thu sắt ở dạng Fe2+ và Fe3+ nhưng hầu hết sắt trên lớp vỏ trái
đất tồn tại dưới hình thức Fe3+. Trong cây trồng sắt được hấp thụ và tồn tại nhiều dưới
hình thức Fe2+ do trạng thái Fe2+ dễ hòa tan, nhưng lại dễ dàng bị oxy hóa thành Fe3+
và sau đó bị kết tủa. Trạng thái Fe3+ không hòa tan trong môi trường trung tính cao. Vì
vậy hàm lượng sắt là rất ít trong cây trồng ở môi trường đất kiềm và môi trường đất có
chứa nhiều canxi. Hơn nữa, trong các loại đất, sắt dễ dàng kết hợp với phosphat,
carbonat, magiê, canxi và các ion hydroxit.
Sắt là một nguyên tố cần thiết cho hệ thống các enzyme để thực hiện phản ứng
oxy hóa khử và chuỗi vận chuyển điện tử trong cây, tổng hợp chất diệp lục, duy trì cấu
trúc của lục lạp. Sắt cũng có vai trò điều hòa hô hấp, quang hợp, khử nitrat và sulfat những phản ứng cần thiết để thực vật phát triển và sinh sản [31]. Hiện nay, trong nuôi
cấy mô tế bào thực vật, sắt chủ yếu được sử dụng dưới dạng chelate (Fe-EDTA). FeEDTA cho phép giải phóng từ từ và liên tục ion sắt vào môi trường nuôi cấy và hạn
chế sự kết tủa của sắt thành dạng oxide [51]. Một số nghiên cứu đã được tiến hành
như nghiên cứu của Zhu et al. (2008) về sự hấp thu, vận chuyển và tích lũy của nano
Fe3O4 trên cây bí ngô [60]; nghiên cứu về độc tính của nano sắt/sắt oxide và
đồng/đồng oxide trên cây rau diếp [54] hay nghiên cứu của Racuciu và Creagna
19


(2006) về ảnh hưởng nano sắt từ phủ tetramethylammonium hydroxide lên sự phát
triển ở cây ngô [47]. Tuy nhiên, ảnh hưởng của nano sắt đến các loài thực vật đặc biệt
là trong nuôi cấy mô thực vật vẫn còn rất hạn chế.
Nano kim loại coban (Co): Là kim loại có mặt trong khoảng một nửa số lượng
môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. Mục đích bổ sung (Co) vào môi trường chống lại
sự gây độc của các chelat kim loại và có thể ngăn cản các phản ứng oxi hóa gây ra bởi
đồng và sắt. Coban (Co) đóng vai trò quan trọng trong quá trình cố định nitơ ở rễ cây
họ đậu, là thành phần cần thiết của enzym cobalomin. Coban trong cơ thể thực vật
thường tồn tại ở dạng ion và trong hợp chất porphyrin của vitamin B12.

Nano kim loại đồng (Cu): Kim loại đồng (Cu) có vai trò quan trọng trong các
phản ứng chuyển hóa sinh hóa trong cơ thể sống. Tuy nhiên, đồng (Cu) vừa là nguyên
tố vi lượng, vừa là chất độc hại đối với con người, cây trồng và động vật. Trong môi
trường đất, hàm lượng đồng (Cu) trong tự nhiên xấp xỉ 24–70 mg/kg, phụ thuộc vào
thành phần khoáng vật và quá trình hình thành đất [1].
Đối với cây trồng: Theo kết quả nghiên cứu nhiều công trình cho thấy đồng (Cu)
có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển của cây trồng. Đồng (Cu) tồn tại trong
cây ở dạng Cu2+. Đồng đóng vai trò quan trọng trong cây trồng nông nghiệp như: (i):
Tham gia vận chuyển điện tử trong quá trình quang hợp, kích thích sự vận chuyển sản
phẩm quang hợp tới mô dự trữ và tổng hợp tinh bột. (ii): Tham gia các thành phần
protein chứa đồng và các enzyme xúc tác các thành phần phản ứng oxi hóa khử. (iii):
Tham gia thành phần của phức hệ nitratreductase trong quá trình khử nitrat ở tế bào.
(iv): Kích thích quá trình tổng hợp tinh bột và vitamin. (v): Làm tăng tính chống chịu
các mầm bệnh, tăng tính chịu rét, chịu nóng cho cây trồng. Ngoài ra, đồng (Cu) có tác
dụng thúc đẩy quá trình hấp thụ nước, vận chuyển và thoát hơi nước của cây, tăng tính
chống chịu hạn cho cây trồng. Thiếu đồng (Cu) cây trồng thường phát triển chậm, mất
nước dẫn đến tình trạng cây bị héo. Đồng (Cu) hình thành một số lớn chất hữu cơ tổng
hợp với protein, acid amin và một số chất khác mà chúng ta thường gặp trong nước
trái cây. Việc thiếu đồng (Cu) hay việc thừa đồng (Cu) cũng xảy ra những biểu hiện
ngộ độc mà chúng có thể dẫn tới tình trạng cây chết [8].
1.3.

Gen bar

20


Gen bar là tên go ̣i của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin
acetyltransferase (PAT), có tác du ̣ng làm mấ t đô ̣c tin
́ h của phosphinothricin (PPT), là

hoa ̣t chấ t chính của thuố c trừ cỏ như Bialaphos và Basta. Gen bar đươ ̣c ta ̣o dòng đầ u
tiên từ mô ̣t dòng vi khuẩ n Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản nhấ t để
kiể m tra sự có mă ̣t của gen bar là phương pháp trực tiế p. Mô, tế bào hoặc cây chuyể n
gen đươ ̣c đă ̣t trên môi trường có các nồ ng đô ̣ phosphinothricin khác nhau (hoă ̣c các
thuố c trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đố i chứng đă ̣t
trên cùng môi trường [14].
1.4. Chọn tạo giống đậu tương bằng phương pháp chuyển gen
Năm 1988, cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được công bố [34]. Kể từ đó, đậu
tương biến đổi gen đã được nghiên cứu và chọn tạo rộng rãi bởi các nhà sản xuất của
Mỹ, Brazil, Argentina, Canada… Từ những năm 1990, cây đậu tương kháng thuốc
diệt cỏ “Roundup – ready” là sản phẩm độc quyền của công ty Monsanto. Hiện nay,
họ đã và đang cung cấp giống cho hơn một nửa diện tích trồng đậu tương tại Mỹ.
Brazil và Mỹ, là hai nước có diện tích trồng cây biến đổi gen (bao gồm cả đậu tương)
đứng thứ nhất trên thế giới. Trong 20 năm trở lại đây việc trồng cây trồng BĐG không
còn là xa lạ ở các nước phát triển. Diện tích trồng cây BĐG trên thế giới đạt 2 tỷ ha
trong đó 1 tỷ ha trồng cây đậu tương BĐG (ISAA, 2016).
Trong những năm gần đây, công nghệ gen phát triển mạnh các nhà nghiên cứu đã
tiến hành giải trình tự genome của đậu tương và đã phát hiện trong genome của đậu
tương có khoảng 66.000 gen được phân tích trong đó 38.172 gen là các nhân tố phiên
mã sẽ quyết định kiểu hình của cây chống lại với điều kiện bất thuận của môi trường
bao gồm kháng hạn, kháng ngập úng, nồng độ protein và dầu cao…[24]. Các yếu tố
ảnh hưởng đến năng suất chính bao gồm các yếu tố sinh học như cỏ dại, sâu, bệnh và
các yếu tố phi sinh học như hạn, mặn, lạnh, nóng, nhiễm độc kim loại. Năng suất giảm
37% bởi cỏ dại, 11% do các loại mầm bệnh, 1% do virus và 11% do sâu hại có nguồn
gốc động vật. Mức giảm do cỏ dại thay đổi không lớn giữa các khu vực (35 – 40%),
tuy nhiên mức thiệt hại do mầm bệnh và sâu hại khá cao, tương ứng dao động ở 7 –
16% đối với mầm bệnh và 4 – 20% đối với sâu hại bởi vì sự khác biệt về sâu hại chính
giữa các vùng miền [39]. Các yếu tố bất lợi về thời tiết cũng gây ảnh hưởng nghiêm
trọng đến năng suất và sản lượng của đậu tương. Trong đó, ảnh hưởng của hạn hán là
21



đặc biệt nghiêm trọng, có thể làm giảm từ 40 - 60% năng suất đậu tương. Hiện nay,
các tính trạng đã và đang được các nhà chọn tạo giống đậu tương bằng công nghệ gen
đang được các nhà nghiên cứu quan tâm bao gồm [36].
Kháng thuốc diệt cỏ: Ngày nay, hơn 85% đậu nành ở Mỹ và 56% đậu tương
trên thế giới là đậu tương kháng thuốc diệt cỏ và đây là tính trạng phổ biến nhất của
cây chuyển gen. Các gen mã hóa cho tính trạng kháng các thành phần trong thuốc diệt
cỏ đã được ứng dụng gồm: ALS (acetolactate synthase), aroA (phân lập từ
Agrobacterium dòng CP4), GAT (phân lập từ Bacillus lichenformis), PAT (phân lập từ
Streptomyces viridochromogenes), BAR (phân lập từ Streptomyces hygroscopicus).
Kháng nấm: Nấm là một trong những nguyên nhân gây bệnh ở đậu tương. Các
nhà khoa học đã phát hiện có hơn 40 loài nấm gây bệnh đã được xác định là có hại lên
sự phát triển của thực vật, trong đó có các loài xâm nhiễm trên cây đậu tương mà
nghiêm trọng nhất là Phytophthora (gây thối rễ). Các gen kháng với Phytophthora tự
nhiên (Rps) cũng đã được nhận diện, phân lập và chuyển vào cây đậu tương [32] .
Ngoài ra, Sclerotina sclerotiorum (một loại mốc trắng) cũng là một tác nhân gây quan
trọng trên đậu tương. Gen OXO đã được nghiên cứu biến nạp vào đậu tương để giúp
cây kháng với mốc trắng [22].
Kháng tuyến trùng: Hơn 100 loài tuyến trùng có thể xâm nhiễm vào cây đậu
nành, gây hư hại rễ, làm cây héo và do đó làm năng suất giảm. Khi xâm nhiễm vào rễ,
tuyến trùng tiết một số các hợp chất làm cho một số tế bào của rễ hình thành nên một
cấu trúc đặc biệt gọi là hỗn bào SCN [36]. Gen kháng SCN tự nhiên đã được định vị
và dòng hóa để chuyển vào cây đậu tương. Ngoài ra, người ta còn tạo ra các cây
kháng tuyến trùng bằng cách chuyển vào cây gen mã hóa cho các peptide ức chế tuyến
trùng,ví dụ như Oc-I∆D86 hay CpT1.
Kháng virus: Có khoảng hơn 100 loại virus gây hại trên thực vật, trong đó virus
khảm BPMV và SbDV là hai loại virus quan trọng nhất tác động lên đậu tương [59].
Phương pháp biến nạp làm im lặng gen sau phiên mã thông qua RNA đã được sử dụng
để tạo ra các cây chuyển gen kháng virus, bằng cách chuyển một cassette gồm mạch

sense và mạch antisense của gen mã hóa cho protein vỏ virus (CP – coat protein) vào
cây.

22


Kháng côn trùng: Có rất nhiều loài côn trùng tấn công vào cây đậu tương. Bt
(phân lập từ Bacillus thuringiensis) được xem là chiến lược hiệu quả nhất cho việc tạo
cây đậu tương chuyển gen kháng côn trùng. Hơn 50 gen độc Bt đã được dòng hóa cho
mục đích này [61]. Bên cạnh gen Bt, protein TcdA (được phân lập từ Photorhabdus
luminescens) cũng được chứng minh là có tiềm năng ứng dụng trong thực vật chuyển
gen kháng côn trùng [37]. Ở đậu tương, sâu hại là nhóm đối tượng thường xuyên gây
ra những thiệt hại đáng kể đối với sản xuất đậu tương. Sâu hại tất cả các bộ phận của
cây, nhóm sâu hại lá, thân, quả, sâu hại trong đất. Có tới 360 loài sâu hại đậu tương ở
các vùng trồng đậu tương trên thế giới. Tuy nhiên, các loài sâu hại và mức độ gây hại
ở các vùng có sự biến thiên.
Kháng các stress phi sinh học: Tạo ra cây chuyển gen kháng với các stress phi
sinh học là một thách thức lớn với công nghệ sinh học thực vật. Các stress này bao
gồm: hạn hán, lạnh, tính mặn, nhiệt và kim loại nặng. Một số gen tiềm năng cho
kháng stress phi sinh học trên cây đậu tương là: CAX1 (mã hóa cho protein của kênh
vận chuyển cation/proton trên màng tế bào, ứng dụng trong việc tạo cây chuyển gen
kháng mặn), P5CR (mã hóa cho một enzyme chìa khóa trong con đường tổng hợp
proline, tích lũy proline có thể dẫn đến sự hình thành tính kháng hạn và kháng nhiệt
độ cao). Quach và cs, đã chứng minh được các gen GmNAC003 và GmNAC004 có
tiềm năng ứng dụng trong chọn tạo giống đậu tương kháng hạn bằng công nghệ gen.
Các cây Arabidopsis sau khi được biến nạp các gen này đã thể hiện tính chống chịu
hạn tốt, bộ rễ phát triển khỏe hơn so với đối chứng [44]. Các điều kiện bất lợi của môi
trường diễn ra do hệ quả của sự thay đổi biến đổi khí hậu toàn cầu, trong đó, đặc biệt
là tình trạng hạn hán và thiếu nước sử dụng đã và đang trở thành vấn nạn chung của
nhiều quốc gia [23]. Đối với đậu tương, ảnh hưởng bởi sự thiếu hụt nước gây ra các hệ

quả to lớn. Do đó, tìm ra được giống đậu tương có khả năng chống lại với các điều
kiện khắc nghiệt của khí hậu hiện nay rất cần thiết. Tuy nhiên, việc tạo ra cây đậu
tương chống chịu hạn vẫn còn khó khăn.
1.5. Thực trạng nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương
Công nghệ biến nạp gen ở đậu tương đã được rất nhiều nhà khoa học trên thế
giới nghiên cứu và cải tiến. Trong đó, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens vào mô in-vitro nhằm tạo cây trồng biến đổi gen đem lại
23


tỷ lệ thành công cao và ít tốn kém. Ngày nay, hai hệ thống chuyển gen ở đậu tương là
chuyển gen thông qua nốt lá mầm (cotyledon node) và thông qua phôi vô tính
(embryogenesis) được cho là có hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi. Hinchee và cs
(1988) đã tái sinh thành công cây đậu tương biến đổi gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens bằng cách sử dụng nốt lá mầm làm mô đích [35]. Các
nghiên cứu ban đầu cho thấy chỉ có một giống đậu tương thích hợp để lây nhiễm với
Agrobacterium và có sẵn hệ thống tái sinh [28], [35], [42]. Tuy nhiên, các nghiên cứu
gần đây đã khắc phục được các hạn chế đó [29], [56].
Các nhà nghiên cứu đã xây dựng thành công phương pháp chuyển gen đậu tương
và có thể lặp lại được bằng cách sử dụng các mảnh nốt lá mầm từ các cây con và các
hạt trưởng thành cho chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium [33]. Vùng nốt lá
mầm có chứa vùng mô phân sinh nách lá nằm giữa lá mầm và trụ dưới lá mầm. Mô
phân sinh nách lá sẽ biệt hóa và tái sinh thông qua hình thành nhiều chồi bất định khi
nuôi cấy trên môi trường chứa cytokinin và benzylaminopurine. Mức độ hình thành
chồi phụ thuộc vào kiểu gen của mẫu nuôi cấy, hầu hết đều có thể hình thành chồi bất
định ở vùng nốt lá mầm. Kỹ thuật gây tổn thương nốt lá mầm bằng dao phẫu thuật đòi
hỏi phải người làm phải có kĩ năng để chuẩn bị mẫu cho lây nhiễm với vi khuẩn [60].
Ngược lại, kỹ thuật tạo vết cắt trên nốt lá mầm đậu tương bằng cách sử dụng dao cấy
thép không gỉ để rạch là phương pháp dễ sử dụng, tạo vết cắt đồng đều, không đòi hỏi
kĩ năng của người làm thí nghiệm [54]. Thêm vào đó, các tác nhân khử như L-cysteine

trong môi trường đồng nuôi cấy lỏng làm tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen vào các tế
bào nốt lá mầm [40], [41] và tạo ra các cây chuyển gen hữu thụ [42]. Kết hợp sử dụng
tác nhân khử và vector nhị thể, acetosyringone sẽ làm tăng hiệu quả chuyển gen [27],
[50]. Cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra sử dụng gen nptII kháng lại
kanamycine là gen chỉ thị chọn lọc [35]. Hiện nay, các mẫu chuyển gen đậu tương
thường được chọn lọc bằng gen bar và thuốc trừ cỏ phosphinothricin (glufosinate)
[58], [60]. Nồng độ của tác nhân chọn lọc có ảnh hưởng đáng kể tới tần suất chuyển
gen [58], vì thế với mỗi giống đậu tương khác nhau có nồng độ chọn lọc phù hợp. Tần
số chuyển gen thu được từ 0,2% đến 10% [42], [46], [57], cho thấy hiệu quả chuyển
gen còn phụ thuộc vào kĩ năng của người thực hiện thí nghiệm và phụ thuộc giống đậu
tương. Tiếp đến, nhiều nhóm tác giả ở các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới
24