BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ XUÂN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HYDROGEL
ACID HYALURONIC CHỨA LIPOSOME

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ XUÂN
Mã sinh viên: 1301486

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HYDROGEL
ACID HYALURONIC CHỨA LIPOSOME

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Nguyễn Cảnh Hưng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Bào chế
2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
3. Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
ThS. Nguyễn Cảnh Hưng
Là người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dạy dỗ, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi và
động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cám ơn GS.TS. Phạm Thị Minh Huệ, ThS. Nguyễn Văn
Lâm, PGS.TS Vũ Đặng Hoàng đã tạo điều kiện, góp ý và hướng dẫn tôi hoàn thiện đề
tài.
Tôi xin gửi lời cám ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Bào
chế, Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia đã tạo
điều kiện cho tôi sử dụng thiết bị, máy móc và hướng dẫn tôi trong quá trình thực
nghiệm.
Tôi xin trân trọng cám ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu Nhà trường cùng
toàn thể thầy cô các bộ môn và cán bộ các phòng ban trường Đại học Dược Hà Nội đã
tận tình dạy dỗ tôi trong những năm tháng học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là
bạn Hoàng Thị Lan Hương trong nhóm nghiên cứu đã luôn ở bên tôi, động viên và tạo
điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Trần Thị Xuân


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

2

1.1. Tổng quan về bệnh thoái hóa khớp và một số thuốc tiêm nội khớp trong điều trị
thoái hóa khớp

2

1.1.1. Tổng quan về bệnh thoái hóa khớp

2

1.1.2. Tổng quan về đường tiêm nội khớp trong điều trị THK

3

1.2. Một số đặc tính lưu biến thường được đánh giá của các chế phẩm bù nhớt
1.2.1. Độ nhớt tĩnh hay độ nhớt tại trạng thái nghỉ η0 (zero shear – viscosity)

10
10

1.2.2. Độ nhớt tại tốc độ trượt 250 s-1, tính trượt mỏng (shear – thinning) và tỷ
suất trượt mỏng (shear – thinning ratio)

10

1.2.3. Tính xúc biến (thixotropic)


11

1.2.4. Mô-đun đàn hồi (G’), mô-đun nhớt (G”) và tần số giao cắt (cross – over
frequency)

11

1.3. Tổng kết

12

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

14

2.1. Nguyên liệu, thiết bị

14

2.1.1. Nguyên liệu

14

2.1.2. Thiết bị sử dụng

14

2.2. Đối tượng nghiên cứu


15

2.3. Phương pháp nghiên cứu

15

2.3.1. Phương pháp bào chế liposome

15

2.3.2. Phương pháp đánh giá KTTP liposome

16

2.3.3. Phương pháp khảo sát lưu biến gel HA và gel HA chứa liposome

17

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

19

3.1. Bào chế các hệ liposome và gel HA - liposome với tỷ lệ thành phần khác nhau
19
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn phương pháp làm giảm KTTP liposome

19


3.1.2. Khảo sát và lựa chọn môi trường hydrat hóa


22

3.1.3. Ảnh hưởng của môi trường hydrat hóa liposome tới đặc tính lưu biến của
gel HA
3.2. Đánh giá đặc tính lưu biến của gel HA và gel HA chứa liposome

24
25

3.2.1. Tính trượt mỏng (shear – thinning)

25

3.2.2. Tính xúc biến (thixotropic)

26

3.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới tần số giao cắt, độ nhớt tĩnh, độ nhớt tại tốc độ
trượt 250 s-1, tỷ suất trượt mỏng của hệ gel HA và gel HA chứa liposome
PHỤ LỤC

28


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
AIA
Chol
CIA

DPPC
EPC
HA
HSPC
IA
KTTP
Na-HA
OA
PC
PL
RA
SF
SPC
STT
THK
KLPT

Ý nghĩa
Viêm khớp do kháng nguyên gây ra (Antigen-Induced
Arthritis)
Cholesterol
Viêm khớp do Collagen gây ra (Collagen-Induced
Arthritis)
Dipalmitoyl PC
Phosphatidyl cholin trứng (Egg phophatidyl choline)
Acid Hyaluronic
Phosphatidyl cholin dầu đậu nành đã hydrogen hóa
(Hydrogen soy bean phophatidyl choline)
Tiêm nội khớp (Intra-articular)
Kích thước tiểu phân

Natri hyaluronat
Viêm xương khớp (Osteoarthritis)
Phosphatidyl cholin
Phospholipid
Viêm khớp dạng thấp (Rheumatoid Arthritis)
Dịch khớp (synovial fluid)
Phosphatidyl cholin dầu đậu nành ( Soybean PC)
Số thứ tự
Thoái hóa khớp
KLPT trung bình


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.2 Đặc tính lưu biến của dịch khớp của người khoẻ mạnh và độ nhớt của bệnh
nhân thoái hoá khớp ........................................................................................................5
Bảng 1.3 Một số chế phẩm HA tiêm nội khớp trên thị trường........................................6
Bảng 1.4. Đặc tính lưu biến của một số chế phẩm acid hyaluronic tiêm nội khớp khác
nhau trên thị trường .........................................................................................................6
Bảng 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng liposome trong điều trị các bệnh về khớp .........8
Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực hiện khóa luận. ......................14
Bảng 3.1 KTTP thu được sau siêu âm bể của các công thức, môi trường hydrat hóa
khác nhau: mannitol 5%, HEPES 10mM (HEPES/Man); glucose 5%, HEPES 10mM
((HEPES/Glu) và đệm phosphat salin (PBS). ...............................................................21
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá KTTP của các mẫu thử độ ổn định trong các môi trường
khác nhau. ......................................................................................................................23
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá lưu biến của các mẫu gel HA và gel HA chứa liposome ...28
Bảng 3.4 Bảng so sánh mối tương quan giữa độ nhớt của các mẫu gel chứa liposome
30mM và 50mM so với mẫu 10mM, trong 2 nồng độ gel HA 1,0%, HA 2,0%. ..........30
Bảng 3.5 Bảng so sánh một số đặc tính lưu biến của hệ gel HA chứa liposome và dịch
khớp bình thường theo Nicholls và cộng sự .................................................................32



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Cấu tạo của sụn khớp bình thường và sụn khớp tổn thương ở bệnh nhân thoái
hoá khớp ..........................................................................................................................2
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của HA được cấu tạo từ các monome N-acetyl glucosamin
và acid glucuronic ............................................................................................................4
Hình 1.4 Cấu trúc của liposome ......................................................................................7
Hình 3.4 Hình ảnh mẫu màng phim hydrat hoá (từ trái qua phải lần lượt bằng
HEPES/Mannitol, HEPES/Glucose và PBS) ................................................................23
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt phức hợp của các mẫu gel trong 2 môi
trường Glucose/HEPES và mannitol/HEPES với độ nhớt phức hợp ban đầu theo thời
gian khi thêm H2O2 ........................................................................................................24
Hình 3.6 Đồ thị thể hiện tính trượt mỏng của (a) gel HA 2,0% và (b) gel HA 2% chứa
liposome 5% DSPE-PEG 2000 (30mM) .......................................................................26
Hình 3.7 Đồ thị đánh giá tính xúc biến của gel HA. Đường cong độ nhớt của giai đoạn
3 (màu xanh lá cây) trùng với đường cong của giai đoạn 1 (màu đỏ) thể hiện hệ gel
không có tính xúc biến. .................................................................................................26
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của độ nhớt theo thời gian khi khảo sát tĩnh xúc
biến của gel HA. ............................................................................................................27
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự không có tính xúc biến của hệ gel HA, gel HA –
liposome 30mM, gel HA – liposome 50mM. ................................................................27
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn sự thay đổ tần số giao cắt theo tổng nồng độ lipid. ...........29
Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ nhớt tĩnh theo tổng nồng độ lipid và KTTP
liposome.........................................................................................................................31
Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn thay đổi của tần số giao cắt (cross-over frequency) theo
tổng nồng độ lipid và KTTP liposome. .........................................................................31
Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt tĩnh theo tổng nồng độ lipid, nồng độ
DSPE-PEG 2000 và KTTP liposome ............................................................................32



ĐẶT VẤN ĐỀ
Mặc dù đã có nhiều các nghiên cứu bào chế và đánh giá lâm sàng, nhưng hiện vẫn
chưa có các biện pháp điều trị triệt để bệnh thoái hoá khớp. Các tổn thương khớp không
hồi phục có thể được điều trị bằng các thuốc sử dụng uống, tiêm tĩnh mạch hay tiêm nội
khớp. So với đường uống và đường tiêm tĩnh mạch, các dạng bào chế tiêm nội khớp có
cho phép đưa được trực tiếp thuốc với nồng độ cao vào vị trí tác dụng, giúp tăng hiệu quả
điều trị và giảm độc tính toàn thân.
Acid hyaluronic (HA) là một trong những loại thuốc tiêm nội khớp được sử dụng
rộng rãi nhất trong điều trị thoái hoá khớp. Tiêm nội khớp HA, còn được gọi là biện pháp
“bù nhớt” (viscosupplementation), giúp khôi phục độ nhớt và các đặc tính lưu biến của
dịch khớp và có thể tạo ra hiệu quả giảm đau có thể lên tới 6 tháng. Trên thị trường có rất
nhiều loại chế phẩm HA với đặc điểm cấu trúc HA khác nhau dẫn tới các đặc tính lưu
biến khác nhau; trong đó chế phẩm HA có liên kết chéo được chứng minh tốt hơn về tác
dụng bảo vệ sụn khớp do đạt được các thông số lưu biến tương tự dịch khớp sinh lý, tuy
nhiên chúng lại có nguy cơ tồn dư hóa chất dùng để tạo các liên kết chéo hóa học. Do đó
yêu cầu đặt ra là cần thay thế các tác nhân hóa học bằng những biện pháp khác mà vẫn
bảo toàn được cấu trúc cũng như tác dụng dược lý của gel HA. Nhiều nghiên cứu chỉ ra
rằng liposome có khả năng làm thay đổi đặc tính lưu biến của gel HA bằng các tương tác
vật lý.
Nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế hydrogel acid
hyaluronic chứa liposome” với một số nội dung chính như sau:
-

Bào chế liposome ở các vùng kích thước khác nhau với tổng nồng độ lipid và tỷ lệ
thành phần khác nhau.

-

Đánh giá ảnh hưởng của liposome tới đặc tính lưu biến và mức độ thuận tiện khi

tiêm của các hệ hydrogel acid hyaluronic chứa liposome hướng đến đường tiêm nội
khớp.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh thoái hóa khớp và một số thuốc tiêm nội khớp trong điều trị
thoái hóa khớp
1.1.1. Tổng quan về bệnh thoái hóa khớp
Thoái hoá khớp (THK) có tỷ lệ biến thiên ở các nước đang phát triển, dao động từ
3 đến 20%, và đây là bệnh viêm khớp phổ biến nhất ở các nước phát triển. Tại Mỹ, tỷ lệ
này là 15% vào năm 1998, có thể lên tới 18,2% vào năm 2020. Ở Việt Nam chưa có
thống kê chính xác nào nhưng thoái hóa khớp chiếm tỷ lệ cao trong các bệnh lý cơ xương
khớp, đặc biệt là thoái hóa khớp gối [1].
THK là tổn thương thoái hóa tiến triển chậm, tăng dần của sụn khớp, gây ra bởi sự
kết hợp của rất nhiều yếu tố khác nhau như yếu tố gen, chuyển hóa, sinh hóa và cơ sinh
học kèm theo các quá trình viêm xảy ra thứ phát. Quá trình thoái hóa tác động đến cả sụn,
xương và màng hoạt dịch khớp [1].

Hình 1.1 Cấu tạo của sụn khớp bình thường và sụn khớp tổn thương ở bệnh nhân thoái
hoá khớp [27]
Đặc trưng của bệnh là quá trình mất dần sụn khớp. Có hai cơ chế chính được cho
là khởi phát quá trình THK: cơ chế thứ nhất, với đa số trường hợp là do tổn thương thoái
hóa thường khu trú ở các vị trí chịu lực của sụn hay ở các vị trí sau chấn thương cho nên
các chấn thương lặp đi lặp lại (các yếu tố sinh cơ sinh học) được cho là những yếu tố
quan trọng dẫn đến khởi phát và gây ra THK. Các tế bào sụn sẽ phản ứng lại với các tác
2



động trên bằng cách giải phóng ra các enzym gây thoái hóa và tạo ra các đáp ứng sửa
chữa không đầy đủ. Cơ chế thứ hai xảy ra ở một số ít trường hợp, chính các khiếm khuyết
của sụn khớp, ví dụ sự thiếu hụt các gen tạo nên collagen typ 2 sẽ làm cho sụn khớp trở
nên kém chịu lực hơn so với khớp bình thường, từ đó khởi phát quá trình THK. Sau quá
trình khởi phát, các diễn biến tiếp theo của THK dẫn tới nhiều tổn thương trong đó tổn
thương chính là ở phần sụn khớp với sự tham gia của nhiều yếu tố như quá tải khớp, vi
chấn thương khớp... và các chất trung gian hóa học gây viêm [1].
Cho tới nay, chưa có biện pháp điều trị hay thuốc nào có thể chữa khỏi hoàn toàn
THK. Mục tiêu điều trị chủ yếu là kiểm soát đau và sưng khớp, làm giảm tàn phế, cải
thiện chất lượng cuộc sống, ngăn chặn quá trình tiến triển của bệnh. Để điều trị THK cần
kết hợp nhiều biện pháp, bao gồm cả các biện pháp dùng thuốc và không dùng thuốc [1].
1.1.2. Tổng quan về đường tiêm nội khớp trong điều trị THK
Để điều trị THK, thuốc có thể được sử dụng qua đường uống hoặc đường tiêm nội
khớp. Các thuốc dùng qua đường uống có thể là các thuốc giảm đau đơn thuần như
paracetamol, các opiod hay các thuốc giảm đau chống viêm không steroid. Những thuốc
nhóm này có tác dụng tốt trong các trường hợp đau cấp. Tuy nhiên, việc dùng thuốc các
thuốc này kéo dài có thể gây nhiều tác dụng phụ như gây nghiện, gây độc với đường tiêu
hóa, gan, thận, tim mạch [1].
So với các thuốc dùng đường uống và tiêm tĩnh mạch, các biện pháp dùng thuốc
qua đường tiêm nội khớp tỏ ra có nhiều ưu điểm như đưa được thuốc với nồng độ cao tới
đích tác dụng và hạn chế các tác dụng không mong muốn toàn thân. HA là một trong
những thuốc điều trị qua đường tiêm nội khớp phổ biến nhất trong THK hiện nay. Tuy
vậy, bên cạnh những ưu điểm, việc sử dụng HA qua đường tiêm nội khớp vẫn còn nhiều
hạn chế. Đặc tính lưu biến của gel HA chưa đáp ứng được yêu cầu bảo vệ sụn khớp như
dịch khớp sinh lý khiến bệnh nhân phải tiêm thuốc nhiều lần làm tăng nguy cơ nhiễm
khuẩn khớp và giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [8].
Để khắc phục các hạn chế này, đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các biện pháp
khác nhau để làm thay đổi các đặc tính lưu biến của gel HA theo hướng đạt được các
3



thông số tương tự hoặc tốt hơn dịch khớp sinh lý. Và sử dụng liposome để tạo liên kết
chéo bằng các tương tác vật lý là một hướng đi cho thấy tiềm năng lớn, khi vừa bảo đảm
được cấu trúc gel HA cũng như tác dụng dược lý, vừa không có nguy cơ về tồn dư hóa
chất dùng để tạo các liên kết chéo hóa học. Từ đó, đề tài hướng đến bào chế hệ gel HA
chứa liposome đạt được các đặc tính lưu biến của dịch khớp sinh lý. Do vậy ở các phần
sau, đề tài chủ yếu trình bày về các đặc tính, ưu nhược điểm của gel HA tiêm nội khớp và
liposome.
1.1.2.1. Tiêm HA nội khớp
Acid hyaluronic (HA), còn được gọi là hyaluronan, là một polyme cao phân tử có
nguồn gốc từ thiên nhiên và có khả năng phân hủy sinh học. HA cấu tạo từ các monome
là các chuỗi các disaccharid, gồm 1 phân tử N-acetyl glucosamin và 1 phân tử acid
glucuronic.

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của HA được cấu tạo từ các monome N-acetyl glucosamin và
acid glucuronic
Nồng độ HA cao trong dịch khớp giúp đảm bảo chức năng và hoạt động bình
thường của khớp, do HA góp phần tạo nên các đặc tính lưu biến có lợi và góp phần bảo
vệ sụn khớp. Ở trạng thái nghỉ, nồng độ cao của HA làm tăng độ nhớt của dịch khớp và
giúp ổn định, hạn chế các va chạm có thể gây tổn thương khớp. Mặt khác, khi khớp ở
trạng thái chuyển động, dịch khớp chịu sự tác động của các ứng suất trượt lớn, cấu trúc
phân tử HA bị duỗi ra, liên kết giữa các phân tử HA bị phá huỷ tạm thời. Độ nhớt của hệ
giảm giúp làm giảm sự hao mòn và tiêu hao năng lượng khi sụn khớp hoạt động. Khi
ngừng vận động, quá trình tái cấu trúc của dịch khớp nói chung và HA nói riêng diễn ra
giúp hồi phục các đặc tính đàn hồi nhớt của dịch khớp ở trạng thái nghỉ.
4


Bên cạnh đó, HA có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của protein huyết tương vào
pha nước của dịch khớp. Khả năng này phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của protein,

tức là các phân tử lớn (ví dụ như alpha 2-macroglobulin huyết tương) về cơ bản được loại
trừ khỏi pha nước dịch khớp. Ngược lại, HA tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển
nước và các chất tan nhỏ qua dịch khớp đến sụn khớp từ các mao mạch trong màng hoạt
dịch và làm giảm thoát dịch khi áp lực của khớp tăng lên khi vận động. Những đặc tính
trên của HA rất quan trọng đối với dinh dưỡng của sụn khớp cũng như để loại bỏ các chất
chuyển hóa và chất độc hại ra khỏi khoang khớp [22].
Ở bệnh nhân bị THK, HA có thể bị phân huỷ dưới sự xúc tác của các enzym sinh
ra trong các phản ứng viêm hoặc bị oxy hoá bởi các gốc oxy phản ứng. Khi đó, nồng độ
và khối lượng phân tử của HA đều giảm so với điều kiện sinh lý, dẫn tới sự suy giảm tính
nhớt đàn hồi của dịch khớp, thể hiện qua sự giảm độ nhớt tại trạng thái nghỉ cũng như sự
suy giảm của các giá trị mô-đun nhớt G’’ và mô-đun đàn hồi G’ (bảng 1.4). Sự suy giảm
đặc tính nhớt đàn hồi của dịch khớp có thể làm giảm khả năng đáp ứng của khớp đối với
các tác động và lực sinh ra trong sinh hoạt thường ngày, làm tăng va chạm giữa sụn, tăng
mài mòn khớp, tăng tiến triển của bệnh THK. Khi tiêm nội khớp HA, một lượng lớn HA
ngoại sinh được đưa vào dịch khớp sẽ giúp khôi phục đặc tính nhớt đàn hồi của dịch
khớp, hạn chế tổn thương khớp đồng thời kích thích sản xuất HA nội sinh, chống viêm,
tăng cường sản sinh proteoglycan và bảo vệ các phần xương dưới sụn.
Bảng 1.1 Đặc tính lưu biến của dịch khớp của người khoẻ mạnh và độ nhớt của bệnh
nhân thoái hoá khớp
Đặc tính nhớt đàn hồi
Mô đun
Mô đun đàn
nhớt G’’
hồi G’ (Pa)
(Pa)

Khối
Nồng
lượng phân độ HA
tử (Mda) (mg/ml)

Dịch khớp ở
người khoẻ mạnh
Dịch khớp của
người bị THK

Độ nhớt ở
trạng thái
nghỉ (Pa.s)

6,3–7,6

2,5 –
4,0

7,0

23,0

6,0–175,0

1,6–3,48

1,0–2,0

5,0

7,0

0,01–1,0


5


Các chế phẩm trên thị trường có sự khác biệt đáng kể về nồng độ và khối lượng
phân tử HA cũng như cách sử dụng và tính hiệu quả, an toàn. Thông tin về một số chế
phẩm thông dụng được trình bày trong bảng 1.3 và bảng 1.4.
Có thể thấy, các chế phẩm chứa HA có khối lượng phân tử lớn (2-3 triệu Dalton)
và/hoặc liên kết chéo cũng như các chế phẩm chứa HA không liên kết chéo và có khối
lượng phân tử trung bình đều có hiệu quả giảm đau lên tới 6 tháng sau mỗi đợt điều trị.
Tuy vậy, các các chế phẩm chứa HA có khối lượng phân tử lớn và/hoặc liên kết chéo yêu
cầu số lần tiêm/đợt điều trị ít hơn so với HA có khối lượng phân tử trung bình và không
liên kết chéo. Một số nghiên cứu cũng cho thấy, các chế phẩm có khối lượng phân tử lớn
thường an toàn và ít tác dụng phụ hơn. Tuy nhiên, HA có liên kết chéo hóa học lại có
nguy cơ về tồn dư hóa chất dùng để tạo ra các liên kết chéo.
Bảng 1.2 Một số chế phẩm HA tiêm nội khớp trên thị trường [11]
Tên thương
mại

Thành phần
Na-HA (1%)
Không liên kết chéo
Na-HA
Không liên kết chéo (1%)

Hyalgan®
Supartz®
Orthovisc®
Synvisc®

Khối lượng

phân tử HA
(kDa)

Liều được
cấp phép
(hàng tuần)

Thể tích
mỗi lần
tiêm

500 – 730

1 lần

2,0 ml

1000

3-5 lần

2,5 ml

3-6 lần

2,0 ml

3 lần

2,0 ml


Na-HA
500 – 730
Không liên kết chéo (1,4 %)
Hylan G-F 20 (HA liên kết
1000 - 2000
chéo)

Bảng 1.3. Đặc tính lưu biến của một số chế phẩm acid hyaluronic tiêm nội khớp khác
nhau trên thị trường [11].
Tên biệt dược
Khối lượng phân tử
Mô đun nhớt G”
Đặc tính
nhớt đàn hồi

Hyalgan ®
500 – 730
3,0

Orthovisc ®
500 - 730
46,0

Synvisc ®
1000 - 2000
25,0 ± 2,0

0,6


60,0

111,0 ± 13,0

3,0 – 5,0

3,0

3,0

Mô đun đàn hồi G’

Số lần tiêm thuốc

6


Sự khác biệt giữa các chế phẩm tiêm nội khớp có thể do nhiều nguyên nhân khác
nhau. Bên cạnh độ tinh khiết và sự phụ thuộc của các tác dụng dược lý vào khối lượng
phân tử của HA, một trong những giả thiết thường được đề cập tới là do sự khác biệt về
đặc tính lưu biến của các chế phẩm này. Các chế phẩm chứa HA khối lượng phân tử lớn
hoặc liên kết chéo có độ nhớt tại trạng thái nghỉ hay mô-đun đàn hồi lớn hơn so với các
chế phẩm chứa HA có khối lượng phân tử trung bình và không liên kết chéo. Các đặc
tính này có thể giúp hạn chế được các vi tổn thương ở trong giai đoạn đầu sau khi tiêm và
hạn chế các tác dụng không mong muốn [24].
1.1.2.2. Tổng quan về liposome và tiềm năng của hydrogel HA chứa liposome trong điều
trị THK
 Khái niệm:
Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân thân nước ở
giữa được bao bọc bởi một vỏ PL gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, kích thước thay đổi

từ hàng chục nm đến hàng chục µm. Liposome có tính tương thích sinh học cao, có khả
năng nạp và kéo dài giải phóng của cả dược chất thân dầu lẫn thân nước [3].

Hình 1.3 Cấu trúc của liposome
 Một số yếu tố ảnh hưởng tới các đặc tính của liposome và ứng dụng của liposome
trong tiêm nội khớp.
-

Kích thước tiểu phân
Các nghiên cứu về những hệ vận chuyển thuốc tiên tiến như liposome hay tiểu

phân nano polyme tiêm nội khớp cho thấy, kích thước tiểu phân ảnh hưởng đến tốc độ
7


thải trừ của các hệ tiểu phân khỏi khớp. Tuy vậy, không có một vùng kích thước tối ưu
chung cho tất cả các hệ và tốc độ thải trừ phụ thuộc vào bản chất của từng hệ.
Bảng 1.4 Một số nghiên cứu ứng dụng liposome trong điều trị các bệnh về khớp [13]
Dược chất

Loại PL
được sử
dụng

KTTP

PA
Cortisol
palmitat


PA và DPPC

Không đề
cập

Hỗn hợp PL

Dexamethason
palmitat

Natri
diclofenac
Methotrexat
Triamcinolon
acetonid 21palmitat

-

EPC/ PA

160 – 750
nm

Hỗn hợp PL
khác nhau

100 nm –
30 µm

PL khác

nhau
Các PL khác
nhau
Các PL khác
nhau

200 250nm
1,0 – 1,2
µm

DPPC/ Chol

Không đề
cập

Các mô hình đánh giá
in vivo

TLTK

Viêm gây ra bằng
poly-α-lysin và HA
[12],[7],[14]
tiêm nội khớp
Mô hình viêm khớp do
kháng nguyên gây ra
[9]
(AIA) ở thỏ
Bệnh nhân viêm khớp
[17]

dạng thấp
Tiêm nội khớp
liposome ở thỏ khỏe
[25]
mạnh và thỏ có AIA
Tiêm nội khớp
liposome ở thỏ khỏe
[5]
mạnh
Mô hình AIA ở thỏ

[26]

Mô hình AIA ở thỏ

[29],[28]

Mô hình AIA ở chuột

[30]

Mô hình AIA ở thỏ

[16]

Thế zeta và điện tích bề mặt tiểu phân
Nhiều nghiên cứu cho thấy điện tích bề mặt tiểu phân có thể ảnh hưởng tới cả thời

gian lưu của hệ trong dịch khớp, tương tác giữa liposome và các đại thực bào dẫn tới sự
thay đổi về tác dụng chống viêm. Chẳng hạn, nghiên cứu của Schwendener và cộng sự

năm 1984 cho thấy liposome chứa stearylamin có điện tích dương và tương tác tốt hơn

8


với các đại thực bào [23]. Nghiên cứu của Philips và cộng sự năm 1979 cho thấy
liposome chứa corticoid giảm hoạt tính chống viêm nếu không có acid phosphatidic [21].
-

Ảnh hưởng của các gốc acid béo trong phân tử phospholipid
Các nghiên cứu đã chứng minh PL là một thành phần quan trọng ảnh hưởng tới

khả năng giải phóng thuốc cũng như thời gian thải trừ của liposome khi tiêm nội khớp.
Dipalmitoyl phosphatidyl cholin (DPPC) là một trong những PL phù hợp nhất để bào chế
liposome do nhiệt độ chuyển pha là 41℃, do vậy lớp màng kép bền hơn và ổn định hơn ở
nhiệt độ cơ thể người. Bên cạnh đó, DPPC rất phù hợp với sử dụng tiêm nội khớp, vì nó
là một thành phần nội sinh của khớp, chiếm khoảng 45% tổng thành phần dịch khớp.
DPPC còn là thành phần của lớp lipid hoạt động bề mặt ở sụn, có vai trò làm giảm ma sát
và bảo vệ sụn khớp. Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy, ngoài DPPC, các liposome
từ PL bão hoà khác như 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) hay HSPC
cũng có khả năng làm giảm ma sát rất tốt trong các thí nghiệm mô phỏng chuyển động để
đánh giá mức độ mài mòn của khớp [15]. Trong khi đó, nhiều nghiên cứu khác cũng sử
dụng các PL chưa bão hòa, chẳng hạn như PL chiết xuất từ trứng. Liposome bào chế từ
các PL này có lớp màng kép tương đối lỏng lẻo và dễ giải phóng dược chất hơn so với
các PL bão hoà. Khi đó, cholesterol thường được đưa vào thành phần của liposome để cải
thiện sự ổn định trong cơ thể, ngăn chặn sự rò rỉ của các phân tử thuốc thông qua màng
liposome [6].
-

Ảnh hưởng của sự có mặt PEG.

Bề mặt của liposome có thể được PEG hoá để tạo ra một lớp áo thân nước bảo vệ

giúp làm ổn định liposome theo cơ chế không gian, tránh gây kết tập tiểu phân đồng thời
giúp cho liposome tránh khỏi sự nhận diện của các đại thực bào. Mặt khác, một số nghiên
cứu bào chế và đánh giá liposome cho thấy liposome nói chung và đặc biệt là liposome
PEG hoá có khả năng làm thay đổi các đặc tính lưu biến của khớp [2] [20].
Hơn nữa, để tiếp tục kéo dài sự giải phóng của hoạt chất cùng với sự lưu giữ lại ở
khớp tốt hơn, liposome cũng có thể được đưa vào gel với các tá dược tạo gel: acid
hyaluronic, carbopol hoặc natri carboxymethyl cellulose. Chẳng hạn, Dong và cộng sự đã
9


tiến hành bào chế liposome từ SPC chứa celecoxib trong gel HA. Kết quả cho thấy, hệ
gel phối hợp giúp kéo dài giải phóng celecoxib và có hiệu quả điều trị thoái hoá khớp trên
thỏ tốt hơn so với khi dùng celecoxib đơn độc [13].
1.2. Một số đặc tính lưu biến thường được đánh giá của các chế phẩm bù nhớt
Định nghĩa lưu biến:
Lưu biến học là khoa học nghiên cứu sự biến dạng và chảy của vật liệu.
Trên thực tế, lưu biến học là ngành khoa học nghiên cứu về mối liên quan giữa sự
biến dạng và sự chảy của các vật liệu mềm, có tính chất trung gian giữa các chất rắn đàn
hồi và chất lỏng Newton (tính chất trung gian đó được hiểu là có tính nhớt đàn hồi
(viscoelastic) [10].
Các chế phẩm bù nhớt tiêm nội khớp chứa HA đều là các chất lỏng phi Newton,
có độ nhớt phụ thuộc vào tốc độ trượt và có tính nhớt đàn hồi. Tuy vậy, các tính chất lưu
biến của các chế phẩm này có sự khác biệt đáng kể. Một số thông số và đặc tính thường
được đánh giá khi so sánh giữa các chế phẩm bù nhớt và các giả thuyết về ý nghĩa của
các đặc tính này về khả năng bảo vệ sụn khớp được trình bày dưới đây.
1.2.1. Độ nhớt tĩnh hay độ nhớt tại trạng thái nghỉ η0 (zero shear – viscosity)
Độ nhớt tĩnh là độ nhớt khi mẫu ở trạng thái tĩnh (nghỉ) hoặc bị biến dạng ở tốc độ
trượt nhỏ xấp xỉ bằng 0 [10]. Độ nhớt ở trạng thái tĩnh lớn sẽ giúp bảo vệ, giảm va chạm

của sụn khớp ở trạng thái nghỉ ngơi hoặc cử động nhẹ [19].
1.2.2. Độ nhớt tại tốc độ trượt 250 s-1, tính trượt mỏng (shear – thinning) và tỷ suất
trượt mỏng (shear – thinning ratio)
Tốc độ trượt là mức độ biến dạng của vật liệu trong một đơn vị thời gian. Tốc đột
trượt 250 s-1 mô phỏng các chuyển động mạnh. Khi đó, dịch khớp và hệ bù nhớt sau khi
tiêm sẽ chuyển đột ngột từ trạng thái nghỉ (tại tốc độ trượt xấp xỉ bằng 0) sang trạng thái
biến dạng ở tốc độ trượt cao (250 s-1).
Dịch khớp cũng như phần lớn các chế phẩm bù nhớt đều có tính trượt mỏng (độ
nhớt giảm dần khi tăng dần tốc độ trượt). Tính chất này giúp làm giảm tiêu hao năng
lượng khi vận động giúp cử động dễ dàng. Để so sánh khả năng trượt mỏng giữa các chế
10


phẩm, một số nghiên cứu sử dụng tỷ suất trượt mỏng là tỷ số giữa độ nhớt tại trạng thái
nghỉ với độ nhớt tại tốc độ trượt 250 s-1 [19].
1.2.3. Tính xúc biến (thixotropic)
Một hệ xúc biến là hệ có độ nhớt giảm dần theo thời gian tác động của một ứng
suất trượt có độ lớn nhất định. Với các hệ này, thời gian mẫu chịu sự tác động của ứng
suất càng lớn, độ nhớt của hệ càng giảm do tốc độ phục hồi cấu trúc của hệ nhỏ hơn tốc
độ phá huỷ cấu trúc. Sau khi cấu trúc bị phá huỷ, các hệ có tính xúc biến có khả năng hồi
phục hoàn toàn như trước khi bị biến dạng nhưng mất nhiều thời gian hơn để hồi phục lại
trạng thái ban đầu so với hệ không có tính xúc biến [10].
Đối với các thuốc tiêm nội khớp để bù nhớt, tính xúc biến là một đặc tính không
có lợi vì khi thuốc được tiêm qua kim có đường kính nhỏ hoặc khi khớp vận động mạnh
ở cường độ cao, mẫu sẽ bị biến dạng ở tốc độ trượt lớn, độ nhớt giảm do cấu trúc của hệ
bị phá huỷ. Các hệ có tính xúc biến thì thời gian để tái cấu trúc để hệ trở lại trạng thái ban
đầu sau khi phá huỷ sẽ dài hơn các hệ không có tính xúc biến (non-thixotropic). Do vậy,
khả năng bảo vệ sụn khớp khi mới tiêm hoặc ngay sau khi vận động lâu có thể sẽ kém
hơn so với các hệ không có tính xúc biến.
1.2.4. Mô-đun đàn hồi (G’), mô-đun nhớt (G”) và tần số giao cắt (cross – over

frequency)
Dịch khớp và các chế phẩm bù nhớt cùng có đặc điểm chung là có tính chất trung
gian giữa chất lỏng và chất rắn đàn hồi. Tính “lỏng” của hệ được đặc trưng bởi mô-đun
nhớt (G’’) và tính đàn hồi được đặc trưng bởi giá trị mô-đun đàn hồi (G’). Các giá trị này
có thể được xác định bằng các thiết bị đo lưu biến ở chế độ đo dao động. Tại một tần số
và biên độ cụ thể, tỷ số giữa G’’/G’ sẽ cho biết là hệ biểu hiện giống chất lỏng hơn hay
giống chất rắn đàn hồi hơn. Cụ thể, G’’/G’ > 1 thì hệ biểu hiện giống chất lỏng hơn, còn
G’’/G’ < 1 thì hệ biểu hiện giống một chất rắn đàn hồi hơn [10].
Khi xác định tỷ số G’’/G’ của các chế phẩm bù nhớt, các nghiên cứu thường tiến
hành bằng chế độ đo dao động với giá trị biên độ nằm trong vùng nhớt đàn hồi tuyến tính
(linear viscoelastic region); còn tần số được khảo sát trong khoảng từ 0,1 đến 10 Hz,
11


trong đó, hai khoảng giá trị 0,4 – 0,5 Hz và 2,5 - 5,0 Hz thường được coi là các tần số
tương ứng khi khớp gối chuyển động ở trạng thái đi bộ và chạy [19]. Các chế phẩm chứa
acid hyaluronic không liên kết chéo là các gel vật lý và thường có tỷ số G’’/G’ > 1 ở tần
số thấp và giảm dần tới các giá trị < 1 ở các tần số cao hơn. Giá trị của tần số mà tại đố
G’’/G’ = 1 được gọi là tần số giao cắt (cross-over frequency). Trong khi đó, các chế
phẩm chứa HA liên kết chéo thường là các gel hoá học và có giá trị G’’/G’ luôn nhỏ hơn
0,5 và không phụ thuộc vào tần số.
Một trong những giả thuyết được đặt ra để giải thích cho các ưu điểm của các chế
phẩm HA liên kết chéo là các hệ biểu hiện như một gel đàn hồi, giúp bảo vệ khớp ở mọi
tần số chuyển động. Trong khi đó, một số chế phẩm không liên kết chéo, chẳng hạn như
Hyalgan® có tần số giao cắt > 10 Hz nên có tác dụng đệm kém hơn khi khớp ở trạng thái
chuyển động như đi bộ hay chạy, cần nhiều lần tiêm hơn so với chế phẩm chứa HA liên
kết chéo [19].
1.3. Tổng kết
Các kết quả nghiên cứu nêu trên gợi ý rằng việc phát triển hệ hydrogel của HA
chứa liposome có nhiều ưu điểm có thể giúp khắc phục các hạn chế còn tồn tại và tăng

hiệu quả sử dụng của biện pháp sử dụng thuốc qua đường tiêm nội khớp phổ biến hiện
nay là HA trong điều trị THK. Có tóm tắt một số ý chính như sau:
Các liposome, đặc biệt là liposome PEG hoá có khả làm thay đổi đặc tính lưu biến
của HA (tăng độ nhớt tại trạng thái nghỉ hay mô-đun đàn hồi G’, giảm tần số giao cắt).
Những sự thay đổi về tính chất lưu biến của HA do liposome có thể có lợi trong điều trị
THK. Khi đó các liposome đóng vai trò như các tác nhân tạo liên kết chéo theo các cơ
chế vật lý, do vậy không làm thay đổi cấu trúc hoá học hay khối lượng phân tử của HA,
giúp bảo toàn các tác dụng dược lý của HA và tránh được việc sử dụng các tác nhân liên
kết chéo bằng phản ứng hoá học có thể gây độc tính khi tồn dư của các chất này được
tiêm vào cơ thể [20].
Tuy vậy, tương tác giữa hệ gel HA và liposome còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố
đòi hỏi người bào chế cần nắm được các yếu tố ảnh hưởng và sự tác động của nó để có
12


thể tạo ra được hệ gel HA – liposome có các thông số tối ưu để tiêm nội khớp. Trong khi
đó, hiện tại chưa có nhiều nghiên cứu sử dụng liposome PEG hoá hoặc hệ hydrogel
liposome PEG khi tiêm nội khớp trong điều trị THK. Bên cạnh đó, ảnh hưởng của đặc
tính lưu biến được đề cập trong các nghiên cứu trước đây mới chỉ mang tính giả thuyết và
cần được kiểm chứng thêm bằng các thí nghiệm in vivo.
Với những lý do trên, đề tài bước đầu nghiên cứu bào chế hydrogel HA chứa
liposome với một số nội dung chính sau đây:
-

Bào chế được các hệ liposome không PEG hoá và liposome PEG hoá (không chứa
dược chất) với kích thước và tỷ lệ các thành phần khác nhau.

-

Bào chế được hydrogel HA chứa các hệ liposome nói trên.


-

Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ, kích thước, tỷ lệ phospholipid gắn
PEG, môi trường hydrat hoá của liposome cũng như nồng độ HA tới các đặc tính
lưu biến của hệ gel HA chứa liposome.

13


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực hiện khóa luận.
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13


Nguyên liệu
Cholesterol
Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã
hydrogen hóa (HSPC)
Natri hyaluronat
(KLPT trung bình: 106 Dalton)
DSPE-PEG 2000
Cloroform
Methanol
Glucose
Mannitol
Acid-4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic (HEPES)
Natri hydroxid
Natri hydrophosphat
Kali dihydrophosphat
Acid clohydric

Nguồn gốc
Sigma Aldrich
Lipoid

Tiêu chuẩn
TCCS
TCCS

Trung quốc

EP 7.0

Lipoid

Trung quốc
Trung quốc
Trung quốc
Pháp
Mỹ

TCCS
TCCS
TCCS
TCCS
TCCS
USP

Trung quốc
Trung quốc
Trung quốc
Trung Quốc

TKHH
TKHH
TKHH
TKHH

2.1.2. Thiết bị sử dụng
Các thiết bị được sử dụng để hoàn thành đề tài:
-

Máy siêu âm đầu dò Ultrasonic Homogenizer (QSONICA – Mỹ).

-


Bể siêu âm ULTRASONIC LC 60H (Đức).

-

Hệ thống đùn nén mini-extruder ER1 (Eastern Scientific LLC-USP).

-

Màng lọc polycarbonat kích thước 200nm, 100nm.

-

Máy đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex – c5 (Avestin – Canada).

-

Máy vortex IKA Vortex GENIUS 3.

-

Tủ sấy chân không LVO 2040 Daihan Labtech (Hàn Quốc).
14


-

Máy khuấy từ IKA®RH Basic 1 (Đức).

-


Máy đo pH Mettler toledo (Mỹ).

-

Thiết bị phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90 (Malvern- Anh).

-

Thiết bị phân tích kích thước tiểu phân Mastersizer 3000E (Malvern- Anh).

-

Máy đo lưu biến Discovery Hybrid Rheometer HR-1 (Mỹ).

-

Cân phân tích, cân kỹ thuật BP 121 Sartorius (Đức).

-

Bình khí Nitơ nén (Việt Nam).

-

Bể điều nhiệt WiseBath (Đức).

-

Tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, đèn cồn và các thiết bị, dụng cụ bào chế, kiểm

nghiệm khác.

2.2. Đối tượng nghiên cứu
-

Liposome trắng.

-

Liposome PEG hóa.

-

Gel HA.

-

Gel HA chứa liposome.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế liposome
Thành phần liposome:
Thành phần
HSPC

Tỷ lệ mol
65%

64%


Cholesterol
DSPE – PEG 2000

60%

35%
0%

1%

5%

Trong đó, tỷ lệ mol cholesterol được giữ nguyên là 35% - tỷ lệ thường gặp tỏng
các bào chế liposome; nghiên cứu tiến hành khảo sát các tỷ lệ khác nhau của DSPE –
PEG 2000 là 0%, 1% và 5%.
Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hoá màng phim với các giai
đoạn được trình bày dưới đây.
15


Tạo màng phim lipid: cân các thành phần HSPC: Chol: DSPE-PEG 2000 theo
công thức vào lọ thủy tinh 15ml, bề dày thành 1,2 mm, hòa tan hoàn toàn trong
cloroform; bốc hơi và tạo màng phim sơ bộ bằng khí Nitơ (vừa thổi khí vừa xoay lọ để
dàn đều mẫu mỏng nhất có thể trên đáy và thành lọ, nhưng phải đảm bảo toàn bộ màng
phim ngập trong lượng môi trường dùng để hydrat hóa), sau đó sấy khô hoàn toàn màng
phim bằng tủ sấy chân không, ở điều kiện 40℃, thời gian sấy 4 giờ.
Hydrat hóa: sử dụng các loại đệm cần khảo sát khác nhau (dung dịch HEPES
10mM/Mannitol 5%, dung dịch HEPES 10mM/Glucose 5% và dung dịch đệm PBS; tất
cả đều điều chỉnh đến pH 7,4); nhiệt độ 65-70℃ (sử dụng bể điều nhiệt hoặc tủ sấy), kết
hợp vortex để tăng tốc độ hydrat hóa; sau 4 giờ hydrat hóa thu được hỗn dịch liposome

thô màu trắng đục.
Phương pháp làm giảm KTTP liposome: đề tài tiến hành khảo sát các phương
pháp đồng nhất hoá áp suất cao, đùn qua màng polycarbonat (200nm và 100nm), siêu âm
đầu dò và siêu âm bể, từ đó lựa chọn phương pháp làm giảm KTTP phù hợp nhất đã chọn
để bào chế các hệ liposome chứa các tỷ lệ khác nhau DSPE-PEG 2000 khác nhau (0, 1, 5
%) ở hai vùng kích thước nm và µm với các nồng độ lipid khác nhau (10, 30, 50 và
100mM).
2.3.2. Phương pháp đánh giá KTTP liposome
Liposome kích thước nm: mẫu liposome có thể pha loãng hoặc không, tùy vào
nồng độ liposome (để đạt count rate từ 200 đến 400 khi đo), đo phân bố kích thước tiểu
phân bằng kỹ thuật tán xạ ánh sánh động (DLS) trên thiết bị phân tích kích thước tiểu
phân Nanosizer ZS90. Đánh giá đặc tính phân bố kích thước tiểu phân qua các chỉ số đa
phân tán PDI, KTTP và đồ thị phân bố kích thước tiểu phân.
Liposome kích thước µm: đo phân bố kích thước tiểu phân bằng kỹ thuật nhiễu xạ
lazer trên thiết bị phân tích kích thước tiểu phân Mastersizer 3000, mẫu liposome được
cho vào cốc nước RO đã chạy nền trên máy để đạt độ đục (obscuration khoảng 5%).
Đánh giá đặc tính phân bố kích thước tiểu phân qua các chỉ số D4.3 (kích thước tiểu phân
trung bình theo thể tích/khối lượng), giá trị Span (hệ số để đánh giá phân bố KTTP, giá
16


trị Span càng nhỏ thì khoảng phân bố KTTP càng hẹp) và đồ thị phân bố kích thước tiểu
phân.
2.3.3. Phương pháp khảo sát lưu biến gel HA và gel HA chứa liposome
Bào chế gel HA và gel HA chứa liposome:
Hỗn dịch liposome có kích thước phù hợp được đưa vào gel. Gel HA và gel HA
chứa liposome được chuẩn bị bằng cách cho natri hyaluronat (cân bằng cân phân tích)
vào dung dịch đệm và hỗn dịch liposome đã làm nhỏ KTTP để đạt nồng độ HA cuối cùng
là 10 và 20mg HA trong 100ml hỗn dịch liposome tương ứng với khoảng 1 và 2% (kl/tt),
để trương nở trong 12 giờ ở điều kiện 2-8℃; khuấy đều; sau đó bảo quản ở điều kiện 28℃ trong ít nhất 12 giờ để loại bỏ bọt khí và các ngoại lực đã tác dụng lên gel khi khuấy

trộn trước khi tiến hành đo lưu biến.
Tiến hành các phép đo bằng máy đo lưu biến DISCOVERY HR-1, cấu hình sử
dụng là côn-đĩa (côn nghiêng 4°1’08”, đường kính 40 mm, đĩa có khả năng điều nhiệt).
Mẫu gel được lấy ra bằng miếng mica mỏng và đổ nhẹ lên mặt đĩa điều nhiệt của máy đo
lưu biến.
Phương pháp đánh giá lưu biến:
Tất cả các phép đo dao động được tiến hành ở vùng nhớt đàn hồi tuyến tính của hệ. Các
thông số cụ thể của từng phép đánh giá được trình bày dưới đây.
-

Đo độ nhớt tĩnh η0 (zero shear viscosity): sử dụng chế độ trượt liên tục (flow
sweep): nhiệt độ 37℃, sau khi để gel ổn định ở 37℃ trong 120s thì tăng dần ứng
suất trượt từ 0,05 đến 200 Pa, sẽ thu được đồ thị độ nhớt theo ứng suất trượt (hoặc
tốc độ trượt); áp dụng mô hình Cross để ngoại suy độ nhớt tĩnh.

-

Đánh giá độ nhớt ở tốc độ trượt 250 s-1: Đo ở chế độ trượt liên tục, cố định giá trị
tốc độ trượt là 250 s-1, thời gian đo là 60 giây. Ghi lại giá trị độ nhớt trượt khi hệ
ổn định.

-

Tần số giao cắt: Các khảo sát đều cho thấy ứng suất trượt 10 Pa nằm trong vùng
nhớt đàn hồi tuyến tính của tất cả các mẫu đo. Tần số được xác định bằng chế độ

17