TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NUÔI CẤY DÒNG TẾ BÀO SF9 CỦA
SÂU KHOANG (Spodoptera
frugiperda)
GVHD

TS. Nguyễn Hữu Đức

Học viên

Nguyễn Hữu Giới
Nguyễn Thị Minh Hiền
Nguyễn Thị Nhã
Phạm Thị Hải
Đỗ Thị Thủy
Đinh Thị Thanh Tâm
Lê Duy Trung

HÀ NỘI – Tháng 3/2014
1


NỘI DUNG
1. SF9 là gì?
2. Mục đích nuôi cấy
3. Các phương pháp nuôi cấy tế bào
SF9
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi
cấy tế bào

5. Kết luận
6. Tài liệu tham khảo
2


SF9
 Được tạo ra từ các dòng tế bào
IPLB-Sf-21-AE bởi Cherry và Smith
tại trường ĐH Texas A &M. Dòng tế
bào IPLB-Sf-21-AE được phân lập
từ năm 1970 từ mô buồng trứng
nhộng của loài Spodotera frugipera.
 Đặc điểm:
+ Kích thước tế bào nhỏ, đồng đều
giúp việc hình thành các lớp đơn và
các mảng.
+ Phát triển tốt trong lớp đơn
+Thích ứng với môi trường huyết
thanh.
3


Mục đích
• Dòng tế bào Sf9 rất dễ bị nhiễm virus, có mặt nhiều
ở nhân Autographa california (AcNPV baculovirus),
và có thể được sử dụng là vecto biểu hiện với tất
cả các baculovirus.
• Tế bào Sf9 thường được sử dụng để tách và lan
truyền baculoviral tái tổ hợp và để sản xuất
protein tái tổ hợp.


4


Nuôi cấy tế bào Sf9
Giải
đông tế
bào
Môi
trường

Cấy truyền
tế bào lớp
đơn

Các yếu
tố ảnh
hưởng

Nuôi cấy
huyền phù
tế bào

Đông
lạnh tế
bào
5


Môi trường


6


Rã đông tế bào
• Lấy tế bào ra khỏi lớp Nito lỏng hoặc băng khô và rã đông
bằng nước ấm 37oC không quá 1 phút.
• Tế bào sau khi rã đông được đưa vào ống ly tâm và ly tâm
2000v/phút trong 5 – 10 phút. Sau khi ly tâm gạn lấy dịch nổi
đưa vào trong môi trường nuôi cấy trong tủ ấm ở 27 oC để tế
bào bám dính trong 30 - 45 phút.
• Sau khi tế bào bám dính loại bỏ môi trường (sử dụng DMSO).
• Nuôi tế bào trong môi trường mới.

• Sau 24h thay môi trường làm cho khả năng sống lại của tế bào
đạt 70 %. Tiếp tục nuôi cây trong tủ ấm cho đến khí tế bào hình
thành lớp đơn sau đó tiến hành cấy truyền.
7


Cấy chuyền tế bào lớp đơn

Các
bước tiến
hành
Vật liệu
và thiết bị

Một số
lưu ý


Cấy
truyền tế
bào lớp
đơn
8


Vật liệu
 Các bình tế bào sơ cấp
 Môi trường nuôi cấy Grace
hoặc TNM-FH
 Dụng cụ thí nghiệm: ống vô
trùng 15ml, pipet, đầu côn,
tủ ấm 37oC, bình nuôi .
 Dung dịch đệm DPBS
(Phosphate Buffered Saline
Dulbecco) không chứa Ca,
Mg hoặc phenol đỏ.
 Trypsin.
9


Các bước thực hiện
 Loại bỏ môi trường cũ từ bình tế bào sơ cấp.
 Rửa TB bằng dung dịch DPBS (khoảng 2ml cho
10cm2 diện tích bề mặt).
 Rửa để loại bỏ dung dịch DPBS.
 Bổ sung Trypsin khoảng 0,5ml cho 10cm2 bề mặt
 Ủ bình môi trường ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.

 Quan sát bằng kính hiển vi khi thấy TB tách ra < 90%
TB thì tăng thời gian ủ, Kiểm tra sau 30s. Khi >90%
TB đã tách ra thí nghiêng bình để các TB ráo nước.
Bổ sung tương đương thể tích môi trường tăng sinh
trước khi ủ ấm. Loại bỏ môi trường trên bề mặt lớp tế
bào bằng pipet nhiều lần.
10


Các bước thực hiện
 Chuyển TB vào bình tam giác 15ml và ly tâm 2000xg
trong 5 – 10 phút.
 Cho một lượng nhỏ dịch huyền phù TB vào trong môi
trường nuôi cấy và loại bỏ một mẫu để đếm.
 Xác định tổng số TB.
 Pha loãng dịch huyền phù với mật độ phù hợp cho dòng
TB. Dùng pipet lấy một lượng thích hợp cho vào bình
nuôi mới và cho vào trong tủ ấm.

11


Một số lưu ý

12


Nuôi cấy huyền phù tế bào

13



Vật liệu và thiết bị

 Tế bào Sf9 lớp đơn
 Môi trường nuôi cấy
Grace hoặc TNM-FH
 Bình spinner
 Tủ ấm 27oC
 Máy khuấy từ
Than
h
khuấ
y
14

Cánh
quạt
thẳng
đứng


Các bước tiến hành
 Các TB lớp đơn ở pha log đạt mật độ 1 x106 TB /ml
 Loại bỏ các TB từ bình, đếm TB để đảm bảo khả năng
tồn tại của TB ít nhất là 95%.
 Giống tiếp phải sạch, không nhiễm đạt mật độ 1 x 106
TB/ml.
 Ủ bình spinner ở nhiệt độ 27oC và khuấy liên tục 80 – 90
rpm.

 Khi các TB đạt mật độ 2-2,5 x106 TB /ml bổ sung thêm
môi trường để pha loãng để mật độ TB đạt 1x106 TB /ml
trong khoảng 24 – 72 h. Cần kiểm tra mật độ và khả năng
sống cử TB hàng ngày. Khi TB đạt mật độ cho phép thì
có thể chuyển sang bình spinner có thể tích lớn hơn.
15


Các lưu ý
 Lưu giữ TB khi mật độ TB đạt 2-2,5 x106 TB /ml và phải
đảm bảo mật độ Tb không lớn hơn 4x106 TB /ml và phải
giữ mật độ TB ở pha log trên 1 x106 TB /ml.
 Không cần thay đổi môi trường khi nuôi TB. Cần loại bỏ
TB và bổ sung thêm môi trường để pha loãng đến mật
độ TB thích hợp và cung cấp thêm dinh dưỡng.
 Duy trì TB ở 27oC và tránh chỗ ẩm.
 Sử dụng các chất có hoạt tính bề mặt để giảm sự phá
vỡ TB do lực quay của cánh quạt như Pluronic® F-68
(BASF) với nồng độ 0,1 %.
16


Đông lạnh TB
 Đông lạnh TB ở nồng độ cao. Mật độ TB đông lạnh 1x107
TB/ml và khả năng sống 90%.
 Luôn luôn sử dụng các môi trường đông lạnh đã được
khuyến cáo. Môi trường đông lạnh có chứa chất bảo
quản lạnh DMSO hoặc glycerol.
 Sử dụng các ống trữ lạnh để lưu giữ các TB. Các ống
này có thể được giữ trong nitơ lỏng hoặc pha khí trong

nitơ lỏng.
 Các thiết bị phải được vô trùng.

17


Vật liệu
 Dịch nuôi cấy chứa các TB đang
sinh trưởng ở pha log.
 Môi trường đông lạnh chứa 60%
môi trường Grace 30% FBS
10% DMSO.
 Các chất dùng trong bảo quản
lạnh như DMSO hoặc glycerol
 Các ống vô trùng dùng một lần
15ml – 50 ml
 Các ống trữ lạnh vô trùng.
 Các thiết bị điều chỉnh lạnh hoặc
buồng isopropanol
 Thùng chứa ni tơ lỏng
18


Các bước tiến hành

Chuẩn bị môi trường đông lạnh giữ ở 2 – 8oC cho đến khi sử dụng.
Đối với TB lớp đơn, nhẹ nhành tách TB ra khỏi các bình nuôi cấy
Xác định TB tổng số, tùy theo mật độ TB mong muốn để tính toán lượng
môi trường đông lạnh.
Ly tâm dịch huyền phù TB 1000- 2000xg trong 5 – 10 phút.

Gạn lấy dịch nổi.
 Đưa các dịch nổi vào môi trường đông lạnh với mật độ thích hợp.
Phân chia dịch huyền phù TB vào trong các ống trữ lạnh.
Đông lạnh TB bằng thiết bị điều chỉnh nhiệt độ làm lạnh ,giảm nhiệt độ
khoảng 1oC trong 1 phút. Ngoài ra đạt các ống trữ lạnh chứa TB trong
buồng isopropanol và giữ ở -80oC qua đêm.
Chuyển các tế bào đông lạnh vào trong nitơ lỏng, và lưu trữ chúng trong
giai đoạn khí trong nitơ lỏng.
19


Các yếu tố ảnh hưởng đến
nuôi cấy TB sf9

20


Kết luận
 Tế bào Sf9 có kích thước đồng đều, dễ thao
tác, và hình thành tốt các lớp đơn và các mảng
TB
 Các dòng tế bào côn trùng Sf9 là dòng tế bào
dễ nuôi cấy, không cần CO2 thích hợp với môi
trường có bổ sung huyết thanh

21


Tài liệu tham khảo
 O'Reilly, D. R., Miller, L. K., and Luckow, V. A. (1992).

Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual
(New York, N. Y.: W. H. Freeman and Company)
 Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., and
McCawley, P. (1977). The Establishment of Two Cell
Lines from the Insect Spodoptera frugiperda
(Lepidoptera: Noctuidae). In Vitro 13, 213-217.
 Wickham, T. J., Davis, T., Granados, R. R., Shuler, M.
L., and Wood, H. A. (1992). Screening of Insect Cell
Lines for the Production of Recombinant Proteins and
Infectious Virus in the Baculovirus Expression System.
Biotechnol. Prog. 8, 391-396.
22


CÁM ƠN SỰ CHÚ Ý LẮNG NGHE
CỦA THẦY GIÁO VÀ CÁC BẠN

23