BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y
****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG
PHÂN TÍCH PROLINE VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN
AMPICILLIN VÀ TETRACYCLINE

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ MINH NHUNG
Lớp: DH05DY
Ngành: DƯỢC THÚ Y
Niên khóa: 2005 - 2010

Tháng 8/2010 

 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y
****************

NGUYỄN THỊ MINH NHUNG

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG
PHÂN TÍCH PROLINE VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN
AMPICILLIN VÀ TETRACYCLINE

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng
Bác sỹ thú y chuyên ngành Dược

Giáo viên hướng dẫn
ThS. PHÙNG VÕ CẨM HỒNG
BSTY. ĐẶNG THỊ XUÂN THIỆP

Tháng 8 năm 2010

i 
 


PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Minh Nhung
Tên luận văn: Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích proline và xây
dựng đường chuẩn ampicillin và tetracycline.
Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và ý kiến đóng góp
của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp khóa ngày … tháng … năm 2010.

TP. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2010
Giáo viên hướng dẫn

ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng

BSTY. Đặng Thị Xuân Thiệp

ii 
 



CẢM TẠ

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho em trong quãng thời gian theo học tại trường.
Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi thú y cùng các thầy cô trong và ngoài trường
đã luôn tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho chúng em.
ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng và BSTY. Đặng Thị Xuân Thiệp đã tận tình trực
tiếp hướng dẫn, theo sát và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện.
TS. Võ Thị Trà An đã hết lòng chỉ bảo, hướng dẫn để em có thể hoàn thành
tốt khóa luận tốt nghiệp.
Các thầy cô và các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm Hóa Lý thuộc Viện
Công nghệ Sinh học và Môi trường trường Đại học Nông Lâm đã hỗ trợ, giúp đỡ
em trong thời gian thực tập.
Toàn thể các bạn sinh viên lớp Dược Thú Y 31 đã gắn bó và động viên mình
trong những ngày tháng học tập cùng nhau.
Thương gửi về ba mẹ và gia đình - nguồn động viên, an ủi và nâng đỡ của
cuộc đời con, lòng thành kính yêu thương và tri ân mãi mãi.
Tháng 7 năm 2010

Nguyễn Thị Minh Nhung

iii 
 


TÓM TẮT


Đề tài “Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích proline và
xây dựng đường chuẩn ampicillin và tetracycline” được tiến hành từ tháng 3
năm 2010 đến tháng 7 năm 2010 tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường
trường Đại học Nông Lâm TP. HCM, với mục đích đánh giá hiệu quả của kỹ thuật
HPLC trong phân tích hàm lượng acid amin proline trong mẫu lá cây và xây dựng
phương trình đường chuẩn hai loại kháng sinh ampicillin và tetracycline.
Bằng phương pháp HPLC với các điều kiện hiện tại ở Viện, chúng tôi đã
phân tích hàm lượng proline trong mẫu lá cây. Đồng thời, chúng tôi cũng đã xây
dựng phương trình đường chuẩn của hai loại kháng sinh ampicillin và tetracycline.
Kết quả phân tích 10 mẫu lá cây, nhận thấy hàm lượng của proline trong lá
biến thiên từ 1,22 μg/g đến 2,62 μg/g với giới hạn phát hiện của phương pháp LOD
= 0,02 μg/g, cho thấy khả năng phát hiện rất cao. Hiệu suất thu hồi của quy trình
phân tích proline là 81,92% nằm trong khoảng cho phép theo quy định của Cục Bảo
vệ thực vật thuộc Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn.
Các phương trình đường chuẩn đã xây dựng được khá tốt, có thể áp dụng
trong thực tế phân tích:
Phương trình đường chuẩn proline: y = 63,70x + 15,24 với hệ số tương quan
tuyến tính khá tốt R2 = 0,964;
Phương trình đường chuẩn ampicillin: y = 1,996x + 0,119 với hệ số tương
quan tuyến tính rất tốt R2 = 1;
Phương trình đường chuẩn tetracycline: y = 68,32x – 103,1 với hệ số tương
quan tuyến tính tốt R2 = 0,999.

iv 
 


ABSTRACT

"Application of high performance liquid chromatography in proline

analysis and the building standard curve of ampicillin and tetracycline", a
scientific research study title, was carried out from March to July 2010 at Research
Institute for Biotechnology and Environment (RIBE), Nong Lam University, Ho
Chi Minh City. The aim of the study was to appriciate the effect of high
performance liquid chromatography (HPLC) in proline analysis in leaves and the
building of ampicillin and tetracycline standard curve.
By HPLC method under current conditions at RIBE, we have built the
standard way of proline, determined recovery efficiency and quantify proline
content in leaves. Simultaneously, we have also built ampicillin and tetracycline
standard curve.
The analyzed results have been recorded: proline content in leaves samples
varies from 1,22 μg/g to 2,62 μg/g with the limit of detection LOD = 0,02 μg/g.
Recovery efficiency of proline is 81,92 % , which can be permitted under the
provisions of the Plant Protection Department, Ministry of Agriculture and Rural
Development.
The equation has built a standard way:
Proline: y = 63,70 x + 15,24; Correlation Cofficient R2 = 0,964
Ampicillin: y = 1,996 x + 0,119; R2 = 1
Tetracycline: y = 68,32 x – 103,1; R2 = 0,999
The results showed that the quantitative ability of HPLC was very positive.
In fact, HPLC can be practically applied in the analysis of compounds.

v 
 


MỤC LỤC
TRANG
Trang tựa ...................................................................................................................... i
Phiếu xác nhận của giáo viên hướng dẫn ....................................................................ii

Cảm tạ ....................................................................................................................... iii
Tóm tắt ...................................................................................................................... iv
Abstract ....................................................................................................................... v
Mục lục....................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... ix
Danh sách các hình...................................................................................................... x
Danh sách các bảng ...................................................................................................xii
Danh sách các sơ đồ, công thức .............................................................................. xiii
Chương 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2 Mục đích................................................................................................................ 2
1.3 Yêu cầu.................................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN .......................................................................................... 3
2.1 Giới thiệu về phương pháp HPLC ........................................................................ 3
2.1.1 Lịch sử ................................................................................................................ 3
2.1.2 Phân loại HPLC.................................................................................................. 4
2.1.3 Nguyên tắc ......................................................................................................... 4

vi 
 


2.1.4 Cấu tạo của một hệ thống HPLC ....................................................................... 6
2.1.5 Ứng dụng của HPLC .......................................................................................... 9
2.2 Sử dụng HPLC trong phân tích một số hoạt chất ............................................... 11
2.2.1 Proline .............................................................................................................. 11
2.2.2 Ampicillin ........................................................................................................ 12
2.2.3 Tetracycline ...................................................................................................... 16
2.3 Một số nghiên cứu trước về việc phân tích HPLC tại Việt Nam ....................... 20
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 22

3.1 Thời gian và địa điểm.......................................................................................... 22
3.1.1 Địa điểm ........................................................................................................... 22
3.1.2 Thời gian .......................................................................................................... 22
3.2 Nội dung .............................................................................................................. 22
3.3 Phương pháp........................................................................................................ 22
3.3.1 Phân tích proline trong mẫu lá cây................................................................... 22
3.3.1.1 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 22
3.3.1.2 Hóa chất ........................................................................................................ 23
3.3.1.3 Quy trình thực hiện ....................................................................................... 23
3.3.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn ampicillin ............................................. 27
3.3.2.1 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 27
3.3.2.2 Hóa chất ........................................................................................................ 27
3.3.2.3 Quy trình thực hiện ....................................................................................... 27
3.3.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn tetracycline ......................................... 28
3.3.3.1 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 28

vii 
 


3.3.3.2 Hóa chất ........................................................................................................ 28
3.3.3.3 Quy trình thực hiện ....................................................................................... 28
3.4 Các chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 29
3.4.1 Phương trình đường chuẩn của proline ............................................................ 29
3.4.2 Hàm lượng proline trong mẫu lá cây ............................................................... 29
3.4.3 Hiệu suất thu hồi R của quy trình định lượng proline ..................................... 30
3.4.4 Giới hạn phát hiện của quy trình phân tích proline.......................................... 30
3.4.5 Phương trình đường chuẩn của ampicillin ....................................................... 30
3.4.6 Phương trình đường chuẩn của tetracycline..................................................... 30
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 31

4.1 Phương trình đường chuẩn của proline ............................................................... 31
4.2 Hàm lượng proline trong mẫu lá cây .................................................................. 33
4.3 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline trong mẫu lá cây ................... 36
4.4 Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) ...................................................... 37
4.5 Phương trình đường chuẩn của ampicillin .......................................................... 38
4.6 Phương trình đường chuẩn của tetracycline........................................................ 39
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 43
5.1 Kết luận ............................................................................................................... 43
5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 45
DANH SÁCH PHỤ LỤC ........................................................................................ 48

viii 
 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ tiếng Anh

ACN

Acetonitrile

GC

Gas Chromatography

Sắc ký khí


HPTLC

High Performance Thin Layer

Sắc ký bản mỏng hiệu

Chromatography

năng cao

Inductively Coupled Plasma Atomic

Phổ hấp thụ, phát xạ

Absorption Spectroscopy

nguyên tử

Liqid Chromatography/ Mass

Sắc ký lỏng ghép phổ khối

ICP - AAS

LC/MS

Tạm dịch

Spectrometry

MS

Mass Spectrometry

phổ khối

ppb

part per billion

phần tỷ

ppm

part per million

phần triệu

ppt

part per trillion

phần nghìn tỷ

ix 
 


DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Nguyên tắc sắc ký ........................................................................................ 5
Hình 2.2 Quá trình sắc ký ........................................................................................... 5
Hình 2.3 Tương tác xảy ra trong cột ........................................................................... 6
Hình 2.4 Quá trình tách các chất trong cột sắc ký ...................................................... 6
Hình 2.5 Mô hình hệ thống HPLC .............................................................................. 7
Hình 2.6 Van bơm mẫu bằng tay ................................................................................ 7
Hình 2.7 Ứng dụng của HPLC .................................................................................. 10
Hình 2.8 Công thức hóa học của proline................................................................... 11
Hình 2.9 Tạo dẫn xuất acid amin - PITC .................................................................. 12
Hình 2.10 Công thức hóa học của ampicillin............................................................ 12
Hình 2.11 6 - aminopenicillic acid ............................................................................ 13
Hình 2.12 Cơ chế kháng khuẩn của ampicillin ......................................................... 14
Hình 2.13 Phổ kháng khuẩn của các penicillin ......................................................... 15
Hình 2.14 Công thức hóa học của tetracycline ......................................................... 16
Hình 2.15 Vị trí tác động của kháng sinh ức chế tổng hợp protein ......................... 18
Hình 3.1 Hệ thống HPLC .......................................................................................... 23
Hình 3.2 Dãy chuẩn định mức ampicillin ................................................................. 27
Hình 4.1 Sắc ký đồ của proline chuẩn 10 mM ở thể tích 2 µl .................................. 31
Hình 4.2 Đường chuẩn proline .................................................................................. 32

x 
 


Hình 4.3 Sắc ký đồ của mẫu lá M4 ........................................................................... 34
Hình 4.4 Sắc ký đồ của mẫu M4 có thêm chuẩn....................................................... 34

Hình 4.5 Sắc ký đồ của chuẩn ampicillin 50 ppm .................................................... 38
Hình 4.6 Đường chuẩn ampicillin ............................................................................. 39
Hình 4.7 Sắc ký đồ của chuẩn tetracycline 40 ppm .................................................. 40
Hình 4.8 Đường chuẩn tetracycline .......................................................................... 41

xi 
 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Các loại đầu dò dùng cho HPLC ................................................................. 8
Bảng 3.1 Chương trình gradient trong phân tích proline .......................................... 25
Bảng 4.1 Thời gian lưu và diện tích peak chuẩn proline ở các thể tích .................... 32
Bảng 4.2 Kết quả hàm lượng proline trong mẫu lá cây ............................................ 35
Bảng 4.3 Thời gian lưu và diện tích các mẫu thêm chuẩn ........................................ 36
Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline ..................................... 36
Bảng 4.5 Thời gian lưu và diện tích các nồng độ chuẩn ampicillin.......................... 38
Bảng 4.6 Thời gian lưu và diện tích các nồng độ chuẩn tetracycline ...................... 40

xii 
 


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ CÔNG THỨC

SƠ ĐỒ, CÔNG THỨC


TRANG

Sơ đồ 2.1 Dược động học của nhóm tetracycline ..................................................... 18
Sơ đồ 3.1 Quy trình định phân tích proline ............................................................... 26
Công thức 3.1 Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích proline ............................. 29
Công thức 3.2 Hàm lượng proline trong mẫu lá cây................................................. 30
 

xiii 
 


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1Đặt vấn đề
Trong đời sống xã hội ở thời đại công nghệ hiện nay, việc kiểm soát tình
hình chất lượng hàng hóa như hàm lượng các hợp chất trong thực phẩm (acid amin,
protein, lipid…), dược phẩm, thức ăn chăn nuôi thú y, kiểm tra tình trạng ô nhiễm
môi trường, tồn dư hóa chất độc hại, tồn dư các loại kháng sinh (ampicillin,
tetracycline…) ... đòi hỏi phải có sự chính xác. Vì thế, việc phát triển và mở rộng hệ
thống kiểm định với những kỹ thuật tiên tiến, hiện đại để đáp ứng nhu cầu ngày
càng cao về chất lượng cuộc sống và sức khỏe của con người là một trong những
yêu cầu cấp thiết của nông nghiệp cũng như công nghiệp và y tế. Một trong các
phương pháp kiểm định có thể kể đến là phương pháp dùng kỹ thuật sắc ký, mà cụ
thể là sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography –
HPLC). Song song với sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật, kỹ thuật phân
tích HPLC với thiết bị và đầu dò hiện đại có khả năng nhận biết các chất thông qua
các tín hiệu điện, cho hiệu quả cao trong việc định tính và định lượng các chất trong
hỗn hợp nhiều cấu tử, ngày càng đóng vai trò to lớn và được ứng dụng rộng rãi hơn.

Để có thể ứng dụng được HPLC trong phân tích các hoạt chất, việc xây dựng quy
trình, thử nghiệm và tối ưu hóa các quy trình trong điều kiện nhất định của các
phòng thí nghiệm là một nhiệm vụ của những người làm công tác kiểm nghiệm,
trong đó việc xây dựng đường chuẩn là một bước khởi đầu quan trọng giúp nhận
diện tín hiệu về chất phân tích. Do đó, việc học tập và tìm hiểu về HPLC là một nhu
cầu tất yếu đối với những người đã, đang và sẽ làm công tác này. Được sự đồng ý
của khoa Chăn nuôi Thú y và Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trường ĐH

1 
 


Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng và
BSTY. Đặng Thị Xuân Thiệp, chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng sắc ký lỏng
hiệu năng cao trong phân tích proline và xây dựng đường chuẩn ampicillin và
tetracycline”.
1.2 Mục đích
Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật HPLC trong phân tích hàm lượng acid amin
proline trong mẫu lá cây và xây dựng phương trình đường chuẩn hai loại kháng sinh
ampicillin và tetracycline.
1.3 Yêu cầu
Đánh giá một số chỉ tiêu trong phân tích hàm lượng proline trong mẫu lá cây,
trong xây dựng phương trình đường chuẩn ampicillin và tetracycline, từ đó nêu lên
được ý nghĩa của việc thực hiện các phân tích này và vai trò của HPLC trong phân
tích.

2 
 



Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu về phương pháp HPLC
2.1.1 Lịch sử
Phương pháp phân tích sắc ký được phát minh vào năm 1903 bởi nhà thực
vật học người Nga Tsvet khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Ông đã tách
thành công các hợp chất này từ lá cây bằng cách chiết có sử dụng dung môi và cột
nhồi. Từ “chromatography” bắt nguồn từ chữ “chroma” nghĩa là chất màu (tiếng
Latinh), vừa là tên của Tsvet trong tiếng Nga, vừa là màu của các sắc tố thực vật
ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn được tiếp tục sử dụng dù các phương
pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Năm 1954, Martin và Synge được trao giải Nobel Hóa học cho sự phát minh
về sắc ký phân bố lỏng (Hồ Viết Quý, 2006). Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh
chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc của sắc kí
Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách, từ đó họ cải tiến và chuyển đổi thành
nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kỹ thuật thực hiện sắc ký cũng cải tiến liên
tục nhằm phân tích các phân tử khác nhau hay tương tự.
Trước kia sắc ký lỏng cổ điển dùng cột hở có nạp những hạt nhồi để tách
chất phân tích ở áp suất thường nhưng hiệu suất tách không cao, độ lặp lại thấp và
tốn nhiều thời gian. Về sau người ta nhận thấy kích cỡ hạt nhỏ, khả năng tách rất
tuyệt vời, nhưng hạt quá bé lại gây cản trở tốc độ dòng chảy pha động, vì vậy người
ta lại mong muốn có một áp suất cao để điều chỉnh cũng như kiểm soát tốc độ dòng
dung môi. Năm 1967, Horvath là tác giả đầu tiên đã tạo ra máy HPLC nghiên cứu
về nucleotide (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Kỹ thuật mới có tên gọi sắc ký lỏng

3 
 


cao áp – HPLC (High Performance Liquid Chromatography hay High Pressure

Liquid Chromatography). Chữ HPLC xuất phát từ sự kiện áp suất cao được dùng để
tạo ra dòng yêu cầu cho sắc ký lỏng trong cột nhồi.
Ngày nay với việc cải tiến các loại cột tách (thay đổi kích thước hình học,
bản chất pha tĩnh), sử dụng các loại đầu dò mới... HPLC đã trở thành một phương
pháp tách hữu hiệu được ứng dụng đa dạng trong các lĩnh vực như sinh học, dược
phẩm, môi trường… Với độ chính xác cao và đặc hiệu, nó có thể tách nhanh những
hỗn hợp phức tạp thành những thành phần riêng lẻ, có thể xác định các hợp chất ở
lượng vết ở nồng độ ppt một cách dễ dàng và có thể thu hồi lại mẫu vì hầu hết mẫu
không bị phá hủy bởi đầu dò.
2.1.2 Phân loại HPLC (Trần Tử An, 2005): có 4 loại cơ bản:
Sắc ký phân bố (Partition chromatography): pha tĩnh là một lớp mỏng hữu cơ
phủ lên bề mặt các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Ứng dụng rất
nhiều trong công tác kiểm nghiệm thuốc.
Sắc ký hấp phụ (Liquid - solid chromatography): là kỹ thuật phát triển sớm
nhất và được dùng phổ biến. Trong kỹ thuật này, chất phân tích bị giữ trên bề mặt
pha tĩnh (chất hấp phụ như silicagel…) và bị dung môi đẩy ra (chất phản hấp phụ là
các dung môi ít hoặc không phân cực).
Sắc ký trao đổi ion (Ion - exchange chromatography): ứng dụng phân tách
các ion hòa tan trong nước, có phân tử lượng nhỏ hơn 1500. Pha tĩnh là các hợp chất
hữu cơ cao phân tử chứa các nhóm chức có khả năng trao đổi.
Sắc ký loại cỡ (Size - exclusion chromatography): dùng trong phân tách các
chất có phân tử lượng lớn hơn 2000. Pha tĩnh là các hạt silicagel hoặc polymer.
2.1.3 Nguyên tắc
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao (Trần Tử
An, 2005).

4 
 



Hình 2.1 Nguyên tắc sắc ký
Quá trình tách sắc ký thường gồm 3 giai đoạn chính: (1) Đưa hỗn hợp lên
pha tĩnh. (2) Cho pha động chạy qua pha tĩnh. (3) Phát hiện các chất được tách.

 

Hình 2.2 Quá trình sắc ký (Levin, 2002) 

Dưới áp suất cao, các thành phần phân tích đã được hòa tan trong dung môi
sẽ bị kéo đi theo sự di chuyển của pha động qua cột sắc ký với các tốc độ khác nhau
và được tách khỏi nhau theo thời gian phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất tan với
pha động và pha tĩnh. Chất nào có lực tương tác lớn hơn sẽ bị giữ lại lâu hơn trên
cột và bị rửa giải chậm hơn. Tín hiệu về từng chất được phát hiện bởi đầu dò đặt sau
cột tách và hiện diện dưới dạng các peak nhờ bộ phận xử lý và ghi kết quả.

5 
 


 

Hình 2.3 Tương tác xảy ra trong cột
Sự lưu giữ được tạo thành bởi tổng 3 lực thành phần. F1 là lực giữ chất phân
tích trên cột, F2 là lực kéo nó đi ra khỏi cột. Các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ
khác nhau. Chất được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi có lực lưu giữ nhỏ nhất, và
ngược lại. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác
nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột (Phạm Luân, 2006).

 


Hình 2.4 Quá trình tách các chất trong cột sắc ký (Phạm Luân, 2006) 

2.1.4 Cấu tạo của một hệ thống HPLC
Bình chứa dung môi pha động: để việc phân tích định lượng được chính xác,
dung môi cần có độ sạch cao và chuyên dụng (HPLC grade). Trong HPLC, pha
động có thể là dung môi đơn như: methanol, axetonitril, n-hexan, nước hoặc cũng

6 
 


có thể là hỗn hợp của các dung môi theo thành phần thể tích nhất định. Ví dụ:
MeOH : H2O (10 : 90).

Hình 2.5 Mô hình hệ thống HPLC (Phạm Luân, 2006)
Bơm tăng áp: đẩy pha động qua cột, làm tăng và ổn định vận tốc dòng pha
động trong quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra khỏi cột. Bơm này phải trơ với hóa
chất, điều chỉnh được khoảng áp suất rộng (0 – 400 bar) (1bar = 0,987 at).
Gradient: dùng chương trình Gradient với tỉ lệ pha động được thay đổi trong
quá trình phân tích (Hà Duyên Tư, 2009).
Bộ phận tiêm mẫu: tiêm mẫu bằng bơm tiêm tiện lợi và đơn giản nhưng ở áp
suất cao việc định lượng sẽ không chính xác.

Hình 2.6 Van bơm mẫu bằng tay.

7 
 



Cột sắc ký: là nơi chứa pha tĩnh và nơi diễn ra quá trình tách sắc ký. Hiệu
quả tách sắc ký phụ thuộc chủ yếu vào cột, do đó tùy thuộc mức độ sắc ký và chất
phân tích để lựa chọn cột cho phù hợp.
Một số loại cột thường gặp: column Gemini 5u C18, Picotag column
3.9*150, HyperClone 3u BDS C18, Nucleosil C18, Chromolith Performance (RP 18, RP 8) (Võ Thị Bạch Huệ và ctv, 2008).
Đầu dò (detector): phát hiện và đo nồng độ chất phân tích theo một tính chất
hóa học, hóa lý hay vật lý nào đó của chất phân tích hay dạng hợp chất của nó. Đầu
dò phải có khoảng động học tuyến tính rộng, là khoảng đo của một chất mà tín hiệu
đáp ứng của đầu dò tỉ lệ thuận với hàm lượng chất. Khi nối với các đầu dò, phương
pháp cho phép định tính dựa vào thời gian lưu và định lượng dựa vào chiều cao
hoặc diện tích peak (Trần Bích Lam, 2006).
Bảng 2.1 Các loại đầu dò dùng cho HPLC (Phạm Luân, 2006)
Số

Tính chất để phát hiện

Tên đầu dò

1

Sự phát xạ của nguyên tử

Đo phổ phát xạ nguyên tử (ICP-AS)

2

Hấp thụ quang UV-VIS

Đo phổ UV, hay UV-VIS


3

Huỳnh quang

Đo phổ huỳnh quang

4

Độ dẫn điện, dòng, thế…

Đo dòng (cực phổ)điện trở và đo thế

5

Chỉ số chiết suất

Đo chiết suất

6

Độ dẫn nhiệt

Đo độ dẫn nhiệt

7

Khối lượng ion chất

Khối phổ (MS)


Phổ biến nhất là UV-VIS vì độ chọn lọc cao, sau đó tới đầu dò huỳnh quang,
điện hóa và chiết xuất với độ nhạy cao hơn nhiều so với UV-VIS. Đầu dò phổ khối
được ứng dụng rộng trong những phân tích kiểm nghiệm phức tạp yêu cầu về giới
hạn phân tích thấp mà các loại phân tích khác không thực hiện được (Chu Phạm
Ngọc Sơn, 2008).

8 
 


Đầu dò UV - VIS: tín hiệu về sự thay đổi cường độ ánh sáng khi đi qua cốc
đo chứa dung dịch phân tích được đo bởi diod quang, sau đó được khuếch đại và
truyền tới máy ghi nhận, máy tính tích phân hay máy vi tính. Đầu dò UV - Vis được
sử dụng dễ dàng với độ tin cậy cao, giá thành không quá đắt, sử dụng được trong
trường hợp chạy gradient, không phá hủy mẫu thử, tương đối nhạy và đặc hiệu. Tuy
vậy, UV - Vis lại đáp ứng kém đối với các chất không hấp thu UV tốt. Khắc phục
hạn chế của đầu dò này (không có nhiều các chất có khả năng hấp thu tia tử ngoại)
bằng cách tạo các dẫn xuất của các hợp chất để chúng trở thành các chất hấp thu tử
ngoại (Võ Thị Bạch Huệ và ctv, 2008).
Bộ phận xử lý và ghi tín hiệu: phải thật chính xác và đa năng, có thể đo được
thời gian lưu, tự động hóa trong việc phát hiện và đo diện tích peak, điều chỉnh
đường nền, có khả năng phân tích định tính thành phần của hỗn hợp. Ngoài ra, phải
xác định được nồng độ mẫu và có khả năng giữ lại các dữ kiện trong bộ nhớ để có
thể lặp lại tính toán kết quả mà không cần đưa mẫu thử qua hệ sắc ký nhiều lần.
Hiện nay, các hệ thống sắc ký được kết nối với hệ thống máy vi tính cho
phép tính toán một cách nhanh chóng và chính xác. Các peak trên sắc ký đồ biểu thị
cho sự đáp ứng với các thành phần khi được rửa giải ra khỏi cột sắc ký. Chiều cao
hay diện tích peak của từng thành phần có thể dùng để xác định nồng độ khi đối
chiếu với peak thu được từ việc tiêm mẫu chất chuẩn (Võ Thị Bạch Huệ và ctv,
2008).

Ngoài ra còn có bộ phận khử khí để loại khí ngay trong bình chứa dung môi
hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi dung môi được đưa vào bơm, và một
tiền cột đặt giữa bộ phận tiêm mẫu và cột tách để loại bỏ tạp trong mẫu cũng như
trong pha động;
2.1.5 Ứng dụng của HPLC
HPLC tỏ ra ưu việt hơn so với GC khi phân tích các hợp chất hữu cơ. Các
thành phần của thực phẩm phần lớn là các hợp chất bay hơi và không bền nhiệt, có
thể tiến hành sắc ký mà không cần phân hủy hoặc chuyển thành các dẫn xuất dễ bay

9 
 


hơi, do đó khi phân tích sẽ được hòa tan vào dung môi thích hợp và được thực hiện
ở nhiệt độ phòng. Phần lớn phân tích mẫu thực phẩm dựa trên cơ sở sắc ký phân bố
và thời gian hoàn tất trong vòng 30 phút. Sự thông dụng của HPLC nhờ vào khả
năng phân tích được trên nhiều nhóm đối tượng, hiệu quả tách và tính chọn lọc của
phương pháp rất cao, thể tích mẫu phân tích chỉ khoảng 1 – 100 μl (Trần Bích Lam,
2006).
Khoảng 10 năm qua và cho đến nay, kỹ thuật HPLC đã được ứng dụng rất
rộng rãi trong nhiều ngành khoa học kĩ thuật, công nghiệp, nông nghiệp và y dược.
Có thể khái quát theo hai hướng sau: (1) Tách và xác định các chất vô cơ: các cation
(Mg2+, Na+, Ca2+…), các anion (PO43+, SO42-, BrO3-, NO2-, F-, Cl-…). (2) Tách và
xác định các chất hữu cơ: hỗn hợp hydrocacbua của dầu mỏ và các sản phẩm hóa
dầu; các acid, bazơ hữu cơ, họ phenol, amine, amino acid và các sản phẩm dẫn xuất;
các hóa chất bảo vệ thực vật; các hợp chất màu, phẩm nhuộm; các protein, lipid,
peptid; các hợp chất cao phân tử và monomer của nó; dược phẩm, dược liệu…
(Phạm Luân, 2006).

Hình 2.7 Ứng dụng của HPLC (Levin, 2002)


10 
 


2.2 Sử dụng HPLC trong phân tích một số hoạt chất
2.2.1 Proline
(S)-Pyrrolidine-2-carboxylic acid (C5H9NO2, M = 115,13).

 

Hình 2.8 Công thức hóa học của proline (Sigma Aldrich Co, 2010)
Proline (Pro, P) được phát hiện bởi Hermamn Emil Fischer vào năm 1904, là
một loại α - amino acid, một trong 20 amino acid mã hóa DNA. Proline là amino
acid duy nhất thiếu proton amid (- NH2) nên chính xác phải được gọi là một imino
acid. Proline do glutamate tạo thành và proline là tiền chất của hydroxyprolin. Cả
hai chất là những chất chính trong các collagen của bắp thịt kể cả da, gan, phổi, tim
và xương. Thiếu chất nầy có thể bị hư thận và óc ngu đần (Nguyễn Thế Thức,
2005).
Trong cây trồng, proline được tổng hợp từ L - glutamic acid. Lượng proline
trong cây vào thời kỳ nhiệt độ cao đóng vai trò rất quan trọng, phụ thuộc vào hệ
thống tín hiệu trong cây và khả năng sản sinh của cây (Alia A. và ctv, 2001). Việc
tích lũy proline tự do dường như là phương thức phổ biến đối với stress ở thực vật
bậc cao (Gzik, 1996).
Trong phân tích proline bằng kỹ thuật HPLC, mẫu thực vật được thủy phân
bằng dung dịch HCl 6 N, tiếp đó được tạo dẫn xuất bởi dung dịch tạo dẫn xuất. Sau
cùng mẫu được bơm vào máy HPLC để định lượng acid amin proline có trong mẫu.
Nguyên lý của việc tạo dẫn xuất: theo Edman (1950), Edman là một phản
ứng hóa học trong đó các tiểu phần acid amin được giải phóng lần lượt từ đầu N của
chuỗi polypeptide. Acid amin ở tận cùng đầu N của một chuỗi polypeptide có thể

được cải biến khi xử lý với phenylisothyocyanate (PITC) dẫn đến sự thay đổi ở gốc
α - amino. Acid amin được cải biến này sau đó được cắt rời khỏi chuỗi polypeptide

11