BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ ĐỘC LỰC
CỦA CÁC CHỦNG Edwardsiella ictaluri NHƯỢC ĐỘC

Họ và tên sinh viên: TRUYỆN NHÃ ĐỊNH HUỆ
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2006 - 2010

Tháng 7/2010


ĐÁNH GIÁ ĐỘC LỰC
CỦA CÁC CHỦNG Edwardsiella ictaluri NHƯỢC ĐỘC

Tác giả

TRUYỆN NHÃ ĐỊNH HUỆ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng
Kỹ sư ngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 7 năm 2010
i

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Cha Mẹ, những người thân trong
gia đình đã nuôi dưỡng, dạy dỗ, động viên và luôn sát cánh bên con để con có được
như ngày hôm nay.
Trong suốt quá trình học tập, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường
Đại Học Nông Lâm - Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản cùng
toàn thể các thầy cô trong và ngoài Khoa Thủy Sản đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Xin gửi lòng biết ơn, kính trọng sâu sắc đến thầy TS. Nguyễn Hữu Thịnh,
người đã rất quan tâm, tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ để tôi có thể hoàn
thành tốt khóa luận này.
Chân thành cảm ơn thầy ThS. Nguyễn Hoàng Nam Kha, anh Đỗ Viết Phương lớp CH09TS và anh Nguyễn Trọng Bình, chị Vũ Thị Thanh Hương - Trung tâm Công
Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, cùng các bạn trong và ngoài lớp DH06NY
đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Do có những hạn chế về mặt thời gian cũng như về mặt kiến thức nên khóa luận
này không thể tránh khỏi những thiếu sót, khuyết điểm. Rất mong nhận được những ý
kiến đóng góp của quý thầy cô cùng các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn.

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Đánh giá độc lực của các chủng Edwardsiella ictaluri nhược độc”
được tiến hành từ ngày 29/12/2009 đến ngày 30/03/2010 tại Trại Thực Nghiệm Thủy
Sản và Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại học
Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Đề tài được thực hiện với mục đích đánh giá độc lực của các chủng
Edwardsiella ictaluri nhược độc trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus Sauvage,

1878).
Thí nghiệm thực hiện trên cá tra giống có trọng lượng 8 - 10 g/con. Các chủng
E. ictaluri nhược độc thử nghiệm gồm 2 chủng: PAM và R320. Độc lực của các chủng
nhược độc được so sánh với độc lực của các chủng E. ictaluri hoang dại ĐT và NL.
Sau khi gây nhiễm cá bằng phương pháp tiêm xoang bụng với các liều tương tự
nhau, các nghiệm thức ĐC, PAM, R320, ĐT và NL có tỷ lệ cá chết lần lượt là 0%, 0%,
58,89%, 92,22% và 95,56%. Kết quả định danh các chủng E. ictaluri bằng phương
pháp PCR cho thấy các chủng vi khuẩn thí nghiệm chính là tác nhân gây chết cá ở các
nghiệm thức tương ứng. Về phương diện triệu chứng, bệnh tích thì không thấy triệu
chứng bệnh tích của cá ở nghiệm thức PAM, nghiệm thức R320 cá có biểu hiện bệnh
tích đặc trưng nhưng mức độ biểu hiện của bệnh nhẹ hơn so với nghiệm thức ĐT và
NL.
Như vậy, chủng E. ictaluri nhược độc PAM bước đầu được đánh giá an toàn
cho cá tra. Chủng E. ictaluri nhược độc R320 có độc lực đã giảm thấp đáng kể so với
chủng E. ictaluri hoang dại ĐT và NL.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa

i

LỜI CẢM ƠN

ii

TÓM TẮT


iii

MỤC LỤC

iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

x

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

xi

Chương 1 MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt vấn đề

1


1.2 Mục tiêu đề tài

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1 Sơ lược về bệnh gan thận mủ

3

2.1.1 Lịch sử bệnh và một số nghiên cứu bệnh do E. ictaluri gây ra

3

2.1.2 Tác nhân gây bệnh

4

2.1.2.1 Phân loại

4

2.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

4

2.1.2.3 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn E. ictaluri


4

2.1.2.4 Khả năng cảm nhiễm E. ictaluri đối với một số loài cá nuôi

5

2.1.3 Dịch tễ bệnh

5

2.1.4 Dấu hiệu bệnh lý

5

2.1.4.1 Triệu chứng bên ngoài

6

2.1.4.2 Bệnh tích bên trong

6

2.1.4.2.1 Bệnh tích đại thể

6

2.1.4.2.2 Bệnh tích vi thể

6


2.1.5 Phòng bệnh

6

2.1.6 Trị bệnh

7
iv


2.2 Tổng quan về vi khuẩn sống nhược độc

7

2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn sống nhược độc

7

2.2.2 Các chủng vi khuẩn nhược độc thử nghiệm

8

2.2.2.1 Chủng E. ictaluri nhược độc PAM

8

2.2.2.2 Chủng E. ictaluri nhược độc R320

9


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

10

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

10

3.2 Vật liệu nghiên cứu

10

3.2.1 Dụng cụ

10

3.2.2 Hóa chất và môi trường

10

3.2.3 Cặp primer sử dụng để định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR

11

3.3 Đối tượng nghiên cứu

11

3.3.1 Cá thí nghiệm


11

3.3.2 Vi khuẩn thí nghiệm

11

3.4 Phương pháp nghiên cứu

12

3.4.1 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng

12

3.4.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn

12

3.4.3 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm

13

3.4.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

13

3.4.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm

14


3.4.6 Phương pháp giải phẩu cá

14

3.4.7 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn

14

3.4.8 Phương pháp cấy thuần

15

3.4.9 Phương pháp định danh

15

3.4.9.1 Thu dịch chứa vi khuẩn

15

3.4.9.2 Ly trích DNA

15

3.4.9.3 Thực hiện phản ứng PCR

16

3.4.9.3.1 Chuẩn bị ống khuyếch đại


16

3.4.9.3.2 Chương trình thực hiện PCR

16

3.4.9.4 Điện di sản phẩm khuyếch đại

17

3.4.9.4.1 Chuẩn bị gel điện di

17
v


3.4.9.4.2 Chuẩn bị dịch điện di

17

3.4.9.5 Nhuộm gel và đọc kết quả

17

3.4.9.5.1 Nhuộm gel

17

3.4.9.5.1 Đọc kết quả


17

3.5 Bố trí thí nghiệm

18

3.6 Các chỉ tiêu theo dõi

19

3.7 Phương pháp xử lý số liệu

19

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

20

4.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá trước khi thí nghiệm

20

4.1.1 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng

20

4.1.2 Kết quả kiểm tra vi khuẩn

20


4.1.3 Trọng lượng cá tiến hành thí nghiệm

20

4.2 Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thí nghiệm

21

4.3 Mật độ vi khuẩn tiêm cá

22

4.4 Kết quả quá trình gây nhiễm

22

4.4.1 Kết quả định danh

22

4.4.1.1 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn chuẩn bị gây bệnh

22

4.4.1.2 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn gây bệnh

23

4.4.2 Tỷ lệ chết


26

4.4.3 Triệu chứng, bệnh tích của cá thí nghiệm

28

4.5 Kết quả kiểm tra cá còn sống sau thí nghiệm

31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

33

5.1 Kết luận

33

5.2 Đề nghị

33

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

ESC: Enteric Septicemia of Catfish
BHIA: Brain Heart Infusion Agar
Rif: Rifampicin
PCR: Polymerase Chain Reaction
UI: International Unit
Taq HN: Taq polymerase
mM: Milimol
µM: Micromol
CFU: Colony Forming Unit
kb: Kilo base pairs
bp: Base pairs
DO: Dissolved Oxygen
pH: Potential of hydrogen
NH3: Ammonia
OD: Optical Density
IDS 14 GNR: Indentification System with 14 biochemical reationsfor
Indentification of non fastidious Gram Negative Rods.
ONPG: Ortho-Nitrophenyl-β-galactoside.
PAD: Phenyl Alanin Deaminnase.
VP: Voges-poskauer
LDC: Lysin decarboncylase
rpm: Revolutions per minute
TE: Tris – EDTA
UV: Ultraviolet
Xhgv : Xuất huyết gốc vây
Bt: Bình thường

vii



DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1: Trọng lượng cá trung bình của các nghiệm thức

20

Bảng 4.2: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình gây bệnh

21

Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn tiêm cá ở các nghiệm thức

22

Bảng 4.4: Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức

27

Bảng 4.5: Kết quả cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách
của cá sau thí nghiệm ở các nghiệm thức

viii

31


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Cấu trúc gen purA của chủng E. ictaluri hoang dại ĐT
và chủng E. ictaluri nhược độc PAM


5

Hình 3.1: Thao tác tiêm cá

13

Hình 3.2: Hệ thống bể thí nghiệm

18

Hình 4.1: Kết quả định danh bằng PCR của chủng E. ictaluri nhược độc PAM
khi dùng cặp primer F1 purA và R3 purA

23

Hình 4.2: Kết quả định danh bằng PCR của chủng E. ictaluri nhược độc R320
khi dùng cặp primer CN-F và C1-R2

24

Hình 4.3: Đĩa cấy phân lập gan, thận, lách cá chết của nghiệm thức NL
sau 48 giờ ủ ở 30oC

25

Hình 4.4: Kết quả định danh bằng PCR của các chủng E. ictaluri
khi dùng cặp primer F2A serC và R2A serC
Hình 4.5: So sánh bệnh tích của cá ở các nghiệm thức R320, ĐT và NL


25
30

(A: Nghiệm thức R320, gan sưng, thận có mủ, lách sưng; B: Nghiệm
thức ĐT, gan sưng có mủ, thận sưng rất to có mủ, lách sưng to và có
mủ, C: Nghiệm thức NL với gan sưng to có mủ xuất hiện mảng trắng ,
thận sưng rất to có mủ, lách sưng có mủ)
Hình 4.6: Kết quả kiểm tra PCR cá còn sống ở các nghiệm thức sau 14 gây bệnh

ix

32


DANH SÁCH BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ cá chết tích lũy ở các nghiệm thức
trong quá trình thí nghiệm

26

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt Vấn Đề
Trong những năm gần đây, ngành Thủy Sản Việt Nam không ngừng phát triển,
đã và đang dần trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn. Năm 2009, tuy có
một số khó khăn, nhưng tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản vẫn đạt 4,2 tỷ USD,

chiếm 7,43% tổng kim ngạch xuất khẩu toàn quốc. Bên cạnh đó, sản lượng thủy sản
khai thác tự nhiên không thay đổi và đang có xu hướng giảm dần, do đó, vai trò của
nuôi trồng thủy sản càng quang trọng hơn. Trong nuôi thủy sản nước mặn, tôm sú là
đối tượng xuất khẩu có sản lượng xuất khẩu cao nhất thì sản lượng xuất khẩu cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) trong nuôi nước ngọt có sản lượng
xuất khẩu đứng vị trí số một.
Cá tra là đối tượng nuôi truyền thống ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Những năm gần đây, nhờ việc xuất khẩu mang lại hiệu quả cao nên việc nghề nuôi cá
tra phát triển một cách nhanh chóng. Để có sản lượng cao cung cấp cho xuất khẩu,
người nuôi đã không ngừng mở rộng diện tích nuôi và đặc biệt là việc gia tăng mật độ
nuôi lên gấp nhiều lần, từ đó đã dẫn đến sự phát sinh nhiều vấn đề như ô nhiễm môi
trường nước hay quang trọng nhất là việc phát sinh của nhiều loại bệnh.
Ở nước ta, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá
tra nuôi thường xuyên xảy ra và gây thiệt hại nặng nề nhất cho nghề nuôi. Khi cá bị
bệnh, người nuôi thường dùng kháng sinh để điều trị nhưng thường sử dụng một cách
tự phát, không theo một hướng dẫn cụ thể nào về loại kháng sinh phải sử dụng hay liều
lượng cũng như nguyên tắc sử dụng chúng, hậu quả là dẫn đến tình trạng kháng kháng
sinh của vi khuẩn gây bệnh. Thêm vào đó, việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh
cá tạo ra một hệ lụy nghiêm trọng là sự tồn dư của kháng sinh trong cơ thịt cá, không
thân thiện với môi trường mà điều này làm cho tình trạng xuất khẩu khó khăn hơn do
các quy định hiện tại để bảo vệ sức khỏe của người tiêu dùng. Mặt khác, một khi dịch

1


bệnh xảy ra thường gây thiệt hại rất nghiêm trọng, tỉ lệ chết của cá luôn lớn hơn 50%
tổng sản lượng.
Để giải quyết vấn đề trên nhiệm vụ đặt ra là phải tìm một giải pháp thích hợp
vừa thân thiện với môi trường vừa ngăn ngừa được sự bùng phát của dịch bệnh và
quang trọng là đảm bảo sức khỏe của người tiêu dùng. Trước yêu cầu đó, các phương

pháp phòng bệnh cho cá được đưa ra, phương pháp phòng bệnh tối ưu được đưa ra là
sử dụng vaccine phòng bệnh. Hiện tại, ở nước ta chưa có một loại vaccine phòng bệnh
gan thận mủ nào được đưa vào sử dụng và việc nghiên cứu vaccine phòng bệnh này đã
và đang được nghiên cứu.
Trong thủy sản có nhiều loại vaccine được đưa ra dựa vào các phương pháp chế
tạo của nó như vaccine bất hoạt, vaccine sống nhược độc, DNA vaccine, vaccine tái tổ
hợp…Trong số đó, phương pháp tạo vaccine sống nhược độc thường được chọn để
nghiên cứu. Để có được vaccine sống nhược độc, phải tạo ra và lựa chọn được các
chủng vi khuẩn nhược độc không gây bệnh cho đối tượng nuôi. Do đó, chúng tôi đã
tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá độc lực của các chủng Edwarsiella ictaluri
nhược độc”.
1.2 Mục Tiêu Đề Tài
So sánh độc lực của các chủng Edwarsiella ictaluri nhược độc trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878).

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ Lược Về Bệnh Gan Thận Mủ
2.1.1 Lịch sử bệnh và một số nghiên cứu bệnh do E. ictaluri gây ra
Bệnh được ghi nhận, phân lập và định danh đầu tiên trên cá nheo, Ictalurus
punctatus, tại Hoa Kỳ vào năm 1976 (Hawke, 1979).
Đến năm 1979, bệnh được mô tả khá đầy đủ về triệu chứng và bệnh tích đặc
trưng, tuy nhiên chưa xác định được nguyên nhân gây ra bệnh (Hawke, 1979).
Vào năm 1981, lần đầu tiên bệnh được xác định nguyên nhân là do vi khuẩn
gây nên, vi khuẩn được đặt tên là Edwardsiella ictaluri. Tên bệnh là Enteric
Septicemia of Catfish - ESC, được dịch là “Bệnh nhiễm trùng huyết và viêm ruột”, hay
có tên gọi là Hole in the head disease, được gọi là “Bệnh lổ đầu”.

Năm 1987, ở Thái Lan đã xảy ra dịch bệnh trên cá trê Clarias bactrachus do vi
khuẩn E. ictaluri gây ra.
Cho đến năm 1992, cá tra, cá basa nuôi ao, bè ở Việt Nam thường bị bệnh với
đốm hoại tử trên gan, thận, lách nhưng không rõ tác nhân gây bệnh.
Vào cuối năm 1998, bệnh xuất hiện và được mô tả lần đầu tiên trên cá tra nuôi
ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (Ferguson và ctv., 2001).
Bệnh thường được gọi tên là bệnh mủ gan hay bệnh gan thận mủ.
Fugerson và ctv (2001) đã có công trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về bệnh gan
thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam, vi khuẩn được định danh là Bacillus sp.
Nhưng đến năm 2002, các nhà nghiên cứu đã đính chính lại nguyên nhân gây
bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish
và ctv., 2002).
Năm 2004, ở Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh xuất hiện trên cá hồi cầu vồng Oncorhynchus
mykiss. Phát hiện mới đây cho thấy vi khuẩn cũng gây bệnh trên cá Ayu Plecoglossus
altivelis (Nhật).
3


2.1.2 Tác nhân gây bệnh
2.1.2.1 Phân loại
Edwardsiella ictaluri thuộc:
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Edwardsiella
Loài: Edwardsiella ictaluri
2.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
E. ictaluri là vi khuẩn yếm khí tùy nghi và cũng là vi khuẩn gây bệnh bắt buộc.
Vi khuẩn E. ictaluri là trực khuẩn gram âm, có kích thước 0,7 x 1,25 µm. Vi

khuẩn thường đứng riêng lẻ, một số tạo thành chuỗi 2 - 3 tế bào và bắt màu hồng nhạt
(Nguyễn Hữu Thịnh, 2007). Vi khuẩn di động yếu, khảo sát di động tốt ở 28oC. Vi
khuẩn không sinh bào tử, cho phản ứng Oxidase âm tính, Catalase dương tính, lên men
trong môi trường O/F glucose, H2S âm tính, Indol âm tính.
E. ictaluri là vi khuẩn yếu, nuôi cấy phát triển chậm trên môi trường dinh
dưỡng thông thường. Trên môi trường giàu dinh dưỡng như BHIA, ở nhiệt độ 28 30oC, khuẩn lạc sau 24 giờ ủ trong suốt và nhỏ li ti; sau 36 - 48 giờ ủ, khuẩn lạc phát
triển rõ hơn, có màu trắng hơi trong, lồi, tròn với đường kính 0,5 - 2 mm. Vi khuẩn
tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng ở 37oC (Valerie và ctv., 1994).
2.1.2.3 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn E. ictaluri
Edwardsiella ictaluri thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc.
Khả năng tồn tại của vi khuẩn trong môi trường nước không cao, khoảng 8
ngày (Hawke, 1979). Tuy nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại trong bùn đáy ao khoảng 95
ngày ở 18oC hay 25oC (Plumb và Quinlan, 1993).
Vi khuẩn tồn tại trong gan, thận, não cá sau khi cá khỏi bệnh được vài tháng.
Chính vì vậy mà có sự kích thích tạo thành đáp ứng miễn dịch có thể giúp cá vượt qua
được sự nhiễm trùng và các dịch bệnh xảy ra sau này.
Vi khuẩn có khả năng kí sinh tùy nghi trong tế bào cơ thể cá. Vi khuẩn có khả
năng xâm nhập trực tiếp từ ruột, mũi, mang vào cơ thể cá. Một số nghiên cứu cho thấy,
4


vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác, di
chuyển vào thần kinh khứu giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shotts và
ctv.,1986). Vi khuẩn lan rộng từ màng não đến sọ và da. Vi khuẩn cũng có thể xâm
nhiễm qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shotts
và ctv.,1986), tiếp đến, vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố
da.
Vi khuẩn được bài thải từ phân và từ xác cá chết vào nước, do đó, bệnh có thể
lây trực tiếp từ cá sang cá trong môi trường nước có vi khuẩn hay do cá khỏe ăn cá
bệnh chết. Chim, động vật, người, dụng cụ sử dụng như lưới, vợt dùng chung cho các

ao cũng làm lây lan mầm bệnh.
2.1.2.4 Khả năng cảm nhiễm E. ictaluri đối với một số loài cá nuôi
Cá tra nhiễm bệnh, chết 100% với các triệu chứng, bệnh tích điển hình.
Cá trê, lăng, rô phi bị nhiễm bệnh và chết, tuy nhiên tỉ lệ chết thay đổi, không
có triệu chứng, bệnh tích rõ nét.
Cá chép, mùi thì cũng bị nhiễm bệnh nhưng không chết.
2.1.3 Dịch tễ bệnh
Cỡ cá mắc bệnh thường có trọng lượng khoảng từ 0,2 g/con đến 0,3 kg/con (cá
giống và cá thịt). Tuy nhiên, cá giống có tỉ lệ chết cao hơn cá thương phẩm, tỷ lệ cá
giống chết có thể lên đến 100% sau 5 ngày mắc bệnh, cá thương phẩm mắc bệnh chết
30 - 50% sau 1 đợt dịch.
Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ và kéo dài đến mùa khô. Thời điểm
bùng phát bệnh khác nhau tùy theo từng năm, cao điểm bệnh thường xảy ra khoảng
tháng 9 đến tháng 12 hàng năm vào thời kỳ thời tiết chuyển mát. Bệnh bộc phát mạnh
khi nhiệt độ nước thấp, khoảng 20 - 28oC, đặc biệt khi nhiệt độ 25 - 28oC, nhưng khi
nhiệt độ nước khoảng 30oC trở lên, cá bệnh sẽ tự động hết bệnh và tỉ lệ chết giảm
xuống.
2.1.4 Dấu hiệu bệnh lý
Khi nhiễm bệnh, cá thường lờ đờ, tấp bờ, bơi xoay vòng và treo lơ lửng cơ thể
trên mặt nước.
Giảm ăn hay bỏ ăn sau khi nhiễm khuẩn.

5


2.1.4.1 Triệu chứng bên ngoài
Cá bệnh thường thấy có xuất huyết quanh hậu môn, miệng, hàm dưới, bụng,
các vây và các gốc vây. Cá có thể xuất huyết điểm trên thân hay xuất huyết toàn thân.
Có hiện tượng phù đầu do tích dịch dưới da vùng sọ. Khi dịch quá nhiều sẽ
chảy xuống hốc mắt và gây lồi mắt.

Do vi khuẩn có khả năng dung huyết làm mất máu nên khi quan sát thường thấy
mang nhạt màu.
2.1.4.2 Bệnh tích bên trong
2.1.4.2.1 Bệnh tích đại thể
Gan, thận, lách cá bệnh sưng rất to, thận thường bị nhũn.
Trên bề mặt gan, thận, lách xuất hiện các đốm trắng hoại tử, với đường kính 0,5
- 2 mm. Khi cá bệnh nặng, trên gan, thận, lách có thể xuất hiện các mảng trắng hoại tử
hay cá có tích dịch mủ trắng trong xoang bụng.
Nhiều vùng mô hoại tử ở gan hóa lỏng.
Cá bệnh có thể có xuất huyết điểm ở ruột, cơ và mỡ, lòng ruột chứa dịch có lẫn
máu. Dịch viêm xoang bụng trong, hơi vàng có khi có lẫn máu.
2.1.4.2.2 Bệnh tích vi thể
Mô bệnh học trên cá tra thể hiện nhiều thay đổi về cấu trúc, đặc biệt gan, thận
và tỳ tạng có hiện tượng sung huyết, xuất huyết và hoại tử trầm trọng ở hầu hết các
vùng chức năng của các cơ quan này. Đồng thời vi khuẩn cũng được tìm thấy trên mẫu
mô, những vi khuẩn này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử (Từ Thanh Dung và ctv.,
2003).
2.1.5 Phòng bệnh
Chọn con giống khỏe mạnh, không bị nhiễm bệnh.
Cải tạo ao đúng quy trình.
Trong quá trình nuôi, phải đảm bảo sức khỏe cá luôn tốt để cá ít bị cảm nhiễm
với mầm bệnh, tránh gây stress cho cá. Đặc biệt, vào thời gian có nhiệt độ nước thích
hợp cho sự phát triển của vi khuẩn, không sử dụng một số hóa chất có khả năng gây
stress cho cá như hóa chất diệt kí sinh trùng CuSO4,…
Khi thấy cá bệnh nên giảm lượng thức ăn hoặc ngưng cho ăn để giảm ô nhiễm
nước ao và giảm khả năng lây lan vi khuẩn.
6


Đối với cá bệnh, cá yếu nên vớt và chôn hố có rãi vôi.

Dụng cụ nên sử dụng riêng cho mỗi ao và nên phơi nắng hay ngâm Chlorine để
diệt mầm bệnh.
2.1.6 Trị bệnh
Bệnh gan thận mủ có thể điều trị bằng thuốc kháng sinh dành để trị vi khuẩn
Gram âm như Chloramphenicol, Florfenicol...hay sử dụng kháng sinh phổ rộng dành
để trị bệnh do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên, do việc sử dụng kháng sinh tràn lan không
đúng quy định dẫn đến vi khuẩn kháng kháng sinh, làm cho việc lựa chọn kháng sinh
sử dụng hiện nay rất khó khăn. Thêm vào đó, những tiêu chuẩn nghiêm ngặt về Vệ
sinh An toàn Thực phẩm đang hạn chế, cấm sử dụng kháng sinh trong Nuôi Trồng
Thủy Sản. Do đó, việc phòng bệnh là đòi hỏi cấp thiết nhất để đảm bảo sức khỏe cho
cá nuôi.
2.2 Tổng Quan Về Vi Khuẩn Sống Nhược Độc
2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn sống nhược độc
Vi khuẩn sống nhược độc là vi khuẩn còn sống nhưng đã được làm yếu, làm
giảm độc lực đến mức không nguy hiểm cho cơ thể nhưng vẫn gây miễn dịch tốt, hoặc
là từ những chủng vi khuẩn vốn có tính gây bệnh thấp đối với động vật được tuyển
chọn từ tự nhiên.
Vi khuẩn nhược độc là nguyên liệu để tạo ra vacine nhược độc.
Các phương pháp tạo chủng vi khuẩn nhược độc:
- Cấy chuyền nhiều lần trong phòng thí nghiệm để làm giảm độc lực của vi
khuẩn hay kéo dài thời gian nuôi cấy sẽ làm độc lực sẽ giảm dần. Tuy nhiên, độc lực
vi khuẩn có thể phục hồi khi chúng được tăng sinh trong cơ thể vật chủ. Phương pháp
này, vì thế, không an toàn và không thích hợp để áp dụng trong sản xuất vaccine.
- Lựa chọn những chủng vi khuẩn đột biến trong tự nhiên.
- Sử dụng công nghệ gen:
• Bất hoạt hay loại bỏ gen độc tính hoặc gen cần thiết cho quá trình sinh
dưỡng của vi khuẩn trong vật chủ (kỹ thuật knock - out gen).
• Cấy những gen nhược độc vào cơ thể vi khuẩn.
- Nuôi cấy vi khuẩn trong điều kiện bất lợi (nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ hay môi
trường không thích hợp).

7


Mặc dù đã bị bất hoạt nhưng các chủng vi sinh vật này vẫn còn sống và có thể
biến thành chủng có độc lực cao do biến đổi gen hoặc thu nhập gen độc từ chủng vi
khuẩn gây bệnh. Vì vậy, chủng vi khuẩn nhược độc cần phải có quá trình nghiên cứu
lâu dài.
2.2.2 Các chủng vi khuẩn nhược độc thử nghiệm
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm độc lực hai chủng vi khuẩn
nhược độc gồm: chủng E. ictaluri nhược độc PAM và chủng E. ictaluri nhược độc
R320.
2.2.2.1 Chủng E. ictaluri nhược độc PAM
Chủng E. ictaluri nhược độc PAM được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến
gen purA. Phương pháp này dựa trên nghiên cứu của Mark L. Lawrence và ctv., công
bố vào năm 1997, nghiên cứu mô tả về việc tạo chủng E. ictaluri đột biến gen purA và
thử nghiệm độc lực trên cá nheo (Ictalurus punctatus).
Định danh chủng E. ictaluri nhược độc PAM bằng PCR:
- Tiến hành chạy cặp primer
F1purA có trình tự 5’ - ATGGGCAAGAACGTCGTCGTAC - 3’
R3purA có trình tự 5’ - GTACGGATAGGTACCGTGGTCG - 3’
- Cặp primer này cho sản phẩm khuyếch đại là 714 bp đối với chủng hoang dại
và cho kết quả âm tính với chủng E. ictaluri nhược độc PAM, vì đoạn giữa của gen purA
- M - đã được loại bỏ và thay vào đó là gen kháng kháng sinh Kanamycin).

Hình 2.1: Cấu trúc gen purA
của chủng E. ictaluri hoang dại ĐT và chủng E. ictaluri nhược độc PAM

8



2.2.2.2 Chủng E. ictaluri nhược độc R320
Chủng E. ictaluri nhược độc R320 là chủng vi khuẩn đột biến gen rpoB của vi
khuẩn E. ictaluri. Chủng vi khuẩn nhược độc này được tạo ra qua quá trình chọn lọc
khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường BHIA có chứa kháng sinh Rifampicin (Rif) với
nồng độ 320 µg/ml. Phương pháp này dựa trên nghiên cứu của tác giả Phillip H.
Klesius công bố năm 1998. Thành công trong việc tạo ra chủng E. ictaluri đột biến gen
rpoB và thử nghiệm vaccine sống nhược độc của chủng vi khuẩn trên cá da nheo
Ictalurus punctatus, kết quả tạo sản phẩm E. ictaluri kháng Rif (RE-33) đã được đăng
ký bản quyền (US patent No. 6019981) và sử dụng là vaccine sống nhược độc ở dạng
thương mại với tên gọi AQUAVAC - ESC™.
Định danh chủng E. ictaluri nhược độc R320 bằng PCR:
- Tiến hành chạy cặp primer
CN-F có trình tự 5’ - CAACGGCACCGAGCGTGTTATC - 3’
C1-R2 có trình tự 5’ - AGACCGCCTGGGCCCAAC - 3’.
- Cặp primer này cho sản phẩm khuyếch đại 1200 bp đối với chủng hoang dại
và cho kết quả âm tính với chủng E. ictaluri nhược độc R320.

9


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Thực Hiện
Đề tài được thực hiện từ 29/12/2009 đến 30/03/2010 tại Trại Thực Nghiệm
Thủy Sản, Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại học
Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố
Hồ Chí Minh.
3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu
3.2.1 Dụng cụ
Bể Composite khối chữ nhật có dung tích khoảng 80 lít, hệ thống sục khí, vèo,

vợt, nhiệt kế, máy đo pH, máy đo DO, test Sera NH3...
Bộ đồ tiểu phẩu, kính hiển vi, cân điện tử, Vortex, tủ cấy vi sinh, tủ ủ, máy
Spectrophotometer (đo OD), máy ly tâm, máy điện di, máy PCR...
Ống nghiệm, bình tam giác, kim tiêm 1 ml, đĩa petri, que cấy vòng, que cấy
thẳng, đèn cồn, lame, lamelle và một số dụng cụ thí nghiệm khác.
3.2.2 Hóa chất và môi trường
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: BHIA.
Kháng sinh cho thêm vào môi trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn nhược độc:
- Chủng E. ictaluri nhược độc PAM: Colistin (50 mg/ml) bảo quản ở - 20oC.
Bổ sung Colistin vào môi trường BHIA trước khi hấp môi trường.
- Chủng E. ictaluri nhược độc R320: Rifampicin (12,8 ml/l) bảo quản ở 20oC. Sau khi hấp môi trường BHIA, khi nhiệt độ môi trường hạ xuống còn khoảng
60oC thì bổ sung thêm Rifampicin (đã làm nguội ở nhiệt độ phòng) và lắc đều.
Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, Fuchsin, Lugol, dung dịch tẩy màu, dầu
soi kính...
Hóa chất cung cấp cho phản ứng PCR, điện di và nhuộm sản phẩm khuyếch đại
gồm: Dung dịch đệm HN, TE, MgCl2, EtBt…

10


3.2.3 Cặp primer sử dụng để định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR
Định danh vi khuẩn E. ictaluri (chủng E. ictaluri hoang dại ĐT và NL):
F2AserC: 5’ - TCTGGTTCTGGCCGAATATGGACTC - 3’
R2A serC: 5’ - CGTAATCAAACCAACACCGGGTATT - 3’
Định danh chủng E. ictaluri nhược độc PAM:
F1purA: 5’- ATGGGCAAGAACGTCGTCGTAC - 3’
R3pur A: 5’-GTACGGATAGGTACCGTGGTCG - 3’
Định danh chủng E. ictaluri nhược độc R320:
CN-F: 5’- CAACGGCACCGAGCGTGTTATC -3’
C1-R2: 5’- AGACCGCCTGGGCCCAAC - 3’

3.3 Đối Tượng Nghiên Cứu
3.3.1 Cá thí nghiệm
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) giống, trọng lượng từ 810 g/con, khỏe mạnh...
Cá được trữ trong bể Composite tròn 600 lít. Cho cá ăn 2 lần/ngày với thức ăn
viên, khẩu phần ăn bằng 4% trọng lượng cơ thể.
Không cho cá ăn 1 ngày trước khi chuyển cá vào bể gây bệnh thí nghiệm và
trong suốt quá trình gây bệnh.
3.3.2 Vi khuẩn thí nghiệm
Chủng E. ictaluri hoang dại NL: Được phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ
tại Vĩnh Long, được định danh và bảo quản tại Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học Thủy
Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Chủng E. ictaluri nhược độc PAM, chủng E. ictaluri nhược độc R320 và chủng
E. ictaluri hoang dại ĐT do Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh
cung cấp. Trong đó:
- Chủng E. ictaluri nhược độc PAM: Chủng vi khuẩn đột biến gen purA.
- Chủng E. ictaluri nhược độc R320: Chủng vi khuẩn đột biến gen rpoB.
- Chủng E. ictaluri hoang dại ĐT: Được phân lập từ cá bệnh gan thận mủ ở
Đồng Tháp, được định danh và bảo quản tại Trung Tâm Công nghệ Sinh Học Thành
Phố Hồ Chí Minh.

11


3.4 Phương Pháp Nghiên Cứu
3.4.1 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng
Mục đích kiểm tra để đánh giá tình trạng sức khỏe tổng quát ban đầu của cá.
Cách tiến hành:
- Cá được làm chết bằng cách hủy não và đặt trong khay mổ sạch.
- Quan sát hình dạng ngoài của cá ở da, mang, gốc vây.
- Kiểm tra ngoại kí sinh: Dùng dao cạo lấy nhớt ở da, vây và dùng lamelle gạt

nhẹ nhớt cạo được lên lame, nhỏ lên đó 1 - 2 giọt nước sạch rồi dùng lamelle dàn
mỏng. Đặt lamelle lên và quan sát dưới kính giải phẫu và kính hiển vi.
- Kiểm tra kí sinh trùng ở cung mang: Dùng kéo cắt bỏ nắp mang rồi quan sát
bằng mắt thường. Cắt cung mang, nhúng sơ qua một đĩa nước đã chuẩn bị trước để rửa
bớt máu, dùng kẹp lấy ra quan sát bằng mắt thường, sau đó quan sát dưới kính hiển vi
từ bội giác nhỏ đến lớn.
3.4.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
Chọn khuẩn lạc:
- Chủng E. ictaluri hoang dại NL: Vi khuẩn từ ống giữ giống được cấy ria trên
các đĩa môi trường BHIA, ủ ở 30oC trong 48 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trưng, đứng
riêng lẻ, mọc trên đường cấy. Định danh vi khuẩn bằng test IDS 14 GNR (Nam Khoa)
ủ ở 30oC trong 16 - 18 giờ đồng thời cấy chuyền sang đĩa BHIA khác, ủ 30oC trong 48
giờ. Nếu kết quả định danh là vi khuẩn E. ictaluri, chọn trên đĩa BHIA (ủ 30oC trong
48 giờ) các khuẩn lạc đặc trưng, đứng riêng lẻ và mọc trên đường cấy để pha huyền
dịch vi khuẩn.
- Các chủng E. ictaluri nhược độc PAM, E. ictaluri nhược độc R320, E.
ictaluri hoang dại ĐT: Từ các đĩa vi khuẩn do Trung Tâm Công Nghệ Sinh học Thành
phố Hồ Chí Minh cung cấp, chọn các khuẩn lạc đặc trưng, đứng riêng lẻ và mọc trên
đường cấy để pha huyền dịch vi khuẩn.
Hòa các khuẩn lạc đã chọn ở mỗi chủng vào ống nghiệm có nước muối sinh lý
vô trùng, đo OD của các huyền dịch. Dùng nước muối sinh lý để điều chỉnh OD, sao
cho các huyền dịch vi khuẩn ở mỗi chủng có OD tương đương nhau. Huyền dịch vi
khuẩn sau khi điều chỉnh được pha loãng 50 lần trong bình tam giác và sử dụng huyền
dịch pha loãng này để tiêm cho cá.
12


3.4.3 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm
Gây mê cá, tiêm huyền dịch vi khuẩn vào xoang bụng với liều 0,1ml/10g cá
(đối với nghiệm thức ĐC thì thay huyền dịch vi khẩn bằng dung dịch nước muối sinh

lý vô trùng).
Hồi phục cá trong nước sạch, có sục khí mạnh rồi đưa cá trở về bể thí nghiệm.

Hình 3.1: Thao tác tiêm cá
3.4.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn
Sau khi điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn về mức OD tương đương nhau, ta tiến
hành pha loãng huyền dịch để có độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8.
Từ mỗi độ pha loãng hút 0,1 ml dung dịch nhỏ lên đĩa thạch BHIA (mỗi độ pha
loãng lặp lại 2 lần), dùng que cấy trang, trang đều dung dịch trên thạch, để khô tự
nhiên và đem ủ ở 30oC trong 48 giờ.
Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch tại mỗi nồng độ pha loãng (chỉ đếm ở các
đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250), dựa vào công thức tính và liều dung dịch vi khuẩn
tiêm cho cá ta suy ra mật độ vi khuẩn tiêm vào mỗi cá.
- Công thức tính : A = X*1/K*V
- Trong đó: A: số khuẩn lạc mọc trên một đơn vị ml.
X: số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa môi trường ở một hệ số pha
loãng.
V: thể tích (ml) mẫu dùng để cấy
K: hệ số pha loãng.
13


3.4.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm
Cá sau khi gây nhiễm theo dõi trong 14 ngày.
Hàng ngày, tiến hành đo nhiệt độ 2 lần/ngày (lúc 7 giờ 30 phút và 15 giờ), kiểm
tra DO, pH, NH3 đo 1 lần/ngày. Thay nước hàng ngày với 10% thể tích bể thí nghiệm.
Lưu ý: Nhiệt kế, máy đo pH, máy đo OD, ống đong của test Sera phải được xịt
cồn, lau chùi sau khi tiến hành đo ở mỗi nghiệm thức.
Quan sát biểu hiện của cá, ghi nhận các biểu hiện bất thường, số liệu cá chết ở
mỗi bể. Khi cá chết, ghi nhận biểu hiện bên ngoài, giải phẩu ghi nhận các biểu hiện

bên trong. Đối với cá mới chết, cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách.
Số cá còn sống sau 14 ngày gây bệnh thực nghiệm được ghi nhận biểu hiện bên
ngoài, bên trong và cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách.
3.4.6 Phương pháp giải phẫu cá
Tất cả dụng cụ giải phẫu phải được tiệt trùng bằng cồn 95% và hơ nhẹ trên
ngọn lửa.
Khử trùng bề mặt cơ thể cá bằng cồn 70% tại những vị trí cần giải phẫu.
Giải phẫu xoang bụng trái của cá bằng 3 đường cắt: Đường xuất phát từ trước
lổ hậu môn cắt song song với đường bụng và đường xuất phát từ trước lổ hậu môn
song song với đường bên. Đường thứ 3 song song rìa nắp mang và cắt 2 đường bên.
Sau khi cắt xong tách rời 1 bên xoang bụng cho thấy nội tạng bên trong.
Dùng 1 miếng bông gòn đã tẩm cồn lau sạch phần máu và dịch xoang bụng.
Quan sát và ghi nhận biểu hiện của các nội quan.
Khi mổ cần phải cẩn thận tránh mũi kéo gây tổn hại các cơ quan bên trong.
3.4.7 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn
Tách lấy gan, thận, lách, đặt lên 1 miếng bông gòn đã tẩm cồn, sau đó sát trùng
mặt ngoài của cơ quan này.
Dùng kéo cắt ngang cơ quan này và chấm lên đĩa thạch.
Dùng que cấy vòng gạt 3 - 4 lần trên mặt thạch BHIA ở một góc. Quay đĩa
thạch sang hướng khác và cấy ria từ 1 vạch thành 3 - 4 đường sao cho đường cấy sau
không trùng lên đường cấy trước. Lặp lại theo hướng tiếp theo mục đích pha loãng mật
độ vi khuẩn dính trên đầu que cấy.
Ủ các đĩa trong vòng 48 giờ ở 30oC.
14