MỤC LỤC

BÀI

NỘI DUNG

TRANG

1

ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACIDE AMIN

02

2

HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM

13

3

LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY

18

4

XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL,
TRANG 17
PROTEIN TRONG MÁU

23

5

XÉT NGHIỆM HÓA SINH NƯỚC TIỂU

30

BÀI 1

ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACIDE AMIN

I.NỘI DUNG:
1


1/ Phản ứng Ninhydrin
2/ Phản ứng Biuret
3/ Phản ứng tủa protein bởi nhiệt với môi trường acid yếu
4/ Phản ứng tủa protein bởi acid mạnh và không đun nóng
5/ Tìm protein trong nước tiểu.
Chuẩn bị bộ dụng cụ:
Tên dụng cụ
1 - Kẹp ống nghiệm
2 - Giá đựng ống
nghiệm
3 - Ống nhỏ giọt
4 - Ống nghiệm nhỏ
5 - Ống nghiệm trung

6 - Cốc 50 ml
7 - Cốc 100ml
8 - Pipet 1ml
9 - Pipet 2ml
10 - Ông đong 5ml
11 - Ống đong 10ml
12 – Quả bóp cao su

Đơn vị
Cái
Cái

Số lượng
2
1

Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái

3
5
20

2
2
1
1
1
1
1

II. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:
1.THÍ NGHIỆM 1: Phản ứng Ninhydrin
a.Nguyên tắc:
Dung dịch protein, peptid hoặc acid amin khi đun nóng với
Ninhydrin 0.2% sẽ cho màu xanh tím.
Protid
t0
Dung dịch : Peptid
+ Dung dịch Ninhydrin 0,2%
Xanh tím

Acide amin
Ninhydrin là một chất oxy hóa nên có thể tạo nên phản ứng

khử carboxyl oxy hóa của acide amin với H 2O, để cuối cùng cho ra
CO2, NH3 và một aldehyd ngắn đi một carbon so với acide amin
2


gốc và Ninhydrin bị khử. Sau đó, Ninhydrin bị khử, lại tác dụng lại
với NH3 vừa được phóng thích và kết hợp với một phần tử
Ninhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm ngưng kết có màu xanh

tím.

Đây là phản ứng chung cho chác Protid va AA tự do. Phản

ứng này cho phéo nhận dạng tất cả các AA có nhóm NH 2 va COOH
tự do. Ngoại trừ Prolin và OH Prolin tác dụng với Ninhydrin cho
màu vàng.
b. Tiến hành:
Dung dịch

Ống nghiệm 1

Nước cất

1 ml

Dd lòng trắng trứng
Ninhydrin 0,2%

Ống nghiệm 2

1 ml
1 ml

1ml

Đem cả hai ống nghiệm đun cách thủy đến khi có hiện tượng
xảy ra, quan sát và nhận xét:

3



c.Kết quả:
Ống nghiệm 1:Không có hiện tượng, màu dung dịch không
đổi.
Ống nghiệm 2: Dung dịch có màu xanh tím.
d.Giải thích:
Ninhydrin là chất oxy hóa  oxy hóa, acid amin CO2 ,
NH3,aldehyde ngắn hơn và Ninhydrin bị khử. Sau đó Ninhydrin bị
4


khử lại tác dụng với NH3 vừa được tạo ra kết hợp với 1 phân tử
Ninhydrin khác tạo sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím.
2/ THÍ NGHIỆM 2: Phản ứng Biuret ( Xác nhận các liên
kết)
a/ Nguyên tắc:
Protein tác dụng với Cu ++ trong môi trường kiềm tạo phức
chất màu tím hồng, phản ứng xảy ra do các liên kết peptid.
Sở dĩ gọi phản ứng Biuret là do chất Biuret (có nhóm CO –
NH, giống như một liên kết peptid) cũng cho phản ứng tương tự,
tạo phức hợp có màu giống như protein.
b/ Tiến hành:
Dung dịch
+ DD lòng trắng
trứng
+ Nước cất
+ DD NaOH 40%
+ DD CuSO4 1%


Cho vào ống nghiệm:

Ống nghiệm 1
1 ml
0,5 ml
3 giọt

Lắc đều,quan sát màu,nhận xét và giải thích:

5

Ống nghiệm 2
1 ml
0,5 ml
3 giọt


c/Kết quả:
Ống nghiệm 1: Không xảy ra hiện tượng, màu dung dịch có
màu của dd CuSO4 (xanh)
Ống nghiệm 2: Xảy ra hiện tượng dung dịch đổi màu (từ
không màu chuyển sang màu tím hồng khi cho CuSO4 vào ) .
d/Giải thích:
Protein có phản ứng đặc trưng ( xác nhận liên kết peptid )
tạo phức có màu tím hồng đặc trưng với dung dịch CuSO 4.
3/ THÍ NGHIỆM 3: Phản ứng tủa Protein bởi nhiệt với môi
trường acid yếu
1/ Nguyên tắc:
Protein hòa tan trong nước hình thành dung dịch keo, trong
đó các tiểu phân protein tích điện cùng dấu và mang lớp áo

nước( hydrat hóa). Nhờ tích điện cùng dấu nên các tiểu phân

6


protein đẩy nhau và nhờ có lớp áo nước nên chúng ngăn cách
nhau, vì vậy dung dịch keo potein bền vững.
Nếu làm mất 2 yếu tố trên thì các tiểu phân protein do
chuyển động sẽ gặp nhau, dính vào nhau thành những hạt to và
kết tủa.
a/ Làm mất điện tích của protein bằng cách:
Thêm chất điện giải như NaCl, (NH4)2SO4,.....
Hoặc đưa pH của môi trường chứa protein về pH 1 đăng điện
của protein.
Các tiểu phân protein khi đã mất đi điện tích chỉ còn lớp áo
nước thì dễ bị kết tủa nếu làm mất lớp áo nước thì protein sẽ kết
tủa.
b/ Làm mất lớp áo nước của protein, bằng cách:
Thêm chất khử nước vào môi trường chứa protein( ví dụ :
alcohol, aceton, (NH4)2SO4 ....)
Hoặc làm biến tính protein bằng cách đun sôi, thêm acid hay
kiềm mạnh hoặc muối kim loại nặng.
2/ Thuốc thử:
+ Dd acid acetic 1% và 10%
+ Dd NaCl bão hòa
+ Dd NaOH 10%
3/ Tiến hành: Cho vào ống nghiệm:
Dung dịch
Lòng trắng trứng đã thẩm
tích

Acid acetic 1 %

Ống
1
1 ml

Ống
2
1 ml
2 giọt

7

Ống
3
1 ml

Ống
4
1 ml

Ống
5
1 ml


Acid acetic 10 %
NaCl bão hòa
NaOH 10%


5 giọt 5 giọt
2 giọt
2 giọt

Đun sôi cách thủy cả 5 ống,nhận xét,ghi kết quả từng ống có tủa
không,giải thích:

-Ống 1: Dung dịch trắng đục lợn cợn ít, không tủa nhiều vì
các tiểu phân phân tử Protein dù bị mất lớp áo nước bên ngoài
nhưng vẫn còn tích điện.
-Ống 2: Có tủ trắng đục vì khi cho 2 giọt A.acetic 1% vào sẽ
tạo môi trường acid yếu  tiểu phân phân tử Protein mất điện tích,
PH môi trường đạt gần tới điểm đẵng điện PH1 Protein tủa.

8


-Ống 3: Không có tủa, vì khi cho them 5 giọt A.acetic 1% vào
 môi trường acid mạnh  nhiều H+  Protein bị khử nước. Phân tử
Protein vẫn còn tích điện dương nên không tạo kết tủa.
-Ống 4: Có tủa trắng đục, vì khi cho them 5 giọt A.acetic 10%
và 2 giọt NaCl bão hòa vào sẽ tạo ra môi trường trung hòa về điện.
Do đó sẽ tạo tủa.
-Ống 5: Không có tủa, vì khi thêm 2 giọt dung dịch NaOH
10% vào sẽ tạo ra môi trường kiềm. Nhóm NH3 được trung hòa. Khi
đun sôi điện tích âm của tiểu phân Protein vẫn còn. Do đó sẽ
không tạo tủa.
4/ THÍ NGHIỆM 4: Phản ứng tủa bởi acid mạnh và
không đun nóng
a/ Nguyên tắc:

Các acid vô cơ mạnh ( HNO3, H2SO4, HCl, ....) và các acid hữu
cơ (acid Tricloracetic, acid Sulfosalisylic) có tác dụng làm biến tính
và kết tủa đại đa số Protein.
b/ Tiến hành:
+ Acid vô cơ:
-Ống 1: 2ml H2O + 1ml HNO3 (Không lắc)
-Ống 2: 2ml Lòng trắng trứng + 1ml HNO3 (Lắc)
Quan sát hiện tượng:

9


-Ống 1: Không có hiện tượng,dung dịch trong suốt.
-Ống 2: Dung dịch có màu trắng đục.
+ Acid hữu cơ: A.Sulfosalicylic
-Ống 1: 2ml H2O + 1ml A.Sulfosalicylic
-Ống 2: 2ml Lòng trắng trứng + 1ml A.Sulfosalicylic (Lắc)
Quan sát hiện tượng:
10


-Ống 1: Không hiện tượng, dung dịch trong
-Ống 2: Dung dịch có màu trắng đục,lớp dưới ngã mảu vàng.
c/Giải thích:

11


Protein tạo tủa trong môi trường acid yếu tốt hơn môi trường acid
mạnh.

5/ THÍ NGHIỆM 5: Tìm protein trong nước tiểu
a/ Nguyên tắc
Các acid vô cơ mạnh ( HNO3, H2SO4, HCl, ....) và các acid hữu
cơ (acid Tricloracetic, acid Sulfosalisylic) có tác dụng làm biến tính
và kết tủa đại đa số Protein.
b/ Tiến hành:
+ Acid vô cơ: HNO3
-Ống 1: 2ml nước tiểu + 1 ml HNO3
-Ống 2: 2 ml nước tiểu (phòng thí nghiệm) + 1ml HNO3
Quan sát hiện tượng:

12


-Ống 1: Bình thường, không chứa Protein
-Ống 2: Có tách lớp, có chứa Protein
+ Acid hữu cơ: A.Sulfosalicylic 3%
-Ống 1: 2ml nước tiểu + 1ml A.Sulfosalicylic 3%
-Ống 2: 2ml nước tiểu (phòng thí nghiệm) + 1ml
A.Sulfosalicylic 3%
Quan sát hiện tượng:

13


-Ống 1: Không có hiện tượng, không có chứa Protein
-Ống 2: Có hiện tượng vẫn đục, có chứa Protein

BÀI 2


HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM
S.G.O.T (Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase). (AST)
S.G.P.T (Serum Glutamic Pyruvic Transaminase). (ALT)

14


Được tổng hợp từ gan và tim, thuộc nhóm phân hóa tố chuyển
nhóm amin.
Xét nghiệm GOT và GPT giúp ta chẩn đoán, theo dõi các bệnh về
gan, tim.
Phương pháp ENZYMMATIC ( U.V Test)
1. Nguyên tắc:

GOT xảy ra theo phản ứng sau đây:
α . cetoglutarate + L . Aspartate GOT
Oxaloacetac
Oxaloacetac + NaDH + H+
MDH
GPT xảy ra theo phản ứng sau đây:
α . cetoglutarate + L. Alanin
GPT
Pyruvate
Pyruvate + NaDH + H+ MDH

L.Glutamate +
L. Malate + NAD+
L. Glutamate +

L. Lactate + NAD+


2. Mẫu thử: (Kim Cương)

Huyết thanh hay huyết tương( kháng đông Heparine).

3. Thuốc thử:

Dạng KIT pha sẵn, gồm các hóa chất sau đây:
3.1.
Buffer / Substrate (Reagent 1)
Tris buffer pH 7.5
L. Aspartate ( GOT) hoặc L. Alanin ( GPT)
3.2.

4.

Enzym / Coenzym (Reagent 2)
α. Oxoglutarate.

Tiến hành:
GOT

GPT

UU
Reagent
1 1
Reagent

500

500µlµl

Reagent
Reagent
2 2

100µlµl
100

Sample

50 µl
15


Sample

50 µl

Trộn đều – Cho vào máy đo
-

Chọn Test  Chọn AST/ALT  Chọn water blank ( Đo nước cất) 
Chọn Sample (Đo mẫu)

Đọc kết quả: GOT (AST) : 7 UI /lit
GPT (ALT) : 4UI /lit
 Chỉ số nằm trong giới hạn bình thường

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘNG AMYLAZ TRONG NƯỚC TIỂU (PP

WHOLGEMUTH):
1/ Nguyên tắc:
Dùng phương pháp pha loãng dần nước tiểu để tìm lượng enzym
tối thiểu phân hủy hết 2 ml dd hồ tinh bột 1% ở 37 0C trong 30
phút.
Kiểm soát độ phân hủy của hồ tinh bột bằng iode. Tính hoạt độ
của Amylaz theo đơn vị Wholgemuth.
Định nghĩa 1 đơn vị Wholgemuth: là lượng Amylaz có khả năng
thủy phân 1 ml dd hồ tinh bột 1% ở nhiệt đô 37 0C trong 30 phút.
2/ Thuốc thử:
-

Dung dịch NaCl 9%.
Dung dịch iode N/50
Dung dịch hồ tinh bột 1%
3/ Tiến hành:

Lấy 8 ống nghiệm đánh số từ 1 -8
Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dd NaCl 9%.

16


Cho vào ống 1: 1 ml nước tiểu. Tráng ống hút bằng cách hút lên
hút xuống 1-2 lần. Trộn đều.
Hút 1 ml của ống 1 cho sang ống 2. Cũng tráng và trộn như ống
trên
Hút 1 ml ống 2 sang ống 3. Tiếp tục như vậy đến ống 7. Đến ống
7 hút ra 1 ml bỏ đi. Như vậy nước tiểu ở các ông theo thứ tự đã
được pha loãng theo tỉ lệ:

1

2

3

4

5

6

7

8

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml


1ml

1ml

1ml
của
ống
1

1ml
của
ống 2

1ml
của
ống 3

1ml
của
ống
4

1ml
1ml
của
của
ống 5 ống 6

1/2


1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

NaCl
9%

Nước
tiểu

Tỉ lệ

Lấy
ra
1ml
bỏ
-Thêm nhanh vào mỗi ống đúng 2 ml hồ tinh bọt 1%, lắc đều. Để

cách thủy 370C trong 30 phút.
-Lấy ra cho nhanh vào mỗi ống 2-3 giọt dd iode N/50 . Lắc đều.
-Quan sát :

17



-Từ ống 1 đên ống 5 không có màu, Ống 6 có màu xanh nhạt,
ống 7 màu xanh, ống 8 có màu xanh đậm nhất.
-Chọn Ống 5 là ống trung gian để biểu diễn kết quả. Hay
1/32ml nước tiểu sẽ có khả năng thủy phân 2ml dung dịch hồ tinh
bột 1%.
-Vậy 1ml nước tiểu sẽ thủy phân 32 x 2 = 64 ml hồ tinh bột.
 Hoạt động Amylaze theo đơn vị Wohlgemuth là 64
4/ Biện luận:
Bình thường : từ 16 – 32 đơn vị
( Có thể thay đổi từ 8- 64 đơn vị Wholgemuth).
Kết luận:
Hoạt độ Amylaz ở thí nghiệm trên là 64 đơn vị Wholgemuth.
Chưa xuất hiện dấu hiện của bệnh lý.
Ngoài ra, trong viêm tụy cấp, Amylaz niệu có thể tăng quá 200 đv
, đôi khí lên tới 4000 – 5000 đv. Trị sô tối đa vào lúc 12 -24 giờ, sau
18


khi xuất hiện nhũng triệu chứng đầu và trở lại bình thường sau 23 ngày. Vì trị số Amylaz trong nước tiểu rất hay thay đổi , nên nếu
chỉ định lượng trong mẫu nước tiểu thì kết quả sẽ ít chính xác hơn
khi kết hợp với Amylaz huyết thanh.
Trường hợp có suy thận, định lượng Amylaz ( huyết thanh và nước
tiểu) đều không có giá trị chuẩn đoán.
Amylaz giảm chỉ có ý nghĩa rất ít.

19


Bài 3:


LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY
A/ NGUYÊN TẮC:
Lipid thuộc nhóm các hợp chất không tan hoặc ít tan trong
nước và dung môi phân cực, dễ tan trong các dung môi hữu cơ
( không phân cực) như: Cloroform, metanol, benzen, ether,....
Nhũ tương dầu trong nước là một nhũ tương không bền, khi
cho thêm một chất nhũ tương hóa như: xà phòng, muối mật,
protein, ...... sẽ được nhũ tương bền.
Thủy phân chất béo trong môi trường kiềm mạnh như: NaOH,
KOH, đun nóng cho xà phòng và glycerol ( gọi là sự xà phòng hóa).
Lipid đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia cấu tạo các
mô động vật, cung cấp năng lượng cho cơ thể.
Lipid thức ăn đưa vào cơ thể ( chủ yếu là Triglycerid) nhờ các
men tiêu hóa: Lipaz và các men khác được thủy phân để tạo thành
những chất: acid béo, glycerol, sphingozin, cholesterol cùng một
số sản phẩm thủy phân không hoàn thành như mono và diglycerid.
Những sản phẩm trên lại được tổng hợp lại thành Lipid tại tế bào
ruột vào hệ tuần hoàn, phần lớn đi theo đường bạch huyết dưới
dạng kết hợp Lipoprotein – chất này ở máu, dưới tác dụng của men
Lipoprotein lipaz lại được phân hủy thành các sản phẩm glycerol,
acid béo,…… Acid béo được thoái hóa theo con đường β oxy hóa
tạo thành những mẫu acetyl coenzym A. Quá trình này xảy ra chủ
yếu ở gan. Một phần acetyl coenzyme A vào chu trình Krebs tạo
thành CO2 và H2O. Trong điều kiện rối loạn chuyển hóa, acetyl
coenzym A cũng có thể tích tụ lại đẻ tạo thành những sản phẩm
20


acid aceto acetic, acid β hydroxyl butyric và eceton; 3 chất này có

tên chung là Cetonic ( thể Ceton). Sự gia tăng của các chất Ceton
trong máu gây hiện tượng nhiễm acid đồng thời kéo theo sự bài
xuất các chất này qua nước tiểu.
B/ TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:
Thí nghiệm 1: Khảo sát tính hòa tan
Thí nghiệm 3: Sự nhũ tương hóa
Thí nghiệm 4: Tìm thể ceton trong nước tiểu
Thí nghiệm 1: Khảo sát tính hòa tan
Cho vào 2 ống nhiệm:
Ống 1

Ống 2

Dầu ăn
5 giọt
5 giọt
Nước cất
1 ml
0
Alcol 70
1 ml
Lắc kỹ, mạnh trong 5 phút, để yên 15 phút ,quan sát.
*Kết quả:
-Ống 1: Sau khi lắc hỗn hợp đục, sau đó để yên 15 phút  dung
dịch tách lớp.
-Ống 2: Sau khi lắc hỗn hợp đục, sau đó để yên 15 phút ống vẫn
đục như ban đầu.
*Kết luận : Lipid (dầu ăn) không tan trong nước, Lipid tan
trong Alcol
Thí nghiệm 2: Sự nhũ tương hóa

Nhũ tương dầu/ nước là 1 nhũ tương không bền, khi cho thêm
1 chất làm nhũ tương bền hơn như: xà phòng, muối mật, protein,
Na2CO3, lecithin... gọi là chất nhũ hóa.
*Tiến hành:Cho vào 3 ống nghiệm:
21


Nước cất
Dầu ăn 10%
Na2CO3 10%
Xà phòng

Ống 1
10 ml
1 giọt
10 giọt

Ống 2
10 ml
1 giọt

Ống 3
10 ml
1 giọt

10 giọt
Lắc mạnh để yên trong 5 phút

*Nhận xét các ống,giải thích các hiện tượng xảy ra:


*Kết quả:
-Ống 1 và ống 2: Sau khi lắc hỗn hợp đục, sau khi để yên cả
2 ống 1 và 2 đều đục nhưng ống 1 đục nhiều hơn ống 2.
-Ống 3: đầu tiên hỗn hợp đục, sau khi để yên bị tách lớp.
*Kết luận: Dầu ăn không tan trong nước, Na2CO3 là xà
phòng là chất nhũ hóa và xà phòng có tác dụng nhũ hóa mạnh
hơn Na2CO3.

22


Thí nghiệm 3: Tìm thể ceton trong nước tiểu
* Nguyên tắc:
Sodium nitroprussiat tác dụng với chất ceton cho ra phức chất
màu tím, phản ứng này xảy ra trong môi trường kiềm.

OHCeton + Na nitroprussiat

phức chất màu tím

*Thuốc thử:
-

Sodium nitroprussia 10% trong nước – Bảo quản trong tối
nhưng dung dịch này cũng mau chuyển sang màu xanh ve,

-

khi do phải pha lại.
Acid acetic kết tinh.

NH4OH đậm đắc.

*Tiến hành:
Cho vào 2 ống nghiệm :
Ống 1
Nước tiểu

Ống 2

20 giọt

Nước tiểu PTN

20 giọt

Acid acetic đâm đặc

2 giọt

2 giọt

Sodium nitroprussia
10%

2 giọt

2 giọt

1ml


1ml

NH4OH đậm đặc

(Trộn đều, hút 10 giọt NH4OH đậm đặc, nghiêng ống nghiêm 450 ;
nhỏ cẩn thận theo thành ống. Quan sát sau vài phút.)

23


*Kết quả:

-Cả 2 ống đều có hiện tượng tách lớp
-Ống 1: Không có vòng tím ở mặt phân cách  trong mẫu
không có ceton
-Ống 2: Có vòng tím xuất hiện ở mặt phân cách của 2 dung
dịch  trong mẫu có ceton
*Giải thích:
Ống 2 có màu tím ở mặt phân cách do trong mẫu có ceton và
ceton sẽ tạo phức có màu tím với Sodium nitroprussia 10% trong
môi trường kiềm ( vai trò của NH4OH)
24


BÀI 4:

XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL,
PROTEIN TRONG MÁU
CHUẨN BỊ DỤNG CỤ:
Dụng cụ


Số
lượng
6 ống
1 cái
1 cái
2 cái
1 cái
2 cái
2 cái

Ống nghiệm nhỏ
Giá ống nghiệm
Micropipet 100-1000 µl
Micropipet 10-100 µl
Máy quang phổ kế
Cốc 50 ml
Cốc 100 ml
NỘI DUNG TIẾN HÀNH:

+ Định lượng glucose trong máu
+ Đinh lượng cholesterol trong máu
+ Định lượng protein trong máu
A/ ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG MÁU
-Glucose có nguồn gốc từ thức ăn hoặc được tân tạo từ các acid
amin và các sản phẩm thoái hóa của Lipid do gan đảm nhiệm tổng
hợp.
-Mục đích của xét nghiệm Glucose giúp ta chẩn đoán và theo dõi
bệnh tiểu đường.
I/ Nguyên tắc:


25