BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA GÂY BỆNH TRÊN CÂY SẮN
(Manihot esculenta Crantz) BẰNG KỸ THUẬT
SINH HỌC PHÂN TỬ

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRỊNH XUÂN THẢO

Niên khóa

: 2006 - 2010

Tháng 07/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA GÂY BỆNH TRÊN CÂY SẮN
(Manihot esculenta Crantz) BẰNG KỸ THUẬT

SINH HỌC PHÂN TỬ

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

ThS. HUỲNH KIM HƯNG

TRỊNH XUÂN THẢO

Tp. Hồ Chí Minh,
Tháng 07/2010


LỜI CẢM ƠN
Thành kính khắc ghi công ơn Cha Mẹ đã sinh thành và dưỡng dục để cho con
có được như ngày hôm nay.
Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin chân thành cám ơn sâu sắc đến
cô HUỲNH KIM HƯNG, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường, trường
Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Người đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn và giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cám ơn:
™ Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
™ Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Quý thầy (cô) trong Bộ môn
Công nghệ Sinh học và trong trường đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý
báu trong thời gian học tập tại trường.
™ Anh Nguyễn Minh Nam, anh Nguyễn Văn Lẫm, các anh chị và các bạn cùng
làm đề tài tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường là những
người đã tận tình giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian làm đề tài.
™ Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường, Đại học Nông Lâm Tp.

Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa
qua.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn tất cả các bạn trong lớp DH06SH và bạn bè gần xa đã
động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07/2010

Trịnh Xuân Thảo

i


TÓM TẮT
Hiện nay, ở nước ta, cây sắn đang bị một loại tác nhân lạ gây bệnh, làm hư hại
hàng ngàn hecta, làm giảm năng suất và chất lượng sắn. Cây sắn bị bệnh có các triệu
chứng như tăng nhanh số lượng chồi nách gây hiện tượng chổi phù thủy, sự kéo dài
khác thường của gióng làm cho chồi mảnh khảnh, không phát triển được như bình
thường (hoa nhỏ, lá và gióng bị rút ngắn lại), sự bạc màu của lá hoặc mọc nhiều chồi,
lá cuộn lại hoặc khum hình cái chén, xuất hiện cụm chồi ở cuối thân cây và ở cây xuất
hiện các suy giảm thông thường (bị còi cọc, chết ngọn chồi, vàng trái mùa, hồng hồng
hoặc đỏ mặt ngoài của lá) v.v. Tác nhân gây bệnh được cho là do phytopasma.
Chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình phản ứng PCR phát hiện phytoplasma
gây bệnh trên sắn, từ đó có biện pháp để phòng bệnh và ngăn chặn thiệt hại do mầm
bệnh gây ra. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:
+ Thành phần phản ứng bao gồm: 2 mM MgCl2; 200 µM mỗi loại dNTP
(dATP, dCTP, dTTP, dGTP); 2,5 U đơn vị Taq polymerase; dung dịch đệm cho phản
ứng PCR 1X; 25 pmol mỗi loại mồi (P1, P7, R16F2n, R16R2); 20 ng DNA, nước khử
ion cho đủ thể tích 50 µl.
+ Chu trình nhiệt: biến tính DNA khuôn ở 94oC trong 3 phút; tiếp theo thực
hiện 38 chu kỳ mỗi chu kỳ gồm 3 bước: biến tính ở 94oC trong 1 phút, gắn mồi ở 55oC

trong 2 phút, kéo dài chuỗi ở 72oC trong 3 phút; phản ứng kết thúc ở 72oC trong 7 phút
và ủ mẫu ở 4oC.
Với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như trên, nhìn chung thì quy trình
đã ổn định, có thể phát hiện được phytoplasma gây bệnh trên cây sắn với sản phẩm là
đoạn DNA có kích thước tương đương 1,2 kb.

ii


SUMMARY
Topic: “Detecting Phytoplasma caused disease on cassava (Manihot esculenta Crantz)
by molecular technologies”.
Cassava have currently been affected by an strange agent, making thousand of
hectare of Cassava decay, reducing the cassava productivity and quality. The
symptoms in diseased cassava are such as the proliferation axillary shoots resulting in
a witches’-broom appearance, abnormal elongations of interodes resulting in slender
shoots, generalized stunting (small flowers and leaves and shortened internodes),
discolouration of leaves or shoots, leaf curling or cupping, bunchy appearance of
growth of the ends of the stems and generalized decline (stunting, dieback of shoots
and unseasonal yellowing, pinkish or reddening of the leaves) v.v. Phytoplasma is
believed to be agent causing the disease.
We build Polymerase Chain Reaction procedue detecting phytoplasma which cause
disease on Cassava so that we offer preventive methods. PCR component and cycling
condition as follow:
+ PCR condition: PCR was performed in a volume of 50 µl using 20 ng of DNA,
25 pmoles of each primer, 1X PCR buffer, 200 µM of each of the four
deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2,5 units of Taq
polymerase.
+ PCR cycling condition: denaturation at 94oC for 3 min; followed by 38 cycles at
94oC for 1 min, 55oC for 2 min, 72oC for 3 min, and one additional extension run at

72oC for 7 min.
With PCR component and cycling condition above, the process is stable in general,
enable to dectect phytoplasma causing disease on Cassava with product is DNA
fragment size equal to 1,2 kb.
Keywords: phytoplasma, disease, Cassava, PCR.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích và yêu cầu ................................................................................................. 2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................ 2
1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Sắn ............................................................................................................................ 3
2.1.1. Phân loại ................................................................................................................ 3
2.1.2. Đặc điểm thực vật ................................................................................................. 3
2.1.3. Nguồn gốc.............................................................................................................. 4
2.1.4. Vùng phân bố và lịch sử phát triển ........................................................................ 4
2.1.5.1. Sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới ................................................................. 5
2.1.5.2. Sản xuất và tiêu thụ sắn tại Việt Nam ................................................................ 6

2.1.6. Vị trí kinh tế của cây sắn ....................................................................................... 7
2.1.6.1. Giá trị sử dụng .................................................................................................... 7
2.1.6.2. Thành phần dinh dưỡng ...................................................................................... 7
2.1.6.3. Lợi ích của nghề sắn ........................................................................................... 8
2.1.6.4. Nhược điểm của nghề sắn .................................................................................. 8
2.1.6.5. Giải pháp phát triển sắn bền vững ...................................................................... 8
2.1.7. Một số bệnh thường gặp trên cây sắn .................................................................... 8
2.1.7.1. Bệnh vết nâu trên lá sắn (Mycosphaerella manihotis (sid.) Sacc) ..................... 8
2.1.7.2. Bệnh vết loét đen trên cành (Glomerella manihotis Chevals) ........................... 9
2.1.7.3. Bệnh chấm trắng trên lá (Corynespora manihotis (Stev.et Solh) Solh) ............. 9
iv


2.1.7.4. Bệnh thối rễ (Phaeolus manihotis Heim) ........................................................... 9
2.1.7.5. Bệnh gỉ sắt (Uromices manihotis Henn) ..........................................................10
2.1.7.6. Bệnh khảm lá phổ biến (virus) .........................................................................10
2.1.7.7. Bệnh bướu rễ (tuyến trùng Meloidogyne sp.) ...................................................10
2.1.7.8. Bệnh thối củ sau thu hoạch (nấm Mucor mucedo và Rhizopus nigricans) ......10
2.1.7.9. Bệnh thán thư (nấm Colletotricum gloeosporiodes) ........................................11
2.1.7.10. Bệnh do phytoplasma .....................................................................................11
2.2. Kỹ thuật PCR ..........................................................................................................11
2.2.1. Giới thiệu sơ lược về PCR ...................................................................................11
2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR ..............................................13
2.2.3. Các thành phần khác trong phản ứng PCR..........................................................14
2.2.4. Số lượng chu kỳ phản ứng ...................................................................................14
2.2.5. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng .......................................................................15
2.2.6. Các ứng dụng của phương pháp PCR .................................................................15
2.2.7. Những hạn chế của phương pháp PCR ...............................................................18
2.2.8. Các sai sót gây ra do Taq polymerase .................................................................19
2.2.9. Kỹ thuật nested PCR ...........................................................................................20

2.3. Phytoplasma và bệnh chổi rồng trên cây sắn .........................................................20
2.3.1. Bệnh chổi rồng do phytoplasma (witches’ broom) .............................................20
2.3.2. Phytoplasma ........................................................................................................21
2.3.2.1. Phân loại ...........................................................................................................21
2.3.2.2. Triệu chứng bệnh ..............................................................................................22
2.3.2.3. Sự truyền và lan rộng của bệnh phytoplasma...................................................22
2.3.2.4. Hình thái và siêu cấu trúc .................................................................................22
2.3.2.5. Tần số phân bố của phytoplasma .....................................................................23
2.3.5.6. Ảnh hưởng của phytoplasma tới sự phát triển của nền kinh tế ........................23
2.3.2.7. Các kỹ thuật phát hiện phytoplasma.................................................................24
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................25
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm ...........................................................25
3.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................25
3.2.1. Ly trích DNA từ mẫu lá sắn ................................................................................25
3.2.2. Xây dựng phản ứng nested PCR phát hiện phytoplasma ....................................25
v


3.3. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................25
3.3.1. Vật liệu ................................................................................................................25
3.3.2. Cặp mồi sử dụng ..................................................................................................26
3.3.3.1. Hóa chất ly trích DNA, điện di và kít ly trích tế bào thực vật .........................26
3.3.3.2. Hóa chất PCR ...................................................................................................26
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ ..............................................................................................27
3.4. Phương pháp tiến hành ...........................................................................................27
3.4.1. Quy trình ly trích DNA........................................................................................27
3.4.2. Phản ứng PCR .....................................................................................................28
3.4.2.1. Phản ứng PCR với cặp mồi P1 và P7 ...............................................................28
3.4.2.2. Phản ứng PCR với cặp mồi R16F2n và R16R2 ...............................................28
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................30

4.1. Mẫu sắn thu thập ở huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai ....................................................30
4.2. Kết quả ly trích DNA từ lá sắn ...............................................................................30
4.3. Kết quả phản ứng PCR ...........................................................................................31
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................32
5.1. Kết luận...................................................................................................................32
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................33

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µg

: Micro gam

µM

: Micro mol/lít

µm

: Micrometer

BVTV

: Bảo vệ thực vật

cDNA


: complementary DNA

CIAT

: Concurrent Information Access Technologies

cm

: Centimeter

Ctv

: Cộng tác viên

DNA

: deoxyribonucleic acid

dNTP

: Deoxyribonucleotide – 5- triphosphate

dTTP

: Thymidine triphosphate

EF - Tu (Tuf)

: Elongation factor Tu (tuf gene)


FAO

: Food and Agriculture Organization

ha

: Hecta

HCN

: Hidro xianua

IFPRI

: The International Food Policy Research Institute

Kb

: Kilo base

Kg

: Kilogam

m

: mete

mm


: Milimeter

nm

: Nano meter

nPCR

: Nested PCR

ng

: Nano gam

PCR

: Polymerase Chain Reaction

pm

: Picro mole

rDNA

: Ribosomal DNA

RNA

: ribonucleic acid


rRNA

: Ribosomal RNA

TBE

: Tris Borate EDTA
vii


Tm

: Melting temperature

TTTA

: Ted Tokio Tanaka Architects

THR

: Thyroid Hormone Redeptor

U

: Unit

UV

: Ultra violet


viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây sắn chụp ở huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai. .................................................. 3
Hình 2.2 Sản xuất sắn ở các nước trên thế giới năm 2006. ............................................ 5
Hình 2.3 Các bước trong quy trình PCR.......................................................................12
Hình 3.1 Mẫu cây sắn thu thập từ huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai. ..................................26
Hình 4.1 Mẫu cây sắn bị bệnh được thu thập ở huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai...............30
Hình 4.2 Kết quả ly trích DNA. ....................................................................................30
Hình 4.3 Kết quả khuếch đại vùng 16S-23S rDNA......................................................31

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Trình tự 2 cặp mồi P1/P7 và R16F2n/R16R2 ...............................................26
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi P1/P7 .............................................28
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi R16F2n/R16R2 .............................28

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những thập kỷ gần đây, nông nghiệp Việt Nam có bước phát triển mạnh mẽ
và đạt được những thành tựu đáng kể về năng suất, sản lượng, chủng loại và quy mô
sản xuất v.v, đã tạo ra một khối lượng sản phẩm nông nghiệp rất lớn đảm bảo tiêu
dùng trong nước và xuất khẩu. Trong số những cây công nghiệp chủ lực của nước ta,
sắn đóng một vai trò quan trọng trong đời sống kinh tế xã hội và là loại lương thực
đứng thứ hai sau gạo. Cây sắn được trồng ở nhiều nơi và trên nhiều loại đất khác nhau
nhưng phổ biến là các vùng trung du, miền núi, và thường tập trung chủ yếu ở các nơi:
miền Nam tập trung nhiều ở Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai và Bình Thuận; miền

Trung tập trung ở Đắc Lắc, Gia Lai, Bình Định, Quảng Nam, Quảng Ngãi; miền Bắc
tập trung tại Phú Thọ. Tính đến hết năm 2006, sản lượng sắn của cả nước là 7.714.000
tấn với tổng diện tích đất trồng sắn là 474.800 ha. Cây sắn có khả năng chịu hạn tốt,
cách thức trồng đơn giản, thích hợp với nhiều loại khí hậu, có năng suất cao hơn so với
nhiều loại cây trồng khác và có thể trồng trên nhiều loại đất (Hoàng Kim, 2008).
Sắn là cây trồng có tiềm năng đem lại nguồn thu đáng kể. Cây sắn Việt Nam hiện
là cây lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, chế biến tinh bột xuất khẩu và làm
nhiên liệu sinh học. Việt Nam đã trở thành nước xuất khẩu tinh bột sắn và sắn lát đứng
thứ hai trên thế giới sau Thái Lan. Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh
bột sắn đã đi vào hoạt động, với tổng công suất chế biến khoảng 800.000 – 1.200.000
tấn tinh bột sắn mỗi năm (Hoàng Kim và ctv, 2008). Các sản phẩm chế biến từ sắn là
một thành phần quan trọng đối với ngành lương thực và dệt may. Tại Việt Nam, việc
trồng sắn đã mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho nhiều hộ gia đình. Tại vùng nhiệt
đới, cây sắn là nguồn năng lượng quan trọng đứng hàng thứ ba sau gạo và bắp.
Tuy nhiên cây sắn đang bị sâu bệnh và dịch bệnh gây hại nghiêm trọng. Loại bệnh
phổ biến nhất có ảnh hưởng tới cây sắn là bệnh sọc nâu cây sắn và bệnh khảm cây sắn.
Và hiện nay, cây sắn đang bị một tác nhân lạ gây bệnh làm hư hại hàng ngàn hecta,
gây thiệt hại hàng chục tỉ đồng cho nhân dân ở các tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi,
Kon Tum v.v. Hiện chưa có những nghiên cứu chính thức xác định tác nhân gây bệnh

1


trên cây sắn nên khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị. Theo đánh giá của các nhà
chuyên môn trong lĩnh vực BVTV thì tác nhân gây bệnh lạ trên cây sắn là
phytoplasma.
Vấn đề đặt ra là tìm kiếm phương pháp có thể phát hiện nhanh và chính xác tác
nhân gây bệnh trên sắn, từ đó có biện pháp phòng bệnh và ngăn chặn thiệt hại do mầm
bệnh gây ra.
Trên tinh thần tìm hiểu về kỹ thuật sinh học phân tử, cũng như nhận thấy khả năng

ứng dụng thực tiễn cao của nghiên cứu này chúng tôi thực hiện đề tài: “Phát hiện
phytoplasma gây bệnh trên cây sắn (Manihot esculenta Crantz) bằng kỹ thuật
sinh học phân tử ”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xây dựng quy trình PCR phát hiện phytoplasma gây bệnh trên cây sắn.
1.2.2. Yêu cầu
Thu thập mẫu bệnh từ đồng ruộng.
Ly trích được DNA của phytoplasma từ mẫu sắn.
Thiết lập được quy trình phản ứng PCR.
Giải trình tự sản phẩm PCR.
1.3. Nội dung thực hiện
Ly trích DNA từ mẫu mô và gân lá sắn.
Thực hiện phản ứng Nested PCR.
1.4. Giới hạn của đề tài
Đề tài được thực hiện từ 26/01/2010 tới ngày 30/06/2010.
Chỉ thực hiện được trên một số mẫu.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sắn
2.1.1. Phân loại (nguồn www.vi.wikipedia.org/wiki/san)
Cây sắn thuộc:
Giới (kingdom): Plantae
Ngành (division): Magnoliophyta
Lớp (class): Magnoliopsida
Bộ (order): Malpighiales
Họ (family): Euphorbiaceae

Họ phụ (subfamily): Crotonoideae
Nhóm (tribe): Manihoteae
Chi (genus): Manihot
Loài (species): M. esculenta

Hình 2.1 Cây sắn chụp ở huyện Vĩnh
Cửu, Đồng Nai.

2.1.2. Đặc điểm thực vật
Thân: thuộc loại cây gỗ cao từ 2 đến 3 m, giữa thân có lõi trắng và xốp nên rất
yếu.
Lá: thuộc loại lá phân thùy sâu, có gân lá nổi rõ ở mặt sau, thuộc loại lá đơn
mọc xen kẽ, xếp trên thân theo chiều xoắn ốc. Cuống lá dài từ 9 đến 20 cm có màu
xanh, tím hoặc xanh điểm tím.
Hoa: là hoa đơn tính có hoa đực và hoa cái trên cùng một chùm hoa. Hoa cái
không nhiều, mọc ở phía dưới cụm hoa và nở trước hoa đực nên cây luôn luôn được
thụ phấn của cây khác nhờ gió và côn trùng.
Quả: là loại quả nang, có màu nâu nhạt đến đỏ tía, có hình lục giác, chia thành
ba ngăn, mỗi ngăn có một hạt, khi chín, quả tự khai.
Rễ: mọc từ mắt và mô sẹo của hom, lúc đầu mọc ngang sau đó cắm sâu xuống
đất. Theo thời gian chúng phình to ra và tích lũy bột thành củ.

3


Củ: củ sắn có hai đầu nhọn, chiều dài biến động từ 25 - 200 cm, trung bình
khoảng 40 - 50 cm. Đuờng kính củ thay đổi từ 2 - 25 cm, trung bình 5 - 7 cm. Nhìn
chung, kích thước cũng như trọng lượng củ thay đổi theo giống, điều kiện canh tác và
độ màu mỡ của đất (Đinh Thế Lộc và ctv, 1997).
2.1.3. Nguồn gốc

Theo trích dẫn của Hoàng Kim, Phạm Văn Biên (1995) cây sắn có nguồn gốc ở
vùng nhiệt đới châu Mỹ Latinh và đã được trồng cách đây khoảng 5.000 năm. Trung
tâm phát sinh cây sắn được giả thiết là tại vùng Đông Bắc của nước Brazin thuộc lưu
vực sông Amazon, nơi có nhiều chủng loại sắn trồng và hoang dại (De Candolle, 1886;
Rogers, 1965). Nguồn gốc cây sắn cũng có thể tại Mexico ở Trung Mỹ và vùng ven
biển phía bắc của Nam Mỹ. Bằng chứng về nguồn gốc sắn trồng là những di tích khảo
cổ ở Venezuela niên đại 2.700 năm trước Công nguyên, di vật thể hiện củ sắn ở vùng
ven biển Peru khoảng 2.000 năm trước Công nguyên, những lò nướng bánh sắn trong
phức hệ Malabo ở phía bắc Colombia niên đại khoảng 1.200 năm trước Công nguyên,
những hạt tinh bột trong phân hóa thạch được phát hiện tại Mexico có tuổi từ năm 900
đến năm 200 trước Công nguyên (Rogers, 1965).
2.1.4. Vùng phân bố và lịch sử phát triển
Hiện tại, sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và là
nguồn thực phẩm của hơn 500 triệu người.
Sắn được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở 30OB – 30ON (Hình 2.2). Cây
sắn được người Bồ Đào Nha đưa đến Congo (châu Phi) khoảng thế kỷ 16. Ở châu Á,
sắn được nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ 17 và SriLanka đầu thế kỷ 18 (W.M.S.M
Bandara và M Sikurajapathy, 1992).
Ở Việt Nam cây sắn được đưa vào trồng khoảng giữa thế kỷ 18 nhưng hiện chưa
có tài liệu chắc chắn về nơi trồng và năm trồng đầu tiên (Hoàng Kim, Phạm Văn Biên,
1996). Sắn được canh tác phổ biến tại hầu hết các tỉnh của Việt Nam từ Bắc đến Nam.
Diện tích sắn trồng nhiều nhất ở vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi và
trung du phía bắc, vùng ven biển nam Trung Bộ và vùng ven biển bắc Trung Bộ.
Sắn được nhập vào Trung Quốc, Myanmar và các nước châu Á khác khoảng cuối
thế kỷ 18, đầu thế kỷ 19 (Fang Baiping, 1992; U Thun Than, 1992).

4


Hình 2.2 Sản xuất sắn ở các nước trên thế giới năm 2006 (Nguồn: FAO, 2006).


2.1.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới và ở Việt Nam
2.1.5.1. Sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới
Sản lượng sắn thế giới tháng 07/2006 đạt 226,34 triệu tấn củ tươi so với
06/2005 là 211,26 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn. Nước có sản lượng sắn nhiều
nhất thế giới là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và
Indonesia (19,92 triệu tấn). Việt Nam đứng thứ mười trên thế giới về sản lượng sắn
(7,71 triệu tấn). Nước có năng suất sắn cao nhất hiện nay là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế
đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là
12,16 tấn/ha (FAO, 2008).
Trên thế giới, sắn được trồng bởi những hộ nông dân sản xuất nhỏ để làm
lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc và để bán. Mức tiêu thụ sắn bình quân toàn thế
giới khoảng 18 kg/người/năm. Sản lượng sắn của thế giới được tiêu dùng trong nước
khoảng 85% (lương thực 58%, thức ăn gia súc 28%, chế biến công nghiệp 3%, hao hụt
11 %), còn lại 15% (gần 30 triệu tấn) được xuất khẩu dưới dạng sắn lát khô, sắn viên
và tinh bột (CIAT, 1993). Nhu cầu sắn làm thức ăn gia súc trên toàn cầu đang giữ mức
độ ổn định trong năm 2006 (FAO, 2007). Sắn chủ yếu trồng trên đất nghèo dinh dưỡng
và dùng kỹ thuật canh tác truyền thống.

5


Năm 2005, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,03 triệu tấn tinh bột, bột sắn và 3,03
triệu tấn sắn lát, sắn viên. Năm 2006, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,15 triệu tấn tinh bột,
bột sắn và 3,40 triệu tấn sắn lát và sắn viên. Thái Lan chiếm trên 85 % lượng xuất
khẩu sắn toàn cầu, kế đến là Indonesia và Việt Nam (FAO, 2007).
Trên thế giới (2006), sắn được bán với giá cao đối với cả bột, tinh bột và sắn
lát. Việc xuất khẩu sắn làm thức ăn gia súc sang các nước châu Âu hiện đã giảm sút
nhưng giá sắn năm 2006 vẫn được duy trì ở mức cao do có thị trường lớn tại Trung
Quốc và Nhật Bản (FAO, 2007).

Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI), đã tính toán nhiều
mặt và dự báo tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn toàn cầu đến năm 2020. Năm 2020,
sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,10 triệu tấn, trong đó sản xuất sắn chủ yếu ở các
nước đang phát triển là 274,70 triệu tấn, các nước đã phát triển khoảng 0,40 triệu tấn.
Mức tiêu thụ sắn ở các nước đang phát triển dự báo đạt 254,60 triệu tấn so với các
nước đã phát triển là 20,50 triệu tấn. Khối lượng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm
lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu là 176,30 triệu tấn và thức ăn gia súc 53,40
triệu tấn. Tốc độ tăng hàng năm của nhu cầu sử dụng sản phẩm sắn làm lương thực,
thực phẩm và thức ăn gia súc đạt tương ứng là 1,98 % và 0,95 %. Châu Phi vẫn là khu
vực dẫn đầu sản lượng sắn toàn cầu với dự báo sản lượng năm 2020 sẽ đạt 168,60 triệu
tấn (Hoàng Kim, 2008).
2.1.5.2. Sản xuất và tiêu thụ sắn tại Việt Nam
Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và ngô.
Năm 2005, cây sắn có diện tích thu hoạch 432 nghìn ha, năng suất 15,35 tấn/ha,
sản lượng 6,60 triệu tấn (FAO, 2007). Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các
hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều
kiện kinh tế nông hộ. Sắn chủ yếu dùng để bán (48,60 %) kế đến dùng làm thức ăn gia
súc (22,40 %), chế biến thủ công (16,80 %), chỉ có 12,20 % dùng tiêu thụ tươi.
Sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước. Sắn là
nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, bio - ethanol, mì ăn liền, bánh kẹo, nước
giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất giữ ẩm cho
đất. Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công suất
khoảng 3,80 triệu tấn củ tươi/năm và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ công rãi rác tại hầu
hết các tỉnh trồng sắn. Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.000 – 1.200.000
6


tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70 % xuất khẩu và gần 30 % tiêu thụ trong nước. Sản
phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là tinh bột, sắn lát và bột sắn. Thị trường
chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapore, Hàn Quốc.

Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam. Chính
phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô và coi trọng việc sản xuất sắn,
khoai lang ở những vùng, những địa phương có điều kiện phát triển. Diện tích sắn của
Việt Nam dự kiến ổn định khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng
sắn bằng cách chọn, tạo và phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm
lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền vững và
thích hợp vùng sinh thái.
2.1.6. Vị trí kinh tế của cây sắn
2.1.6.1. Giá trị sử dụng
Sắn là cây trồng có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia
súc và lương thực thực phẩm. Củ sắn được dùng để chế biến tinh bột, sắn lát khô, bột
sắn nghiền hoặc dùng để ăn tươi. Từ sắn củ tươi hoặc từ các sản phẩm sắn sơ chế tạo
thành hàng loạt các sản phẩm công nghiệp như bột ngọt, rượu, cồn, mì ăn liền, bánh
kẹo, mạch nha, kỹ nghệ chất dính (hồ vải, dán gỗ), bún, miến, mì ống, mì sợi, bánh
tráng, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, phụ gia dược phẩm. Củ sắn cũng là
nguồn nguyên liệu chính để làm thức ăn gia súc. Thân sắn dùng để làm giống, nguyên
liệu cho công nghiệp cellulose, làm nấm, làm củi đun. Lá sắn non dùng làm rau xanh
giàu đạm cho gia súc. Lá sắn dùng trực tiếp để nuôi tằm, nuôi cá. Bột lá sắn hoặc lá
sắn ủ chua dùng để nuôi lợn, gà, trâu, bò, dê v.v. Hiện tại, sản phẩm sắn ngày càng
thông dụng trong buôn bán, trao đổi thương mại quốc tế (P.Silvestre, M.Arraudeau,
1991).
2.1.6.2. Thành phần dinh dưỡng
Củ sắn tươi có tỷ lệ chất khô 38 – 40 %, tinh bột 16 – 32 %, giàu vitamin C,
calcium, vitamin B và các chất khoáng, nghèo chất béo, muối khoáng. Trong củ sắn,
hàm lượng các acid amin không được cân đối, thừa arginin nhưng lại thiếu các acid
amin chứa lưu huỳnh. Thành phần dinh dưỡng khác biệt tùy giống, vụ trồng, số tháng
thu hoạch sau khi trồng. Trong cây sắn ngoài các chất dinh dưỡng, cũng chứa một
lượng độc tố axit Cianhydric (HCN), là một loại sản phẩm trung gian trong quá trình

7



tổng hợp protein và là sản phẩm phụ trong quá trình trao đổi đạm. Các giống sắn ngọt
có 80 - 110 mg HCN/ 1kg lá tươi. Các giống sắn đắng chứa 160 - 240 mg HCN/ 1kg lá
tươi (Đinh Thế Lộc và ctv, 1997).
2.1.6.3. Lợi ích của nghề sắn
Sắn dễ trồng, hợp với nhiều loại đất, vốn đầu tư thấp, phù hợp với khả năng kinh tế
của các hộ gia đình nông dân nghèo, tận dụng đất để lấy ngắn nuôi dài.
2.1.6.4. Nhược điểm của nghề sắn
- Trồng sắn làm cạn kiệt đất.
- Củ sắn nghèo đạm và vitamin, có độc tố HCN trong sắn củ tươi.
- Chế biến sắn gây ô nhiễm môi trường.
2.1.6.5. Giải pháp phát triển sắn bền vững
- Áp dụng giống mới và kỹ thuật canh tác sắn bền vững để đạt năng suất lợi
nhuận cao và duy trì độ phì nhiêu của đất.
- Áp dụng kỹ thuật chế biến và phối hợp thực phẩm để nâng cao giá trị dinh
dưỡng của các sản phẩm sắn.
- Ứng dụng dây chuyền công nghệ chế biến sắn hiện đại, tận dụng phế phụ
phẩm để làm thức ăn gia súc, phân bón, thường xuyên đánh giá tác động môi trường.
- Quy hoạch sản xuất, chế biến và tiêu thụ sắn.
- Mở rộng thị trường tiêu thụ các sản phẩm sắn.
- Hình thành và phát triển chương trình sắn Việt Nam để liên kết mạng lưới
hợp tác nghiên cứu, giảng dạy, khuyến nông, quản lý, đầu tư, sản xuất, kinh doanh,
chế biến và tiêu thụ sắn.
2.1.7. Một số bệnh thường gặp trên cây sắn
Theo Mai Thạch Hoành, Nguyễn Công Vinh (2003), một số bệnh thường gặp trên cây
sắn là:
2.1.7.1. Bệnh vết nâu trên lá sắn (Mycosphaerella manihotis (sid.) Sacc)
Trên lá xuất hiện các chấm bệnh rải rác, ban đầu màu xanh nhạt, đường kính
vào khoảng 5 - 6 mm, thường là hình tròn hoặc đa giác không đều, nằm ở giữa các

gân lá hoặc ở rìa lá, thường vết bệnh ít lớn lên và đạt mức cao nhất có đường kính 10 15 mm. Về sau vết bệnh khô đi có màu nâu hoặc màu nâu đỏ, mặt dưới lá vết bệnh
màu nhạt hơn hoặc hơi xám vào giai đoạn nấm hình thành bào tử. Chung quanh vết
bệnh có đường viền màu nâu đậm, nhưng ở phía ngoài không có vùng tế bào mất màu.
8


Ở mặt dưới vết bệnh (củng có cả ở mặt trên, nhưng ít hơn) xuất hiện nhiều chấm đen
hoặc nâu đậm, đó là các ổ bào tử của nấm, hoặc phần mô bào lá vết bệnh bị khô và
rụng đi làm cho phiến lá bị thủng lỗ. Sợi nấm phát triển trong nhu mô lá, mọc tương
đối sâu, xuyên qua các tế bào.
2.1.7.2. Bệnh vết loét đen trên cành (Glomerella manihotis Chevals)
Triệu chứng bệnh thường xuất hiện ở cuối cành đang sinh trưởng, thường là ở
bộ phận không có lông. Bộ phận bị bệnh có màu nâu. Vết nâu thường dài khoảng 1520 cm bắt đầu từ ngọn. về sau bộ phận bị bệnh khô, mô bào tách ra, nhăn nheo và cuối
cùng có màu đen, lá rụng. Vết bệnh lan ra phía ngọn làm cho mầm ở ngọn bị chết và
lan rộng vào phía trong thân. Ở phía thân, vết bệnh có một đường viền màu đậm hoặc
đỏ giới hạn phần mô bào bị chết. Ở một số nơi triệu chứng bệnh là các vết trên lá. Vết
bệnh tròn, nhỏ, hoặc kéo dài, màu nhạt, gặp điều kiện khí hậu ẩm vết bệnh lớn lên rất
nhanh và chiếm phần lớn phiến lá. Ở chỗ vết bệnh nhu mô bị héo khô.
2.1.7.3. Bệnh chấm trắng trên lá (Corynespora manihotis (Stev.et Solh) Solh)
Bệnh biểu hiện dưới dạng các chấm ở rải rác trên lá, phần lớn là hình tròn, có
khi hình bất kỳ, hoặc có góc, ranh giới rõ, lúc đầu có đường kính là 0,5 - 1,5 mm. Lúc
mới hình thành, vết bệnh có màu nâu đều đặn, ở giữa màu nhạt dần, trở thành vàng,
hơi xám hoặc trắng hoàn toàn, nhưng luôn luôn có một đường viền màu nâu rộng 0,5
mm. So với bệnh vết nâu, chấm trắng thường bé hơn và trên một lá nhiều vết hơn. Sợi
nấm phát triển trong nhu mô, không màu hoặc nhuộm màu nhạt, chỗ to, chỗ nhỏ
(đường kính 2 - 5 µm). Bệnh thường phát triển mạnh trên cây bị suy yếu và trong mùa
mưa.
2.1.7.4. Bệnh thối rễ (Phaeolus manihotis Heim)
Rễ bị nấm xâm nhập phát triển không bình thường. Sợi nấm quấn quanh làm
cho rễ bị ngạt và thối. Sợi nấm không màu, phát triển rất nhiều trong rễ sắn, chủ yếu là

trong các bó mạch dẫn. Sợi nấm tạo thành các vòng chung quanh rễ và lan lên đến
mặt đất ở bộ phận cổ rễ và gốc thân. Bộ phận sinh sản của nấm được hình thành ở
gốc thân, thành từng đám xốp, màu vàng da cam hay vàng nhạt. Hình dáng chủ yếu là
hình nấm, tuy vậy hình dáng thay đổi nhiều, đa dạng, đường kính có khi tới 40 cm và
chiều dày đạt 10 – 15 cm, cao 12 - 15 cm. Bào tử không màu, hình bầu dục, có một
giọt dầu, kích thước 5,5 - 7 x 3,2 - 3,4 µm. Phần lớn nấm xâm nhập và gây hại cho
những cây sắn bị suy yếu, thường là qua các vết thương và gây ra hiện tượng thối rễ.
9


2.1.7.5. Bệnh gỉ sắt (Uromices manihotis Henn)
Triệu chứng bệnh biểu hiện ở tất cả các các bộ phận trên mặt đất của sắn: cành,
lá, hoa, quả. Bệnh làm cho các bộ phận của cây bị biến dạng ở các mức độ khác nhau,
chủ yếu là các lá còn non. Lá bị bệnh nhăn nheo, phiến lá có nhiều đốm tế bào bị chết,
cành cây có thể phân nhánh nhiều, tạo thành hiện tượng “chổi thầu”.
2.1.7.6. Bệnh khảm lá phổ biến (virus)
Trên lá có những vết vàng loang lỗ xen lẫn phần xanh. Khi bị nặng vết vàng
loang rộng ra trên phiến lá, lá biến dạng nhăn nheo, hơi cuốn lại và nhỏ đi, có một số
mô bị chết hoại. Cây bị bệnh thấp bé dần, lóng ngắn lại và có thể chết đi sau vài tháng.
Triệu chứng bệnh có khi chỉ xuất hiện trên một vài thùy của một lá hoặc trên vài lá và
có thể thay đổi theo giống sắn, địa phương và mùa vụ trồng.
Bệnh lan truyền chủ yếu qua các hom giống lấy từ cây bị bệnh. Trên đồng
ruộng bệnh lan truyền qua các vết thương cơ giới. chưa xác định được côn trùng hay
nhện là môi giới truyền bệnh khảm lá phổ biến. Bệnh khảm lá châu Phi có triệu chứng
rất giống với bệnh khảm lá phổ biến và đã xác định môi giới lan truyền là bọ phấn
Bemisia.
2.1.7.7. Bệnh bướu rễ (tuyến trùng Meloidogyne sp.)
Tuyến trùng xâm nhập vào rễ sắn tạo thành một khối u và đẻ trứng trong đó.
Tuyến trùng non ở trong các khối u ăn hại các mô tế bào của rễ làm rễ không phát
triển, bị thối đen, cây sinh trưởng kém, củ ít và nhỏ. Tuyến trùng cũng xâm nhập phá

hoại ở củ. Khi mới hình thành, khối u còn nhỏ, mật độ cao có thể làm thối củ. Củ đã
lớn ít bị hại hơn. Vết chích của tuyến trùng mở đường cho các vi sinh vật gây bệnh
xâm nhập.
Đã phát hiện có 40 loài tuyến trùng hại sắn, trong đó phổ biến là các nhóm
Meloidegyne và Pratylenchus. Tuyến trùng tồn tại trong đất là nguồn gây bệnh
chủ yếu. Các kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt rất rõ giữa các giống sắn về
sự cảm nhiễm đối với tuyến trùng.
2.1.7.8. Bệnh thối củ sau thu hoạch (nấm Mucor mucedo và nấm Rhizopus
nigricans)
Nấm xâm nhập vào củ từ các vết thương khi thu hoạch, tạo thành các vết bệnh
màu nâu, chỗ bị bệnh mềm nhũn và có mùi rượu. Trên mặt vết bệnh thường sinh lớp
sợi nấm màu trắng, sau chuyển màu đen. Gặp điều kiện thuận lợi nấm phát triển rất
10


nhanh, làm thối phần lớn củ hoặc cả củ trong vài ngày. Các nấm trên phát triển thích
hợp ở nhiệt độ tương đối cao, từ 23 - 29oC, chết ở 35oC trong 10 phút. Nấm tồn tại trên
củ và tàn dư cây dưới dạng phân sinh bào tử. Củ bị xây xát và bảo quản trong điều
kiện nóng, ẩm rất dễ bị bệnh.
2.1.7.9. Bệnh thán thư (nấm Colletotricum gloeosporiodes)
Bệnh gây hại trên lá, ngọn và hom. Trên lá vết bệnh hình tròn , màu nâu, xung
quanh viền vàng. Nhiều vết liên kết với nhau làm cháy một mảng lá lớn, lá vàng và
rụng. Giữa vết bệnh có các ổ nấm như hạt nhỏ màu đen. Bệnh tạo thành những vết nâu
trên ngọn làm ngọn bị khô héo. Trên hom sắn, nấm gây thối ở đầu hom, vệt thối loang
dần làm biểu bì bị nứt ra và hình thành các ổ nấm màu đen. Nấm bệnh tồn tại trên tàn
dư cây sắn và hom giống. Bệnh phát triển nhiều trong điều kiện thời tiết nóng, ẩm,
mưa nhiều. Bệnh thán thư phổ biến ở các vùng trồng sắn trên thế giới nhưng tác hại
thường không nặng.
2.1.7.10. Bệnh do phytoplasma
Phytoplasma ký sinh trong bó mạch libe của cây. Phytoplasma gây bệnh trên

cây sắn làm cho cây sắn mọc nhiều chồi như "chồi rồng", các đốt thân sít lại, cành
bệnh bị chết khô, hoặc còi cọc, làm ảnh hưởng đến năng suất và hàm lượng tinh bột.
Cây sắn bị bệnh ở giai đoạn trước thu hoạch mọc nhiều chồi ngọn và chồi thân. Cây bị
nặng lá cây nhỏ lại và thô cứng, các đốt thân ngắn lại, trên thân và củ phần tiếp giáp
với vỏ chuyển màu thâm đen, chồi bị chết khô. Cây sắn bị bệnh sớm thường không
cho thu hoạch, cây bị bệnh muộn thường giảm 10 - 20% năng suất và giảm 20 - 30%
hàm lượng tinh bột. Đây là loại bệnh lần đầu tiên phát hiện ở Việt Nam nên hiện vẫn
chưa có thuốc đặc trị loại bệnh này (Đỗ Thị Lợi, 2010).
2.2. Kỹ thuật PCR
2.2.1. Giới thiệu sơ lược về PCR
Trong lịch sử ngắn của sinh học phân tử, sự xuất hiện của một kỹ thuật mới (ví
dụ lai Southern, nhân dòng phân tử, điện di gel xung trường) thường thay đổi cách
tiếp cận sinh học cơ bản và ứng dụng của chúng ta. Khả năng khuếch đại các đoạn
DNA đặc hiệu bằng phản ứng chuỗi polymerase là một thay đổi như thế (Quyền Đình
Thi, Nông Văn Hải, 2007).
Năm 1985, Kary Mullis và cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật PCR và đến năm
1988 thì Saiki đã hoàn thiện kỹ thuật này. Việc sử dụng enzyme Taq DNA polymerase
11


trong phản ứng PCR là một bước tiến cực kỳ quan trọng trong các thí nghiệm sinh học
phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Kỹ thuật PCR về bản chất là phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm không
cần sự hiện diện của tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Phương pháp PCR sẽ
khuếch đại đoạn DNA nằm giữa cặp primer. Theo nguyên tắc trên thì yêu cầu của
phản ứng PCR là phải biết được trình tự đoạn DNA, đặc biệt là trình tự hai đầu của
đoạn DNA cần khuếch đại (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba
bước như sau:


Hình 2.3 Các bước trong quy trình PCR. Nguồn: Diendanykhoa.com.

Bước 1 (tách sợi đơn DNA, denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử
DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn, thường là 940C – 950C trong vòng
30 giây – 4 phút.
Bước 2 (bước lai, anealation): trong bước này, ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm (nhiệt
độ nóng chảy) của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực
nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C – 700C tuỳ thuộc Tm của các mồi
sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây tùy thuộc vào kích thước sản phẩm khuếch đại.
Bước 3 (bước kéo dài, elongation): dưới tác động của DNA polymerase, các
nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới
được tạo thành từ mồi được nối dài. Nhiệt độ phản ứng là 720C.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lập lại nhiều
lần, làm gia tăng số lượng sản phẩm theo cấp số nhân. Theo tính toán sau 30 đến 40
12


chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA sản
phẩm được nhuộm bởi Ethidium Bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện
di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm).
2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR
DNA khuôn
DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhưng đôi khi kỹ
thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà
vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán.
Lượng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR là một lượng thật nhỏ khoảng 1
µg, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm
lượng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra
những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là dương tính giả. Khuôn DNA
có thể được thu nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần

như trong tế bào máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người
đã chết.
Enzyme
Thông thường DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu
nhiệt cao. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase tách chiết từ vi
khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Nó được phân lập từ suối nước nóng ở
Yellowstone National Park, ở đó chúng phát triển rất tốt, có thể sao chép DNA ở nhiệt
độ trên 85oC. Ngày nay, nhiều loại enzyme polymerase chịu nhiệt khác đã được phát
hiện và đưa ra thị trường với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn.
Tăng tính đặc hiệu của Taq polymerase sẽ nâng cao hiệu suất khuếch đại phân đoạn
đích và giảm tính cạnh tranh dành enzyme và mồi của các sản phẩm không phải là
đích.
Mồi và nhiệt độ
Việc thiết kế và chọn mồi phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:
Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
“xuôi” và mồi “ngược”, không có những cấu trúc “primer dimer” do sự bắt cặp bổ
sung giữa các thành phần khác nhau của một mồi.
“Nhiệt độ nóng chảy” (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không được cách biệt
quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi phải cân bằng tránh lập đi lập lại nhiều lần.
13


Các mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với
trình tự lặp lại trên gene.
Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR tối
ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
2.2.3. Các thành phần khác trong phản ứng PCR
Bốn loại nucleotide (dNTP) thường được sử dụng ở nồng độ là 200 µM/mỗi
loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính
giả hay tạp nhiễm. Điều quan trọng là nồng độ mỗi loại dNTP phải như nhau. Sự mất

cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng mức độ gắn nhầm nucleotide vào
sản phẩm PCR, dẫn đến kết quả trình tự có lỗi và sản phẩm biểu hiện có thể là một thể
đột biến. Thừa dNTP có thể tăng tỷ lệ lỗi và có khả năng ức chế Taq polymerase. Phân
đoạn DNA kích thước lớn hơn cần nhiều dNTP hơn.
Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, ảnh
hưởng tới bắt cặp mồi, nhiệt độ nóng chảy của sợi khuôn, sản phẩm và liên kết mồi –
khuôn, tính đặc hiệu sản phẩm, hoạt tính enzyme và tính chính xác. Nồng độ MgCl2
ảnh hưởng tới sự bắt cặp của oligo với khuôn DNA. Vì vậy nồng độ MgCl2 cũng tăng
sự bắt cặp không đặc hiệu và tổng hợp các sản phẩm PCR không mong muốn. Nồng
độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường nồng độ tối
ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng.
2.2.4. Số lượng chu kỳ phản ứng
Số chu kỳ của phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA trong hỗn
hợp phản ứng và hiệu suất mong đợi sản phẩm PCR. Số lượng chu kỳ trong một phản
ứng PCR thông thường không vượt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai
giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng
mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân
hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; sự xuất hiện những sản phẩm phụ làm
ức chế phản ứng khuếch đại; các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà
chúng tự bắt cặp với nhau.

14