BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TIÊU CHUẨN HÓA NẤM THƯỢNG HOÀNG
(Phellinus linteus)Teng

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG
Niên khóa: 2006 - 2010

Tháng 7/2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TIÊU CHUẨN HÓA NẤM THƯỢNG HOÀNG
(Phellinus linteus)Teng

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện

TS. TRẦN CÔNG LUẬN

TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài cho khóa luận tốt nghiệp, em đã gặp rất
nhiều khó khăn nhưng được sự dạy dỗ, chỉ bảo và giúp đỡ của gia đình, thầy cô và bạn
bè, em đã hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Con xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình là người thân yêu luôn bên cạnh, động
viên, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con; em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới thầy cô
khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tụy dạy
dỗ em trong suốt những năm học tại trường; thầy Trần Công Luận là người trực tiếp
hướng dẫn chỉ bảo tận tình cho em; cô Dương Thị Mộng Ngọc, cô Nguyễn Thị Hoa,
anh Bùi Thế Vinh, chị Lâm Bích Thảo, anh Lê Minh Triết đã hết lòng giúp đỡ tạo mọi
điều kiện tốt nhất cho em trong thời gian thực hiện đề tài; cuối cùng là các bạn trường
ĐH Nông Lâm, ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Sư phạm và bạn bè đã luôn giúp đỡ, chia
sẻ kinh nghiệm, niềm vui nỗi buồn cùng em.

iii


TÓM TẮT
Nấm không chỉ là nguồn thực phẩm cung cấp dinh dưỡng trong bữa ăn hàng
ngày của con người mà nó còn là một nguồn dược liệu chứa các hợp chất có khả năng
phòng và điều trị bệnh cho con người.
Nấm Thượng hoàng là một trong những loại nấm dược liệu quý được sử dụng
chủ yếu ở các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc. Nhưng hiện nay tại Việt Nam
chưa có một tiêu chuẩn cơ sở nào để phân biệt nấm Thượng hoàng với các loại nấm
khác. Chính vì thế, đề tài “Tiêu chuẩn hóa nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)”

được tiến hành.
Trong nghiên cưú này chúng tôi tiến hành định tính sơ bộ thành phần hóa thực
vật bằng các phản ứng hóa học; thử độ tinh khiết của dược liệu; định tính thành phần
hoạt tính chính triterpenoid có trong nấm Thượng hoàng bằng phản ứng hóa học đặc
trưng và phương pháp sắc ký lớp mỏng; định lượng steroid, một loại triterpenoid có
trong nguyên liệu nấm ban đầu bằng phương pháp đo quang. Và từ đó đã xác định
được thành phần hóa thực vật trong nấm gồm có chất béo, triterpenoid, alkaloid,
glycosid tim, saponin, polyphenol, acid hữu cơ, chất khử, hợp chất polyuronic; độ ẩm
là 11,52 %, độ tro toàn phần là 3,66 % và 4,13 % (tính theo nguyên liệu khô kiệt, độ
tro không tan trong HCl là 0,013 %; xác định được sự hiện diện của hợp chất
triterpenoid có trong nấm Thượng hoàng; định lượng được hàm lượng steroid có trong
mẫu nguyên liệu là 0,245 %.

iv


SUMMARY
Mushroom is not only food sources of nutrient for daily meals of people but also a
medicinal source containing compounds for prevention and treatment of human being.
Phellinus linteus is one of the precious medicinal mushrooms that are used mainly
in China, Japan and South Korea. However, there is not now individual standard to
distinguish Phellinus linteus with others in Vietnam. Therefore, the thesis
"Standardization of Phellinus linteus " was carried out.
In this study, we were qualitative dertermination its chemical compositions by
means of chemical reactions; the purity of raw materials; qualitative analysis of active
triterpenoid components as mentioned in this mushroom by means of specific
chemical reactions and thin layer chromatography methods; quantitative analysis of
steroid, a one of kind of triterpenoid group in raw materials by Spectrophotometric
methods.
The results showed that it was determined the chemical compositions of Phellinus

linteus including fat, triterpenoid, alkaloid, cardiac glycoside, saponin, polyphenol,
organic acid, reduced compounds, polyuronic compounds. Its humidity was 11, 52 %;
total ash was 3,66 % and 4,13 % (calculated as dry material); insoluble ash in HCl was
0,013 %; determining the presence of triterpenoid compounds of P. linteus; the yield
of steroid content in the material samples was 0,245 %.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................................... iii
TÓM TẮT ......................................................................................................................................... iv
SUMMARY....................................................................................................................................... v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................................ x
DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................................. x
Chương 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài.................................................................................................1
1.3. Nội dung thực hiện ...............................................................................................1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3
2.1. Tổng quan về nấm Thượng hoàng ........................................................................3
2.1.1. Phân loại ............................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm phân bố và hình thái ..........................................................................3
2.1.3. Thành phần hóa học...........................................................................................4
2.1.4. Tác dụng ............................................................................................................5
2.2. Giới thiệu về hợp chất triterpennoid.....................................................................8
2.2.1.Phân loại .............................................................................................................8
2.2.2. Giới thiệu về nhóm triterpenoid có cấu trúc sterol ............................................8
2.2.3. Tác dụng sinh học ..............................................................................................9

2.3. Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ (UV – VIS) ..................................9
2.3.1. Khái niệm ..........................................................................................................9
2.3.2. Kỹ thuật định lượng bằng phổ UV- VIS .........................................................10
2.3.3. Thẩm định quy trình định lượng......................................................................10
2.3.3.1. Tính chất tuyến tính ......................................................................................10
2.3.3.2. Độ chính xác .................................................................................................11
2.3.3.3 Độ đúng .........................................................................................................11
Chương3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 13
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................13
3.2. Vật Liệu ..............................................................................................................13
vi


3.2.1. Nguyên liệu .....................................................................................................13
3.2.2. Hoá chất ...........................................................................................................13
3.2.3. Trang thiết bị ...................................................................................................13
3.3. Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật bằng phản ứng hóa học .....................13
3.3.1. Chuẩn bị dịch chiết ..........................................................................................14
3.3.1.1. Chiết dịch chiết ether ....................................................................................14
3.3.1.2. Chiết dịch chiết cồn ......................................................................................14
3.3.1.3. Chiết dịch chiết nước ....................................................................................14
3.3.2. Xác định các nhóm hợp chất ...........................................................................14
3.3.2.1. Xác định các chất tan trong dịch ether .........................................................14
3.3.2.2. Xác định các nhóm hợp chất tan trong dịch chiết cồn .................................16
3.3.2.3. Xác định các nhóm hợp chất từ dịch cồn thủy phân ....................................18
3.2.2.4. Xác định các chất tan trong dịch chiết nước ................................................19
3.3.2.5. Xác định các nhóm hợp chất từ dịch nước thủy phân ..................................21
3.4. Thử tinh khiết .....................................................................................................22
3.4.1. Xác định độ ẩm ................................................................................................22
3.4.2. Xác định độ tro ................................................................................................22

3.4.2.1. Xác định tro toàn phần .................................................................................22
3.4.2.2. Tro không tan trong acid HCl.......................................................................23
3.5. Định tính triterpenoid có trong mẫu ...................................................................23
3.5.1. Định tính triterpenoid bằng phản ứng hóa học ................................................23
3.5.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng......................................................................24
3.5.2.1.Chuẩn bị bản mỏng ........................................................................................24
3.5.2.2. Dung môi khai triển ......................................................................................24
3.5.2.3. Chuẩn bị mẫu thử .........................................................................................24
3.5.2.4. Phát hiện .......................................................................................................24
3.6. Định lượng steroid dựa vào chất đối chiếu.........................................................24
3.6.1. Khảo sát quy trình định lượng .........................................................................24
3.6.1.1. Khảo sát độ hấp thu cực đại của chất đối chiếu ..........................................25
3.6.1.2. Khoảng tuyến tính ........................................................................................25
3.6.1.3. Độ chính xác .................................................................................................26
3.6.1.4. Độ đúng ........................................................................................................26
vii


3.6.2. Xác định hàm lượng steroid có trong nguyên liệu ..........................................27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................... 28
4.1. Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật bằng phản ứng hóa học .....................28
4.2. Thử độ tinh khiết của dược liệu..........................................................................29
4.3. Định tính triterpenoid có trong mẫu nấm dược liệu ...........................................30
4.3.1. Định tính bằng phương pháp hóa học .............................................................30
4.3.2. Định tính trên sắc ký lớp mỏng .......................................................................30
4.4. Định lượng hợp chất steroid dựa vào chất đối chiếu .........................................35
4.4.1. Khảo sát quy trình định lượng .........................................................................35
4.4.1.1. Phổ UV – VIS tìm bước sóng hấp thu cực đại .............................................35
4.4.1.2. Khoảng tuyến tính ........................................................................................36
4.4.1.3. Độ chính xác .................................................................................................37

4.4.1.4. Độ đúng ........................................................................................................38
4.4.2. Xác định hàm lượng steroid có trong nguyên liệu ..........................................39
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................... 40
5.1. Kết luận...............................................................................................................40
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 41
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CHCl3:

Chloroform

DCs:

Dendritic cells

DĐVN: Dược điển Việt Nam
DAEA:

Dietylaminoetyl

đđ:

Đậm đặc

HPLC:


Hight Performance Liquid Chromatography

IL(s):

Interleukin (s)

IFN:

Interferon

NK:

Natural Killer

NTH:

Nấm Thượng hoàng

PE:

Petroleum Ether

SKLM:

Sắc ký lớp mỏng

UV

Ultraviolet


VIS

Visible Spectrometry

VS:

Vanilin - sulfuric

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Quy trình khảo sát khoảng tuyến tính........................................................................... 25
Bảng 4.1 Kết quả sơ bộ thành phần hóa thực vật......................................................................... 28
Bảng 4.2 Độ ẩm của dược liệu....................................................................................................... 29
Bảng 4.3 Độ tro toàn phần của dược liệu tính trên nguyên liệu khô kiệt .................................. 29
Bảng 4.4 Độ tro không tan trong HCl của dược liệu tính trên dược liệu khô kiệt.................... 30
Bảng 4.5 Bảng kết quả định tính triterpenoid bằng phương pháp hóa học ............................... 30
Bảng 4.6 Bảng kết quả định tính trên SKLM............................................................................... 31
Bảng 4.6 (tt) Bảng kết quả định tính trên SKLM ........................................................................ 32
Bảng 4.6 (tt) Bảng kết quả định tính trên SKLM ........................................................................ 33
Bảng 4.6 (tt) Bảng kết quả định tính trên SKLM ........................................................................ 34
Bảng 4.7 Độ hấp thu cực đại của các dung dịch khảo sát ........................................................... 35
Bảng 4.8 Sự tương quan giữa lượng ergosta -7,22-dien-3-one và độ hấp thu .......................... 36
Bảng 4.9 Kết quả khảo sát độ chính xác ....................................................................................... 37
Bảng 4.10 Kết quả khảo sát độ đúng............................................................................................. 38
Bảng 4.11 Kết quả hàm lượng steroid trong nguyên liệu ........................................................... 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Quả thể nấm Thượng hoàng ............................................................................................ 4
Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu tiến hành xác định độ chính xác ................................................. 26
Hình 4.1 Sắc ký đồ thể hiện sự hiện diện của các steroid (vết chất màu xanh) ........................ 35
Hình 4.2 Đường biểu diễn khoảng tuyến tính của chất đối ....................................................... 37

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Hàm lượng protein (đạm
thực vật) chỉ sau thịt, cá, rất giàu chất khoáng và các acid amin không thay thế các
vitamin A, B, C, D, E…. không có các độc tố. Có thể coi nấm ăn như một loại rau sạch
và thịt sạch. Ngoài giá trị dinh dưỡng, nấm còn có nhiều đặc tính biệt dược, có khả
năng phòng và chữa bệnh như: làm hạ huyết áp, chống bệnh béo phì, chữa bệnh đường
ruột, tẩy máu xấu. Nhiều công trình nghiên cứu về y học xem nấm là một loại thuốc có
khả năng phòng chống bệnh ung thư.
Nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus (Berkeley & M. A. Curtis) Teng (PL)) là
một loại nấm dược liệu có nhiều ở các nước phương Đông như Nhật Bản, Hàn Quốc,
Trung Quốc, Việt Nam…. trong nhiều thế kỷ để ngăn ngừa nhiều loại bệnh khác nhau
như rối loạn chức năng dạ dày-ruột, xuất huyết, tiêu chảy và bệnh ung thư. Các nhà
khoa học trên thế giới đã chứng minh các chất chiết xuất từ quả thể, hệ sợi của Nấm
Thượng hoàng không chỉ có chức năng kích thích các hormone, tế bào trung gian miễn
dịch và các phản ứng viêm mà còn ngăn chặn sự phát triển khối u và di căn.
Hiện nay tại Việt Nam chưa có một tiêu chuẩn cơ sở nào cho nấm Thượng
hoàng để có thể phân biệt với các nấm khác về mặt vi học, độ tinh khiết (độ ẩm, độ
tro) thành phần hóa thực vật vì thế đề tài “Tiêu chuẩn hóa Nấm Thượng hoàng
(Phellinus linteus)” được tiến hành.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật bằng các phản ứng hóa học

Thử độ tinh khiết của dược liệu
Định tính thành phần có hoạt tính chính triterpenoid có trong mẫu nấm Thượng
hoàng .
Định lượng hợp chất steroid, một loại triterpenoid có trong nấm Thượng hoàng.
1.3. Nội dung thực hiện
Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu nhằm xác định sơ bộ các
nhóm hợp chất chính có trong dược liệu.

1


Thử độ tinh khiết của dược liệu: xác định độ ẩm, độ tro của dược liệu (tro toàn
phần và tro tan trong HCl).
Định tính hợp chất triterpenoid có trong nấm Thượng hoàng bằng các phản ứng
hóa học và bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng nhằm xác định sự hiện diện của hợp
chất triterpenoid.
Định lượng hợp chất steroid có trong nấm Thượng hoàng bằng phương pháp đo
quang.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nấm Thượng hoàng
2.1.1. Phân loại
Nấm Thượng hoàng có tên la tinh là Phellinus linteus, ở Nhật Bản loại nấm này
được gọi là Meshimakobu (hoặc Meshima), ở Hàn Quốc gọi là Sang Hwang, ở Trung
Quốc gọi là Lingzhi hay Reshi (y học truyền thống Trung Quốc) hoặc Sang Shin, Sang
I, Sang Hwang – Go (trong một cuốn dược điển của Trung Quốc: Joong Yak Dae
Sajeon).

Ngành:

Nấm

Lớp:

Basidiomycetes

Lớp phụ:

Incertae sedis

Bộ:

Hymenochaetales

Họ:

Hymenochaetaceae

Chi:

Phellinus

Loài:

Phellinus linteus (Berkeley & M. A. Curtis) Teng (PL)

2.1.2. Đặc điểm phân bố và hình thái
Nấm Thượng hoàng phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới của Nam Mỹ, Châu Phi

và Đông Á. Nó thường mọc tự nhiên trên thân cây Bạch dương, Sồi và Dâu tằm hơn
1000 năm tuổi và sẽ phát triển tối thiểu 30 – 40 năm nữa để tạo thành một quả thể
được sử dụng trong y học. NTH rất hiếm trong tự nhiên vì chúng phụ thuộc vào các
điều kiện tăng trưởng như độ ẩm, nhiệt độ, ánh sáng một cách nghiêm ngặt.
Ở Việt Nam nấm thường được thu hái tự nhiên ở vùng rừng sâu, rừng nguyên
sinh, núi cao hiểm trở. Hiện nay loại nấm này đã được trồng thành công ở trung tâm
Nghiên cứu Linh Chi và Nấm dược liệu.

3


Hình 2.1 Quả thể nấm Thượng hoàng
(Mẫu tại Trung tâm Nghiên cứu linh chi và nấm dược liệu TP. HCM)

Đây là một loại nấm có hình dạng như một móng guốc và có vị đắng, thường
mang màu của thân cây từ vàng, nâu sẫm đến đen.
Cổ Đức Trọng, Phan Thị Nhiều (2008) đã nghiên cứu thành công phương pháp
trồng nấm Thượng Hoàng trên mạt mùn cưa để tạo nguyên liệu làm thuốc.
2.1.3. Thành phần hóa học
Có nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh thành phần hóa học chính của
nấm Thượng hoàng là polysaccharid gồm có intracellular polysaccharid (IPS) và
exopolysaccharid (EPS), triterpenoid ngoài ra còn có proteoglycan, cyclophelliton,
hispidin và hispolon sử dụng các phương pháp chiết ethanol, chiết nước, tách phân
đoạn , sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Leo JLD Van Griensven, Hunb Savelkoul, Đại học Wageningen, Hà Lan đã chỉ
ra 19 loại acid amin được tìm thấy trong nấm Thượng hoàng tự nhiên là aspartat,
methionin, cystein, threonin, isoleucin, serin, leucin, glutamate, gluthathion, tyrosin,
phenylalanin, prolin, ornithin, alanin, lysine, glycin, histidin, valin, arginin. Nhưng
trong nấm trồng chỉ có asparagin, threonin, serin, glutamin, alanin, glysin, valin,
isoleucin, leucin và lysin.


4


2.1.4. Tác dụng
Cuốn sách y học 2000 năm tuổi: Serg Nongs Herbal Classic được cho là cuốn
sách cổ nhất về thảo dược phương Đông đã phân chia thảo dược thành ba loại. Loại
đầu tiên là loại cao cấp bao gồm thảo dược có tác dụng trên nhiều loại bệnh giúp duy
trì và khôi phục lại sự cân bằng trong cơ thể, chúng không có tác dụng phụ bất lợi.
Loại thứ 2, giữa, gồm các loại thuốc bổ, sử dụng không có giới hạn. Loại 3, thấp nhất
phải được dùng với liều nhỏ và cho những bệnh cụ thể. NTH đã được xếp vào một
trong những loại cao cấp, một trong những loại thuốc quý trong y học cổ đại, được sử
dụng cho người trẻ và kéo dài tuổi thọ. Chúng được tôn sùng như một loại thần dược
hàng ngàn năm ở Trung Quốc và Nhật Bản.
Trong các ứng dụng truyền thống của phương Đông, NTH được dùng để chữa
trị chứng mất ngủ, loét dạ dày, suy nhược thần kinh, viêm khớp, viêm thận, hen suyễn,
viêm phế quản, chứng tăng huyết áp và nhiễm độc. Nó cũng được sử dụng để chữa trị
các rối loạn thần kinh cơ, loạn dưỡng cơ, teo cơ.
NTH đã được miêu tả trong một cuốn sách Đông y là có hiệu quả trên nhiều
bệnh bao gồm giảm hoặc tăng huyết áp, cải thiện lưu thông máu, tăng tính khử độc,
bảo vệ gan, chống dị ứng và bệnh tiểu đường, loét miệng, rối loạn dạ dày ruột, bệnh
bạch huyết.
Năm 1993, Hàn Quốc đã thành công trong việc phát triển một loại thuốc chống
khối u từ NTH. Năm 1968, nhóm nghiên cứu của tiến sĩ Ikagawa đã công bố kết quả
nghiên cứu về “hoạt động chống khối u của một số nấm đảm (Basidiomycetes) đặc
biệt là Phellinus linteus” trong một tạp chí thuốc của Nhật Bản. NTH trở nên rất phổ
biến trong các nghiên cứu của các nhà khoa học.
Trong nhiều thế kỷ qua, các loại thuốc sử dụng trong y học cổ truyền của Châu
Á thường dựa trên kinh nghiệm thực tiễn mà chưa có những nghiên cứu mang tính
khoa học cụ thể cho các ứng dụng lâm sàng vào hệ thống y tế của phương Tây. Do đó,

trong một nỗ lực để dịch chuyển các loại thuốc truyền thống của Châu Á sang ứng
dụng và phát triển rộng rãi ở phương Tây, các nhà khoa học đã chứng minh rằng các
chất chiết từ quả thể, hệ sợi nấm của NTH có khả năng kích thích miễn dịch trung gian
tế bào và miễn dịch bẩm sinh, kích hoạt tế bào lympho B và T, tế bào giết tự nhiên

5


(NK), tế bào sợi (DCs) và các đại thực bào, chấm dứt phản ứng viêm gây ra bởi một
loạt các kích thích mà còn ngăn chặn sự phát triển của các khối u và di căn bao gồm
ung thư ruột kết, ung thư gan, ung thư biểu mô, mô sợi, khối u ác tính.
Ở Nhật Bản có một báo cáo nói rằng, một bệnh nhân bị ung thư biểu mô tế bào
gan bị di căn đến phổi, 6 tháng sau khối u hoàn toàn biến mất sau khi uống dịch chiết
từ quả thể nấm NTH, quá trình điều trị này độc lập với các phương pháp khác.
Polysaccharid từ hệ sợi của NTH được tiêm vào lách chuột tăng cường chức
năng miễn dịch của tế bào T trong khi đó ß glucan và các polysaccharid khác chỉ tăng
hoạt động miễn dịch qua trung gian tế bào T. Miễn dịch không đặc hiệu của các tế bào
NK, đại thực bào cũng được tăng cường khi bổ sung NTH vào trong cơ thể (Hwan và
cộng sự, 1996)
NTH đã được chứng minh có khả năng chống khối u một cách trực tiếp và gián
tiếp. Ở chuột, sau khi cấy tế bào ung thư MCA 102 thì cho uống proteglycan từ NTH
để tăng cường sự biến đổi các tế bào sợi (DCs) có nguồn gốc từ tủy xương thành dạng
trưởng thành. Các DCs trưởng thành đã dung nạp kháng nguyên của khối u và sau đó
di cư đến các tổ chức lympho, kích hoạt sự phá hủy khối u thông qua các tế bào T.
Polysaccharid acid phân lập từ NTH có khả năng tăng cường hoạt động của đại
thực bào để tạo ra nitric oxid (thông qua hai enzym protein kinase C (PKC) và protein
tyrosin kinase (PTK)) ức chế hoạt động của khối u. Các polysaccharid acid này cũng
kích hoạt các thụ thể trên bề mặt tế bào CD18, CD11b chống lại sự phát triển của khối
u (Kim và cộng sự, 1996)
Trong một đánh giá về tác dụng chống oxi hóa của NTH đã cho thấy dịch

chiết ethanol từ NTH có hiệu quả tương đương vitamin C trong việc ngăn chặn quá
trình oxi hóa.
Hispidin phân tách từ NTH có khả năng chống lại bệnh mất trí nhớ. Nó được
xác định là chất ức chế không cạnh tranh của enzym β- secretase (một enzyme cắt
protein, một tiền tố của amyloid tại vị trí β), các protease huyết thanh như
chymotrypsin, trypsin, elasta.
Nhóm của Chang-Yan Chen (Trường ĐH Y dược Boston ở Massachusetts (Mỹ)
đã cho thêm chiết xuất từ nấm Phellinus linteus vào thuốc trị ung thư tuyến tiền liệt ở
mức rất nhỏ đủ để không gây ảnh hưởng. Họ phát hiện sự kết hợp này đã giết chết các

6


tế bào ung thư tương tự như khi sử dụng thuốc trị ung thư ở một liều lớn nhưng không
gây hại cho các tế bào khỏe mạnh.
Theo phân tích của nhóm nghiên cứu Chihara tại Trung tâm Nghiên cứu ung thư
quốc gia Tokyo tại Nhật Bản từ năm 1976 thử tác dụng chống khối u của dịch chiết
nước nóng của 27 loài nấm thì NTH cho tỉ lệ ức chế các khối u là cao nhất 96,7 % so
với nấm mèo là 42,6 %, nấm mỡ là 2,7 %, nấm cổ linh chi là 64,9 %.
Năm 1995, Song KS, Cho SM, Lee JH, Kim JH, Han SB, Ko KS, Yoo ID tại Viện
nghiên cứu Công nghệ sinh học và Sinh học Hàn Quốc chứng minh dịch chiết nước
thủy phân từ hệ sợi nấm NTH kích thích sản xuất kháng thể đa dòng trong hệ thống
nuôi cấy in vitro. Các phân đoạn polysaccharid được tinh sạch từ dịch chiết này gấp
1030 lần so với dich chiết ethanol bằng phương pháp sắc ký lọc gel và DAEA –
cellulose. Nồng độ polysaccharid kích thích tế bào lympho B là 3 μg/ ml.
Han Kook Shin Yak nuôi cấy thành công sinh khối hệ sợi nấm NTH, và tên
thương mại Meshima xuất hiện trên thị trường (1993). Năm 1999, tập đoàn Meshima
của Nhật kí kết với công ty Dược phẩm mới của Hàn Quốc và trở thành nhà sản xuất
và bán tại Nhật. Meshima được dùng trong các trường hợp.
9 Ngăn ngừa sự tái phát sau khi phẫu thuật loại bỏ khối u hoàn toàn kiểm tra bằng

siêu âm hoặc chụp X quang.
9 Ngăn ngừa sự phát triển của khối u nếu không tiến hành phẫu thuật được hoặc
phẫu thuật nhưng không loại bỏ hết khối u.
Aiith và Janardhanan (2003) đã mô tả hoạt tính chống khối u của P. linteus, P.
rimosus bằng cách cho chuột uống polysaccharid với liều lượng 50 mg/ kg/ ngày tiến
hành trong 10 ngày liên tục và kết quả là chúng ức chế sự phát triển khối u đạt 57 %.
Năm 2003, Tae Woong Kim, Jae Mosung, Ho Kyung Kim và Yoon Jung Ba của
Đại học quốc gia Kangwon (Hàn Quốc) đã tiến hành nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa
và chống ung thư của dịch chiết nấm Phellinus linteus và Phellinus igniarius. Kết quả cho
thấy cả hai loại nấm này đều có khả năng chống oxi hóa và chống ung thư.
Kim và cộng sự (2009) báo cáo rằng polysaccharid phân lập từ NTH ức chế sự
biểu hiện của các cytokines như IL2, IFNγ, IL10, IL20 nguyên nhân gây ra bệnh tiểu
đường.
Với các tác dụng mà NTH đem lại, nó đang sở hữu nhiều chức năng chống lại
nhiều căn bệnh khác nhau, đặc biệt là chống lại nhiều căn bệnh ung thư khác nhau.
7


NTH trở thành ứng cử viên đầy hứa hẹn cho nhiều nghiên cứu cũng như ứng dụng
trong chương trình phát triển các chất có hoạt tính sinh học hiện nay.
2.2. Giới thiệu về hợp chất triterpennoid
2.2.1.Phân loại
Triterpenoid được tạo thành bởi 6 đơn vị isopren kết hợp và được phân bố rộng rãi
trong giới thực vật và động vật: sterol có trong động vật, thực vật; triterpen; saponin;
saponin triterpenoid; saponin steroid; glycosid có tác dụng trên tim. Chúng được chia
thành 3 nhóm dựa vào cấu trúc: không vòng, 4 vòng, 5 vòng.
• Triterpenoid không vòng như squalen, ambrein.
• Triterpnoid 4 vòng: thuộc loại squalenoxid (mọi vòng 6C đều ở cấu hình trans
với nhau) lanosterol, protosterol, agnosterol, cycloaudinol.
• Triterpenoid 5 vòng: được chia làm 3 nhóm

i) Nhóm α - amyrin: α- amyrin, acid ursolic, acid asiatic, acid xentoic…, nhóm
nàycórấtít trong tự nhiên
ii) Nhóm β - amyrin: β- Amyrin, acid oleanolic, acid albigenic…, nhóm này chiếm
đa số trong sapogenin triterpen phổ biến nhất là saponin của acid oleanolic.
iii) Nhóm lupeol: lupeol, betulin, taraxasterol…nhóm dẫn xuất này cũng ít gặp.
2.2.2. Giới thiệu về nhóm triterpenoid có cấu trúc sterol
Sterol là những ancol thể rắn có cấu trúc 27 - 29 nguyên tử C, thuộc nguồn gốc
động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, ß- sitosterol, ergosterol,
stigmasterol) nhưng đều có cấu trúc khung cơ bản xyclopentanoperhydro phenanthren
và một chuỗi ngang với các nhóm methyl (loại ergostan) hoặc etyl (stigmastan) đặc
biệt là ở C24.
Đặc tính của sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu
béo, carotene, lexithin, rất tan trong các dung môi không phân cực như PE, ether,
benzene, CHCl3 nên các chất này được dùng làm dung môi để chiết chúng. Ngoài ra có
thể dùng cồn để chiết sterol (dạng glycozit).
Sản phẩm chiết được từ các dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp của các este
sterol kết hợp với lipid, carotene, lexithin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các
chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng kết
tinh phân đoạn.

8


Công thức của một số Sterol

2.2.3. Tác dụng sinh học
Giảm nguy cơ ung thư, làm giảm cholesterol, giúp máu lưu thông tốt, làm giảm
huyết áp, nếu dùng lâu dài nó được coi là kháng sinh tự nhiên, chống oxi hóa.
2.3. Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ (UV – VIS)
2.3.1. Khái niệm

Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) hay còn gọi là phương
pháp quang phổ hấp thụ, hay phương pháp đo quang dựa trên hấp thụ chọn lọc các bức
xạ rọi vào dung dịch của chất nghiên cứu trong một dung môi nhất định. Tùy theo
bước sóng ánh sáng được chia thành từng vùng sóng: Vùng tử ngoại (200 – 400 nm),
vùng khả kiến (400 – 800 nm).
Phổ hấp thụ UV- VIS là phổ được hình thành do sự tương tác của các điện tử
hóa trị ở trong phân tử hay nhóm phân tử với chùm nguồn sáng kích thích (chùm tia
bức xạ trong vùng UV – VIS) tạo ra. Nó cũng là phổ tổ hợp do sự di chuyển mức năng
lượng của các điện tử liên kết của sự quay và sự di động của phân tử.
Phương pháp đo quang ngoài khả năng phân tích các chất trong dung dịch đơn
chất tinh khiết, nó còn giúp phân tích các chất trong dung dịch hỗn hợp nhiều chất nhờ
sự hỗ trợ của phần mềm xử lý vi tính.

9


2.3.2. Kỹ thuật định lượng bằng phổ UV- VIS
Chọn bước sóng: ta thường chọn bước sóng ứng với cực đại hấp thụ lớn nhất
khi đó đường chuẩn có độ dốc lớn nhất cùng một sai số ∆A và ∆C nhỏ nhất. Tại
λ max sai số bước sóng ít ảnh hưởng.
Chọn khoảng nồng độ thích hợp: khoảng nồng độ trong đó quan hệ giữa độ hấp
thụ và nồng độ là tuyến tính. Nồng độ phải được chọn sao cho độ hấp thụ thu được rơi
vào khoảng vùng tối ưu là 0,2 – 0,8 và càng gần 0,43 càng tốt.
Chọn các điều kiện làm việc khác: chiết chất cần kiểm nghiệm khỏi tạp rồi mới
định lượng, làm phản ứng màu.
2.3.3. Thẩm định quy trình định lượng
2.3.3.1. Tính chất tuyến tính
Tính chất tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của
phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo
được và nồng độ là một đường thẳng hay trực tiếp tính toán dựa vào tương quan tỷ lệ

giữa đại lượng đo được và nồng độ. Cả hai trường hợp đều yêu cầu giữa đại lượng đo
được và nồng độ phải có sự phụ thuộc tuyến tính. Tính chất tuyến tính được biểu thị
bằng hệ số tương quan R
Cách xác định:
Tiến hành thực nghiệm để xác định các giá trị đo được theo nồng độ.
Nếu là sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một đường
thẳng tuân theo phương trình sau: y= ax + b
Và R được tính theo công thức:
n

∑ ( x − x)( y

R=

i =1

i

i

n

n

i =1

i =1

− y)


∑ ( xi − x)2 ∑ ( yi − y)2
Nếu R = 1 : có tương quan tuyến tính rõ rệt.
Nếu R > 0 : có tương quan đồng biến.
Nếu R < 0 : có tương quan nghịch biến.
Nếu R < 5 : không có tương quan tuyến tính.
Nếu R > 5 : có phụ thuộc tuyến tính.
10


Nếu R = 0 : hoàn toàn không có tương quan tuyến tính.
Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể xây dựng
phương trình hồi quy của khoảng này, tức là xác định hệ số a và b.
2.3.3.2. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng rẽ xi với giá trị trung
bình Χ thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng mẫu thử đồng nhất trong
cùng điều kiện xác định.
Độ chính xác ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên (random errors)
Độ chính xác của phương pháp được biểu thị bằng
9 Độ lệch chuẩn (SD = Standard Deviation) hoặc
9 Độ lệch chuẩn tương đối ( RSD = Relative Standard Deviation)
Cách xác định: với cùng một mẫu đã được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng
phương pháp đề xuất n lần (n = 6 – 10 hay nhiều hơn…..) sau đó áp dụng công thức
SD =
Trong đó:

∑ (x

− x) 2
n −1
i


RSD =

SD
× 100
x

xi: giá trị đo được lần thứ i ⎯x: giá trị trung bình

Giới hạn tin cậy: e = ±

n: số lần đo

tSD
n

t là hệ số tra trong bảng Student với (n – 1) bậc tự do và P = 95 %
Khoảng tin cậy: μ = x ± e
2.3.3.3 Độ đúng
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy
với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng
nhất trong cùng điều kiện xác định.
Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống. Độ đúng thường được biểu thị bằng
tỷ lệ phục hồi ( %) của các giá trị tìm thấy với giá trị thực thêm vào mẫu thử.
Cách xác định: việc xác định độ đúng được tiến hành như sau:
9 Xác định hàm lượng của chất cần thử trong mẫu đem thử bằng phương pháp dự
kiến.
11



9 Cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử có hàm lượng bằng
100 % ± 10 % hoặc 100 % ± 20 % hàm lượng lý thuyết rồi tiến hành xác định
bằng

phương pháp đề xuất.

9 Tỷ lệ phục hồi được tính theo công thức:

Trong đó: μ là hàm lượng của chất chuẩn thêm vào
là hàm lượng xác định được.
Một quy trình chỉ đạt độ đúng hay độ chính xác là chưa đủ, một quy trình phải
đáp ứng cả độ chính xác lẫn độ đúng. Đây là 2 trong các chỉ tiêu cơ bản để thẩm định
quy trình thử nghiệm.

12


Chương3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
9 Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 01/02/2010 đến ngày 14/07/2010.
9 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh.
9 Địa chỉ: 41 Đinh Tiên Hoàng, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật Liệu
3.2.1. Nguyên liệu
9 Nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) do công ty Vina Linh Chi cung cấp.
9 Dược liệu ở dạng quả thể, bảo quản khô và sau đó xay thành bột.
3.2.2. Dung môi, hoá chất
Dung môi: chloroform, diethyl ether (Trung Quốc), methanol công nghiệp,
benzene, ethylacetat, toluene, acetone, petroleum ether (PE).
Hóa chất: Anhydric acetic, FeCl3, HCl, H2SO4, KOH, Mg, CaSO4 khan,

NaCO3.Các thuốc thử Dragendorff, Mayer, Bouchardat, Fehling.
3.2.3. Trang thiết bị
Tủ sấy KC-65.
Cân phân tích Meltler Toledo AB-204.
Máy cô quay BUCHI (Đức).
Đèn soi UV-VIS DESAGA SARSTEDT GRUPPE.
Máy đo UV: Heλios γ Thermo Spectronic (UNICAM-UK).
Bản nhôm tráng sẵn, loại silicagel 60 F254 (Merck).
Bồn siêu âm Elma LC60H (Đức).
Bếp cách thủy Memmert (Đức).
Tủ sấy chân không VWR S/P.
Bình sắc kí lớp mỏng.
3.3. Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật bằng phản ứng hóa học
Các phân tích này được thực hiện theo phương pháp của trường Đại học Dược
khoa Rumani đã được cải tiến với mục đích nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của
các dược liệu cần nghiên cứu để làm cơ sở định hướng cho việc chiết xuất các hợp
chất trong cây thuốc và đánh giá chất lượng các sản phẩm này.

13


Nguyên tắc: dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất trong dược liệu để
tách chúng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần. Sau đó xác định hợp chất
chính bằng phản ứng đặc trưng.
3.3.1. Chuẩn bị dịch chiết
3.3.1.1. Chiết dịch chiết ether
Chiết khoảng 20 g bột dược liệu (có thể ít hơn hay nhiều hơn, tùy điều kiện
thực hiện và nguyên liệu cụ thể) bằng 20 ml diethyl ether trong bồn siêu âm khoảng
10-20 phút. Chiết cho đến khi dịch chiết ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn
mờ trên mặt kính đồng hồ, thực hiện 2 - 3 lần. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn

khoảng 50 ml dịch chiết ether.
3.3.1.2. Chiết dịch chiết cồn
Bã dược liệu được chiết tiếp bằng cồn cao độ (hoặc methanol) khoảng 20 ml
trong bồn siêu âm, thực hiện 2 - 3 lần. Gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn
khoảng 50 ml dịch chiết cồn.Phần lớn dịch chiết cồn được dùng để định tính trực tiếp
các nhóm hợp chất.
Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân.
Lấy 15 ml dịch chiết cồn cho vào cốc thủy tinh, thêm 10 ml acid hydrocloric 10 %
đánh trong bồn siêu âm 30 phút. Để nguội cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết
bằng ether (15 ml × 3 lần). Dịch ether được dùng để định tính các aglycon.
3.3.1.3. Chiết dịch chiết nước
Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóng với 20 ml nước trong
bình siêu âm. Gộp các dịch chiết, để nguội, lọc (và cô lại nếu cần) để thu được 50 ml
dịch chiết nước.Phần lớn dịch chiết nước được dùng để định tính trực tiếp các nhóm
chất.Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân.
Lấy 15 ml dịch chiết nước cho vào cốc thủy tinh, thêm 10 ml acid hydrocloric
10 % đánh trong bồn siêu âm 30 phút. Để nguội cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và
chiết bằng ether (15 ml × 3 lần). Dịch ether được dùng để định tính các aglycon.
3.3.2. Xác định các nhóm hợp chất
3.3.2.1. Xác định các chất tan trong dịch ether
Dịch ether được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau:
1. Chất béo 4. Triterpenoid tự do

7. Anthraquinon

2. Tinh dầu 5. Alkaloid

8. Flanoid
14



3. Carotenoid 6. Coumarin
9 Xác định chất béo
Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng giấy mỏng, hơ
hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Nếu
tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ: có chất béo.
9 Xác định tinh dầu
Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Nếu cắn có mùi thơm
nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ, rồi lại bốc hơi cho tới cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ
đặc trưng: có tinh dầu.
9 Định tính carotenoid
Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn (và gần như
không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Thêm vào cắn vài giọt H2SO4đđ. Dung
dịch có màu xanh dương đậm hay màu xanh lục ngả sang màu xanh dương: có
carotenoid.
9 Định tính triterpenoid
Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn
với 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung
dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1 - 2 ml
H2SO4đđ lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi
tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên
dần dần chuyển sang màu xanh lục hay tím: có triterpenoid (phytosterol hoặc các
triterpen) tự do.
9 Định tính alkaloid
Lấy khoảng 10 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong
2 -4 ml dung dịch acid hydroclorid 1 %. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ.
Định tính alkaloid bằng các thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff.
Thuốc thử Mayer: tủa trắng - vàng nhạt.
Thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ nâu.
Thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ cam.

So sánh kết quả với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hơn so với
ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid

15