BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ NHIỄM PCV2 TRÊN CÁC LOẠI MẪU:
HUYẾT THANH, HẠCH VÀ PHÂN TỪ HEO CÒI BẰNG KĨ
THUẬT PCR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: PHẠM THỊ HUYỀN TRANG

Niên khoá

: 2006 – 2010

Tháng 7/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ NHIỄM PCV2 TRÊN CÁC LOẠI MẪU:
HUYẾT THANH, HẠCH VÀ PHÂN TỪ HEO CÒI BẰNG KĨ
THUẬT PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

PHẠM THỊ HUYỀN TRANG

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên con xin bày tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ cùng những người thân trong gia
đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em
trong suốt quá trình học tập tại trường.
Các Thầy Cô và anh chị tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường
Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho em trong suốt quá trình thực tập .
Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động
viên em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận
Kỹ sư Võ Khánh Hưng, chị Bùi Thị Kim Hằng đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn em
trong quá trình thực hiện đề tài.
Tập thể lớp Công nghệ Sinh học khóa 32 và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận.

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2010
Phạm Thị Huyền Trang

i


TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát sự nhiễm Porcine circovirus type 2 trên các mẫu : huyết thanh,
hạch, phân từ heo còi bằng kĩ thuật PCR” được thực hiện nhằm mục đích tìm ra
phương hướng chẩn đoán sớm PCV2.
Đề tài được tiến hành gồm ba nội dung: phát hiện PCV2 bằng kỹ thuật PCR từ
các loại mẫu khác nhau; phân tích trình tự của PCV2 thu nhận được và tiến hành xây
dựng cây sinh dòng.
Bằng kỹ thuật PCR phát hiện được 47 ca dương tính với PCV2 trên tổng số 57
heo được khảo sát chiếm tỷ lệ 82,4 %.
Tỷ lệ dương tính với PCV2 theo biểu hiện lâm sàng: 29/31 heo có biểu hiện còi
cọc, 3/5 heo có biểu hiện viêm da; 15/21 heo bình thường.
Tỷ lệ dương tính theo hạng heo: 22/24 heo cai sữa, 21/26 heo thịt, 3/7 heo nái
Tỷ lệ dương tính trên các loại mẫu khảo sát: 12 ca dương tính với PCV2 trên 12
mẫu hạch, 16 ca dương tính trên 25 mẫu huyết thanh và 27 ca dương tính trên 35 mẫu
phân.
Xây dựng được cây sinh dòng từ 3 chủng PCV2 phân lập từ 2 trại heo trên địa
bàn Thành Phố Hồ Chí Minh và 1 trại heo tại Đồng Nai cùng với 23 chủng PCV từ
ngân hàng gene.
Có thể sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện PCV2 từ mẫu máu hoặc mẫu phân thu
nhận trên heo còn sống mà không phải giết mổ, trong đó mẫu phân là mẫu tốt nhất
dùng để chẩn đoán PCV2. Hiện tại chưa có sự biến đổi nhiều về cấu trúc di truyền

giữa các chủng PCV2 tại Việt Nam và thế giới.

ii


SUMARY

The thesis title "Detection of Porcine circovirus infection type 2 on the serum,
ganglion and feces from pigs with PCR technology" aims to early diagnosis PCV2.
Topic was including three content: detected PCV2 by PCR technique from the
different samples; sequence analysis of PCV2 obtained and build phylogenetic tree.
By PCR technique detected 47/57 case positive with PCV2 proportion of 82.4%.
The rate of pigs positive for PCV2 with the clinical symptoms: 29/31 stunted pig,
3/5 dermatitis pig; 15/21 normal pig
The rate of positive pigs in group: 22/24 weaned pigs; 21/26 pig meat; 3/7 sows
Positive rate on the survey samples: 12/12 ganglions samples, 17/25 serum
samples, and 27/35 feces samples positive for PCV2.
Phylogenetic tree was build with two strains of PCV2 obtained from 2 farms in
Ho Chi Minh City and one strain of PCV2 obtained from 1 farm of Dong Nai province
in comparing with 23 PCV2 isolation from gene bank
the PCR technique could detect easily PCV2 from serum or feces samples
collected on alive pig. There are not much of change in genetic between PCV2 strains
in Viet Nam and on the world.

iii


MỤC LỤC
TRANG
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i

TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii
SUMARY ...................................................................................................................... iii
DÁCH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài .................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...............................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3
2.1. Giới thiệu hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa ................................................3
2.1.1. Dịch tễ học .....................................................................................................4
2.1.2. Cơ chế sinh bệnh ............................................................................................5
2.1.3. Triệu chứng và bệnh tích................................................................................5
2.1.3.1. Triệu chứng .............................................................................................5
2.3.3.2 Bệnh tích...................................................................................................6
2.2. Porcine circovirus .................................................................................................7
2.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất .....................................................................7
2.2.2. Cấu trúc bộ gen của PCV ...............................................................................8
2.3. Chẩn đoán ...........................................................................................................10
2.5 Một số công trình nghiên cứu chẩn đoán PCV2 trong và ngoài nước.................13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................15
3.1. Thời gian và địa điểm: ........................................................................................15
3.2. Đối tượng khảo sát và số lượng mẫu: .................................................................15
3.3. Vật liệu và dụng cụ .............................................................................................16
3.3.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR ..............................................16
3.3.2. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách DNA và PCR .......................................16
3.3.3. Vật liệu cho phản ứng PCR..........................................................................17
iv



3.3.4. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm PCR ..........................................19
3.4. Các bước tiến hành .............................................................................................19
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu.............................................................19
3.4.1.1. Thu nhận và xử lý mẫu huyết thanh: .....................................................19
3.4.1.2. Thu nhận và xử lý mẫu hạch. ................................................................20
3.4.1.3. Thu nhận và xử lý mẫu phân .................................................................21
3.5.2 Thực hiện phản ứng PCR ..............................................................................22
3.4.2.1 Thực hiện phản ứng PCR bằng máy luân nhiệt với các thông số sau ....23
3.4.2.2 Điện di sản phẩm ....................................................................................23
3.5. Phân tích trình tự gene PCV2 .............................................................................24
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................26
4.1. Kết quả phát hiện PCV2 bằng phương pháp PCR ..............................................26
4.2. Tỷ lệ heo dương tình với PCV2 theo biểu hiện lâm sàng...................................28
4.3. Tỷ lệ nhiễm PCV2 trên các nhóm heo ................................................................29
4.4. Kết quả phát hiện PCV2 trên 3 loại mẫu: mẫu hạch, huyết thanh và phân ........30
4.5. Giải trình tự và xây dựng cây sinh dòng PCV2 ..................................................32
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................35
5.1. Kết luận ...............................................................................................................35
5.2. Đề nghị ................................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................36
PHỤ LỤC

v


DÁCH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PMWS


Post - Weaning Multisystemic Wasting Syndrome

PCV1

Porcine circovirus type 1

PCV2

Porcine circovirus type 2

PPV

Porcine parpovirus

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

DN

Đồng Nai

Tp.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

PRRSV

Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus


PCR

Polymerase chain reaction

AHL

Animal Health Laboratory

DNA

Deoxyribonucleic acid

ORF

Open reading frames

RF

Double- stranded Replicate Form

IIP

Indirect immunoperoxidase

IFA

Indirect Immunoflourescence assay

ELISA


Enzyme linked immunosorbent assay

ICC

Immunocytochemistry

ISH

In situ hybridization

CTV

Cộng tác viên

CS

Cộng sự

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.2 Virion của PCV ........................................................................................................... 7
Hình 2.3 So sánh cấu trúc steem-loop của PCV1 và PCV2 ...................................................... 9
Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen của PCV2 với 6 khung đọc mở ........................................................ 9
Hình 2.5 Nguyên tắc phản ứng PCR ........................................................................................ 12
Hình 3.1 Kết quả align primer F của PCV1 ............................................................................. 17
Hình 3.2 Kết quả align primer R của PCV1 ............................................................................ 17
Hình 3.3 Kết quả align primer F của PCV2 ............................................................................. 18

Hình 3.4 Kết quả align Primer R của PCV2 ............................................................................ 18
Hình 4.1 Heo còi dương tính với PCV2 .................................................................................. 26
Hình 4.3 Heo bị viêm da nặng nhất là ở sau mang tai. ............................................................ 27
Hình 4.4 Kết quả phát hiện PCV ............................................................................................. 27
Hình 4.5 Kết quả align trình tự PCV2 ..................................................................................... 32
Hình 4.6 Cây sinh dòng PCV2................................................................................................. 33

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 3.1 Bảng tổng hợp số lượng mẫu .........................................................................15
Bảng 3.2 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR ......................................................23
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................................23
Bảng 4.1 Tỷ lệ heo dương tính PCV2 theo biểu hiện lâm sàng. ...................................28
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm PCV2 theo nhóm heo ................................................................29
Bảng 4.3 Kết quả phát hiện PCV2 trên các mẫu...........................................................30
Bảng 4.4 Tỷ lệ dương tính PCV2 trên 2 loại mẫu ........................................................31

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam trong những năm gần đây, các nhà chăn nuôi heo nước ta luôn phải
đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc phòng và chữa trị bệnh trên heo. Trong đó,
hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (Post Weaning Multisystemic Wasting
Syndrome - PMWS) mới được phát hiện gần đây đã gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng.

Đây là một bệnh truyền nhiễm do virus gây ra trên heo sau cai sữa. Mặc dù căn bệnh
diễn biến chậm nhưng tăng dần lên với mức độ nguy hại cao.
Virus gây bệnh PMWS là một DNA virus chuỗi đơn, thuộc họ Circoviridae,
giống Circovirus thường được gọi là porcine circovirus (PCV). Khi nghiên cứu về
PCV người ta nhận thấy có đến 2 loại PCV: PCV1 và PCV2. PCV1 xuất hiện đã lâu và
không gây bệnh trên heo. PCV2 mới xuất hiện gần đây và gắn liền với bệnh (Nguyễn
Ngọc Hải, 2007).
Ngày nay có rất nhiều phương pháp để chẩn đoán PCV2, trong đó kỹ thuật PCR
được ứng dụng rộng rãi nhất nhờ ưu điểm chẩn đoán nhanh, có độ nhạy và độ chính
xác cao. Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR chẩn
đoán và khảo sát tình hình nhiễm PCV2. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu khảo
sát trên mẫu mô do đó việc thu nhận mẫu rất khó khăn đòi hỏi phải giết mổ heo bệnh.
Dịch bệnh do PCV2 gây ra ngày càng lan rộng và gây thiệt hại kinh tế trầm
trọng. Việc xác định nhanh, sớm và chính xác sự hiện diện của virus khi heo mới có
biểu hiện bệnh lâm sàng có tầm quan trọng rất lớn, là cơ sở cho công tác phòng trị
bệnh và các nghiên cứu về sau.
Từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Khảo sát sự nhiễm
PCV2 trên các loại

mẫu: máu, hạch, phân từ heo còi bằng kĩ thuật PCR”.

1


1.2. Yêu cầu của đề tài
Ghi nhận một số biểu hiện bệnh lâm sàng và bệnh tích trên heo được chọn lấy
mẫu.
Thu nhận được mẫu tốt dùng cho chẩn đoán bằng kĩ thuật PCR xác định sự hiện
diện của virus trên 3 loại mẫu máu, hạch, phân.
Xác định tỉ lệ nhiễm PCV2 giữa các mẫu.

1.3. Nội dung thực hiện

Ghi nhận một số biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo được chọn lấy mẫu
Ứng dụng kĩ thuật PCR phát hiện PCV2 trên các loại mẫu thu nhận được: máu,
hạch, phân.
Phân tích trình tự bộ gen của chủng PCV2 phân lập được và so sánh với trình tự
gene của các chủng PCV2 phân lập được trên thế giới.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa
PMWS (Post - Weaning Multisystemic Wasting Syndrome) đã trở thành một vấn
đề nhận được nhiều sự quan tâm trên thế giới trong những năm qua, đặc biệt là tại
Canada, Mỹ, Châu Âu và Châu Á. Hội chứng gầy còm trên heo con sau cai sữa
(PMWS) được ghi nhận lần đầu tiên trên một đàn heo ở Canada vào năm 1991. Trên
đàn heo này, một số heo sau cai sữa khoảng hai tuần bắt đầu có biểu hiện còi cọc và
không có đáp ứng tốt với việc điều trị. Cho đến nay, bệnh được phát hiện trên nhiều
đàn heo ở Mĩ, nhiều nước Châu Âu, Châu Á và đã gây thiệt hại kinh tế rất lớn trong
ngành chăn nuôi heo công nghiệp ở những nước này.
Hội chứng PMWS thường xuất hiện ở heo lứa tuổi từ 6 đến 18 tuần tuổi, tỉ lệ
chết có thể đến 30% ở một số đàn heo. Bệnh xuất hiện với những triệu chứng điển
hình như gầy còm nhanh, thở khó, tiêu chảy thỉnh thoảng có một số heo bị vàng da,
nhạt màu…
Nguyên nhân gây ra bệnh là do một loại virus có tên là porcine circovirus type 2
gọi tắt là PCV2: một loại virus DNA chuỗi đơn, vòng, không có vỏ bọc, thuộc họ
Circoviridae. Virus này mới được phân lập vào năm 1997. Virus PCV2 được xem là
yếu tố tiền phát gây suy yếu hệ miễn dịch làm heo dễ bị nhiễm kế phát một số mầm

bệnh khác và làm triệu chứng trầm trọng hơn.
PMWS gây thiệt hại kinh tế đáng kể và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe đàn heo
trong ngành chăn nuôi heo công nghiệp của nhiều quốc gia.
Trong một cáo cáo gần đây của susy carman năm 2007 về ảnh hưởng của PCV2
gây bệnh PMWS trên heo cho thấy tốc độ lây lan của bệnh tăng lên đáng kể từ năm
2004 – 2006.

3


Hình 2.1 Tổng số trường hợp bệnh do PCV2 và tỉ lệ phần trăm tương ứng trong
tổng số các trường hợp heo bệnh được gởi về AHL từ năm 1998 đến năm 2006.
(nguồn Susy Carman, 2007).
Các nước Châu Âu có trên 8 triệu heo mắc hội chứng này mỗi năm và thiệt hại
do PMWS được ước tính từ 562 - 900 triệu EURO hàng năm.
PMWS có chiều hướng lây lan rộng trên khắp thế giới nhưng những hiểu biết về
bệnh vẫn còn hạn chế, vì thế các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu và tìm cách
khống chế căn bệnh này.
2.1.1. Dịch tễ học
Hội chứng PMWS do PCV2 gây ra thường tác động trên heo trên 3 tuần tuổi và
hiện rõ hơn từ 4-6 tuần tuổi trở đi. Giai đoạn nguy hiểm là từ 8-13 tuần tuổi. Heo con
có hàm lượng kháng thể mẹ tuyền cao thường không nhiễm bệnh.( Lâm Thị Thu
Hương và cs, 2005).
PCV2 phân bố nhiều trên các cơ quan nội tạng đặc biệt là hạch bạch huyết.
Ngoài ra, virus còn được tìm thấy trong xoang mũi, phân, nước tiểu, mẫu máu của heo
con cũng như trong tinh dịch của heo đực. Sự bài tiết virus sau khi gây nhiễm thử
nghiệm của đàn heo với PCV2 đã được báo cáo. Sau khi gây nhiễm trên heo tri nhiễm
1 ngày tuổi với PCV2, acid nucleic của virus đã được phát hiện trong phân, nước bọt
và nước mắt của heo sau 31 ngày gây nhiễm (Ellis và cs, 2000).


4


PCV2 có thể lây truyền ngang hoặc dọc theo các đường hô hấp, đường máu,
nhau thai và đường sinh dục. Bệnh chủ yếu lây truyền từ heo bệnh sang heo khỏe qua
phân, qua tiếp xúc trực tiếp, mật độ chăn nuôi cao, stress… PCV2 có thể lan truyền
giữa các đàn khi chuyển heo từ đàn này sang đàn khác hoặc thông qua những động vật
trung gian mang mầm bệnh như chuột, chim….
Ngoài ra PCV2 có trong tinh dịch của những nọc bị nhiễm bệnh có thể lây truyền
virus qua giao phối (Kim và ctv, 2002).
2.1.2. Cơ chế sinh bệnh
Hiện nay cơ chế gây bệnh của PCV2 chưa được hiểu rõ , sau khi gây bệnh thực
nghiệm qua đường mũi hay tiêm tĩnh mạch, người ta nhận thấy có sự hiện diện virus
trong bạch cầu đơn nhân và đại thực bào ở phổi, hạch hạnh nhân, lách, hạch lympho và
những cơ quan khác trong hệ thống miễn dịch.
Khi virus xâm nhập vào cơ thể, trong những ngày đầu virus có thể sinh sản
không kiểm soát trong tế bào miễn dịch sơ khai, sự sinh sản nhanh chóng của virus
phá hủy nhanh chóng hệ thống miễn dịch của heo con, do đó heo trở nên nhạy cảm
hơn với các tác nhân gây bệnh khác. Trong một nghiên cứu về sự đồng nhiễm của
PCV2 (S. Krakowka, 2001) cho thấy khi nhiễm thứ cấp PCV2 với một số loại virus
khác như: porcine parpovirus (PPV), PRRSV thì biểu hiện bệnh PMWS điển hình
hơn và bệnh xảy ra trầm trọng hơn so với khi heo nhiễm một mình PCV2.
PCV2 được xem như yếu tố mở đường cho những virus và vi khuẩn khác xâm
nhiễm và gây bệnh. Tuy nhiên biểu hiện bệnh phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn
dịch của heo.
2.1.3. Triệu chứng và bệnh tích
2.1.3.1. Triệu chứng
Biểu hiện lâm sàng của PMWS thay đổi khác nhau tùy vào mầm bệnh phụ
nhiễm, một số tá chất trong vaccine, hoặc phụ thuộc vào công tác quản lý…
Trên heo sau cai sữa và heo thịt: bệnh tiến triển chậm, tỷ lệ bệnh chết cao trên

tổng số heo bệnh. Heo kém vận động, ốm, giảm cân, lông khô, da xanh đôi khi trở nên
vàng. Quanh hạch bạch huyết sưng, đặc biệt hạch ở giữa hai chân sau, có thể có tiêu
5


chảy (30 %), thở khó do viêm phổi kẽ. Một số con có triệu chứng thần kinh. Tỷ lệ heo
bệnh trong đàn có thể từ 3-50% và tỉ lệ chết có thể lên đến 80% trong số những heo bị
nhiễm bệnh.
PWMS đồng nhiễm với hội chứng viêm da, bệnh thận ở heo (Porcine Dermatitis
and Nephropathy Syndrome - PDNS) gây chết đột ngột (tỷ lệ chết 6 – 10 %) trên đàn
heo bệnh. Bệnh biểu hiện qua viêm vành tai, viêm da phía sau đùi, nặng hơn viêm da
toàn thân (giống triệu chứng viêm da tiết dịch do nhiễm Staphylococcus), bệnh có thể
kéo dài nhiều tháng trong đàn, từ nhóm này sang nhóm khác. Điều trị hiệu quả không
cao.
2.3.3.2 Bệnh tích
Bệnh tích đại thể: Bệnh tích đại thể chủ yếu là tổn thương mô nhất là mô bạch
huyết và mô phổi. Lách và nhiều hạch bạch huyết sưng to. Phổi bị xơ, cứng, dai, nặng,
không bị xẹp khi bóp mạnh. Lách cũng sưng lớn nhưng không sung huyết. Vùng nối
thực quản với dạ dày bị loét, vách dạ dày sưng, ruột viêm, thành ruột mỏng. Ngoài ra
bệnh tích viêm gan, thận sưng lớn đồng thời phù thủng cũng có thể được tìm thấy.
“Heo nái nhiễm PCV2 có thể bị sẩy thai, thai khô, heo con chết khi sinh và bị viêm cơ
tim nặng” (dẫn liệu Lâm Tiến Dũng, 2003).
Bệnh tích vi thể: Bệnh tích đặc trưng tại các cơ quan lympho là sự suy giảm tế
bào lympno. Đại thực bào nhiều nhân thường xuất hiện, đặc biệt là tại mảng Peyer’s và
hạch bạch huyết. Thể vùi trong bào tương và lympho bào hoại tử cũng hiện diện ở
mảng Peyer’s và hạch hạnh nhân. (Lâm Thị Thu Hương và cộng sự, 2005)
Xét nghiệm mô học thường thấy viêm phổi kẽ,u mô bào lympho. Phổi bị bong
tróc một phần hay toàn phần với sự hiện diện của những tế bào biểu mô xơ hóa, xuất
hiện tế bào có nhiều nhân khổng lồ, suy giảm hạch bạch huyết và sự xuất hiện của
kháng thể chống PCV2 trong cơ quan đại thực bào của tế bào chất. Một số biến đổi

khác xảy ra trong gan và thận (Susy Carman và ctv, 2007).

6


2.2. Porcine circovirus
2.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất
PCV được xác định vào năm 1970 là một virus không gây bệnh tích tế bào khi
gây nhiễm trên môi trường tế bào thận heo ( PK15 – pig kidny cell line 15). Cùng với
virus gây bệnh thiếu máu gà và virus gây bệnh trên mỏ và lông chim mỏ vẹt, PCV đã
được phân loại vào họ virus mới gọi là circoviridae (Ellis và cs, 1999)
Circovirus là những virus nhỏ nhất lây nhiễm sang động vật có vú được công
nhận. Virus không có vỏ bọc, hình khối 20 mặt, khích thước vào khoảng 17 nm, đường
kính 15 - 24 nm. Bộ máy di truyền là một vòng DNA chuỗi đơn (Ellis và cs, 1999).

Hình 2.2 Virion của PCV (nguồn M. Allan, 2000).
Trước đây PCV được cân nhắc là virus không gây bệnh. Gần đây, các nghiên cứu
về PCV tiếp tục phát triển và đã phát hiện một loại kháng nguyên và cấu trúc bộ gene
PCV khác biệt trên đàn heo. Virus mới này có độc tính cao và là nguyên nhân gây
bệnh trên heo được gọi là porcine circovirus type 2 ( PCV2). Chủng PCV gốc không
gây bệnh được gọi là porcine circovirus type 1 ( PCV1).
PCV1 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1974, nhiễm phổ biến trên các đàn
heo trên thế giới. Một lượng kháng thể huyết thanh chống PCV1 đã được phát hiện từ
những heo bị bệnh còi. Tuy nhiên, khi tiến hành thử nghiệm lây nhiễm trên heo mới
sinh thì không gây triệu chứng bệnh lâm sàng và PCV1 được kết luận là yếu tố không
gây bệnh.

7



PCV2 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1991 trên đàn heo ở phía tây Canada.
Kháng thể chống PCV2 đã được phát hiện trong huyết thanh trên đàn heo nuôi tại Bỉ
năm 1985. Từ những nghiên cứu ban đàu cho thấy khi gây nhiễm trên heo, heo có một
số biểu hiện tổn thương đặc trưng của bệnh PMWS. Tuy nhiên, nguyên nhân gây bệnh
còn là do sự nhiễm thứ cấp của một số virus và vi khuẩn như PPV hay PRRS cùng với
yếu tố môi trường và kĩ thuật chăm sóc (G. Allan at al, 2000)
Mật độ nổi của PCV1 trong CSCl là 1,33 - 1,34 g/cm3 ( G. allan và cs 2000). Hệ
số lắng của PCV là 57s và nhân lên tốt trên môi trường PK-15. PCV không có tính
chất gây ngưng kết hồng cầu của một số động vật và có khả năng đề kháng cao với
một số chất sát trùng mạnh như (ethanol, chloroform, formaldehyde…). Nó có thể tồn
tại trong môi trường nhiều tháng, không bị bất hoạt ở Ph 3,0 và nhiệt độ 70oC trong 15
phút (Ellis và ctv , 1999). Để bất hoạt PCV2 có thể dùng sodium hydroxide với độ pha
loãng 1% (Royer và ctv, 2001).
2.2.2. Cấu trúc bộ gen của PCV
Kích thước của bộ gen của các phân lập PCV1 vào khoảng 1758 – 1760 bp và
của PCV2 là 1767 – 1768 bp. PCV sao chép thông qua khuôn sao chép sợi đôi
(Double- stranded Replicate Form – RF), cả 2 sợi PCV- RF đều phiên mã và mã hóa
thành các protein (Ellis và cs, 1999).
Phân tích bộ gen của PCV2 phân lập từ Bắc Mỹ và Châu Âu cho thấy chúng
thuộc về một nhóm có quan hệ mật thiết với hơn 96% trình tự Nu tương đồng, trong
khi so sánh trình tự gen giữa PCV1 và PCV2 thì chỉ có khoảng 80% trình tự Nu tương
đồng. Các phân lập PCV2 có nhiều kiểu gen khác nhau và được xếp vào 2 nhóm
chính: PCV2a và PCV2b.
Bộ gene của PCV1 và PCV2 có cấu trúc steem-loop và các trình tự
nonanucleotide motif gần giống nhau. Đây là vùng được xem là cần thiết cho sự nhân
lên của virus.

8



Hình 2.3 So sánh cấu trúc steem-loop của porcine circovirus type 1 và 2 (nguồn
Andrel, 1998). a, cấu trúc stem-loop dạng thẳng của PCV1 và PCV2. Dấu sao chỉ các
trình tự Nu tương đồng; b, cấu trúc steem-loop dạng vòng mô phỏng từ hình a.

PCV1 có 7 khung đọc mở - open reading frames (ORFs) có khả năng mã hóa các
protein có kích thước lớn hơn 5 KDa, PCV2 có 6 khung đọc mở.

Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen của porcine circovirus type 2 với 6 khung đọc mở
(nguồn Andrel, 1998).

9


ORF1 của PCV1 kích thước 936 Nu và của PCV2 kích thước là 942 Nu, tương
đồng khoảng 83% về trình tự nucleotic và 86 % axit amin giữa PCV1 và PCV2
(Nguyễn Ngọc Hải, 2007). ORF1 mã hóa protein liên quan đến sự nhân lên của virus,
sản phẩm protein mã hóa có kích thước 35,7kDa (Mankertz et al.,1998a). ORF1 được
gọi là rep gen.
ORF2 mã hóa protein vỏ capsid. ORF2 ở cả PCV1 và PCV2 điều có kích thước
699 nu chỉ tương đồng 67% về trình tự nucleotide và 65% axit amin. Sản phẩm protein
mã hóa có kích thước 27,8 kDa. ORF2 được gọi là cap gen. Khi giải mã trình tự gen
khung đọc mở ORF2 của vỏ capsid virus, những phân lập PCV2 ở châu Mỹ có tính
tương đồng rất cao với các phân lập PCV2 khác trên thế giới. Mặc dù có một số khác
biệt về gen của ORF2 nhưng vùng gen mã hóa đầu N cuối (N- terminal region) của
ORF2 gần như không thay đổi ở tất cả các phân lập virus được nghiên cứu (Nguyễn
Ngọc Hải, 2007).
Gần đây, gen ORF3 của PCV2 cũng được nghiên cứu. Gen ORF3 có kích thước
315bp. ORF3 có vai trò cảm ứng virus gây ra hiện tượng apoptosis. Tuy nhiên, ORF3
không cần thiết cho viêc nhân rộng của virus và các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng
apoptosis chưa phải là đặc tính đáng lưu ý trong việc phát triển thương tổn lympho do

PMWS (Resendes AR, Majo Nl, Segales J, Mateu E, Calsamiglia M, Domingo
M,2004). Ý nghĩa của các ORFs còn lại vẫn chưa được hiểu biết nhiều.
2.3. Chẩn đoán
Chẩn đoán PMWS cần dựa vào 3 tiêu chí: Biểu hiện lâm sàng, bệnh tích đặc
trưng và xét nghiệm chứng minh acid nucleic hoặc kháng nguyên của PCV2 liên quan
bệnh tích đặc trưng.
Các phương pháp phát hiện PCV2:
¾

Phương pháp huyết thanh học: Sử dụng các phương pháp Indirect

immunoperoxidase (IIP), Indirect Immunoflourescence assay (IFA), ELISA…. để phát
hiện kháng thể kháng PCV2. Phương pháp ELISA cạnh tranh hiện được sử dụng nhiều
để chẩn đoán PCV2 do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, phương pháp huyết

10


thanh học chẩn đoán PCV2 cần được lưu ý do có thể xảy ra hiện tượng nhiễm chéo
giữa PCV1 và PCV2, sự đồng nhiễm của PCV2 với các virus khác như PPV, PRRSV
gây khó khăn cho việc chẩn đoán.
¾

Phương pháp mô hóa miễn dịch (immunocytochemistry – ICC) và lai in situ

(in situ hybridization – ISH) được dùng để phát hiện kháng nguyên PCV2 trực tiếp
trên mô bệnh. Trong đó kỹ thuật ICC được đánh giá là nhạy hơn so với kỹ thuật ISH.
¾ Phương pháp nuôi cấy tế bào: PCV2 được phân lập trên môi trường tế bào
PK15 ly trích từ những mô của heo không bị nhiễm PCV1. Phương pháp này chủ yếu
phục vụ cho việc bào chế vaccine và định type virus.

¾

Phương pháp PCR: đây là phương pháp có độ nhạy, độ chính xác cao và ít tốn

thời gian nên được sử dung chủ yếu để chẩn đoán PCV2 phân biệt với PCV1.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA
dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng
bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của
đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo
dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của
DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng
lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể
thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như
vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu
về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các
primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
như sau :
• Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử
(94 – 95 0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách
11


thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp
2 mạch bổ sung mới.
• Bước 2: (Bắt cặp, annealing)

Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các
primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này
dao động trong khoảng 55 – 65 0C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt
cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
• Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)
Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới
tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc
bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự
DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n
m: số bản sao của chuỗi mã hóa.
n: số chu kỳ.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản
sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích
đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.

Hình 2.5 Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999)
12


2.5 Một số công trình nghiên cứu chẩn đoán PCV2 trong và ngoài nước
Trong nước
Lâm Thị Thu Hương và ctv (2005) khảo sát tỷ lệ nhiễm PCV2 cho biết tỉ lệ
dương tính với PCV2 trên heo còi tại một số trại heo công nghiệp ở thành phố HCM
và vùng phụ cận biến động rất lớn từ không nhiễm đến 60 % trong tổng 25 bộ mẫu
hạch của 25 heo xét nghiệm
Lê Thị Hồng Hạnh (2005) đã ứng dụng kỹ thuật PCR báo cáo tỉ lệ heo dương
tinh với virus PCV2 cao nhất thuộc nhóm heo 9-11 tuần tuổi (40%), thấp nhất ở nhóm
heo 12-18 tuần tuổi (28,58%)

Theo Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2006) bằng kỹ thuật miễn dịch trên tế bào
một lớp (IPMA) đối với các mẫu máu lưu trữ từ năm 2000 của một số tỉnh thành phía
nam, trong đó có Tp.HCM đã phát hiện kháng thể PCV2 trong điều kiện vẫn chưa có
vaccine chủng ngừa bệnh này.
Trên thế giới
Harmel và ctv(1998) đã thiết kế mồi cho kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn DNA
đặc trưng của virus PCV2 có kích thước 361bp
Ellis và ctv (1998) đã nghiên cứu thành công kỹ thuật PCR phát hiện PCV2. đoạn
mồi do tác giả thiết kế khuếch đại đoạn DNA đặc trưng của virus có kích thước 481
bp.
Larochelle và ctv (1999) đã nghiên cứu kỹ thuật PCR đa mồi nhằm phát hiện,
phân biệt các PCV type 1 và type 2. Kỹ thuật multiplex PCR khuếch đại đoạn DNA
đặc trưng của PCV1 trên khung đọc mở ORF1 có kích thước 349bp, và khuếch đại
đoạn DNA đặc trưng trên khung đọc mở ORF2 của PCV2 có kích thước 263bp.
Porntippa Nawagitgul, Igor Morozov, Steven R. Bolin, Perry A. Harms, Steven
D. Sorden, and Prem S. Paul (2000) ghi nhận ORF2 của PCV2 mã hóa protein capsid.

13


Mahé. D, Blanchard. P, Truong. C, Arnauld. C, Le Cann. P, Cariolet. R, Madec.
F, Albina. E and Jestin.A. (2000) ghi nhận sự khác nhau của protein ORF2 của type1
và type2 của PCV và sự nhận dạng của immunorelevant epitopes.
Kim và ctv (2002) cho biết kỹ thuật ISH tỏ ra hữu dụng để có thể phân biệt giữa
PCV1 và PCV2 ngay cả trong trường hợp nhiễm kép bởi những mầm bệnh khác như
PPV hoặc PRRS.
Neilly và ctv(2002) cho biết kỹ thuật mô hóa miễn dịch, phân lập định lượng
virus và ELISA phát hiện kháng nguyên đã phân biệt được heo nhiễm virus PCV2 hay
bệnh liên quan PCV2
Acaprioli và ctv (2006), đã nghiên cứu kỹ thuật PCR trong phân tách DNA

PCV2 trong mẫu máu, hạch và phân trong thí nghiệm gây nhiễm trên heo. Kết quả thu
được với sai biệt thống kê p=0,332 cho thấy khả năng phát hiện PCV2 trên cả 3 loại
mẫu là như nhau.
Năm 2009, Kwang Soo Lyoo, Hyeun Bum Kim and Han Soo Joo, Khảo nghiệm
đánh giá phương pháp nested PCR để phân biệt giữa hai kiểu gen của PCV2: PCV2a
và PCV2b. Kết quả là đã xây dựng được cây sinh dòng phân biệt 2 nhánh PCV2a và
PCV2b trên cây di truyền của PCV2.

14


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm:
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2010 đến tháng 6/ 2010
Địa điểm lấy mẫu: Một số trại heo trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và các
vùng phụ cận
Địa điểm phân tích: Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM
3.2. Đối tượng khảo sát và số lượng mẫu:
Các mẫu được lấy từ 57 con heo : 7 heo nái, 22 heo cai sữa, 28 heo thịt.
Dựa theo biểu hiện bệnh: 31 heo con từ 4 - 16 tuần tuổi có biểu hiện lâm sàng
nghi ngờ nhiễm bệnh PMWS (triệu chứng còi cọc), 5 heo có biểu hiện viêm da và 21
heo bình thường .
Bảng 3.1 Bảng tổng hợp số lượng mẫu
Nhóm heo

Heo cai sữa Heo thịt

Triệu chứng Heo còi


Heo nái

Heo viêm da

Heo bình thường

4

8

0

12

0

0

10

18

7

6

5

24


16

9

0

18

3

4

Tổng số

Loại mẫu
Mẫu hạch

Mẫu phân

Mẫu huyết thanh

Các số có màu chỉ số liệu mẫu được lấy theo triệu chứng
15

12

35

25