BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI
TRÊN CÀ CHUA BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN XUÂN NAM

Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 7/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI
TRÊN CÀ CHUA BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TRƯƠNG QUỐC ÁNH

NGUYỄN XUÂN NAM

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin cảm ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, trường
Đại học Nông lâm TP. HCM đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình
học tập.
Em xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Trương Quốc Ánh ở Viện Khoa học kỹ thuật
Nông nghiệp miền Nam, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên em trong quá trình
thực hiện đề tài. Em cũng xin cảm ơn tập thể các anh chị ở trong phòng Công nghệ sinh
học đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tại viện. Cảm ơn anh Khoa, bạn
Nhung đã cùng em thực hiện đề tài này.
Xin cảm ơn bạn bè trong và ngoài lớp đã giúp đỡ tôi về mặt tinh thần cũng như
đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành luận văn này.

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 7 năm 2010

Nguyễn Xuân Nam

 

i



TÓM TẮT
Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) là loại rau màu được trồng phổ biến
trên thế giới đứng thứ hai sau khoai tây. Cà chua chịu ảnh hưởng bởi nhiều loài côn
trùng và dịch bệnh trong đó bệnh sương mai gây ra bởi nấm Phytophthora infestans
(Mont) de Bary là bệnh nguy hiểm nhất. Tác nhân gây bệnh này tấn công trên cả lá,
thân, quả và hạt cà chua. Biện pháp hoá học sử dụng thuốc trừ nấm là biện pháp duy
nhất có hiệu quả hiện nay để kiểm soát bệnh. Chiến lược này làm tăng chi phí sản xuất
và ảnh hưởng đến môi trường với mức độ cao của thuốc trừ nấm. Sử dụng các giống
kháng là phương pháp hiệu quả để kiểm soát dịch bệnh này. Việc sử dụng kỹ thật chọn
lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS) có thể dễ dàng chọn tạo giống cà chua nhằm cải tiến các
tính trạng nông sinh học cũng như tính kháng bệnh.
Trình tự lặp lại đơn giản (SSR) rất phổ biến và thay đổi trong bộ gen của sinh
vật nhân thật. Cho nên đề tài dựa vào kết quả đánh giá kiểu hình để xác định giống
kháng và giống nhiễm bệnh sương mai. Sau đó thực hiện phản ứng PCR để tìm ra
marker SSR cho đa hình liên kết với gen kháng bệnh sương mai trên cà chua.
Kết quả đã xác định được marker TOM236 liên kết với gen kháng bệnh sương
mai Ph-3 nằm trên nhiễm sắc thể số 9 ở giống L3708. Tạo tiền đề cho chọn tạo giống
cà chua kháng bệnh sương mai.

 

ii


SUMMARY
Subject title “Evaluation of late blight resistant sources on tomato varieties by
molecular marker SSR”
The cultivated tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) is a worldwide-grown

vegetable crop in the second grade after potato. Cultivated tomato influenced by many
pest and disease which late blight caused by Phytophthora infestans (Mont.) de Bary is
a most devastating disease of tomato. This oomycete pathogen attacks leaves, stems,
fruits and seeds of tomato. Chemical spray containing fungicides is the only effective
method to control the disease. This strategy increases production costs and exposes the
environment to higher levels of fungicides. Introduction of resistant varieties is the
most effective measure to control this disease. The use of molecular markers can
facilitate tomato breeding through marker assisted selection (MAS) for improvement
of agronomic traits such as disease resistance. Simple sequence repeats (SSR) are not
only very common but also hyper variable among the types of tandem repetitive DNA
in the genome of eukaryotes. Result was identified TOM236 marker shown linkage
tighly to Ph-3 resistant gene located on chromosome 9 by L3708 tomato variety open
up for selection of Ph-3 resistant gene into cultivated tomato by masker asissted
selection.

 

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................... i
TÓM TẮT........................................................................................................................ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1

1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu .....................................................................................................................1
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................3
2.1. Giới thiệu về cà chua ................................................................................................3
2.1.1. Phân loại cây cà chua ............................................................................................3
2.1.2. Nguồn gốc..............................................................................................................3
2.1.3. Giá trị dinh dưỡng .................................................................................................3
2.1.4. Đặc tính thực vật....................................................................................................3
2.2. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và trong nước ...........................................4
2.2.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới................................................................4
2.2.2. Tình hình sản xuất cà chua trong nước..................................................................4
2.3. Bệnh sương mai trên cây cà chua .............................................................................6
2.3.1. Triệu chứng bệnh ...................................................................................................6
2.3.2. Nguyên nhân gây bệnh ..........................................................................................7
2.3.3. Biện pháp phòng trừ bệnh sương mai ...................................................................8
2.4. Các nghiên cứu về bệnh sương mai..........................................................................9
2.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới..................................................................................9
2.4.2. Các nghiên cứu trong nước..................................................................................11
2.5. DNA marker ...........................................................................................................12
2.5.1. Các loại DNA marker ..........................................................................................12

 

iv


2.5.2. Marker RFLP .......................................................................................................12
2.5.3. Marker AFLP.......................................................................................................13
2.5.4. Marker RAPD ......................................................................................................14

2.5.5. Marker SSR .........................................................................................................14
2.5.5.1. Khái niệm về microsatellite ..............................................................................14
2.5.5.2. Các loại microsatellite ......................................................................................15
2.5.5.3. Vai trò của microsatellite..................................................................................15
2.5.5.4. Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng phản ứng PCR ................................16
2.5.5.5. Ưu điểm của phương pháp microsatellite.........................................................17
2.5.5.6. Ứng dụng của phương pháp microsatellite.......................................................18
2.6. Phản ứng PCR ........................................................................................................19
2.6.1. Nguyên tác cơ bản của PCR ................................................................................19
2.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR...........................................................20
2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................................21
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................22
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................22
3.2. Vật liệu ...................................................................................................................22
3.2.1. Mẫu thí nghiệm....................................................................................................22
3.2.2. Hóa chất ...............................................................................................................22
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................24
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................24
3.3.1. Phương pháp đánh giá kiểu hình .........................................................................24
3.3.2. Phương pháp đánh giá kiểu gen ..........................................................................24
3.3.2.1. Phương pháp li trích DNA tổng số ...................................................................24
3.3.2.2. Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di ...........................................25
3.3.2.3. Định lượng DNA bằng máy đo quang phổ kế ..................................................25
3.3.2.4. Thực hiện phản ứng PCR với các marker SSR ................................................26
3.3.2.5. Xác định marker SSR liên kết với gen kháng bệnh sương mai........................27
4.1. Đánh giá kiểu hình..................................................................................................29
4.2. Đánh giá kiểu gen ...................................................................................................35
4.2.1. Kiểm tra DNA tổng số .........................................................................................35
4.2.2. Thực hiện phản ứng PCR với các primer SSR ....................................................35
 


v


Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................38
5.1. Kết luận...................................................................................................................38
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................39

 

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
al

: allele

AFLP

: Amplified Fragment Length Polymorphism

BC

: Backcross

cM

: centi Morgan


ctv

: cộng tác viên

DNA

: Deoxyribonucleotide Acid

dNTP

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

MAS

: Marker Assisted Selection

OD

: Optical Density

PCR

: Polymerase Chain Reaction

QTL

: Quantitative Trait Loci

RAPD


: Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP

: Restriction Fragment Length Polymorphism

SSR

: Simple Sequence Repeat

STR

: Short Tandem Repeats

Tm

: Melting temperature

UV

: Ultra violet

VNTR

: Variable Number of Tandem Repeats

 

vii



DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các loại DNA marker ................................................................................... 12
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR ..................................................... 26
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ............................................................... 26
Bảng 3.3 Danh sách các cặp primer sử dụng trong thí nghiệm ................................... 26
Bảng 4.1 Kết quả mức độ nhiễm bệnh trên tập đoàn cà chua ...................................... 29
Bảng 4.2 Thang điểm đánh giá mức độ kháng – nhiễm .............................................. 31
Bảng 4.3 Kết quả mức độ nhiễm bệnh đối với các giống có gen kháng...................... 32
Bảng 4.4 Kết quả lây nhiễm trên lá tách rời ................................................................ 34
Bảng 4.5 Kết quả lây nhiễm trên cây con .................................................................... 34

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cà chua bị bệnh sương mai ..............................................................................7
Hình 2.2 Bào tử nấm Phytophthora infestans.................................................................8
Hình 2.4 Marker SSR và phương pháp phát hiện ........................................................ 17
Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số........................................................................ 35
Hình 4.2 Kết quả PCR với primer SSR112 ................................................................. 35
Hình 4.3 Kết quả PCR với primer TOM236 ............................................................... 36

 

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) thuộc họ cà, có nguồn gốc từ Nam
Mỹ. Ngày nay, cà chua đã được trồng rộng rãi trên toàn thế giới với hàng ngàn giống,
đa dạng về màu sắc, hình dạng, sử dụng để ăn tươi và chế biến. Cà chua đã trở thành
cây màu có mức độ tiêu thụ nhiều thứ hai thế giới, sau khoai tây, với nhu cầu và sản
lượng ngày càng tăng. Việc thuần hóa, chọn lọc các giống cà chua đã được bắt đầu
thực hiện từ khoảng 200 năm trước, để làm tăng năng suất phục vụ cho nhu cầu ngày
càng gia tăng của con người đã làm tính đa dạng của nguồn gen ngày càng bị sói mòn,
làm tăng nguy cơ nhiễm dịch bệnh của cây trồng này. Do vậy, hiện nay cà chua trồng
trọt bị mẫm cảm với trên 200 bệnh khác nhau (nấm, vi khuẩn, tuyến trùng, vi rút).
Bệnh sương mai (late blight) gây hại bởi nấm Phytophthora infestans (Mont.)
de Bary là một trong những bệnh gây hại hủy diệt ở hầu hết các vùng cà chua và khoai
tây trên toàn thế giới. Bệnh có thể hại trong mọi thời gian sinh trưởng của cây, từ thời
kỳ cây mới phân cành đến suốt cả vụ. Nấm bệnh hại nhiều bộ phận của cà chua: thân,
lá, quả và hạt. Bệnh có thể tiềm ẩn trong đất, hạt giống và phát tán được trong không
khí. Để hạn chế bệnh sương mai có thể áp dụng một số kỹ thuật: Luân canh cây trồng;
sử dụng thuốc hóa học; sử dụng giống kháng bệnh, trong đó sử dụng giống kháng bệnh
là một trong những giải pháp rất quan trọng để quản lý dịch hại này. Tuy đã có một số
dòng cà chua kháng bệnh sương mai đã được chọn tạo nhưng những kết quả còn rất
hạn chế và cần phải tiếp tục nghiên cứu.
1.2. Yêu cầu
− Thu thập các mẫu giống cà chua kháng bệnh sương mai.
− Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh sương mai qua lây nhiễm nhân tạo.
− Xác định marker phân tử SSR liên kết với gen kháng bệnh sương mai trên cà
chua.
1.3. Nội dung thực hiện
− Lây nhiễm nhân tạo bệnh sương mai lên tập đoàn cà chua rồi đánh giá kiểu hình
của chúng.

 


1


− Thu thập mẫu lá các giống cà chua để ly trích DNA.
− Ly trích DNA tổng số từ lá cây cà chua.
− Thực hiện phản ứng PCR với các marker SSR.
− Xác định marker cho đa hình liên kết với gen kháng bệnh sương mai trên cà
chua.

 

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cà chua
2.1.1. Phân loại cây cà chua
Giới: Plantae
Ngành: Angiosperms
Lớp: eudicots
Bộ: Solanales
Họ: Solanaceae
Chi: Solanum
Loài: S. lycoperscium
Tên khoa học: Lycopersicon esculentum Mill.
2.1.2. Nguồn gốc
Cà chua có nguồn gốc ở vùng Trung và Nam châu Mỹ. Hiện nay, các dạng cà
chua hoang dại vẫn còn tìm thấy ở Bolivia, Chile, Ecuador và Peru. Cà chua được phổ
biến vào Trung Quốc và các nước Đông Nam Á khoảng thế kỉ thứ 17 và trở thành một
trong những loại rau quan trọng ở nhiều nước (Phạm Hồng Cúc, 2008).

2.1.3. Giá trị dinh dưỡng
Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, trong cà chua có nhiều loại
vitamin như A, C, B1, B2, PP, K nhưng nhiều nhất là vitamin C. Ngoài ra, còn có các
chất khoáng như Ca, Fe, P, S, Na, K, Mg và đường. Cà chua được sử dụng để ăn tươi,
nấu canh, chế biến cà chua khô, cà chua bột, tương cà chua. Mỗi người một ngày chỉ
cần ăn 100 – 200 g cà chua có thể thỏa mãn được nhu cầu vitamin C, A, B1 và các
khoáng chất chủ yếu (Nguyễn Văn Viên và Đỗ Tấn Dũng, 2008).
2.1.4. Đặc tính thực vật
Cà chua có bộ rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh. Do bộ rễ phân bố sâu và
rộng nên cây có sức hút nước và dinh dưỡng mạnh. Thân cà chua tròn, thẳng đứng,
mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân dần hóa gỗ, thân mang lá và chùm
hoa. Tùy khả năng tăng trưởng và phân nhánh, cà chua có 4 dạng hình: dạng vô hạn,
dạng hữu hạn, dạng bán hữu hạn và dạng bụi. Lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3 – 4 đôi
lá chét, ngọn lá có riêng lá đỉnh, rìa lá chét đều có răng cưa, phiến lá thường phủ lông
tơ. Cà chua có 3 dạng lá: dạng lá thông thường, dạng lá khoai tây và dạng lá trung gian.
 

3


Hoa mọc thành chùm trên thân, thông thường mỗi chùm có 6 – 12 hoa, đôi khi
có 30 – 100 hoa. Hoa lưỡng tính, tư thụ phấn là chính. Trái thuộc quả mọng nước, hình
dạng thay đổi từ tròn đến dài, vỏ trơn láng hay có khía, màu xanh và có lông khi còn
xanh, màu đỏ, hồng, cam hay vàng và trơn láng khi chín. Trái có 2 hay nhiều ngăn
chứa hạt. Trong trái xanh có chứa một lượng khá nhiều chất độc là tomatine, lượng
chất này giảm dần theo mức độ chín của trái và biến mất hoàn toàn khi trái chín. Hạt
nhỏ, dẹp, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối.
Theo Phạm Hồng Cúc (2008) trái cà chua chín theo 3 giai đoạn:
- Giai đoạn chín xanh: Trái phát triển đầy đủ về kích thước, có màu xanh sáng,
keo xung quanh hạt được hình thành, trái chưa có màu hồng hay vàng nhưng khi đem

dấm trái chín hồng.
- Giai đoạn chín vàng: Đỉnh trái xuất hiện màu hồng, xung quanh cuống trái
còn xanh, trái cứng, chịu được chuyên chở xa.
- Giai đoạn chín đỏ: Trái thể hiện màu đỏ hồng hay vàng của giống, trái bắt
đầu mềm, hạt trong trái phát tiển đầy đủ có thể thu làm giống. Trái chín đỏ dùng ăn
tươi hay chế biến, không thích hợp chuyên chở xa hay trữ lâu.
2.2. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và trong nước
2.2.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới
Cà chua là loại rau màu có mức tiêu dùng nhiều thứ 2 trên thế giới, sau khoai
tây (FAOSTAT, 2005). Năm 2004, diện tích trồng cà chua của Mỹ ước đạt 170.808 ha
(trong đó 50.560 ha cho ăn tươi, 120.248 ha cho chế biến) với tổng giá trị 2,06 tỷ USD
(trong đó: 1,34 tỉ thu từ cà chua ăn tươi và 0,7 tỉ thu từ cà chua chế biến) (USDA,
2004). Năm 2005, toàn thế giới sản xuất được 125 triệu tấn, năng suất trung bình đạt
27,4 tấn/ha, trong đó Trung Quốc (31,6 triệu tấn), Mỹ (11,0 triệu tấn), Thổ Nhĩ Kỳ
(9,7 triệu tấn), Ấn Độ (7,6 triệu tấn), Hy Lạp (7,6 triệu tấn) là các quốc gia dẫn đầu
trong sản xuất cà chua. Một số nước khác cũng được xếp vào các quốc gia sản xuất cà
chua chính là: Tây Ban Nha, Braxin, Mehico, Iran, Nga, Ai Cập. Năm 2006, sản lượng
cà chua của các nước sản xuất chính tiếp tục tăng (Trung qQốc là 32.540.040 tấn, Mỹ
là 11.250.000 tấn, Thổ Nhĩ Kỳ là 9.854.877 tấn) (FAO, 2008).
2.2.2. Tình hình sản xuất cà chua trong nước
Theo Phạm Hồng Cúc (2008), hiện nay cà chua có thể trồng hầu như quanh
năm ở vùng đồng bằng cũng như vùng cao, tuy nhiên có 3 vụ trồng phổ biến như sau:
 

4


- Vụ Đông Xuân: Gieo tháng 10 – 11 dương lịch vào đầu mùa khô và thu hoạch
vào tháng 1 – 2 dương lịch. Cà chua tăng trưởng trong mùa khô ráo, ấm áp nên phát
triển tốt và cho năng suất cao. Nếu gieo sớm trong tháng 10, khi trời còn mưa, nên làm

giàn che cây con để khỏi hao hụt.
- Vụ Xuân Hè: Gieo tháng 12 – 1 và thu hoạch tháng 3 – 4 dương lịch. Cà chua
tăng trưởng hoàn toàn trong mùa khô nhưng ra hoa kết trái trong những tháng nóng
nhất trong năm, do đó phải chọn giống chịu nóng và chống bệnh tốt.
- Vụ Hè Thu: Gieo tháng 6 – 7 và thu hoạch tháng 9 – 10 dương lịch. Cà chua
tăng trưởng hoàn toàn trong mùa mưa do đó đất trồng phải thoát nước tốt, chọn giống
chịu mưa, chống bệnh tốt, không rụng hoa, trái cứng, không nứt và có màu đỏ đẹp khi
chín.
Sản xuất cà chua ở nước ta có một số tồn tại chủ yếu: chưa có bộ giống tốt cho
từng vụ trồng, sản xuất còn manh mún, chưa có sản phẩm hàng hoá lớn cho chế biến
công nghiệp. Quá trình canh tác, thu hái diễn ra hoàn toàn thủ công. So với các nước
trong khu vực, sản xuất cà chua ở Việt Nam có lợi thế rõ rệt về khí hậu, thời tiết và đất
đai, đặc biệt các tỉnh phía Bắc phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của cà chua nếu
được đầu tư tốt, năng suất cà chua sẽ rất cao. Diện tích cho phát triển cà chua còn rất
lớn vì trồng trong vụ Đông, không ảnh hưởng đến 2 vụ lúa nhưng sản phẩm lại là trái
vụ so với Trung Quốc, nước có khối lượng cà chua lớn nhất thế giới (trên 20 triệu
tấn/năm). Các vùng trồng cà chua đều có nguồn lao động lớn, nông dân có kinh
nghiệm canh tác nên giá thành có khả năng cạnh tranh cao.
Theo số liệu của Vụ Kế hoạch – Quy hoạch, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển
Nông Thôn, diện tích cà chua nước ta khoảng 18.000 – 20.000 ha, năng suất 18 – 20
tấn/ha và sản lượng 350.000 – 400.000 tấn. Theo đó, năng suất bình quân còn thấp,
theo báo cáo về xuất khẩu nông sản của Việt Nam trong vòng 10 năm qua của Bộ
Khoa Học và Công Nghệ cho biết năng suất cà chua của nước ta chỉ bằng 65% so với
thế giới. Hầu hết các địa phương, cà chua chủ yếu được trồng trong vụ Đông Xuân,
riêng ở Lâm Đồng trồng quanh năm. Hiện nay Lâm Đồng là địa phương có diện tích,
năng suất và sản lượng cà chua lớn nhất cả nước, khoảng 4.000 ha. Chỉ riêng huyện
Đơn Dương, tỉnh Lâm Đồng, theo số liệu của Phòng Nông Nghiệp, diện tích gieo
trồng cà chua hàng năm khoảng 3.000 – 3.500 ha, năng suất trung bình vào khoảng 40
– 50 tấn/ha, cá biệt 80 – 90 tấn/ha.
 


5


Sản xuất cà chua trong vụ Đông ở nước ta khá thuận lợi, nên cà chua được
trồng chủ yếu (70%) trong vụ Đông Xuân từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau. Tuy nhiên,
vụ Đông Xuân là thời kỳ hội tụ nhiều yếu tố môi trường (nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng)
rất thuận lợi cho bệnh sương mai phát triển. Để hạn chế bệnh, kỹ thuật phổ biến nhất
đang được nông dân áp dụng là phun thuốc trừ bệnh với 13 – 15 lần phun/vụ cà chua.
Với đặc thù này sản xuất cà chua luôn tiềm ẩn tính thiếu ổn định và nguy cơ không an
toàn vệ sinh thực phẩm cao.
2.3. Bệnh sương mai trên cây cà chua
Bệnh sương mai cà chua có nơi còn gọi là bệnh mốc sương, bệnh rám sương,
bệnh dịch muộn, do cùng một loài nấm gây bệnh sương mai trên khoai tây là
Phytopthora infestans (Mont.) de Bary. Bệnh sương mai cà chua do Payen (Pháp,
1847) đã giám định trên quả. Bệnh này lan tràn khắp thế giới cùng với diện tích trồng
cà chua ngày càng mở rộng từ cuối thế kỉ 19. Ở vùng duyên hải nước Đức, bệnh này
gây thiệt hại 60 – 75%, thậm chí 100% cà chua. Bệnh còn phá hoại nghiêm trọng ở Mỹ,
Nam Phi và Trung Quốc. Ở Việt Nam, từ nhiều năm nay bệnh thường xuyên gây thiệt
hại ở các vùng trồng cà chua, thiệt hại trung bình 30 – 70%, có khi lên đến 100% diện
tích không được thu hoạch (Vũ Triệu Mân, 2007).
2.3.1. Triệu chứng bệnh
Theo Nguyễn Văn Viên và Đỗ Tấn Dũng (2008) bệnh xuất hiện trên thân, lá,
hoa và quả của cây. Trên lá vết bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở đầu lá, mép lá hoặc
gần cuống lá. Vết bệnh lúc đầu hình tròn hoặc hình bán nguyệt, màu xanh tối, về sau
không định hình màu nâu đen, giới hạn giữa phần bệnh và phần khỏe không rõ ràng,
mặt dưới vết bệnh màu nhạt hơn. Vết bệnh có thể lan rộng khắp lá, lan qua cuống lá
làm toàn bộ lá chét bị bệnh, lá bị khô nâu. Khi trời ẩm ướt, mặt dưới lớp bệnh hình
thành lớp mốc trắng, đó là cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh của nấm, lớp
mốc này còn lan rộng ra vùng lá xung quanh vết bệnh, khi trời nắng, nhiệt độ cao, lớp

mốc trắng này nhanh chóng bị mất đi.
Ở trên thân, cành vết bệnh ban đầu hình bầu dục nhỏ hoặc hình dạng không đều
đặn, sau đó lớp bệnh lan rộng bao quanh và kéo dài dọc thân cành, màu nâu hoặc nâu
sẫm, hơi bị lõm và úng nước. Khi trời ẩm ướt, thân cành bị bệnh giòn, tóp nhỏ và dễ
gãy. Khi trời khô ráo, vết bệnh không phát triển thêm, màu nâu xám, cây có thể tiếp
tục sinh trưởng.
 

6


Trên hoa vết bệnh màu nâu hoặc màu đen xuất hiện ở đài hoa ngay sau khi nụ
được hình thành, bệnh lan sang cánh hoa, nhị hoa, cuống hoa làm cho cả chùm hoa bị
rụng.
Trên quả lớn, vết bệnh có thể xuất hiện ở núm hoặc ở giữa quả, lúc đầu màu
nâu nhạt, sau thành nâu đậm hoặc nâu đen, vết bệnh lan khắp bề mặt quả. Quả bệnh
khô cứng, bề mặt sù sì lồi lõm. Thịt quả bên trong vết bệnh cũng có màu nâu, khoảng
trống trong quả có tản nấm trắng, khi trời ẩm ướt trên bề mặt vết bệnh ở quả cũng có
lớp nấm trắng xốp bao phủ. Về sau quả bệnh thối đen nhũn.
Hạt trong quả bị bệnh cũng bị hại, hạt bị bệnh nặng thường nhỏ hơn hạt khỏe,
vết bệnh màu nâu chiếm một phần hoặc toàn bộ bề mặt hạt. Quả bị bệnh nặng thì sẽ bị
thối rữa, hạt đen.

Hình 2.1 Cà chua bị bệnh sương mai
( />
2.3.2. Nguyên nhân gây bệnh
Theo Nguyễn Văn Viên và Đỗ Tấn Dũng (2008), bệnh sương mai do nấm
Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, thuộc bộ Peronosporales, lớp Phycomycestes
có chu kì phát triển hoàn toàn bao gồm giai đoạn sợi nấm, sinh sản vô tính (bào tử
phân sinh – bào tử động) và sinh sản hữu tính tạo ra bào tử trứng. Sợi nấm hình ống,

đơn bào, có nhiều nhân.
Cành bào tử phân sinh đâm ra ngoài qua lỗ khí khổng hoặc trực tiếp qua biểu bì
cây, đơn độc từng cành hoặc từng nhóm 2 – 3 cành. Trong điều kiện độ ẩm 90 – 100%,
đặc biệt đêm có sương và mưa phùn, nhiệt độ 14,6 – 22,9oC thì bào tử được hình thành
 

7


rất nhiều. Bào tử phân sinh nảy mầm theo 2 kiểu: hoặc hình thành bào tử động hoặc
hình thành ống mầm. Bào tử động chuyển động được nhờ 2 lông roi. Nhiệt độ thích
hợp để nảy mầm hình thành bào tử động là 12 – 14oC. Từ 18oC trở lên bào tử phân
sinh nảy mầm tạo thành ống mầm. Khi nhiệt độ lên trên 28oC hoặc dưới 4oC, bào tử
phân sinh không nảy mầm. Bào tử phân sinh được hình thành trong điều kiện thích
hợp ở nhiệt độ dưới 18oC, độ ẩm càng cao thì khả năng bào tử nảy mầm càng lớn, tuổi
bào tử càng non thì tỉ lệ nảy mầm càng cao, nấm xâm nhập vào cây qua lỗ khí khổng
hoặc trực tiếp qua biểu bì. Một bào tử phân sinh hoặc bào tử động cũng có thể tạo
thành vết bệnh. Nhiệt độ tối thiểu để nấm xâm nhập là 12oC, thích hợp nhất là 18 –
22oC. Thời kì tiềm dục của nấm ở lá là 2 ngày, trên quả từ 3 – 10 ngày.
Nguồn bệnh truyền từ năm này qua năm khác bằng sợi nấm, bào tử trứng trên
tàn dư cây cà chua bị bệnh, sợi nấm còn tồn tại ở hạt cà chua. Trong thời kì cây sinh
trưởng, bệnh lây lan phát triển nhanh chóng bằng bào tử phân sinh.

Hình 2.2 Bào tử nấm Phytophthora infestans
( />
2.3.3. Biện pháp phòng trừ bệnh sương mai
Theo Hà Viết Cường (2008) kỹ thuật phòng bệnh cần tiến hành phối hợp các
biện pháp canh tác, dự tính, dự báo, hóa học, giống chống bệnh.
- Biện pháp canh tác: chọn nơi đất tốt thích hợp với sinh trưởng của cây, luống
trồng cao dễ thoát nước. Bón phân cân đối, bón lót là chính, bón thúc sớm, có thể tăng

thêm tro và kali ở những nơi đất xấu và nơi bệnh thường xảy ra.

 

8


- Biện pháp dự báo: vì bệnh sương mai là một trong những bệnh có phản ứng
rất nhạy cảm với nhiệt độ, ẩm độ ngoại cảnh nên cần theo dõi cụ thể diễn biến của các
yếu tố thời tiết, tiến hành dự tính, dự báo chính xác.
- Biện pháp hóa học: rất nhiều thuốc hóa học, cả tiếp xúc và nội hấp, có hiệu
quả tốt phòng trừ nấm P. infestans. Có thể phun các loại thuốc tiếp xúc như boocđô,
zinep, oxyclorua đồng, mancozeb trước khi ổ bệnh xuất hiện. Theo dõi các đợt gió
mùa Đông Bắc từ trung tuần tháng 12 trở đi để phun thuốc phòng bệnh khi thời tiết có
nhiệt độ thấp và ẩm độ cao kéo dài. Trường hợp bệnh đã phát sinh gây hại kèm theo
điều kiện thời tiết thuận lợi cho bệnh phát triển mạnh, cần phun nhiều lần (khoảng 7
ngày/lần) một số loại thuốc như: Rhidomil MZ 72BHN (2,5 – 3,0 kg/ha); Mancozep
80WP (0,2 – 0,3%); Antracol 80WP (0,2 – 0,4%); Zinep 80WP (2,5 – 3,0 kg/ha);
Aliette 80WP (0,3%). Trong quá trình sử dụng thuốc phải tuân thủ thời gian nồng độ
và liều lượng như hướng dẫn mới có tác dụng.
- Biện pháp chọn giống sạch bệnh: do nguồn bệnh (sợi nấm) có thể tồn tại được
trên hạt cà chua nên biện pháp sử dụng giống sạch bệnh cũng quan trọng, nên chọn hạt
của các quả khỏe để trồng. Xử lý hạt giống bằng thuốc hóa học cũng có hiệu quả.
- Biện pháp chọn giống kháng: cần nghiên cứu xác định thành phần chủng nấm
trên cơ sở đó tiến hành thay đổi cơ cấu giống, dùng các giống kháng bệnh thích hợp
cho từng vùng sản xuất.
2.4. Các nghiên cứu về bệnh sương mai
2.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu ban đầu tính kháng bệnh sương mai trên cà chua đã xác định được
một số gen kháng: gen Ph-1 nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (Clayberg và ctv, 1965), gen

Ph-2 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 (Moreau và ctv, 1998) và gen Ph-3 trên nhiễm sắc
thể số 9 (Chunwongse và ctv, 2002). Tuy nhiên những gen này không thể hiện tính
kháng đối với tất cả các isolate của nấm sương mai. Gen kháng Ph-1 trội (có trong
giống cà chua New Yorker), có hiệu quả với chủng T0. Gen kháng Ph-2 trội không
hoàn toàn (có trong giống cà chua Pieraline, Macline, Piline) có hiệu lực với chủng T0,
ít tác dụng đối với chủng T1. Gen Ph-3 trội không hoàn toàn, kháng tốt với chủng Pi 16, trong khi đó gen Ph-1 và Ph-2 không thể hiện tính kháng với chủng này. Giống cà
chua mang gen kháng Ph-1 hay gen Ph-2 không thể hiện khả năng kháng tốt đối với
các chủng nấm sương mai tại Israel (Cohen, 2002). Điều đó chứng tỏ các gen trên chỉ
 

9


mang tính kháng chuyên tính với một hoặc một số chủng Phytophthora infestans nhất
định. Trái lại, nấm bệnh này có khả năng sinh sản hữu tính tạo ra các dạng tái tổ hợp
mới rất nhanh nên giống cà chua mang gen kháng trên rất dễ bị nhiễm bệnh bởi các
chủng mới.
Phương pháp sử dụng nhiều gen, mỗi gen có vai trò nhất định liên quan đến tính
kháng, nhằm tạo ra các giống cà chua kháng bệnh ổn định (durable resistance) đã được
nghiên cứu. Một số QTL kháng bệnh sương mai đã được xác định trên loài cà chua dại
Lycopersicon pimpinellifolium (Frary và ctv, 1998), và L. hirsutum (Brouwer và ctv,
2004). Giống L3707 (L. Pimpenellifolium, PI365951, Peru) được xác định kháng với
nấm sương mai (Black và ctv, 1996a; Black và ctv, 1996b). L3707 thể hiện tính kháng
không chuyên tính với nấm phytophthora infestans, được qui định bởi 2 gen độc lập,
trội không hoàn toàn, và thể hiện tương tác trội (Irit Irzhansky và Yigal Cohen, 2006).
Hầu hết nguồn gen kháng bệnh của cà chua được tìm thấy ở 8 loài hoang dại, tất
cả chúng đều có thể lai với cà chua trồng. Tuy nhiên, trong một số trường hợp cụ thể
cũng gặp một số khó khăn do sử dụng loài xa nhau về di truyền như là Lycopersicon
chilense hay Lycopersicon peruvianum (Rick, 1982). Phương pháp lai tạo giống truyền
thống gặp rất nhiều khó khăn để sử dụng các gen có trong các loài cà chua dại. Các

dạng dại thường thiếu các tính trạng cần thiết cho nhu cầu con người, năng suất thấp,
chất lượng quả kém. Để hạn chế hàng loạt các gen không cần thiết đi kèm với một số ít
gen cần trong quá trình lai tạo, phương pháp lai lại với dạng trồng trọt được sử dụng.
Với sự trợ giúp của sinh học phân tử, bản đồ liên kết gen xác định được chính
xác số và vị trí của từng gen hay QTL của nó trên nhiễm sắc thể. Các QTL cần thiết sẽ
được đưa vào cây trồng, các tính trạng không cần thiết sẽ loại bỏ nhanh chóng trong
quá trình chọn lọc có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS) (Tanksley và ctv, 1989).
Trong các năm qua, bản đồ chỉ thị phân tử (molecular marker maps) đã được phát triển
cho nhiều loại cây, trong đó có cây cà chua và đã sử dụng thành công trong lĩnh vực di
truyền và chọn giống ứng dụng (Foolad và ctv, 1997; Paterson và ctv, 1988). Đối với
QTL kháng bệnh sương mai của cà chua cũng được một số tác giả nghiên cứu (Duglas
và ctv, 2003; Christine và ctv, 2007).
ZHU Hai-shan và ctv (2006) đã phân tích di truyền và xác định marker SSR liên
kết với tính kháng bệnh sương mai trên cà chua. Kết quả từ bản đồ di truyền và phân

 

10


tích liên kết gen cho thấy gen kháng bệnh sương mai Ph-ROL định vị ở nhiễm sắc thể
số 9 với khoảng cách di truyền so với SSR marker TOM236 là 5,7 cM.
QIU Yi-peng và ctv (2009) tiến hành xác định marker RAPD liên kết với tính
kháng bệnh sương mai trên cà chua. Kết quả phân tích liên kết gen cho thấy, marker
CCPB272-03740 liên kết chặt với gen kháng Ph-3 với khoảng cách di truyền là 5,8 cM.
2.4.2. Các nghiên cứu trong nước
Công tác chọn tạo giống rau của nước ta trải qua từng giai đoạn đã thay đổi về
chất: 1968 – 1985: chủ yếu là thu thập, khảo nghiệm và tuyển chọn giống; 1986 –
1985: tập trung tạo giống thuần (giống cà chua Hồng Lan, CS1);1996 – 2000: đã có
giống lai F1 đầu tiên (cà chua HT7); 2001 – 2005: một số giống cà chua F1 đã được tạo

ra. Nhiều giống được công nhận cho phép phát triển sản xuất là do kết quả tuyển chọn
các giống cà chua nhập nội (CS1, VT3, PT18, XH5), một số giống khác sử dụng
phương pháp lai tạo truyền thống (conventional approach) thông qua đánh giá biển
hiện kiểu hình của nguồn vật liệu ngoài đồng ruộng. Trong từng giai đoạn, các giống
mới đã giữ vai trò nhất định trong sản xuất.
Trong những năm qua trong nhiều chương trình, dự án chọn tạo giống rau, các cơ
quan thuộc Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, trường Đại học đã đưa ra một
số giống cà chua mới vào sản xuất. Giống cà chua phục vụ chế biến PT18 (Viện
Nghiên Cứu Rau Quả), Giống C95, VT3 (Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm),
các giống cà chua lai F1: FM20, FM29, lai số 4, lai số 9 (Viện Nghiên Cứu Rau Quả),
HT21 (trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội). So với các giống cà chua truyền thống
(cà chua Ba lan, cà chua Pháp, cà chua Hồng Lan), các giống mới tạo ra thể hiện vượt
trội về năng suất và chất lượng. Điều đáng chú ý là hầu hết các giống được chọn tạo
trên chưa hoặc ít chú ý đến tính kháng bệnh sương mai.
Bên cạnh các giống cà chua được đưa vào sản xuất trong thời gian qua, tại Viện
Nghiên Cứu Rau Quả còn có trên 1000 dòng, giống cà chua đã được xác có các tính
trạng quý: kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, kháng bệnh virus xoăn vàng lá, chất lượng
quả tốt. Các dòng cà chua này đã được nghiên cứu phân lập thành từng nhóm theo yêu
cầu của chọn giống: nhóm cà chua chín sớm, nhóm cà chua có chất lượng cao, nhóm
cà chua có đặc điểm nông sinh học phù hợp cho chế biến, nhóm giống cà chua dùng
cho ăn tươi, nhóm cà chua dạng quả nhỏ. Một số dòng thể hiện tính kháng bệnh sương
mai ngoài đồng ruộng tốt.
 

11


Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu về việc áp dụng chỉ thị phân tử
vào chọn tạo giống cà chua.
2.5. DNA marker

DNA marker là những marker phân tử được tạo ra nhờ kỹ thuật phân cắt DNA
bằng những restriction endonuclease. Khi sáng tạo ra những đoạn DNA mới, người ta
cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa marker và gen định vị trên nhiễm sắc thể nào đó.
Điều này hoàn toàn có thể thực hiện được nhờ công trình có tính lịch sử của Morgan
về liên kết gen và khoảng cách di truyền (tính bằng centi Margan, viết tắt là cM) (Bùi
Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
2.5.1. Các loại DNA marker
Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999), về cơ bản, bất cứ chuỗi mã DNA
nào được dùng phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể
xem như là một DNA marker. Các DNA marker co thể chia thành hai nhóm sau:
− PCR-based: ALP, AFLP, SSR, SSCP.
− DNA / DNA hybridization: RFLP, minisatallite.
Bảng 2.1 Các loại DNA marker
Marker

Tên đầy đủ

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

ALP

Amplicon length polymorphism

AFLP

Amplified fragment length polymorphism

RAPD


Random amplified polymorphism DNA

DAF

DNA amplification fingerprinting

SSR

Simple sequence repeat (microsatellite)

AP – PCR

Arbitrary primer – PCR

SSCP

Single strand conformation polymorphism

MRDHV – DNA

Moderatery repeated, dispersed, and highly variable DNA
(minisatellite)

(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.5.2. Marker RFLP
Trong các DNA marker, RFLP là marker được dùng phổ biến nhất và được biết
nhiều nhất. Trong nhiều trường hợp, thuật ngữ RFLP marker đồng nghĩa với DNA
marker (Bùi Chi Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).

 

12


Đây là kỹ thuật cắt các đoạn DNA ngẫu nhiên bởi các enzym cắt giới hạn, DNA
sau khi bị cắt sẽ tạo thành các đoạn DNA, còn được gọi là fingerprint đặc trưng cho
từng phân tử DNA. Xử lí các mẫu DNA bằng cùng một cặp enzym cắt giới hạn, các bộ
gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều dài khác nhau còn những
bộ gen hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau. Bản đồ di truyền các
kết quả RFLP có tính chính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu định loài
nguồn gốc và mức độ tiến hóa của các vi sinh vật (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Trong chọn giống thực vật có thể sử dụng RFLP để chọn lọc trực tiếp các cá thể
mang các gen lặn mong muốn, không cần phân tích qua lai nhiều thế hệ. Mặt khác đối
với các đặc điểm do nhiều gen kiểm soát hoặc có sự liên kết giữa các gen, sử dụng
RFLP có thể phát hiện quan hệ giữa các gen đó. Hình thức chọn lọc RFLP có thể thực
hiện từ khi các cá thể thực vật, động vật còn non giảm công sức, đỡ tốn kém chi phí
nuôi trồng. Phương pháp RFLP còn được sử dụng để kiểm tra sự phân li di truyền của
một tính trạng theo qui luật Mendel.
Sau khi điện di, DNA được chuyển sang một vật thể rắn (tấm lọc nitrocellulose
hoặc màng lọc nylon) và gắn probe được đánh dấu phóng xạ, sau đó được chụp hình.
Các tín hiệu phóng xạ phát ra sẽ được ghi lại trên phim X-quang.
RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú nhưng qui trình thực hiện
phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng
và chất lượng rất cao. Do đó, người ta có xu hướng áp dụng những marker đơn giản
hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase (Bùi Chi Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 1999).
2.5.3. Marker AFLP
AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết
hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng

những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. Nó được áp dụng
cho kỹ thuật DNA fingerprinting để tìm kiếm tính chất đa dạng của DNA giữa các
mẫu xét nghiệm khác nhau. Những sản phẩm fingerprint này có thể được xem như một
công cụ nhằm xác định sự phân lập của một mẫu DNA nào đó. Những fingerprint cũng
được dùng làm nguồn cung cấp các marker di truyền, hình thành bản đồ liên kết gen.
AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng

 

13


đẳng gen. Người ta so sánh các DNA fingerprint này bằng cách quan sát các băng có
tính đa hình hay không đa hình (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Ưu điểm của AFLP là lượng DNA cần dùng ít, tạo nhiều băng khuếch đại, khả
năng đa hình cao, kết quả có độ tin cậy cao, có khả năng lặp lại và không cần biết
trước trình dự DNA genome. Tuy nhiên, AFLP cần DNA có độ tinh sạch cao, không
làm tạp nuclease hoặc ức chế nó, cần biết trước trình tự để thiết kế primer và là một
marker trội, hạn chế việc phân biệt được đồng hợp và dị hợp. Do đó marker AFLP vẫn
chưa được sử dụng nhiều.
2.5.4. Marker RAPD
Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi thực
hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không
cần biết trước trình tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn,
dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR.
Mồi ngẫu nhiên là những đoạn oligonucleotide từ 5 – 12 nucleotide. Mồi càng
ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, dễ thực hiện phản ứng PCR, mồi càng dài thì kết
quả nhân gen càng chính xác. Nhiệt độ biến tính (Tm) của mồi phải đảm bảo không
cách biệt quá lớn với Tm của đoạn DNA khuôn. Kỹ thuật RAPD có ưu điểm thực hiện
nhanh, dễ làm, ít tốn kém, giúp xác định tính đa dạng sinh học và nguồn gốc di truyền

của các giống động vật, thực vật và vi sinh vật còn được gọi là phương pháp phân loại
phân tử (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Trong khi RFLP có tính chất codominant thì RAPD có tính chất dominant, do
đó những gen điều khiển tính trạng nào đó có tính lặn (recessive) sẽ khó tìm thấy sự đa
hình trong điện di. Hơn nữa RAPD có tính chất ngẫu nhiên, nên việc lập lại phân tích
điện di để tìm liên kết gen và marker thường không thống nhất (Khuất Hữu Thanh,
2003).
2.5.5. Marker SSR
2.5.5.1. Khái niệm về microsatellite
SSR hay còn gọi là microsatellite ngày nay đã trở thành thuật ngữ chung nhất
để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR
hay VNTR. Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 – 6 bp và kích thước tại
mỗi locus là 20 – 100 bp. Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc
biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome.
 

14


Microsatellite có tính đa hình rất cao (đa hình theo chiều dài), là những
codominance – al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có
các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104 – 5.10-6, nó tuân theo
định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định
bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào
đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng (Beckmann và ctv,
1992).
2.5.5.2. Các loại microsatellite
Theo Ma và ctv (1996), căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 – 6 lần) có:
Mononucleotide SSR (A)
AAAAAAAAAAA

Dinucleotide SSR (GT)6
GTGTGTGTGTGT
Trinucleotide SSR (CTG)4
CTGCTGCTGCTG
Tetranucleotide SSR (ACTC)4
ACTCACTCACTCACTC
Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và
tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa.
2.5.5.3. Vai trò của microsatellite
Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu
sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa rõ
ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới
các bệnh di truyền (Beckmann và ctv, 1992).
Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền
quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng
trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa.
Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng
mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lượng khác
nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện
của gen và chức năng của gen (Morgante và Olivieri, 1993).

 

15