BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG
SỐ BẢN SAO GEN SMN1 GÂY BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LI NA
Niên khóa: 2006-2010

Tháng 07 năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG
SỐ BẢN SAO GEN SMN1 GÂY BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

Ths. NGUYỄN THỤY DẠ THẢO

NGUYỄN THỊ LI NA

CN. NGUYỄN VĂN HƯNG

Tháng 07 năm 2010


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường
Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh
học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học
tại trường.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến BGĐ Công ty Cổ Phần
Công Nghệ Việt Á đã cho phép và tạo điều kiện tốt cho em học tập, nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thụy Dạ Thảo, CN. Nguyễn Văn
Hưng, chị Hồ Thị Thanh Thủy là những người đã hết lòng hướng dẫn, dạy dỗ, động
viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các anh chị tại công ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á
đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ nhiều điều cho em trong suốt thời gian thực hiện khoá
luận.
Tôi xin cảm ơn các bạn lớp DH06SH đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong
thời gian học.
Với tất cả lòng kính trọng và thương yêu con cảm ơn cha mẹ và các em đã
chăm sóc, động viên con trong suốt những năm tháng qua.
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Li Na

i


 


TÓM TẮT
“XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG BẢN SAO GEN
SMN1 GÂY BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG”.
Teo cơ tủy sống là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường có tần suất cao
thứ hai trên thế giới, bệnh có thể gây chết hoặc để lại những di chứng ảnh hưởng nặng
nề đến khả năng vận động của bệnh nhân. Bệnh được chẩn đoán dựa trên các triệu
chứng lâm sàng, tuy nhiên có thể gây nhầm lẫn do nhầm lẫn với các triệu chứng của
những bệnh teo cơ khác. Chính vì thế các phương pháp chẩn đoán phân tử hiện nay tỏ
ra là phương pháp hiệu quả hơn cả. Hơn nữa, ngoài xác định được bệnh, các phương
pháp sinh học phân tử còn có thể xác định thể mang, giúp đưa ra các tư vấn cần thiết
cho những người có nhu cầu. Trong khóa luận này chúng tôi tiến hành xây dựng quy
trình Real-time PCR định lượng số lượng bản sao gen SMN1 và thu được những kết
quả sau:
Bước đầu xây dựng thành công quy trình Real-time PCR để định lượng bản sao
gen SMN1 với hệ mồi và mẫu dò có khả năng hoạt động tốt. Xác định được nhiệt độ
lai thích hợp mà tại đó hệ mồi và mẫu dò hoạt động tốt và cho kết quả đặc hiệu là 66.
Xác định được độ nhạy của quy trình là 102.
Xây dựng được cách tính bản sao gen SMN1 theo phương pháp ∆∆Ct của
Livak, 2001.
Tiến hành chạy thực nghiệm quy trình xây dựng được trên các mẫu DNA
genomecủa bệnh nhân teo cơ tủy sống (SMA), và các mẫu DNA genome đại trà. Đối
với các 7 mẫu DNA genome của bệnh nhân SMA, kết quả Real-time PCR khẳng định
7 trường hợp đều là đột biến đồng hợp tử mất gen SMN1. Đối với 23 mẫu DNA
genome đại trà thì kết quả Real-time PCR cho biết 2 trường hợp là thể mang.

ii


 


SUMMARY
“CONSTRUCTING REAL-TIME PCR PROCESS TO QUANTIFY THE SMN1
COPY NUMBER CAUSE SPINAL MUSCULAR ATROPHY”.
Spinal Muscular Atrophy is an autosomal recessive disease which has the 2nd
frequency in the world; this disease can cause deaths or leave serious damages to the
movement ability of the patients. This disease can be diagnosed by clinical features,
but it may cause confusion with the symptons of others atrophy diseases. Because of
this reason, nowadays, molecular diagnosis methods seem to be the most effective.
Moreover, molecular methods can not only diagnose the disease but also determine the
carrier status in order to give out counsels for needed people. In this research, we
constructed Rel-time PCR process to quantify the SMN1 gene copy number and
received the following results:
Constructing successfully Real-time PCR process to quantify the copy number
of SMN1 gene with workable set of primers and probes.
Determining that 66°C is the proper annealing temperature in which the set of
primers and probes work well and has high specification.
Determining that the sensitivity of the process is 102.
Construting the formulating method to quantify the copy number of SMN1
gene by ∆∆Ct method (Livak, 2001).
Practical implementing the process on the DNA genome samples of SMA
patients and normal individuals. The results confirm that 7 DNA genome samples of
SMA patients are homozygous deletion of SMN1 gene. 2 of 23 DNA samples of
normal people are determined carrier.
Keys words: Spinal Muscular Atrophy, SMN1 gene, Real-time PCR.

iii


 


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................... i
TÓM TẮT........................................................................................................................ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu ..................................................................................................................... 1
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 2
2.1. Giới thiệu về bệnh teo cơ tủy sống ........................................................................... 2
2.1.1. Teo cơ tủy sống type I (SMA I) ............................................................................ 2
2.1.2. Teo cơ tủy sống type II (SMA II) .......................................................................... 2
2.1.3. Teo cơ tủy sống type III (SMA III) ...................................................................... 3
2.1.4. Teo cơ tủy sống type IV (SMA IV)....................................................................... 3
2.2. Gene SMN: Nguyên nhân gây bệnh teo cơ tủy sống ............................................... 3
2.2.1. Gene Survival motor neuron (SMN) ..................................................................... 3
2.2.1.1. Vị trí và cấu trúc gen SMN.................................................................................3
2.2.1.2. Quá trình ghép nối gene SMN ............................................................................4
2.2.1.3. Chức năng gen SMN và vai trò của protien SMN trong bệnh teo cơ tủy sống .. 5
2.2.2. Đột biến gen SMN1: nguyên nhân gây bệnh teo cơ tủy sống ............................... 6
2.2.2.1. Đột biến lớn (đột biến mất và đột biến hoán chuyển) ........................................6
2.2.2.2. Đột biến nhỏ .......................................................................................................7

2.2.2.3. Đột biến de novo .................................................................................................7
2.3. Kiểu gen của bệnh nhân teo cơ tủy sống và thể mang ............................................. 8
2.3.1. Kiểu gen của bệnh nhân teo cơ tủy sống ............................................................... 8
iv

 


2.3.2. Kiểu gen ở thể mang SMA .................................................................................... 8
2.4. Chẩn đoán SMA ....................................................................................................... 9
2.4.1. Chẩn đoán lâm sàng............................................................................................... 9
2.4.2. Chẩn đoán sử dụng các công cụ sinh học phân tử ............................................... 10
2.4.2.1. Phương pháp phân tích liên kết (linkage analysis) ...........................................10
2.4.2.2. Phương pháp PCR-SSCP..................................................................................11
2.4.2.3. Phương pháp PCR-RFLP (SMN1 deletion assay) ............................................11
2.4.2.4. Phương pháp Realtime-PCR ............................................................................12
2.4.2.5. Phương pháp MLPA ..........................................................................................13
2.4.2.6. Phương pháp DHPLC ........................................................................................13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 14
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 14
3.2. Vật liệu và thiết bị .................................................................................................. 14
3.2.1. Mẫu ...................................................................................................................... 14
3.2.2. Hóa chất ............................................................................................................... 14
3.2.2.1. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA ...............................................................14
3.2.2.2. Hóa chất dùng cho phản ứng Realtime-PCR....................................................14
3.2.3. Dụng cụ thiết bị ................................................................................................... 15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 15
3.3.1. Phương pháp thiết kế mồi, mẫu dò ...................................................................... 15
3.3.1.1. Các phần mềm sử dụng ....................................................................................15
3.3.1.2. Tiêu chuẩn thiết kế mồi ....................................................................................15

3.3.1.3. Tiêu chuẩn thiết kế mẫu dò ..............................................................................16
3.3.1.4. Phương pháp tiến hành .....................................................................................16
3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA .............................................................................. 16
3.3.2.1. Nguyên tắc ........................................................................................................16
3.3.2.2. Phương pháp tiến hành .....................................................................................17
3.3.3. Phương pháp allele specific realtime-PCR.......................................................... 17
3.3.4. Khảo sát sự hoạt động của mồi và mẫu dò ..........................................................18
3.3.4.1. Nguyên tắc ........................................................................................................18
3.3.4.2. Phương pháp tiến hành .....................................................................................18
v

 


3.3.5. Khảo sát độ đặc hiệu kết hợp khảo sát Tm thích hợp cho mồi và mẫu dò .......... 19
3.3.6. Khảo sát độ nhạy của quy trình ........................................................................... 19
3.3.7. Phương pháp tính toán kết quả ............................................................................ 20
3.3.7.1. Nguyên tắc ........................................................................................................20
3.3.7.2. Phương pháp tiến hành .....................................................................................20
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 21
4.1. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò cho gene SMN1 và gene ß-actin ......................... 21
4.2. Kết quả khảo sát các đặc tính của hệ mồi và mẫu dò trên lý thuyết ...................... 22
4.2.1. Kết quả khảo sát các chỉ tiêu của mồi và mẫu dò................................................ 22
4.2.2. Các chỉ tiêu về cấu trúc thứ cấp........................................................................... 23
4.2.3. Kết quả kiểm tra độ tương đồng của hệ mồi và mẫu dò với trình tự đích .......... 24
4.2.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của hệ mồi và mẫu dò trên lý thuyết ................................. 25
4.3. Khảo sát hoạt động của mồi và mẫu dò.................................................................. 30
4.3.1. Khảo sát hoạt động của mồi và mẫu dò trong phản ứng singleplex.................... 30
4.3.1.1. Khảo sát hoạt động của mồi và mẫu dò của gene ß-actin ...............................30
4.3.1.2. Khảo sát hoạt động của mồi và mẫu dò của gen SMN1...................................31

4.3.2. Khảo sát hoạt động của mồi và mẫu dò trong phản ứng multiplex ..................... 32
4.4. Khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu ....................................................................... 33
4.5. Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình ................................................................. 35
4.5.1. Kết quả khảo sát độ nhạy gen ß-actin.................................................................. 35
4.5.2. Kết quả khảo sát độ nhạy gen SMN1 .................................................................. 36
4.6. Kết quả xây dựng cách tính số lượng bản sao gen SMN1 ..................................... 36
4.7. Tiến hành chạy thực nghiệm với quy trình đã xây dựng trên mẫu đại trà ............. 39
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 42
5.1. Kết luận................................................................................................................... 42
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 43

vi

 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AS PCR: Allele Specific Polymerase Chain Reaction
ASF/SF2: alternative splicing factor/splicing factor 2
Ct: chu kỳ ngưỡng
DHPLC: Denaturing High-performance Liquid Chromatography
EMG: Electromyography testing
ESE: Exonic Splicing Enhancer
ESS: Exonic Splicing Silencer
hnRNPs: heterogeneous nuclear ribonucleoproteins
ISSs: Intronic Slicing Silencers
MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
PCR-SSCP: Polymerase Chain Reaction / Single-Strand Conformation
Polymorphism

PCR-RFLP: Polymerase Chain Reaction / Restriction Fragment Length
Polymorphism
SMA: Spinal Muscular Atrophy
SMN: Survival motor neuron
SMN1: Survival motor neuron 1
SMN2: Survival motor neuron 2
snRNP: uridine-rich small nuclear ribonucleoprotein particle

vii

 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1 Trình tự hệ mồi và mẫu dò sử dụng............................................................... 21 
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đặc tính của mồi và mẫu dò ........................................ 22 
Bảng 4.3 Kết quả các chỉ số thứ cấp ............................................................................. 23 
Bảng 4.4 Kết quả chạy phản ứng Real-time đơn cho gen ß-actin ................................ 31 
Bảng 4.5 Kết quả chạy Real-time PCR đơn cho gen SMN1 ........................................ 31 
Bảng 4.6 Kết quả chạy phản ứng Real-time PCR multiplex ....................................... 32 
Bảng 4.7 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu gen SMN1............................... 34 
Bảng 4.8 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai gen ß-actin ...................................................... 35 
Bảng 4.9 Kết quả khảo sát độ nhạy gen ß-actin ............................................................ 35 
Bảng 4.10 Kết quả khảo sát độ nhạy gen SMN1 .......................................................... 36 
Bảng 4.11 Kết quả phản ứng Real-time PCR trên mẫu chứng ..................................... 38 
Bảng 4.12 Kết quả phản ứng Real-time PCR trên mẫu thực nghiệm ........................... 39 

viii


 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1 Vị trí gen SMN trên nhiễm sắc thể số 5........................................................... 3 
Hình 1.2 Cấu trúc gen và sự khác nhau trong ghép nối gen giữa SMN1 và SMN2....... 4 
Hình 1.3 Ghép nối mRNA gen SMN1 và SMN2 ........................................................... 5 
Hình 4.1 Kết quả chạy annhyb hệ mồi và mẫu dò gen SMN1 ..................................... 25 
Hình 4.2 Kết quả chạy annhyb hệ mồi và mẫu dò gen ß-actin ..................................... 25 
Hình 4.3 Kết quả blast mồi xuôi gen SMN1 ................................................................ 26 
Hình 4.4 Kết quả blast mồi ngược gen SMN1.............................................................. 27 
Hình 4.5 Kết quả blast mẫu dò gen SMN1. .................................................................. 27 
Hình 4.6 Kết quả blast mồi xuôi gen ß-actin. ............................................................... 28 
Hình 4.7 Kết quả blast mồi ngược gen ß-actin. ............................................................ 29 
Hình 4.8 Kết quả blast mẫu dò gen ß-actin. ................................................................. 30 
Hình 4.9 Kết quả chạy Real-time đơn cho gen ß-actin. ............................................... 31 
Hình 4.10 Kết quả chạy Real-time PCR đơn cho gen SMN1....................................... 32 
Hình 4.11 Kết quả chạy multiplex Real-time PCR....................................................... 32 
Hình 4.14 Kết quả khảo sát độ nhạy gen ß-actin. ......................................................... 36 
Hình 4.15 Kết quả khảo sát độ nhạy gen SMN1. ......................................................... 36 
Hình 4.16 Kết quả xây dựng đường chuẩn gen SMN................................................... 37 
Hình 4.17 Kết quả hiệu suất khuếch đại gen β-actin. ................................................... 37 
 

ix

 



x

 


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Teo cơ tủy sống (spinal muscular atrophy) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc

thể thường, với tần suất mắc bệnh khoảng 1/10000 đến 1/6000 và tần suất mang gen
bệnh là 1/50 đến 1/40, đây là bệnh di truyền có tần suất cao thứ hai ở Châu Âu chỉ sau
bệnh ung thư máu (Pearn 1980). Gen gây bệnh là SMN (survival motor neuron) gồm
hai allele là SMN1 và SMN2, với 94% bệnh nhân mắc bệnh do đồng hợp tử mất gen
SMN1 (Wirth, 2000). Bệnh này rất nguy hiểm do ảnh hưởng làm thoái hóa các tế bào
sừng trước tủy sống, bệnh nhân bị teo cơ, mất trương lực cơ, suy giảm hô hấp, gây
khuyết tật và gây chết ở lứa tuổi rất nhỏ đến lứa tuổi trung niên tùy thuộc vào type
bệnh. Hiện nay các phương pháp chẩn đoán dựa trên triệu chứng tỏ ra không thật sự
hiệu quả do bệnh có nhiều triệu chứng chồng chéo với một số bệnh teo cơ khác. Chính
vì thế các phương pháp chẩn đoán phân tử được coi là công cụ hữu hiệu để chẩn đoán
và phân type bệnh chính xác. Mặt khác dù được phát hiện từ những năm 90 của thế kỉ
19 nhưng cho đến nay bệnh vẫn chưa có phương pháp chữa trị hữu hiệu. Đến khi tìm
ra được cách chữa trị hiệu quả thì hạn chế các ca bệnh mới xuất hiện là giải pháp tốt
nhất hiện tại. Muốn làm được điều này thì trước tiên cần định lượng được số lượng
bản sao của SMN1 để phân biệt người bình thường với thể mang.
1.2.

Yêu cầu

Xây dựng thành công quy trình Real-time PCR định lượng bản sao gen SMN1

gây bệnh teo cơ tủy sống ở người.
1.3.

Nội dung thực hiện
Xây dựng và tối ưu hóa quy trình Real-time PCR định lượng bản sao gen

SMN1(thiết kế mồi và mẫu dò, kiểm tra hoạt động của mồi và mẫu dò,xác định nhiệt
độ lai, độ đặc hiệu của mồi và độ nhạy của quy trình)
Xây dựng cách tính để định lượng bản sao gen SMN1
Chạy thực nghiệm trên mẫu DNA của bệnh nhân teo cơ tủy sống và mẫu DNA
đại trà.

1

 


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về bệnh teo cơ tủy sống
Bệnh teo cơ tủy sống là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được mô
tả lần đầu tiên vào thập niên 1890 bởi Guido Werdnig (Đại học Vienna) và Johann
Hoffman (Đại học Heidelberg). Triệu chứng đặc thù của các bệnh nhân là yếu liệt và
thoái hóa cơ do tổn thương các tế bào thần kinh vận động. Yếu liệt cơ mang tính chất
đối xứng với đặc điểm cơ chân bị tác động nặng hơn hai tay, cơ tay bị tác động nặng
hơn cơ mặt và cơ hoành. Tùy theo thời điểm mắc bệnh và mức độ trầm trọng của bệnh
mà người ta chia bệnh thành 4 type:
2.1.1. Teo cơ tủy sống type I (SMA I)
Teo cơ tủy sống type I hay còn gọi là bệnh Werdnig-Hoffmann là bệnh của trẻ sơ

sinh, đây là thể bệnh nặng nhất, triệu chứng của bệnh thường xuất hiện ngay lúc mới sinh
hoặc trong vòng vài tháng đầu sau khi sinh, bệnh diễn tiến nhanh và thường dẫn đến tử
vong trước khi được hai năm tuổi vì suy hô hấp. Biểu hiện lâm sàng gồm có yếu liệt và
mất toàn bộ trương lực cơ, hoàn toàn không có cử động tự phát ngoại trừ vài cử động ngo
ngoe của bàn tay và bàn chân.Các ngón tay có thể có những cử động run rất nhẹ . Do yếu
liệt nặng nề các cơ nên hai chi dưới của trẻ luôn trong tư thế giống như chân ếch. Các cơ
liên sườn bị yếu liệt khiến trẻ phải thở bằng cơ hoành rất kém hiệu quả, ngoài ra trẻ còn có
biểu lộ khác như lồng ngực bị lõm và các xương sườn dưới bị xòe ra, rung cơ bó lưỡi.Tuy
nhiên các chức năng cơ tròn và cảm giác của trẻ bình thường. Thiếu dinh dưỡng, viêm
phổi hít sặc và suy hô hấp là những biến chứng kinh điển của thể bệnh này.
SMA I chiếm tỷ lệ cao nhất trong ba thể bệnh teo cơ tủy nhưng do trẻ bị thể này
chết sớm nên trong thực tế lâm sàng người ta hay gặp các thể SMA II và SMA III nhiều
hơn (Lê Minh, Huỳnh Văn Phụng và Võ Đôn, 2003)
2.1.2. Teo cơ tủy sống type II (SMA II)
Teo cơ tủy sống type II hay còn gọi là teo cơ tủy trung gian (intermediate form of
SMA). Bệnh thường biểu hiện triệu chứng lúc 6-12 tháng tuổi tuy nhiên ngay trước đó, kể
từ khi mới sanh, hiện tượng giảm trương lực cơ đã xuất hiện. Triệu chứng gồm yếu liệt
hai chi dưới nhiều hơn hai chi trên khiến trẻ không đi đứng được, bàn chân bị biến dạng.
Các phản xạ gân cơ thuộc các vùng cơ liệt bị mất trong khi đó phản xạ gân cơ thuộc các
2

 


vùng cơ bình thường vẫn còn hiện diện. Các bệnh nhi có thể ngồi, đứng hoặc đi được với
sự hỗ trợ của người khác. Tuổi tử vong trong khoảng bảy tháng đến bảy năm tuổi,một số
bệnh nhân có thể sống đến 30 hay 40 tuổi (Lê Minh, Huỳnh Văn Phụng và Võ Đôn,
2003).
2.1.3. Teo cơ tủy sống type III (SMA III)
Teo cơ tủy sống type III hay còn gọi là hội chứng Kugelberg-Welander là thể

bệnh nhẹ. Bệnh thường xuất hiện trễ vào cuối lứa tuổi thiếu niên và đầu lứa tuổi thanh
nhiên với triệu chứng teo cơ, dáng đi như vịt, ưỡn thắt lưng, ưỡn bụng và cong ngược
khớp gối với mặt lồi ra sau. Bệnh nhân SMA III có khả năng tự đi đứng được, không cần
có sự giúp đỡ của người khác tuy nhiên vẫn bị liệt khi đạt độ tuổi lớn hơn về sau. Thường
thì nếu yếu liệt xuất hiện trước hai tuổi, có thể bệnh nhân sẽ bị liệt ở tuổi 15, nếu yếu liệt
xuất hiện sau hai tuổi, bệnh nhân có thể còn đi đứng được cho đến tuổi 50. (Lê Minh,
Huỳnh Văn Phụng và Võ Đôn, 2003).
2.1.4. Teo cơ tủy sống type IV (SMA IV)
Teo cơ tủy sống type IV là thể bệnh xuất hiện ở giai đoạn muộn, thường ở độ
tuổi hai mươi đến ba mươi và bệnh diễn tiến rất từ từ. Các triệu chứng bệnh cũng
tương tự như triệu chứng được miêu tả ở SMA type III. (Lê Minh, Huỳnh Văn Phụng
và Võ Đôn, 2003).
2.2. Gen SMN: Nguyên nhân gây bệnh teo cơ tủy sống
2.2.1. Gen Survival motor neuron (SMN)
2.2.1.1. Vị trí và cấu trúc gen SMN

Hình 1.1 Vị trí gen SMN trên nhiễm sắc thể số 5 (Mitchell R Lunn và Ching H Wang,
2008).
Gen survival motor neuron (gen SMN) có hai bản sao là SMN1 và SMN2, cả
hai bản sao cùng nằm trên nhiễm sắc thể số 5, thuộc vùng phức hợp có chiều dài 500
kb, vùng này chứa một vài gen lặp: gen survival motor neuron (SMN), gen neuronal
3

 


apoptosis inhibitory protein (NAIP), gen mã hóa cho tiểu phần p44 của nhân tố phiên
mã TFJIH và gen H4F5. Trong đó SMN1 nằm ở vị trí 5q13 thuộc phần vai, còn SMN2
thuộc phần tâm động của nhiễm sắc thể. (Yolanda Martín và ctv., 2002).


 
Hình 1.2 Cấu trúc gen, nucleotide và sự khác nhau trong ghép nối gen giữa SMN1 và
SMN2 (Brunhilde Wirth, 2006).
Gen SMN gồm 9 exon (exon 1, 2a, 2b, và 3-8) với codon dừng nằm ở gần vị trí
kết thúc của exon 7, exon 8 không mã hóa, chiều dài vùng mã hóa khoảng 20kb, mã
hóa cho protein SMN, hai bản sao gen SMN1 và gen SMN2 chỉ khác nhau bởi 5
nucleotide, 1 ở intron 6, một ở exon 7, hai ở intron 7 và một ở exon 8, nhưng sự khác
biệt quan trọng của hai gen này là hai base ở exon 7 và 8(Burglen và ctv., 1997), được
ứng dụng trong phân biệt SMN1 và SMN2 và cũng được dùng trong chẩn đoán bệnh
SMA hiện nay. Trong đó đặc biệt quan trọng là sự khác biệt ở exon 7 (sự thay thế base
C thành T trong SMN2). Ở gen SMN1, vị trí +6, exon7 là nucleotide C, gen SMN1 tạo
sản phẩm là mRNA có chiều dài hoàn chỉnh và mã hóa cho protein SMN có đầy đủ
chức năng. Trong khi đó ở gen SMN2, vị trí +6, exon 7 là nucleotide T, khác biệt này
ảnh hưởng tới khả năng ghép nối mRNA, kết quả chỉ tạo ra 10% mRNA có chiều dài
hoàn chỉnh, mã hóa khoảng 10% protein SMN có đầy đủ chức năng. Còn lại khoảng
90% là protein SMN∆7, không có chức năng (Umrao R. Monani. 2005).
2.2.1.2. Quá trình ghép nối gen SMN
Như đã nói ở trên khác biệt trong khả năng tạo protein SMN hoàn chỉnh ở hai
gen SMN là do sự khác biệt ở vị trí +6, exon 7. Sự khác biệt này ảnh hưởng đến quá
trình ghép nối mRNA của hai gen.

4

 


Hình 1.3 Ghép nối mRNA gen SMN1 và SMN2 (Mitchell R Lunn, Ching H Wang,
2008).
Hiện tại có hai quan điểm khác nhau giải thích về cơ chế sự thay đổi một
nucleotide trên exon 7 của gen SMN làm thay đổi sự ghép nối exon 7 trên gen SMN2.

Cartegni và Krainer (2002) đưa ra bằng chứng rằng sự khác nhau trong exonic splicing
enhancer (ESE) ở exon 7, đây là vị trí bám của nhân tố splicing ASF/SF2. ASF/SF2
của gen SMN1 bám gắn với exon 7 hiệu quả hơn so với ASF/SF2 của gen SMN2 dẫn
đến sự bỏ qua exon 7 và làm cho chỉ 10% sản phẩm phiên mã của gen SMN2 có kích
thước đầy đủ. Kashima và Manley (2003) đưa ra lý giải khác rằng nucleotide khác biệt
ở exon 7 của gen SMN2 đã tạo ra exonic splicing silencer (ESS), đây là vị trí kết bám
của nhân tố kìm hãm ghép nối hnRNPA1. Nhân tố kìm hãm splicing hnRNPA1 này
chỉ kết bám với nhân tố kìm hãm của exon7 gen SMN2 nhưng không kết bám được
với exon 7 gen SMN1 dẫn đến sự bỏ qua exon 7 trong hầu hết sản phẩm phiên mã của
gen SMN2. Hiện tại chưa có khẳng định chắc chắn rằng cơ chế nào trong hai cơ chế
được nêu ra ở trên giải thích tốt nhất cho cơ chế splicing của gen SMN, cũng có thể là
cả hai cơ chế trên cùng đóng góp trong quá trình splicing của exon 7 SMN gen.
2.2.1.3. Chức năng gen SMN và vai trò của protien SMN trong bệnh teo cơ tủy
sống
Gen SMN mã hóa cho protein SMN có kích thước 38kDa, được cấu tạo từ 294
amino acid và không tương đồng với bất cứ protein đã được phát hiện trước đó.
Protein này được tìm thấy ở khắp cơ thể, với hàm lượng cao ở tế bào neuron vận động
tủy sống. Protein SMN rất quan trọng trong việc duy trì một loại tế bào thần kinh đặc
biệt gọi là neuron vận động (motor neuron) có trong sừng trước tủy sống. Khi hàm
lượng protein này tạo thành không đủ do đột biến xảy ra trên gen SMN1 sẽ gây bệnh
teo cơ tủy sống. Những người đột biến mất gen SMN1 có mức độ rất thấp protein
SMN, tuy nhiên có sự tương quan trực tiếp giữa số lượng bản sao gen SMN2 và mức
độ biểu hiện của SMN protein , số lượng bản sao SMN2 càng nhiều thì lượng protein
5

 


SMN được sản xuất cũng nhiều hơn và bệnh cũng nhẹ hơn (Umrao R. Monani, 2005).
Năm 1996, người ta phát hiện ra rằng protein SMN có khả năng gắn với heterogeneous

nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) và trú ngụ trong các cấu trúc dạng dấu chấm
trong nhân tế bào HeLa. Những cấu trúc này thường cùng được tìm thấy với các thể
cuộn (coiled bodies) và được gọi là gem (Gemini of coiled bodies). Thể cuộn (coiled
bodies hay còn gọi là Cajal bodies) có rất nhiều trong các nhân tố tham gia vào quá
trình phiên mã và các quá trình hình thành nhiều loại RNA nhân, small nuclear
ribonucleoprotein (snRNPs), và small nucleolar ribonucleoprotein (snoRNPs), người
ta kết luận rằng protein SMN giữ vai trò quan trọng trong quá trình tạo RNA. Các
nghiên cứu của các phòng thí nghiệm Dreyfuss và Fischer đã đưa ra rằng protein SMN
tồn tại trong tế bào dưới dạng một thành phần của phức hợp lớn bao gồm ít nhất 6
protein tương tác với nhau được gọi là gemins 2-7. Phức hợp này được công nhận là
có chức năng như là “assemblysome” giúp tăng cường tương tác giữa protein gắnkết
RNA (RNA binding protein) với trình tự đích của chúng. Phức hợp này được cho là
mang lại cho các RNA các đặc tính chuyên biệt của snRNAs và cho phép chúng kết
hợp với các protein thích hợp trong quá trình hình thành mạch snRNP. Sau khi phân tử
protein SMN gắn với snNP trong tế bào chất chúng sẽ đi vào trong nhân, tại đó chúng
tách rời khỏi phức hợp protein SMN và tập trung trong thể cuộn. Phức hợp SMN sau
đó sẽ tham gia vào quá trình ghép nối pre-mRNA để tạo thành mRNA hoàn chỉnh
(Umrao R. Monani, 2005).
2.2.2. Đột biến gen SMN1: nguyên nhân gây bệnh teo cơ tủy sống
Vì gen SMN1 là gene chịu trách nhiệm chính trong việc tạo thành protein SMN
hoàn chỉnh nên đột biến trên gen SMN1 gây sự thiếu hụt trong lượng protein SMN
được tạo thành, đây được xem là nguyên nhân gây bệnh teo cơ tủy sống. Đột biến trên
gen SMN1 có nhiều dạng bao gồm các đột biến lớn và đột biến nhỏ, có thể được phân
loại như sau:
2.2.2.1. Đột biến lớn (đột biến mất và đột biến hoán chuyển)
Đột biến lớn (đột biến mất đoạn và đột biến hoán chuyển) ở dạng đồng hợp tử
là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh SMA. Khoảng 94% bệnh nhân mắc SMA thiếu cả
hai bản sao exon 7 của gen SMN1. Mất gen SMN1 có thể xảy ra do mất đoạn: điển
hình là mất đoạn lớn bao gồm toàn bộ gen, hoặc mất đoạn exon 7, hoặc mất đồng thời
exon 7 và exon 8 hoặc do chuyển đổi thành gen SMN2. Hahnen và ctv., 1996 phát

6

 


hiện ra rằng phần lớn gen chuyển đổi từ SMN1 thành SMN2 mang trình tự của gen
SMN2 ngoại trừ exon 8 là mang trình tự của gen SMN1. Sự sai khác nhỏ trong các gen
SMN lai cũng đã được mô tả, bao gồm exon 7, intron 6 của gen SMN2 đặt cạnh intron
7 và exon 8 của gen SMN1, exon 7 của gen SMN2 xếp cạnh intron 6, exon 8 của gen
SMN1, và gen lai mang hầu hết trình tự của gen SMN1, ngoại trừ trình tự exon 8 của
gen SMN2 (người mang gen lai này là người không mắc bệnh). Các giả thuyết giải
thích cho việc hình thành gen lai gồm tái tổ hợp không đều, mất đoạn bên trong nhiễm
sắc thể (intrachromosomal deletion) và hoán chuyển gen ( Shuji Ogino, Robert B.
Wilson, 2002)
2.2.2.2. Đột biến nhỏ
Một số ít trường hợp mắc bệnh SMA là do đột biến dị hợp tử kết hợp nghĩa là
một bản sao gen SMN1 trên một nhiễm sắc thể bị mất đoạn exon 7, còn bản sao gen
SMN1 trên nhiễm sắc thể còn lại bị đột biến nhỏ. Khoảng 6% bệnh nhân SMA không
bị mất đồng thời hai bản sao gen SMN1(Wirth và ctv., 1999). Ở những bệnh nhân này
có những đột biến nhỏ (subtle hoặc non-deletion mutations) trên gen SMN1, trong đó
tỉ lệ này cao nhất ở bệnh nhân type III và thấp nhất ở bệnh nhân type I (Wirth, 2000).
Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy khoảng 40 đột biến nhỏ trên gen SMN1, trong đó các
đột biến nhỏ xảy ra thường xuyên nhất trên exon 6 và exon 3. Hai đột biến có tần số
cao nhất là đột biến chuyển nghĩa (missense) Y272C (815A→G, Wirth 2000; Wirth và
ctv., 1999) và đột biến chuyển khung 813ins/dup 11 (768_778dupTGCTATGCTT;
Wirth, 2000).
2.2.2.3. Đột biến de novo
Đột biến de novo xảy ra do bất thường trong quá trình giảm phân tạo giao tử.
Gen SMN1 có tỉ lệ đột biến mất de novo cao dẫn đến tần số thể mang SMA cao trong
dân số. Tỉ lệ đột biến de novo xấp xĩ 2%, tỉ lệ đột biến de novo có nguồn gốc từ cha và

từ mẹ có tần số khoảng 2,11×10-4 và 4,15×10-5. Đột biến mất de novo được báo cáo
nhiều nhất có nguồn gốc từ cha ( Ogino và ctv., 2002; Wirth và ctv., 1997). Có ba
nguyên nhân quan trọng được xem là gây đột biến de novo: trao đổi chéo không đều
giữa các nhiễm sắc thể đồng dạng, mất đoạn bên trong nhiễm sắc thể, hoán vị gen
(Hahnen và ctv., 1996). Do trình tự vùng lặp đảo ngược lớn (large inverted repeat) trên
nhiễm sắc thể 5q13 và trình tự lặp nhỏ xung quanh locus của gen SMN1 và SMN2 dẫn
đến trao đổi chéo và tái tổ hợp không đều, điều này có thể dẫn đến tỉ lệ đột biến de
7

 


novo cao ở gen SMN1. Tuy nhiên lý do tại sao đột biến de novo có nguồn gốc từ cha
có tần số cao hơn đột biến de novo có nguồn gốc từ mẹ vẫn chưa được biết rõ.
2.3. Kiểu gen của bệnh nhân teo cơ tủy sống và thể mang
2.3.1. Kiểu gen của bệnh nhân teo cơ tủy sống
Ở hầu hết các bệnh nhân (khoảng 80%) có kiểu hình SMA I mang đột biến
đồng hợp tử mất exon 7 (và đôi khi mất thêm exon 8), dẫn đến số lượng sản phẩm
phiên mã giảm mạnh và lượng protein SMN được tạo thành rất ít. Những bệnh nhân
này có một lượng protein SMN có đầy đủ chức năng được dịch mã từ gen SMN2. Ở
hầu hết bệnh nhân (khoảng 90%) với kiểu hình ít nghiêm trọng hơn, ở SMA II và
SMA III, thì exon 7 của gen SMN1 có đột biến điểm dẫn đến tình trạng tương tự như
exon 7 của gen SMN2, hay còn gọi là hiện tượng hoán chuyển gen SMN1 thành
SMN2, ở dạng này tuy lượng protein bị giảm mạnh nhưng cũng nhiều hơn so với
trường hợp mất đoạn exon 7 và dẫn đến tình trạng bệnh ít nghiêm trọng hơn (Wirth,
2000). Bác sĩ Trần Văn Khánh và ctv. đã tiến hành nghiên cứu trên năm bệnh nhân
SMA và đưa ra kết luận rằng đồng hợp tử mất gen SMN1 cũng là nguyên nhân gây
bệnh teo cơ tủy sống ở trẻ em Việt Nam (Trần Văn Khánh và ctv., 2002).
Khoảng 5-6% bệnh nhân SMA có ít nhất một exon 7 của gen SMN1, một nửa
trong số đó có đột biến trên gen SMN1, và nửa kia thì bị bệnh SMA không liên quan

đến nhiễm sắc thể số 5. Xấp xĩ 3% bệnh nhân SMA có kiểu gen dị hợp tử kết hợp,
những bệnh nhân này bị đột biến mất hoặc đột biến hoán chuyển trên một bản sao
SMN1, còn bản sao gen SMN1 còn lại thì bị đột biến điểm. Mặc dù tương đối hiếm,
nhưng đột biến nhỏ trên gen SMN1 gây bệnh SMN trên 1,8-4,8% bệnh nhân (ShuChin Chien, Yi-Ning Su, review, 2005).
2.3.2. Kiểu gen ở thể mang SMA
Một người chỉ mang một bản sao của gen SMN được gọi là thể mang, những
người này không biểu hiện bệnh SMA. Tuy nhiên, thể mang thì có thể sinh ra con bị
bệnh SMA nếu như vợ hoặc chồng của người đó cũng là thể mang, và con của họ
mang nhiễm sắc thể không có bản sao gen SMN của cả hai người. Với những cặp vợ
chồng là thể mang thì tỉ lệ sinh ra con bị mắc bệnh SMA là 25%. Đa số trường hợp thể
mang có kiểu gen “1+0” tức là có một bản sao gen SMN1 trên một nhiễm sắc thể và
không có bản sao gen SMN1 nào ở nhiễm sắc thể tương đồng còn lại (Ogino và ctv,
2002).
8

 


Khoảng 3-5% thể mang có kiểu gen “2+0” tức là có hai bản sao gen SMN1 trên
cùng một nhiễm sắc thể, còn nhiễm sắc thể còn lại không có bản sao gen SMN1 nào
(Ogino và ctv, 2002). Đây là trường hợp đặc biệt và hiện tại không thể được phát hiện
bởi các phương pháp định lượng gen.
Ngoài ra, ba mẹ của trẻ bị bệnh SMA có thể không phải là thể mang, do trẻ bị
bệnh có nguyên nhân bởi đột biến de novo , cho nên những cặp cha mẹ có con bị mắc
SMA vẫn có thể làm xét nghiệm thể mang để có thể xác định chính xác họ là thể mang
hay đứa trẻ sinh ra mắc bệnh là do đột biến de novo , nếu đứa trẻ mắc bệnh do đột biến
de novo thì cặp cha mẹ đó có thể tiếp tục sinh các đứa trẻ tiếp theo với tỉ lệ mắc SMA
thấp hơn rất nhiều (2%).
2.4. Chẩn đoán SMA
2.4.1. Chẩn đoán lâm sàng (Athanasios I. Tsirikos và ctv., 2006)

Thông thường các bác sĩ có thể chẩn đoán trẻ mắc SMA dựa trên các triệu
chứng lâm sàng quan trọng như yếu liệt cơ nặng ở hai tay và hai chân, rung cơ bó lưỡi,
mất phản xạ đầu gối...Ngoài ra các type SMA lại có các triệu chứng khác nhau như đã
nêu ở phần tổng quan.Mặc dù chẩn đoán lâm sàng là cực kì quan trọng tuy nhiên lại có
thể đưa đến kết quả nhầm lẫn vì có một số bệnh teo cơ khác cũng có các triệu chứng
tương tự nên cần có thêm các kiểm tra khác như kiểm tra nồng độ enzyme cơ trong
máu (enzyme creatine kinase-CPK). Kiểm tra nồng độ creatine kinase trong máu có
thể phân biệt được bệnh teo cơ với bệnh SMA, trẻ bị bệnh teo cơ thường thì có chỉ số
CPK rất cao, trong khi trẻ bị bệnh teo cơ tủy sống lại có chỉ số CPK bình thường hoặc
tăng rất nhẹ.Ngoài ra còn có các kiểm tra khác như:
Electromyography testing (EMG): Kiểm tra EMG gồm hai phần. Đầu tiên bác
sĩ sử dụng một loại dụng cụ kích thích thần kinh để kích thích và kiểm tra tốc độ dẫn
truyền kích thích thần kinh vận động và cảm ứng của cơ tay và chân của trẻ. Kiểm tra
này cần thiết để phân biệt SMA với một số bệnh thần kinh khác. Ở phần thứ hai, một
mẫu dò điện rất nhỏ sẽ được đưa vào một số cơ, nếu mẫu dò này phát hiện được một
số đặc điểm bất thường trong dẫn truyền thần kinh vận động cơ do sự mất chức năng
của tế bào thần kinh vận động thì có thể khẳng định trẻ mắc bệnh SMA. Kiểm tra
EMG rất nhạy tuy nhiên lại cần những bác sĩ có kỹ năng và kinh nghiệm để có thể

9

 


thực hiện quy trình kiểm tra này thật nhanh chóng, tránh sự đau đớn cho bệnh nhân
đồng thời có thể phân tích kết quả chính xác.
Kiểm tra sinh thiết cơ: Kiểm tra mô cơ thường được sử dụng phổ biến để khẳng
định kết quả chẩn đoán SMA. Sinh thiết cơ có thể được lấy bằng hai cách: Phẫu thuật
cắt trên da và lấy một mảnh cơ khoảng 1 đến hai inch để kiểm tra. Một phương phái
lấy sinh thiết cơ ít gây đau đớn hơn được sử dụng phổ biến hiện nay là “punch muscle

biopsy”, với phương pháp này các bác sĩ chỉ cần cắt mảnh cơ có kích thước vài
milimet. Sinh thiết cơ sẽ được đem đi kiểm tra các thông số cần thiết để đưa ra kết quả.
Mặc dù kiểm tra sinh thiết cơ có độ chuyên biệt cao cho bệnh SMA, tuy nhiên các
phương pháp khác như kiểm tra EMG hoặc kiểm tra di truyền được ưa chuộng hơn
trong chẩn đoán SMA. Khi nào các kiểm tra về di truyền không thể đưa ra được kết
quả chắc chắn thì kiểm tra sinh thiết cơ mới được sử dụng.
2.4.2. Chẩn đoán sử dụng các công cụ sinh học phân tử
2.4.2.1. Phương pháp phân tích liên kết (linkage analysis)
Thông thường các gen nằm cạnh nhau trên nhiễm sắc thể thường có xu hướng
liên kết với nhau và được di truyền cùng nhau. Dựa trên nguyên tắc đó thì nếu một số
căn bệnh thường được di truyền cho con cái cùng với các marker-gen chuyên biệt thì
có thể kết luận rằng gen gây bệnh nằm ở vị trí gần với marker-gen trên nhiễm sắc thể.
Trong bệnh SMA người ta thường xác định các marker của gen SMN1, phân
tích di truyền của các marker đó để xác định sự hiện diện hoặc không hiện diện của
gen SMN1, thông qua đó để chẩn đoán bệnh nhân có mắc SMA hay không. Các
marker của gen SMN1 thường nằm ở vị trí thuộc vùng tâm động hoặc vùng vai của
nhiễm sắc thể. Các marker liên kết đã được công bố là: : D5S125, D5S681, D5S435,
D5S629, D5S823, D5S1556/D5F150 (intragenic/SMN1 promoter region), D5S149
(intragenic/SMN1 promoter region), (SMN1), D5S557,D5S610, D5S351, 5’-MAP1B,
3’-MAP1B, D5S112, D5S127, and D5S539 ( review, Scheffer và ctv. 2001).
Phân tích liên kết là phương pháp nhanh và kinh tế tuy nhiên đây chỉ là phương
pháp gián tiếp và để hiểu được kết quả phân tích thì người thực hiện cần phải có những
kĩ năng nhất định.

10

 


2.4.2.2. Phương pháp PCR-SSCP

Phương pháp này dựa trên sự biến dạng gây ra bởi sự thay thế một nucleotide
trong một đoạn DNA mạch đơn. Sự thay đổi hình dạng này dẫn đến sự khác biệt về độ
di động điện di so với đoạn DNA mạch đơn của chủng hoang dại
Phương pháp PCR-SSCP bao gồm sự khuyếch đại bằng PCR một đoạn DNA cần quan
tâm, sản phẩm khuyếch đại được biến tính và điện di trong gel polyacrylamide cùng
với mẫu hoang dại cũng đã được biến tính. Sự thay đổi độ di động điện di ở những
mẫu lâm sàng biểu thị sự hiện diện của nucleotide bị biến đổi ở vùng được phân tích.
PCR-SSCP được sử dụng để phát hiện đồng hợp tử mất exon 7 và 8 (Lefebyre
và ctv., 1995).
Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, rẻ tiền và dễ thực hiện. Tuy nhiên,
hiện nay phương pháp này chỉ còn được sử dụng để phát hiện các đột biến nhỏ đối với
những bệnh nhân không phải bị SMA do đồng hợp tử mất SMN1.
2.4.2.3. Phương pháp PCR-RFLP (SMN1 deletion assay)
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên phản ứng PCR để khuyếch đại một
đoạn DNA chứa vị trí nhận biết đích. Sau đó, sản phẩm khuyếch đại được cắt với một
hoặc một vài enzyme cắt giới hạn (tùy thuộc vào số vị trí nhận biết của enzyme cắt tại
vị trí nhận biết đich). Những sản phẩm cắt này sẽ được điện di trên gel agarose. Dựa
vào sự hiện diện của các đoạn cắt giới hạn, chúng ta có thể xác định được có sự sai
khác, đột biến tại vị trí đích hay không.
Trong chẩn đoán SMA người ta dùng xét nghiệm PCR-RFLP (hay còn gọi là
SMN1 deletion assay) để phát hiện đồng hợp tử mất SMN1 (Van der Steege và ctv.
1995). Xét nghiệm PCR-RFLP dựa trên base khác biệt ở exon 7 và 8 để phân biệt
SMN1 và SMN2. Sau khi thực hiện phản ứng PCR với mẫu để khuyếch đại gen
SMN1, SMN2, sau đó sản phẩm khuyếch đại sẽ được cắt bởi enzyme giới hạn DraI
hoặc Dde I . Enzyme giới hạn DraI chỉ cắt exon 7 của SMN2, sau phản ứng cắt bởi
enzyme này thì SMN1 không bị phân cắt tạo ra một đoạn DNA có chiều dài 190 bp,
trong khi đó SMN2 bị phân cắt thành hai đoạn với chiều dài 170 bp và 20 bp. Còn
DdeI chỉ cắt exon 8 của SMN2, sau khi cắt bởi enzyme Dde I thì SMN2 tạo thành hai
đoạn có chiều dài là 119 bp và 68 bp, còn SMN1 chỉ có một đoạn 187 bp (Yu-hua
Liang và ctv., 2008). Sau khi thực hiện phản ứng cắt, thì sản phẩm sẽ được đem điện

di và phân tích kết quả.
11

 


Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có thể phát hiện được đồng hợp tử mất SMN1
nhưng lại không thể xác định được thể mang SMN1, chính vì thế cần đến các phương
pháp định lượng bản sao SMN1.
2.4.2.4. Phương pháp Realtime-PCR
Phương pháp Real-time PCR được xem là công cụ đáng tin cậy trong chẩn đoán
phân tử bệnh SMA, sử dụng phương pháp này người ta có thể xác định bệnh nhân có
bị mắc bệnh hay không hoặc xác định thể mang thông qua định lượng số lượng bản
sao gen SMN1, đồng thời cũng có thể xác định số lượng bản sao gen SMN2 để tiên
đoán tình trạng bệnh của bệnh nhân, do các nghiên cứu đã công bố rằng số lượng bản
sao gen SMN2 có tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh, số lượng bản sao
gen SMN2 càng nhiều thì bệnh càng nhẹ hơn.
Thông thường các nhà nghiên cứu xây dựng quy trình Real-time PCR định
lượng bản sao gen SMN1 và SMN2 thông qua exon 7, dựa vào sự khác biệt giữa hai
gen đó tại vị trí nu thứ 6 trên exon 7, gồm có 2 hướng chính:
Sử dụng cặp mồi chuyên biệt để phân biệt gen SMN1và gen SMN2 (phương
pháp allele specific Real-time PCR): Mồi xuôi được thiết kế để phân biệt
SMN1và SMN2: Nu cuối cùng tại đầu 3’ bắt tại vị trí Nu thứ 6 trên exon 7 ở 2
gen SMN, mồi ngược được dùng chung cho cả hai gen, mẫu dò được sử dụng
để phát hiện và định lượng cũng được dùng chung cho hai gen. Hai phản ứng
định lượng gen SMN1 và SMN2 sẽ được thực hiện riêng biệt (Ilsa GómezCuret và ctv,2007)
Sử dụng mẫu dò DNA có gắn MGB, có độ nhạy cao, cho phép phân biệt gen
SMN1 và SMN2. Trong phương pháp này thì cặp mồi trong phản ứng PCR
dùng chung cho cả 2 gen SMN1và SMN2. Sử dụng cặp mồi chung khuếch đại
cả 2 gen SMN1 và SMN2, sau đó hai gen SMN1 và SMN2 sẽ được phát hiện và

định lượng nhờ vào mẫu dò chuyên biệt cho từng gen. Mẫu dò này được thiết
kế để phát hiện nucleotide khác biệt ở vị trí +6, exon 7 (Dirk Anhuf và ctv,
2003; Nadia Passon và ctv, 2009)
Để định lượng tương đối số lượng bản sao của hai gen này người ta sử dụng
thêm gen tham chiếu, gen tham chiếu này vừa có tác dụng như là chứng nội vừa có tác
12

 


dụng trong phần tính toán sự tương quan giữa gen tham chiếu với gen đích (gen SMN1
hoặc SMN2) nhờ đó có thể tính toán tương đối số lượng bản sao của gen đích.
2.4.2.5. Phương pháp MLPA
Phương pháp MLPA (Multiplex Ligation-dependent probe Amplification) là
phương pháp khá mới, có thể thực hiện ở quy mô lớn, được phát triển bởi MRC Hollan,
phương pháp này cho phép phát hiện số lượng bản sao DNA thay đổi lên tới 40 trình tự
trong một phản ứng đơn. Đây là một phản ứng dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR bán
định lượng.
Để định lượng bản sao SMN bằng phương pháp MLPA, người ta dùng 16 mẫu
dò đặc hiệu cho các vùng quan trọng trên vùng 5q12.2-5q13.3 của nhiễm sắc thể số
5.Hỗn hợp này bao gồm 1 mẫu dò cho mỗi exon 1, 4, 6 và 8 của SMN1 và SMN2; hai
mẫu dò cho exon 7 tại vị trí có sự chuyển đổi C thành T, hai mẫu dò cho exon 8 tại vị
trí G chuyển thành A, hai mẫu dò cho gen NAIP và BIRC1-D02, 3 mẫu dò cho
GTF2H2, một mẫu dò cho gen N-cadherin-like, một mẫu dò cho gen CDH6 và một
mẫu dò cho gen RAD17 (Oronzo Scarciolla và ctv, 2006).
2.4.2.6. Phương pháp DHPLC
Trong quy trình DHPLC (denaturing high-performance liquid chromatography)
thì sản phẩm PCR sẽ được phân tách trên cột sắc kí để đưa ra các thông tin DNA riêng
biệt cho từng cá thể. Đây là kỹ thuật mới, nhanh và dễ dàng để phân tích DNA.
DHPLC được ứng dụng để phát hiện đồng hợp tử mất SMN1, tuy nhiên kỹ

thuật này không thể phát hiện được dị hợp tử mất SMN1 (đối với trường hợp thể mang
hoặc trường hợp mất một gen SMN1 và đột biến ở gen SMN1 còn lại) (Yi-Ning Su và
ctv., 2005).

13