KĨ THUẬT CHUYỂN GEN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM
KHOA SINH HỌC

Môn: KĨ THUẬT DI TRUYỀN

GIẢNG VIÊN: CÔ NGUYỄN THỊ HẰNG

NHÓM 6
1. Lê Thị Trinh
2. Huỳnh Thị Anh Thơ
3. Dương Thị Đào
4. Nguyễn Ngọc Như
5. Nguyễn Thị Hương Lài

Mục lục

1


A. KHÁI NIỆM VỀ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ GEN CHUYỂN
1. Khái niệm kỹ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ (1 đoạn phan tử ADN hoặc
RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn vào
bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ
hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất
hiện những đặc điểm mới của cơ thể chuyển gen. Mục đích tạo ra giống sinh vật mới.
- Kĩ thuật chuyển gen gồm những bước cơ bản sau:
1. Tạo ADN tái tổ hợp
2

2. Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận
3. Kiểm tra sự sát nhập của gen và biểu hiện của gen
Quy trình của kĩ thuật chuyển gen giống với tạo dòng nhưng có mục đích khác nhau. Kĩ
thuật chuyển gen nhằm tạo ra giống sinh vật mới.
Nguyên lý: một đoạn gen mong muốn được khai thác, sau đó chúng được tháo tác các
yếu tố cần thiết để chuyển vào hệ gen nhân của tế bào nhận. Gen chuyển có khả năng
biểu hiện và di truyền ổn định ở thế hệ sau, đó là nguyên lý của công nghệ này.
2. Gen chuyển

Gen chuyển là các gen mã hóa tính trạng mong muốn được tách chiết từ các sinh vật
khác như động vật, thực vật, vi sinh vật... chúng mã hóa các tính trạng số lượng, chất
lượng (như sản lượng sữa, thịt), hay mã hóa một số thành phần bổ sung.
Cấu trúc của gen chuyển bao gồm 2 trình tự chính: Trình tự mã hóa cho phân tử
protein (transgen – gen chuyển) và trình tự điều hòa (promoter và enchancer).
Để biểu hiện protein trong mô chuyên biệt, cấu trúc gen phải chứa trình tự điều hòa
thích hợp, có khả năng phiên mã trực tiếp trong mô. Vùng điều hòa có chiều dài khoảng
100bp, kết hợp với các nhân tố cis hoặc trans để tham gia quá trình phiên mã (khởi động
hay kết thúc quá trình phiên mã.
Enhancer: một đoạn ADN ngắn, có thể gắn với protein (còn gọi là nhân tố hoạt động
trans), làm tăng mức độ phiên mã của gen mục tiêu trong 1 nhóm gen, không phụ thuộc
vào vị trí định hướng của gen.
*Ngoài ra còn nhiều cấu trúc khác cần gắn vào gen chuyển
- Các marker chọn lọc: khi gen chuyển vào tế bào, chúng được nuôi cấy để sau đó
sàng lọc, chọn ra những tế bào đã được biến nạp hoặc tải nạp thành công. Gồm 2 loại:

3



+ Các marker chọn lọc dương (sản phẩm của gen chọn lọc) được sử dụng hiệu quả
trong hầu hết các gen chuyển, nhằm chọn lọc những tế bào đã nhận được cấu trúc gen
chuyển (ở dạng tự do hay đã được sát nhập vào bộ gen tế bào chủ).
+ Các marker chọn lọc âm thường đươc sử dụng: HSV-tk, dt và hprt để chọn lọc tế
bào không tồn tại gen chuyển hay 1 gen nào đó bên trong.
- Gen báo cáo (reporter gen) là những gen mã hóa cho các protein dễ phát hiện giúp
báo cáo vai trò hoạt động của gen, được chèn vào “bên sườn” của gen chuyển. Dựa vào
sự biểu hiện của gen báo cáo giúp đánh giá sự điều hòa của gen chuyển trong tế bào hay
mô.
- Polylinker: Ở cuối các cấu trúc gen có thể được biến đổi để hình thành các
polylinker chứa một số vị trí nhận diện của các enzyme cắt giới hạn. Polylinker cho phép
cấu trúc gen chèn vào những vector, nhằm mục đích nhân dòng và kiểm tra.
ADN gen chuyển được tạo ra bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn và ligase,
gen từ những loại khác nhau có thể được kết hợp lại trong ống nghiệm để tạo thành cấu
trúc gen chuyển.

Cấu trúc gen chuyển

ATG: Vị trí bắt đầu phiên mã
SIG: Trình tự dấu hiệu
AAA: đuôi poly A

4


3. Các nguyên lý sinh học
-

Tạo các điều kiện sinh lý sinh hóa, hoăc cưỡng bức để hệ tế bào chủ chấp nhận yếu tố lạ


-

(gen chuyển), tránh sự thải loại
Gen chuyển phải vào được trong tế bào nhận và phải diễn ra sự dung hợp giữa gen tế bào

-

vào gen chuyển
Gen chuyển phải được biểu hiện trong tế bào chủ
Số lượng cá thể nhận gen chuyển phải được khuếch đại (di truyền cho thế hệ con cái) để

-

di truyền hiệu quả của gen chuyển.
Tổ hợp gen cần chuyển phải được chèn chính xác vào vị trí cần thiết đồng thời khống chế
được những tác động tiêu cực của mô chủ.

5


B. CÁC BƯỚC TRONG CHUYỂN GEN
I. Tạo ADN tái tổ hợp
1. Khái niệm chung
- ADN tái tổ hợp (recombinant ADN) được dùng để chỉ các phân tử ADN được tạo ra
từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau.

6


* Những yêu cầu của ADN tái tổ hợp

- ADN tái tổ hợp phải đạt được những yêu cầu cần thiết của một vector chuyển gen.
- ADN tái tổ hợp phải có hoạt tính khi đưa vào tế bào chủ.
- ADN tái tổ hợp phải có những dấu hiệu dễ phát hiện trong quần thể vi khuẩn. Và dễ
quan sát sự hoạt động và biểu hiện của gen tái tổ hợp.
2. ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
Các bước cơ bản thực hiện ADN tái tổ hợp
2.1. Chọn nguyên liệu
- ADN được chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường là ADN plasmid và
ADN phage. Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, được tách và làm sạch
theo phương pháp chiết tách ADN plasmid, ADN virus.
- ADN chứa gen cần nghiên cứu (ADN lạ) cũng được thu nhận từ tế bào sinh vật được
chiết tách và làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách ADN.
2.2. Gia công đoạn ADN cần chuyển với sự tham gia của enzyme RE kiểu II
RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt ở những vị trí xác định
chúng có một số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm
nhiệm việc cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong
hay cạnh trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg +2 và không cần năng lượng ATP.
- Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử ADN và cắt ADN thành hai
mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính.
Hiệu quả cắt của enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như hàm
lượng của enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của ADN.

7


2.3. Nối ADN vào vector với sự có mặt của enzyme ADN ligase
Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối các đoạn ADN vào vector chuyển gen để
tạo vector tái tổ hợp có mang ADN lạ. Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme ADN
ligase.
ADN ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh ADN bằng cách tạo

cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau
(Hình 6-2). Trong sinh học phân tử, người ta coi ADN ligase như một chất keo phân tử
để kết dính các mẫu ADN lại với nhau.
2.3.1. Nối đầu bằng
Nối đầu bằng được xảy ra khi

hai

đoạn ADN đầu bằng đứng cạnh
nhau. Dưới tác dụng của enzyme
ligase, liên kết phosphodiester
giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH)
được hình thành và hai nucleotide
được nối lại với nhau.
2.3.2. Nối đầu lệch
Đầu tiên, hai mảnh ADN đầu
lệch do có những bazơ bổ sung
nên chúng tiến gần lại nhau để tạo
liên kết hydro giữa các bazơ nitơ

bổ

sung. Sau đó, hai nucleotide của

hai

đầu nối tạo liên kết este giữa OH
(3’) và P (5’) dưới tác dụng của
enzyme ADN ligase.
=> Nhờ sử dụng các enzyme cắt giới hạn và ligase, gen từ những loài khác nhau có thể

được kết hợp lại trong ống nghiệm để tạo thành cấu trúc gen chuyển.
8


II. Đưa ADN vào tế bào nhân
1. Kỹ thuật Calcium phosphate (calcium phosphate technique)
Nguyên tắc: khả ẩm bào của phức hợp ADN – calcium phosphate.
Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) được phát triển đầu tiên để
xác định sự lây nhiễm của ADN virus (Graham,1973).
Hiện nay được sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp của ADN virus
cũng như ADN tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer,
1980).
Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết tủa ADN và calcium
phosphate. Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm
bào (Loyter, 1982). Trong tế bào, các phân tử ADN ngoại lai nằm trong không bào được
tạo thành do ẩm bào và lysosome nhưng rất ít ADN đi đến nhân và hợp nhất vào genome
chủ.

Hình: Phức hợp ADN-calcium phosphate.
Kỹ thuật này vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma
nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích. Bên
9


cạnh đó, biến nạp ADN tách chiết từ các tế bào ung thư vào các tế bào nhận không ung
thư đã cho thấy đây là phương pháp duy nhất để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của
ung thư.
Ưu điểm: đơn giản, protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp
không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc ổn định và quan trọng trong việc
thiết kế vector virus tái tổ hợp.

Nhược điểm: hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp.
2. Chuyển gen qua liposome
Nguyên tắc: sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-ADN.

Hình 2.1: Cấu trúc tổng quát của Lipid cation.

Hình 2.2: Cấu trúc tổng quát của DOPE (L-diolecyl phosphatidyllethanolamine).

10


Hình 2.3: Phức hợp Liposome-ADN.

11


Hình 2.4: Sơ đồ Hoạt động của vector liposome.
-

Lipid cation được trộn với một lipid trung tính như L-dioleoyl phosphatidyl-

-

ethanolamine (DOPE).
Phần cation của phân tử lipid kết hợp với ADN tích điện âm và kết quả là chứa đầy ADN

-

trong phức hợp liposome-ADN.
Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân.

DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của nó là phóng thích các
phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài
với phức hợp liposome-ADN xảy ra dễ dàng.
Ưu điểm: gen chuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả tốt đối với
cả tế bào in vitro và in vivo, có thể mang được các ADN có kích thước rất lớn, độ tinh
khiết cao, không gây miễn dịch, có thể sử dụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuật
calcium phosphat không có hiệu quả.
Nhược điểm: sự biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành
phần của huyết thanh có thể xảy ra.

12


3. Phương pháp vi tiêm
Sự thành công đầu tiên trong nghiên cứu tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp vi
tiêm vào tiền nhân đã được công bố vào năm 1980 (Gordon, 1980).

Hình 3.1: Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân của trứng thụ tinh.
Cho đến nay, trong các kỹ thuật chuyển gen vào động vật thì phương pháp vi tiêm
dung dịch ADN vào hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất trên động vật có vú và hiện
là phương pháp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi.
Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi
của hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn.

13


Nguyên tắc: một lượng nhỏ ADN được tiêm trực tiếp vào tế bào phôi trần hoặc tế
bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi.


- Dung dịch gen chuyển
- Gen chuyển được xen vào trong một vector plasmid và tạo dòng trong E.coli.
- Các vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp được phát hiện trong môi trường
nuôi cấy có thuốc kháng sinh do plasmid mang các gen kháng thuốc đặc hiệu.
- Các vi khuẩn sống sót được sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng thích hợp
và plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển sẽ được sao chép mỗi khi tế bào vi khuẩn phân
chia.
- Sau đó, hàng triệu bản sao của plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển được tách
chiết từ các tế bào vi khuẩn này và các đoạn gen chuyển được tách ra từ plasmid tái tổ
hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế.
- Ðể tinh sạch, gen chuyển được điện di trên gel agarose.
- Hoà tan gen chuyển trong dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA;
dung dịch TE...) và tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế.
- Nồng độ dung dịch ADN sử dụng cho vi tiêm thường là 1-5 µg/ml.
- Trước khi chuyển vào phôi, gen chuyển được kiểm tra sự biểu hiện trong các tế
bào nuôi cấy bằng sự chuyển nhiễm (transfection).
14


- Các bước tiến hành
- Nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung
dịch gen khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào.
- Lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa
petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ
bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy
vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân
bằng cách vặn nhẹ syringe. Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở nên sáng hơn thì
dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra.
- Trứng tiền nhân sau khi tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêm
trứng tiền nhân tiếp theo.

- Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi
trường khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng.
- Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ống
dẫn trứng của con cái nhận.
Loài động

Số lượng trứng được

Số lượng con sinh ra từ

Số lượng

vật

vi tiêm

trứng vi tiêm

con chuyển gen

Thỏ

1907

218 (11,4%)

28 (1,5%)

Cừu


1032

73 (7,1%)

1(0,1%)

Lợn

2035

192 (9,4%)

20 (1%)

Hình 3.4: Hiệu quả của vi tiêm ở một số loài động vật (Hammer và cộng sự, 1985).
Ưu điểm:
- Cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương
đối cao.
- Phương pháp chuyển gen có hiệu quả nhất trên động vật có vú và hiện là phương
pháp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi.
- Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi
của hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn.
Nhược điểm:
15


- Đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác nên hạn chế số lượng tế bào vi
tiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khi
thực hiện.
- Sự xâm nhập của gen chuyển vào ADN tế bào vật chủ là một quá trình ngẫu

nhiên và xác suất để gen chuyển xen vào vị trí ADN vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện
là thấp.
4. Biến nạp (Transformation)
Nguyên tắc: Muốn đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ được phải làm cho màng
sinh chất tế bào nhận bị biến đổi sau đó ủ với một tỉ lệ giữa vector tái tổ hợp với tế bào
chủ đã xử lý.
Biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN. Trong biến
nạp, ADN trần từ một tế bào vi khuẩn (thể cho) này được truyền sang tế bào vi khuẩn
khác (thể nhận). Biến nạp xảy ra khi vi khuẩn nhận ADN ngoại lai và hấp thu vào trong tế
bào. Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do bị tan (lysis), ADN vòng tròn của chúng thoát ra môi
trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau, có khả năng gây biến nạp cho các
tế bào nhận khác.
Biến nạp được nghiên cứu kĩ nhất ở các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae,
Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae và ở một số nhóm vi khuẩn khác.
Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố:
+ Tính dung nạp của tế bào nhận.
+ Kích thước của đoạn ADN ngoại lai.
+ Nồng độ của ADN.

16


4.1. Cơ chế phân tử

Hình 4.1: Sơ đồ diễn biến của quá trình biến nạp ở cấp độ phân tử
a.

ADN bám vào. b. Thâm nhập. c. Bắt cặp và tái tổ hợp. d. –Tế bào biến nạp

4.2. Quá trình gồm các giai đọan chủ yếu

– Sự phân hủy ADN tế bào cho: ADN tế bào cho có thể là của tế bào tự nhiên bị
phân hủy hoặc trong thí nghiệm bị gây chế bằng nhiệt độ cao hay tác nhân phá vỡ tế bào.
– ADN bám vào bề mặt tế bào: Protein gắn vào ADN.
– Thâm nhập của ADN: Sợi ADN mạch kép của dòng vi khuẩn S sau khi chui qua
màng tế bào của dòng R thì một mạch S sẽ bịnucleaz của tế bào cắt, còn lại một mạch
nguyên.
– Bắt cặp (Synapsis)và tái tổ hợp: Nhờ sự hỗ trợ của protein RecA ADN của thể
nhận R sẽ biến tính tách rời 2 mạch ở 1 đoạn dễ bắt cặp với đoạn ADN thể cho S vừa
chui vào.
17


Sao chép: Sau khi bắt cặp tạo đoạn lai R - S, phân tử ADN sao chép tạo ra 2 sợi,
một sợi kép R-R và sợi kép khác có mang đoạn ADN thể nhận S-S. Kết quả cuối cùng là
đọan gen của SIII chèn vào bộ gen tế bào nhận. Sau phân bào thì một dòng tế bào nhận
được ADN ngoại lai vào bộ gen - tế bào được biến nạp. Tế bào đã được biến nạp sinh sản
tạo dòng nhận RII mới.
4.2.1. Làm cho màng sinh chất bị biến đổi nhờ hóa biến nạp
- Phương thức kinh điển để biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.Coli.
+ B1: Các tế bào chủ được ủ trong dung dịch CaCl 2 để trở thành tế bào khả biến
giúp cho chúng dễ tiếp nhận ADN plasmid.
+ B2: ADN plasmid đưa vào bằng cách shock nhiệt nhanh (40-50giây)
+ B3: Các tế bào biến nạp được chọn lọc bằng phương pháp chọn lọc dương tính
trên đĩa agar chứa môi trường LB với kháng sinh thích hợp. Mỗi khuẩn lạc trên đĩa kháng
sinh đại diện cho một thể biến nạp đơn
+ B4: Bổ sung thêm cơ chất NST cho β – galactosidase (X- gal)
=> Các tế bào chứa plasmid mang ADN ngoại lai có thể xác định bằng mắt
4.2.2. Làm cho màng sinh chất bị biến đổi nhờ điện biến nạp
- Đây là kĩ thuật hiệu quả nhất để biến nạp vi khuẩn.
- Hai thông số quan trọng là loại tế bào vi khuẩn và tần số xung điện cần thiết.

Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên màng
sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ ADN tái tổ hợp dễ dàng.
- Hiệu suất khoảng 108 - 109 thể biến nạp/μg plasmid.
- Phương pháp này đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền.
4.2.3. Biến nạp gen nhờ polyetylen glycol (PEP)
- Là phương pháp chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lý bằng
polyetylen glycol (PEG).
- Để tạo tế bào trần người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30 – 40%.
- Đây là phương pháp hiệu quả cao đối với tế bào thực vật. Bằng phương pháp này
người ta đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua nhiều
thế hệ.
Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao. Có thể
chuyển gen vào tế bào protoplast của bất kỳ loại cây nào. Đặc biệt loai cây có giá trị
kinh tế cao như: lúa, ngô, đại mạch.
Nhược điểm: Việc tái sinh cây protoplast còn rất khó khăn ở một số loài cây.
5. Tải nạp (Transduction)

18


Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn cho
sang vi khuẩn nhận, trong đó quá trình chuyển gen và tái tổ hơp gen ở vi khuẩn nhờ thực
khuẩn thể (Bacteriophage).
Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E.Coli qua phage λ, pha P1 và ở Bacillus
subtilis qua phage SP10 thì tải nạp cho hiệu quả cao hơn.
Tiêu chuẩn virus làm vector chuyển gen:
+ Hệ gen của virus phải là ADN.
+ Không gây tác hại đáng kể cho thực vật.
+ Có khả năng tải được đoạn ADN gắn vào.
Tuy nhiên phương pháp này ít được sử dụng

Ưu điểm: Virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật.
* Tải nạp gồm: tải nạp chung và tải nạp chuyên biệt.
5.1. Tải nạp chung (Genral transduction)
Tải nạp chung xảy ra khi phage mang bất kì gen nào của vi khuẩn A chuyển sang vi
khuẩn B.
Tải nạp chung (genralized transduction) có các đặc điểm:
- Thường do phage kiểu P1 thực hiện.
- Bất kì gen nào của vi khuẩn cũng đều được tải nạp.
- Tải nạp có được do gói nhầm ADN của tế bào chủ khi phage trưởng thành.
- Các thể tái tổ hợp đơn bội được tạo ra.
5.2. Tải nạp chuyên biệt (Special transduction)

19


Tải nạp chuyên biệt hay hạn chế (restricted transduction) là trường hợp chỉ mang một
vài gen nhất định, nó có 4 đặc điểm:
- Những gen được chuyển nằm sát chỗ prophage gắn vào.
- Chỉ prophage kiểu λ thực hiện.
- Do kết quả sự cắt sai của prophage khi tách khỏi nhiễm sắc thể của tế bào chủ.
- Các vi khuẩn tái tổ hợp có thể lưỡng bội một phần.
6. Chuyển gen nhờ vector là virus
Nguyên tắc: Virus được sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm của phôi
trước khi được chuyển ghép vào con mẹ.
Nhiều nhóm trong số đó, các papovavirus, adenovirus, retrovirus...được sử dụng vào
những mục đích chuyên biệt. Ðể sử dụng làm vector, các phần khác nhau của genome
virus được thay thế bằng gen cấu trúc quan tâm; các virus được sử dụng phải an toàn,
không gây bệnh.
Các cơ thể chuyển gen sinh ra ở dạng khảm. Gen chuyển chỉ có thể di truyền được
nếu retrovirus hợp nhất vào một số tế bào sinh dục.

Khi gen chuyển đã hợp nhất trong các tế bào sinh dục thì được gọi là thể khảm dòng
mầm và sau đó được lai cùng dòng khoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được các động
vật chuyển gen đồng hợp tử và gen chuyển có mặt ở trong tất cả mọi tế bào. Ở giai đoạn
này, phôi mang gen chuyển có thể được đông lạnh và được bảo quản cho các quá trình
cấy chuyển về sau.
Ưu điểm: Bất kỳ loại virus nào cũng có thể được sử dụng làm vector để chuyển vật
liệu di truyền vào trong tế bào.

20


Nhược điểm: Tỉ lệ sống của các động vật chuyển gen sơ sinh rất thấp.

Hình 6.1 Chuyển gen ở chuột nhờ vector là virus.
7. Chuyển gen bằng súng bắn gen
Nguyên tắc: sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tăng tốc độ các hạt.
Sử dụng các hạt tungsten đường kính rất nhỏ hoảng 1 micromet ( có thể là các hạt
kim loai nặng như vàng, bạc…) được bao bọc ADN và bắn trực tiếp vào tế bào.

21


Dùng phổ biến nhất trong chuyển gen các loài ngũ cốc.

Hình 8.1: Nguyên lý hoạt động cúa súng bắn gen.
Ưu điểm: thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào
được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong
muốn.... Ứng dụng đa dạng: tạo thực vật chuyển gen, tiêm chủng vaccine di truyền, liệu
pháp gen tự sát, sự điều biến miễn dịch, …
Nhược điểm: Cây chuyển gen khó tái sinh, hiệu quả thấp, đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi

phí vật tư đắt (hạt vàng, volfram…).
=> Tóm lại có rất nhiều phương pháp nhưng sẽ phụ thuộc vào nhiều yếu tố để chọn ra
phương pháp phù hợp nhất. Không có phương pháp nào là tối ưu nhất.

III. Kiểm tra sự sát nhập của gen chuyển và biểu hiện của gen

22


1. Kiểm tra sự sát nhập của gen chuyển
- Công việc này tốn nhiều thời gian và công sức, bao gồm từ bước thu nhận mô, tách
chiết ADN, xác định sự hiện diện của gen chuyển trong bộ gen. Một số phương pháp
thường được sử dụng là PCR, Southern blot, dot blot, sot blot.
+ Sử dụng PCR để sàng lọc sơ bộ hàng trăm, hàng ngàn cá thể được chuyển gen, sau đó
sử dụng các phương pháp Southern blot để khẳng định kết quả sàng lọc ban đầu của PCR.
+ 2 phương pháp Dot blot và slot blot cũng dùng song song để định lượng tương đối một
loại ADN đặc trưng nào đó cũng bằng phương pháp lai phân tử và đánh dấu phóng xạ.
2. Xác định sự biểu hiện của gen chuyển
- Kiểm tra sự biểu hiện của gen là bước cuối cùng và quan trọng nhất. Có hai cách đánh
giá sự biểu hiện của gen ngoại lai trong cơ thể vật chủ:
+ Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua protein
+ Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua mARN
2.2. Một số phương pháp xác định sự biểu hiện của gen chuyển
2.2.1. Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua protein của gen được dịch mã
- Sử dụng trong trường hợp kháng thể của protein gen chuyển có sẵn, phát hiện sự biểu
hiện protein có thể được tiến hành bằng phương pháp Western blot, ELISA, RIA.
1. Thu nhận protein
2. phân tích kích thước protein bằng điện di
3. Các vạch lai với kháng thể chuyên biệt (lai phân tử)
=> Sự tồn tại các bắt cặp đặc hiệu của kháng thể và protein trên bảng điện di sẽ dự

đoán được sự biểu hiện của gen chuyển.
2.2.1.1. Kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA)
- Nguyên lý của kỹ thuật ELISA
23


Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là một phương pháp sinh hoá
sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc
kháng nguyên trong một mẫu; ELISA được sử dụng như một công cụ chẩn đoán y học và
bệnh lý học thực vật, cũng như kiểm soát chất lượng trong các ngành công nghiệp khác
nhau.
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể và
gồm các bước cơ bản sau:
• Kháng nguyên – antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt.
• Kháng thể – antibody (KT) biết trước được “rửa” qua bề mặt đó. Kháng thể này
được gắn kết với ezyme.
• Thêm vào một cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu
có thể xác định được.

24


a. Phương pháp ELISA trực tiếp
Sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất enzyme sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên trên
bề mặt đĩa phản ứng.
Các bước tiến hành kĩ thuật ELISA trực tiếp

Ưu điểm:

Nhược điểm:


• Nhanh, vì chỉ sử dụng một kháng thể

• Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ

có gắn cơ chất à hạn chế tối đa các

cấp có thể bị ảnh hưởng xấu bởi

thao tác khi thực hiện phản ứng.

enzyme hoặc cơ chất gắn,

• Loại bỏ được phản ứng chéo của

• Khó khăn và tốn kém trong việc lựa

kháng thể thứ cấp.

chọn kháng thể cho phản ứng.

25