BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN- ĐHQG HÀ NỘI
KHOA HÓA HỌC

NGHIÊN
CỨU
ĐỊNH
LƯỢNG
CEFUROXIME ACETYL
TRONG THUỐC KHÁNG SINH DẠNG
VIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY
CHUYÊN NGÀNH HÓA PHÂN TÍCH

Giảng viên hướng dẫn:
Sinh viên : Nguyễn Quốc Cường
Lớp : K53a hóa học

HÀ NỘI – 2012

1


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn đến TS
Từ Bình Minh, ThS Lê Thị Hường Hoa người đã giáo đề tài và tận
tình hướng dẫn em trong quá trình nghiên cứu để em có thể hoàn
thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn ThS Hoàng Thanh Tâm cùng các
anh chị trong khoa Mĩ Phẩm đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong

quá trình em thực tập tại khoa Mĩ Phẩm -Viện kiểm nghiệm thuốc TW
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Bộ môn Hóa
Phân Tích cùng các thầy, cô giáo Trường Đại Học Khoa Học Tự
Nhiên đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cơ sở trong
những năm qua, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm trong Bộ môn
Hóa Phân Tích đã tận tình giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu.
Cuối cùng, em muốn nói lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè,
những người đã tận tình giúp đỡ và động viên khích lệ để em có thể
hoàn thành bản khóa luận này.
Hà Nội, Ngày 20, Tháng 5, Năm 2012
Sinh viên:

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1.Kháng sinh ß-lactame
1.1.1.Penicillin
1.1.2.Kháng sinh cephalosporin
1.1.2.1 Các thế hệ cephalosporin và chế phẩm đại diện
1.2. Cefuroxime
1.2.1. Cefuroxime natri
1.2.2. Cefuroxim acetyl
1.3. Tình hình sử dụng kháng sinh Beta-lactame và cefuroxime hiện
nay ở Việt Nam
1.4. Các phương pháp đã áp dụng để định lượng Cefuroxime
1.4.1. Phương pháp quang phổ tử ngoại
1.4.2. Phương pháp LCMS

1.4.3. Phương pháp HPLC định lượng viên nén Cefuroxime
1.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
1.5.1. Khái niệm về sắc ký
1.5.2. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.5.3. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
1.5.4 Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.5.4.1. Hệ thống cấp pha động
1.5.4.2. Hệ thống bơm
1.5.4.3. Hệ tiêm mẫu
1.5.4.4. Cột sắc ký
1.5.4.5. Detector
1.5.4.6. Hệ thu nhận và xử lý số liệu
1.5.5. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.5.6. Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.5.7. Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.5.7.1. Định tính
3


1.5.7.2. Định lượng
1.5.7.3. Thử tạp chất
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
(NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, DUNG MÔI VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU)
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Dung môi và hóa chất
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2. Đối tượng nghiên cứu, nội dung, phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.2.4. Một số công thức sử dụng trong thống kê
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát lựa chọn qui trình xử lý mẫu
3.1.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu
3.1.2. Quy trình xử lý mẫu
3.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
3.3. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký
3.4. Khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
3.5. Khảo sát độ lặp lại của quá trình phân tích
3.6. Khảo sát độ đúng của phương pháp
3.7. Xác định giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện của
Cefuroxime
3.8 Ứng dụng định lượng Cefuroxime acetyl trong mẫu thực tế
Bàn luận
KẾT LUẬN
KIẾN NGH

4


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HPLC : Hight performace liquid chromatography ( sắc ký lỏng hiệu
năng cao).
LC-MS-MS : Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ.
UV : Tử ngoại.
DUV-VIS : Detector tử ngoại khả kiến.
DĐVN : Dược điển Việt Nam.
KS : Kháng sinh.

5



ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, nền kinh tế nước ta đang phát triển đời sống nhân
dân ngày càng được cải thiện nhưng nguy cơ về bệnh tật cũng ngày
càng tăng. Từ lâu, người ta đã tìm ra các kháng sinh có tác dụng diệt
khuẩn.. Kháng sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay
kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác
dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng
của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi
khuẩn. Cefuroxime acetyl là một kháng sinh thế hệ 2 của nhóm
cephalosporin nằm trong danh mục các kháng sinh có chứa vòng
Beta_lactam. Cefuroxime acetyl có tác dụng trị bệnh nhiễm trùng do
vi khuẩn gây ra về các đường hô hấp, tai-mũi-họng và các bệnh về
đường tiêu hóa, đường sinh dục. Cefuroxime là loại thuốc có hoạt
tính kháng khuẩn hữu hiệu và có khả năng phân bố rộng khắp cơ
thể, kể cả dịch màng phổi, hoạt dịch và thủy dịch.
Cefuroxime thường có 2 dạng muối: Cefuroxime natri dễ tan
trong nước, thường được dùng ở dạng bột pha tiêm, cefuroxime
acetyl ít tan trong nước thường được dùng dưới dạng viên nén.
Để góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng thuốc nói chung
và nghiên cứu phương pháp định lượng Cefuroxime nói riêng, chúng
tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu định lượng cefuroxime acetyl trong thuốc viên nén

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”
Mục tiêu của đề tài:
1. Khảo sát chọn ra quy trình xử lý mẫu, điều kiện sắc ký phù
hợp để có thể phân tích được cefuroxime acetyl trong chế phẩm
bằng phương pháp HPLC.

2. Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng
Cefuroxime acetyl trong chế phẩm viên nén Cezirnate 500mg trên thị
trường.
6


Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1.Kháng sinh ß-lactame. [5, 8].
Câú trúc :
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng ß-lactam. Hai nhóm
lớn của kháng sinh này là Penicillin và Cephalosporin.

1.1.1. Penicilin. [5, 8, 9].
Công thức chung :

Các penicillin khác nhau bởi gốc R, những cacbon bất đối có
cấu hình theo vị trí 2S, 5S, 6R.
enicillin là các acyl hoặc amid của A6AP ( acid 6- amino
nicillanic).
Cơ chế tác dụng: Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của
màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển
của vi khuẩn.

1.1.2. Kháng sinh Cephalosporin. [5,8,9].
7


Cấu tạo :

Năm 1948, Abraham và cộng sự phân lập từ môi trường nuôi

cấy nấm cephalosporium aeremonium được cephalosporin C là dẫn
chất acyl của acid 7-aminocephalosporanic(A7AC).
Các kháng sinh cephalosporin được dùng là kháng sinh bán
tổng hợp, chúng là dẫn chất acyl hóa của A7AC mang cấu trúc ∆ 3cephem; ∆3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng B-lactam để hợp chất
có tác dụng sinh học.
Cơ chế tác dụng: Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của
màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển
của vi khuẩn.

1.1.2.1 Các thế hệ cephalosporin và chế phẩm đại diện
[5,8,9,11].
Cephalosporin thế hệ I: có các chế phẩm đại diện là
cephalexin, cephradin, cefradoxil.
Cephalosporin thế hệ II: có các chế phẩm đại diện là cefuroxim
natri; cefuroxim acetyl.
Cephalosporin thế hệ III: có các chế phẩm đại diện là
cefotaximnatri; cefixim; ceftriaxonnatri.
Cephalosporin thế hệ IV: có các chế phẩm đại diện là cefepim.

1.2. Cefuroxime
Là kháng sinh bán tổ hợp phổ rộng, thuộc nhóm caphalosporin
thế hệ 2. Cefuroxime có hoạt tính kháng khuẩn do ức chế tổng hợp
vách tế bào vi khuẩn bằng cách gắn vào các protein đích thiết yếu..

1.2.1. Cefuroxime natri [5,8,9,11].
8


Công thức cấu tạo: C16H15N4NaO8S


Tên khoa học:
Là muối natri của acid (6R,7R)-3[(carbamoyloxy)methyl]-7-[[(Z)(furan-2-yl)(methoxyimino)acetyl]amino]-8-oxo-5-thia-1zabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylic, phải chứa từ 96% đến 102%
C16H15N4NaO8S.
Tính chất:
+ Bột trắng hoặc trắng ngà, dễ tan trong nước,
ethanol.

ít tan trong

+ pH Từ 5,5 đến 8,
+ Độ tan: không quá 3.5% trong nước và không quá 0.5% trong
acid-2-ethyl hexanoic.
+ Cefuroxime natri hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng: 278nm
Công dụng: Có phổ kháng khuẩn điển hình của cephalosporin
thế hệ II. Và trong thế hệ này, duy nhất là chất đạt nồng độ tác dụng
ở dịch não tủy.
Chỉ định: cho các trường hợp :
+ viêm màng não, bệnh lậu.
+ viêm đường hô hấp dưới, viêm phổi, viêm phế quản.
+ viêm đường tiết niệu, có hạn chế số trường hợp được dùng so với
các chất thế hệ II.
+ nhiễm trùng máu, viêm xương ( bởi các vi khuẩn nhạy cảm).
+ phòng nhiễm trùng trong phẫu thuật.
Dạng thuốc: Lọ bột pha tiêm.

9


1.2.2. Cefuroxim acetyl [5,8,9,11].
Công thức cấu tạo: C20H22N4O10S


Tên khoa học:
Là hỗn hợp 2 đồng phân không đối quang (diastereo-isomer A
và diastereo-isomer B) của (1RS)-1-(acetyloxy)ethyl(6R,7R)-3((cacbamoyloxy)methyl)-7((Z)-2-(furan-2-(furan-2-yl)-2-(methoxyimino)acetyl)amino)-8-oxo-5-thia-1-a-azabicyclo-(4.2.1)oct-2-en2-carboxylat.
Tính chất:
+ Bột trắng hoặc trắng ngà, ít tan trong nước, tan trong aceton ethyl
acetate và methanol, ít tan trong ethanol.
+ Độ tan: trong nước ở 25oC không quá 1.5%.
+ Cefuroxime acetyl hấp thụ ánh sang mạnh ở bước sóng 278nm.
+ Là tiền chất của cefuroxime, có ít hoạt tính kháng khuẩn khi chưa
bị thủy phân thành cefuroxim trong cơ thể.
Chỉ định: Cho các nhiễm khuẩn nhẹ hơn, nhất là các trường
hợp viêm tai giữa, viêm phổi, viêm đường tiết liệu.
Dạng thuốc: thuốc viên.

1.3. Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh Beta-lactame
và Cefuroxime ở Việt Nam.
Bệnh nhiễm khuẩn chiếm 60% trong số các bệnh có tỷ lệ mắc
cao nhất tại Việt Nam, do vậy kháng sinh vẫn là loại thuốc được dung
phần lớn. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh ở bước ta vẫn còn
chưa hợp lý. Trước tiên là việc chuẩn đoán bệnh chưa đúng do bác
sĩ chưa chú ý, chưa xác định chính xác vi khuẩn gây bệnh; chưa chú
ý hiệu chỉnh liều kháng sinh nhóm aminoglycozid, beta lactam…đối
với nhóm bệnh nhân đặc biệt (người cao tuổi, trẻ em, phụ nữ mang
10


thai, bà mẹ cho con bú…). Qua khảo sát tình hình sử dụng kháng
sinh ở bệnh nhi viêm phổi trước và trong quá trình điều trị tại khoa
Nhi bệnh viện Bạch Mai trong năm 2006 với đối tượng nghiên cứu là

303 trẻ từ 2 tháng tới 5 tuổi. Kết quả cho thấy 63% (191/303) bệnh
nhi đã dùng KS trước khi vào viện, trong đó 29,3% không có đơn
thầy thuốc. Cephalosporin là thuốc được sử dụng phổ biến nhất
(55,1%). Tất cả 303 trẻ viêm phổi vào viện đều được điều trị KS từ 2
tới 32 ngày, trung bình là 8,7 ± 4,2 ngày dù chỉ có 54 trẻ (17,8%) có
nhiều khả năng nhiễm vi khuẩn, trong đó phần lớn (68,7%) được
điều trị bằng 1 loại KS; 30,3% được điều trị bằng từ 2 loại KS . KS
điều trị ban đầu phổ biến nhất là Cephalosporin thế hệ 1
(48,5%), KS thay thế chủ yếu là Cephalosporin thế hệ 3 (31,0%).
Không có sự khác biệt về thời gian cũng như số nhóm thuốc được
chỉ định điều trị cho hai nhóm ít và nhiều khả năng nhiễm vi khuẩn.
Có 15,2 % trẻ được phối hợp KS ngay khi nhập viện, giữa
Cephalosporin với aminosid. Việc sử dụng KS trong điều trị viêm hổi
trẻ em rất khác nhau tuỳ thuộc từng trường hợp bệnh, theo kinh
nghiệm của từng thầy thuốc vì khó xác định nguyên nhân gây bệnh
và cần được chuẩn hoá qua các nghiên cứu tiến cứu quy mô lớn.
Tại huyện Yên Minh, tỉnh Hà Giang đã xảy ra vụ hàng loạt
người từ 6 - 51 tuổi bị thủng ruột do uống thuốc mua từ chợ. Kiểm
nghiệm của cơ quan chức năng cho thấy loại thuốc mà số người này
sử dụng là không rõ nguồn gốc.
Bộ Y tế cho biết từ năm 2001 đến nay, tỉ lệ thuốc giả phát hiện
tại Việt Nam liên tục tăng (từ 0,03% lên 0,17%). Bị làm giả nhiều nhất
là nhóm kháng sinh thông thường vì có sức tiêu thụ lớn trên thị
trường.

1.4. Các phương pháp xác định kháng sinh Beta-lactame
và Cefuroxime acetyl.
1.4.1. Phương pháp quang phổ tử ngoại. [1, 2, 11, 12]
Nguyên lý dựa trên khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ rọi
vào dung dịch của chất nghiên cứu trong một dung môi nhất định.

+ Theo DĐVN 3, với kháng sinh Cefuroxime acetyl thì việc định tính
dựa trên sự phù hợp của phổ hồng ngoại của chế phẩm viên nén với
phổ hồng ngoại của Cefuroxime acetyl chuẩn.
+ Phương pháp đo quang được sử dụng để đánh giá độ hòa tan của
cefuroxime acetyl bằng cách lấy một phần dung dịch môi trường đã
11


hòa tan mẫu thử, lọc (bỏ 20ml dịch lọc đầu). Pha loãng dịch lọc thu
được tới nồng độ thích hợp với môi trường hòa tan (nếu cần). Đo độ
hấp thụ của dung dịch thu được bước sóng hấp thụ cực đại 278nm,
cốc đo dày 1cm, mẫu trắng là môi trường có nồng độ tương đương
pha trong môi trường hòa tan. Kết quả thu được lượng Cefuroxime
acetyl được hòa tan trong 45 phút là 98% (>70%) so với lượng
cefuroxime acetyl ghi trên nhãn.
1.4.2. Phương pháp LC-MS-MS.[13]
Mẫu phân tích được ly trích bằng một dung môi hữu cơ. Sau
đó, dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động
tiêm vào hệ thống HPLC với đầu dò MS/MS, cấu tử ra khỏi cột được
đưa vào đầu dò MS (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z)
của ion”) dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung
hòa thành các ion phân tử mang điện tích (+) hoặc phá vỡ thành các
mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao. Ion phân
tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta tính
được số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích).
Tiến sĩ Từ Bình Minh (ĐHKHTN-ĐHQG Hà Nội): ứng dụng
phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ hai
lần trong phân tích kháng sinh trong mẫu nước biển và mẫu
nước thải. Với kháng sinh Beta-lactame kết quả thu được như
sau:

Bảng 1: Kết quả phân tích Beta-lactam trong mẫu nước ở Hồng Kông
Beta-lactam

Giới hạn phát
hiện (ng/l)
Nước thải

Độ thu hồi
(%)
Nước biển

Nước thải

Nước biển

Cefalexin

20

0,7

98

87

Amoxicillin

13

0,35


66

75

Cefotaxime

1,2

0,4

96

94

Điều kiện sắc ký: cột C18( Water Corp., 2,1mm i.d, × 50mm
length, 5µm), pha động: nước cất được acid hóa bởi acid
fomic(10mM) và methanol được acid hóa bởi acid fomic(10mM), tốc
độ dòng: 30µl/phút.
1.4.3.Phương pháp HPLC định lượng viên nén Cefuroxime.
[8, 9].
12


Trong tài liệu tham khảo là dược điển Việt Nam sử dụng cột
thép không gỉ (25cm*4.6nm) nhồi pha tĩnh trimethylsilyl silicagel dung
cho sắc ký (5µm) ( cột Hypersil SAS). Tuy nhiên khi định lượng
cefuroxime acetyl, dược điển Việt Nam lại sử dụng cột octadecylsilyl
silicagel 5µm( cột RP18e) là cột khá thông dụng dang có tại Viện
kiểm nghiệm thuốc TW.

Nhận xét: Để định lượng cefuroxime trong thuốc (dạng viên nén) gặp
nhiều khó khăn trong việc tách chiết phức tạp, loại bỏ ảnh hương của
các tá dược (đặc biệt là các chất màu). Do đó phương pháp HPLC
được lựa chọn là giải pháp tốt bởi những ưu điểm của nó như không
cần chiết tách, hạn chế sai số, nhanh. Xuất phát từ thực tế trên,
chúng tôi lựa chọn phương pháp HPLC với cột RP18 để nghiên cứu
xây dựng quy trình định lượng cefuroxime acetyl trong viên nén.
*Hai tác giả Yuko Ito và Hisao Oka đã:
_Phân tích penicillin trong mẫu huyết thanh bằng phương pháp
HPLC-UV : pha tĩnh là cột Spherisorb ODS (250*4,6 mm i.d cỡ hạt
5µm ), pha động: dung dịch CH 3COONH4 (1mM)( đệm pH 6,4):
Acetonitrile, detector 720LC UV-VIS, bước sóng: 208nm. Kết quả cho
thấy penicillin chiếm 79,4 tới 95,7 % trong các mẫu huyết thanh. Giới
hạn phát hiện là 0,05µg/ml với benzyl penicillin, 0,1µg/ml, cho
phenoxy methyl penicillin và cloxacillin, 0,15 µg/ml với benzyl
penicillin, 0,1µg/ml, cho phenoxy methyl penicillin và cloxacillin, 0,15
µg/ml cho ampicillin và dicloxacillin và 0,2 µg/ml cho nafcillin. Nồng
độ nghiên cứu trong khoảng ( 0,5- 50 µg/ml). Sự tách biệt của 6 loại
thuốc tương đối tốt.
Phân tích thuốc kháng sinh cephem trong mẫu huyết tương
bằng phương pháp HPLC với hệ thống cột chuyển đổi: pha tĩnh là
cột Corasil RP C18 (40*20mm i.d, kích thước hạt 37-50µm), pha
động: Acetonitrile/ đệm acetate 0,02M (pH 4,3)( 15:85), tốc độ dòng
1ml/phút, detector UV :254nm. Kết quả cho thấy 5 loại thuốc cephem
chiếm từ 72,3 đến 85,6% trong mẫu huyết tương.

1.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
1.5.1. Khái niệm về sắc ký [2].
Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu
tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả

năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển
qua pha tĩnh gọi là pha động, do các cấu tử chất phân tích có ái lực
13


khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và
tách ra khỏi nhau.
1.5.2. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao. [2]
HPLC ( High performance liquid chromatoghraphy) là một kỹ
thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các
hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân
bố của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của
các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra
khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động
đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để
rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.
1.5.3. Nguyên tắc của quá trình sắc ký. [3, 4, 10]
Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định. Pha
tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc
ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký pha
thuận. Pha tĩnh là các chất đã được liên kết với một nhóm chức khác
ta có sắc ký pha liên kết ( pha thuận, pha đảo, trao đổi ion). Nếu pha
tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử. Cùng với pha
tĩnh, để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một
pha động.
Như vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích
A, B, C… vào cột tách, kết quả là các chất A, B, C…sẽ được tách ra
khỏi nhau. Sau khi đi qua cột nhờ pha động. Quyết định hiệu quả của
sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác.
Chất phân tích

(A+B+C)
F1

F2
Pha động

Pha tĩnh
F3

Hình 1 : Tương tác giữa chất phân tích, pha tĩnh, pha động

14


Tổng của ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa
giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu gữ là nhỏ nhất, và ngược lại.
Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được tạo thành bởi ba lực thành phần :
F1, F2, F3. Trong đó F1, F2 là quyết định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng
không lớn. Ở đây F1 là lực lưu giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực
kéo nó đi ra khỏi cột. Như vậy các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ
khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với
tốc độ khác nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột.
1.5.4 Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng đều giống nhau, bao gồm.

Hình 2: Sơ đồ hệ thống HPLC.
1.5.4.1. Hệ thống cấp pha động. [2, 4]
Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai hay nhiều dung môi
hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp.
Trước khi chạy mẫu, cần lọc (màng lọc 0,45µm) và đuổi khí hòa tan

trong pha động. Khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực
cột, làm nhiễu đường nền.
Có hai cách dùng để rửa giải pha động:
Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đổi
trong quá trình sắc ký, thường được trộn sẵn và đựng trong một bình
thủy tinh có nắp.
Gradient: Pha động là hỗn hợp nhiều dung môi, thường 2-4
loại được đựng trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay
đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định.

15


1.5.4.2. Hệ thống bơm. [2, 4]
Hệ thống bơm có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động
từ bình dung môi qua hệ thống sắc ký. Hệ thống bơm hiện nay được
điều khiển bằng máy tính có thể lập chương trình để thay đổi tỉ lệ các
thành phần pha động theo yêu cầu (sắc ký gradient). Bơm HPLC cần
đáp ứng một số yêu cầu sau:
Tạo được áp suất cao 3000–6000psi (250–500atm).
Lưu lượng bơm khoảng 0,1–10ml/phút.
Không bị ăn mòn với các thành phần pha động.
Có tốc độ bơm không đổi
Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn.
Khoảng bơm có lưu lượng dao động từ 2-3µL/phút, áp suất có thể
lên tới 10000psi
1.5.4.3. Hệ tiêm mẫu [2,4]
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hoặc tiêm mẫu
bằng hệ thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ
vòng chứa mẫu

(tiêm tay) hay trong hệ tiêm mẫu tự động. Sai số
tiêm mẫu dùng van khoảng 0,5 %
1.5.4.4. Cột sắc ký [2, 4,10].
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép
không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30cm, đường kính
trong 4-10mm. Thường có cột nhồi và cột bảo vệ.
- Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10µm, gần đây có loại cột nhỏ
đường kính trong 1-2mm, dài 3-7,5cm loại này nhồi được cỡ hạt
khoảng 3 đến 5µm có ưu điểm là chạy sắc kí tốn ít dung môi và ít
thời gian hơn. Có thể điều nhiệt để tăng nhiệt độ cột nhằm đạt hiệu
quả phân tách tốt hơn nhưng hiếm khi tiến hành ở nhiệt độ trên 60°C
vì ở nhiệt độ này có thể làm suy giảm hiệu lực cột và làm bay hơi pha
động. Chất nhồi cột thường là Silicagel có bao một lớp mỏng chất
hữu cơ (hoặc liên kết hóa học với một số chất hữu cơ). Ngoài ra, còn
có các chất nhồi khác như nhôm oxyd, polyme xốp, nhựa trao đổi
ion.
- Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt
trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ của cột. Cột

16


bảo vệ ngắn hơn cột sắc kí, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích
thước hạt lớn hơn.
1.5.4.5. Detector [2,4].
Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và
cho tín hiệu ghi trên sắc kí đồ. Phát hiện các chất phân tích có thể
dựa vào:
Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp thụ bức
xạ UV hoặc huỳnh quang.

Tính chất chung của chất phân tích trong pha động, như
detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện.
Detector trong sắc kí lỏng cần đáp ứng nhưng yêu cầu sau:
Đáp ứng nhanh và lặp lại.
Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc
nồng độ thấp.
Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng.
Khoảng hoạt động tuyến tính rộng.
Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
1.5.4.6. Hệ thu nhận và xử lý số liệu [2,3,4,10]
Gồm có máy ghi, máy tích phân, máy tính.
Máy ghi đơn giản thì có thể vẽ sắc ký đồ, ghi thời gian lưu, diện
tích pic hoặc chiều cao pic, % diện tích pic…Máy vi tính ngoài khả
năng ghi còn có khả năng xử lý số liệu.
1.5.5. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao.[2, 4,6,10].
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợp
chất phân tích. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp và kích thước
hạt nhỏ, đường kính hạt cỡ từ 3-10µm, diện tích bề mặt riêng từ 50500m²/g
Phân loại pha tĩnh
+ Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột
tách, người ta chia thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, rây phân tử.Tương ứng với các loại chất nhồi như thế người ta
có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC.

17


+ Căn cứ theo trạng thái rắn hoặc lỏng của pha tĩnh. Nếu pha
tĩnh là chất rắn người ta có sắc ký lỏng- rắn (LSC). Nếu pha tĩnh là
chất lỏng thì có sắc ký lỏng-lỏng (LLC).

+ Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người
ta chia nó thành hai loại: xốp toàn phần và xốp chỉ ở lớp vỏ ngoài.
- Yều cầu của pha tĩnh trong HPLC:
+ Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký.
+ Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.
+ Tính chất bề mặt ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó.
+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại
tốt.
+ Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất
1.5.6. Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân
tích) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký.
Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay
hỗn hợp của 2, 3 dung môi theo tỉ lệ nhất định. Pha động là yếu tố
quan trọng quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời
gian lưu tR và hiệu quả tách.
Pha động có thể ảnh hưởng tới:
+ Độ chọn lọc của hệ pha động.
+ Thời gian lưu giữ của chất tan.
+ Hiệu lực tách của cột.
+ Độ phân giải của chất tan.
+ Độ rộng của pic sắc ký.
1.5.7. Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao [4,10].
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính sau:
1.5.7.1. Định tính
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích trong cùng
điều kiện sắc kí (pha động, pha tĩnh, nhiệt độ), những thông tin
định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong
mẫu. Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ
18



thường gặp nhiều khó khăn. Do vậy HPLC thường dùng để tách
các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ
1.5.7.2. Định lượng
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên
nguyên tắc: Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic
của nó.
Có 4 phương pháp định lượng thường sử dụng:
- Phương pháp chuẩn ngoại:
Phương pháp định lượng cơ bản: mẫu thử và mẫu chuẩn được
tiến hành sắc ký trong cùng diều kiện.
So sánh diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử với mẫu
chuẩn tính được nồng độ của mẫu thử. Có thể sử dụng phương
pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm.
- Phương pháp chuẩn nội:
Thêm những lượng giống nhau của chuất chuẩn thứ hai vào cả
chuẩn ngoại lẫn mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai
này được gọi là chất chuẩn nội.
Yêu cầu đối với chất chuẩn nội:
+ Trong điều kiện sắc ký, chuẩn nội phải được tách hoàn toàn
và có thời gian lưu gần với chất cần phân tích.
+ Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử.
+ Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử.
+ Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
+ Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
- Phương pháp thêm chuẩn:
Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩn nội và chuẩn ngoại.
Ưu điểm của kỹ thuật thêm chuẩn là có độ chính xác cao
vì nó loại trừ được sai số (do các yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt là do

quá trình xử lý mẫu: chiết xuất, tinh chế các chất từ dạng bào chế...)
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích:
Hàm lượng phần trăm (%) của một chất trong hỗn hợp nhiều
thành phần được tính bằng tỷ lệ % diện tích pic của nó so với tổng
diện tích của tất cả các pic trên sắc ký đồ.
19


Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều phải
được rửa giải và phát hiện. Tất cả các thành phần đều có đáp ứng
detector như nhau
1.5.7.3. Thử tạp chất
Về cơ sở cũng giống như định lượng. Ngoài ra, đối với phép
thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp
chuẩn ta có thể tính tỷ lệ tạp chất dựa vào phần trăm (%) diện tích
pic của tạp so với hoạt chất.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU (NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ,
DUNG MÔI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU)
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Dung môi và hóa chất
Methanol tinh khiết dùng cho HPLC (Merck, Đức).
Amoni dihydrophosphat 0,2M lọc qua màng lọc milipore
0,45µm.
Chuẩn cefuroxime acetyl hàm lượng 93,0%, độ ẩm 0,25%
(Viện kiểm nghiệm thuốc TW).
Dung dịch acid phosphoric 1%, lọc qua màng lọc milipore
0,45µm.

Nước cất được lọc qua màng lọc milipore 0,45µm (Viện kiểm
nghiệm thuốc TW).

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
+ Máy sắc ký lỏng Shimadzu.
- Bơm: Model LC - 10Avp.
- Detector mảng diod: Model SPD - M10Avp.
- Module điều khiển: Model SCL - 10Avp.
- Bộ trộn dung môi: FCV - 10Alvp.
- Bộ loại khí (Degasser): DGU - 14A.
20


+ Cột Apollo C18 (250 x 4,6mm, 5µm).
+ Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm.
+ Máy lắc siêu âm Elmasonic.
+ Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác ± 0,1 mg.
+ Các dụng cụ thủy tinh chính xác: bình định mức, pipet chính
xác, ống đong, giấy lọc...
2.2. Đối tượng nghiên cứu, nội dung, phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là thuốc viên cezirnate 500mg của công
ty cổ phần dược phẩm trung ương II. Có tính chất: dạng viên nén
màu trắng bao phim.
- Công thức bào chế cho 1viên thuốc cezirnate 500mg
Cefuroxime 500mg (cefuroxime axetyl) ;
Tá dược: lactose, DST, polyvidon, Aerosil, Disolcel, Talc,
magnesi stearat, Pharmacoat 615, titan dioxyd, PEG6000.
- Lô sản xuất: 501111.


2.2.2. Nội dung nghiên cứu
+ Xây dựng phương pháp định lượng Cefuroxime acetyl trong thuốc
bắng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với hai quy trình:
* Quy trình xử lý mẫu, áp dụng phương pháp hòa tan mẫu
trong dung môi thích hợp để chuyển chất phân tích sang dạng dịch
lỏng đồng nhất và phù hợp cho bước phân tích tiếp theo.
* Quy trình phân tích cefuroxime acetyl được thực hiện với việc
xây dựng quy trình phân tích với điều kiện thích hợp:
- Cột sắc ký, nhiệt độ cột.
- Các điều kiện pha động.
- Thể tích tiêm.
- Quy trình xử lý mẫu.
- Bước sóng lấy sắc đồ
* Để đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng được, chúng
tôi tiến hành:
21


+ Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.
+ Khảo sát độ đúng.
+ Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic.
+ Khảo sát độ lặp lại của quá trình phân tích.Giới hạn phát
hiện, giới hạn định lượng.
+ Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.
+ Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng
Cefuroxime acetyl trong chế phẩm đã chọn.

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành trên thiết bị là máy HPLC của
Shimadzu. Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện phân tích thích

hợp, xử lý thống kê các kết quả thu được và nhận xét rút ra kết luận.

2.2.4. Một số công thức sử dụng trong thống kê
Giá trị trung bình :

=

xi
n

Độ lệch chuẩn:



 xi  x 


S  i 1 
n 1

Phương sai:

S=

2

( xi - )

Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = x 100
Trong đó: - xi là kết quả của lần xác định thứ i.

n là số lần xác định.

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ
BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát lựa chọn qui trình xử lý mẫu
3.1.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu

22


Cần lựa chọn dung môi pha mẫu sao cho đảm bảo hòa tan tốt
hoạt chất và hòa tan càng ít các tá dược khác có trong mẫu thuốc bôi
da nghiên cứu càng tốt. Việc lựa chọn trên dựa vào tính chất tan tốt
trong methanol, amoni dihydrophosphat của cefuroxime acetyl.
Thử nghiệm với một số dung môi pha mẫu nhưnước,
methanol,...chúng tôi thấy dung môi pha mẫu là hỗn hợp gồm
Methanol và dung dịch NH 4H2PO4 0,2M( đã điều chỉnh pH 2.4 bằng
acid photphoric 1%) với tỉ lệ (38:62) là hệ dung môi thích hợp hơn cả.
Hệ dung môi này có một số ưu điểm sau:
+ Hòa tan được cefuroxime và đưa ra khỏi thuốc viên với hàm
lượng cao và ít tạp chất nhất.
+ Dễ trộn lẫn với dung môi pha động của hệ sắc ký pha đảo.
+ Cách tiến hành nhanh và dễ thực hiện.
3.1.2. Quy trình xử lý mẫu.
Cân chính xác khoảng 0.3552g bột viên ( tương ứng với 250mg
cefuroxime acetyl), cho vào bình 50ml, thêm metanol khoảng 2/3
bình, đem lắc siêu âm cho tan hết, sau đó vừa đủ bằng dung môi pha
mẫu, lọc qua giấy lọc, hút 1ml dịch lọc vào bình 20ml, vừa đủ bằng
dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
3.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký

Chúng tôi phải nghiên cứu điều kiện sắc ký sao cho pic của
Cefuroxim acetyl tách được riêng rẽ 2 đồng phân A và B, đồng thời
tách riêng với các pic còn lại trên sắc ký đồ và thời gian lưu phù hợp
cho quá trình phân tích.
Trên cơ sở tham khảo các tài liệu đã nghiên cứu về Cefuroxim
húng tôi chọn phương pháp HPLC pha đảo và sử dụng cột apolo
C18 (250x4,6mm, 5µm). Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi đã
tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký trên cột này: Thành phần và
tỷ lệ dung môi trong pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng
chạy sắc ký.
Sau khi tiến hành khảo sát với pha động là: MeOH : dung dịch
NH4H2P04 0.2M( pH 2.4) (38:62) như tài liệu tham khảo thì chúng tôi
nhận thấy pic gọn, tương đối cân xứng, t R =15 phút với đồng phân A
và tR=18 phút với đồng phân B.

23


- Với kết quả này chúng tôi quyết định chọn pha động theo tỉ lệ
sau MeOH : dung dịch NH4H2P04 0.2M( pH 2.4) (38:62) để chạy sắc
ký.
- Để chọn bước sóng làm việc của detector dựa vào tài liệu
tham khảo chúng tôi chọn bước sóng 278nm là bước sóng lấy sắc ký
đồ.
Tiếp tục tiến hành khảo sát lựa chọn tốc độ dòng theo các điều
kiện đã chọn ở trên với các giá trị là 0,8; 1,0; 1,2mL/phút nhằm lựa
chọn được tốc độ dòng thích hợp đảm bảo việc phân tách và định
lượng Cefuroxime acetyl đồng thời rút ngắn thời gian phân tích. Qua
kết quả thực nghiệm chúng tôi thấy với tốc độ dòng là 1,0ml/phút, pic
của Cefuroxime acetyl gọn, cân đối, thời gian lưu hợp lý, áp suất vừa

phải. Vậy chúng tôi quyết định lưạ chọn tốc độ dòng 1ml/phút để tiến
hành chạy sắc ký.
Như vậy qua khảo sát thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn các
điều kiện sắc ký để định lượng Cefuroxime acetyl trong thuốc viên
như sau:
Máy sắc ký lỏng năng hiệu nâng cao Shimadzu.
Cột apolo C18 (250x4,6mm, 5µm).
Nhiệt độ cột 25°C.
Pha động: (Metanol : dung dịch NH 4H2P04 0.2M( pH 2.4))
(38:62).
Tốc độ dòng 1ml/phút.
Thể tích tiêm: 20µl.
Detector: 278nm.
3.3. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Chúng tôi tiến hành tiêm lặp lại cùng một dung dịch chuẩn
Cefuroxime acetyl vào hệ thống sắc ký. Yêu cầu độ lệch chuẩn
tương đối RSD (%) của diện tích pic không lớn hơn 2% và RSD (%)
của thời gian lưu giữa các lần tiêm không lớn hơn 1%. Để đánh giá
tính thích hợp của hệ thống chúng tôi tiến hành như sau:
Cân chính xác khoảng 50,0mg chất chuẩn Cefuroxime acetyl
vào bình định mức 50,0ml thêm methanol khoảng 2/3 bình, lắc siêu
âm đến khi tan hoàn toàn. Sau đó vừa đủ bằng dung môi pha mẫu.
Pha loãng 5,0ml dung dịch này thành 20,0ml bằng dung môi pha mẫu,
24


lắc đều, được dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 0.025mg/ml. Lọc
qua màng lọc 0,45µm, được dịch lọc để tiêm sắc ký. Tiến hành tiêm
mẫu vào hệ thống sắc ký với điều kiện đã nêu ở mục 3.2. Kết quả
được trình bày ở bảng 2

Bảng2. Đánh giá độ thích hợp của hệ thống
STT

Thời gian lưu
(phút)

Diện tích pic
(mAU)

Đồng phânA Đồng phân B

Đồng phân A

Đồng phân B

1

15,187

18,563

4902812

5057982

2

15,195

18,552


4844074

5015275

3

15,163

18,531

4839680

4986196

4

15,120

18,477

4829117

4948854

5

15,152

18,509


4794831

4923474

6

15,184

18,541

4775819

4927833

RSD(%)

0,17

Số đĩa lý
thuyết trung
bình (N)

5942

1,04

Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy RSD (%) của các
thông số đặc trưng của quá trình sắc ký là thời gian lưu nhỏ hơn 2%
(0,17%) và diện tích pic nhỏ hơn 2% (0,27%). Số đĩa lý thuyết cao

thể hiện cột được lựa chọn có khả năng tách tốt. Những điều này
chứng tỏ hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là phù hợp và đảm
bảo sự ổn định của phép định tính và định lượng Cefuroxime acetyl.

25