VĂN PHÒNG HỢP TÁC
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG VÀ HỘI ĐỘNG VẬT FRANKFURT

---o0o---

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH
PHÒNG TRỪ NẤM FUSARIUM SP. GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CÀ PHÊ TẠI HUYỆN KON RẪY,
TỈNH KON TUM

ĐÀ NẴNG, 12/2017


VĂN PHÒNG HỢP TÁC
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG VÀ HỘI ĐỘNG VẬT FRANKFURT

---o0o---

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH
PHÒNG TRỪ NẤM FUSARIUM SP. GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CÀ PHÊ TẠI HUYỆN KON RẪY,
TỈNH KON TUM
SV thực hiện:1. Võ Lê Nguyễn
2. Phạm Thị Tú Nguyên
Lớp, khoa:

13CNSH- Khoa sinh – môi trườngNăm thứ: 4

Ngành học: Công nghệ sinh học
Người hướng dẫn: TS. Đoàn Thị Vân

ĐÀ NẴNG, 12/2017


MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


CF
CPVS
GTSX
PBS
PDA
PTN
VK
VSV

Cà phê
Chế phẩm vi sinh
Giá trị sản xuất
Phosphate Buffered Saline
Potato Dextro Agar
Phòng thí nghiệm
Vi khuẩn

Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG BIỂU

TT
Bảng 1.1
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 3.9
Bảng 3.10
Bảng 3.11

Tên Bảng
Diện tích và sản lượng trồng cà phê qua các năm
của huyện Kon Rẫy
Sự phân bố vi khuẩn phân lập được trên các vườn cà phê
khác nhau tại huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum
Sự phân bố vi khuẩn phân lập được theo mùa
Sự phân bố nấm mốc phân lập được trên các vườn cà phê
khác nhau tại huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum
Sự phân bố nấm mốc phân lập được theo mùa
Kết quả hoạt tính kháng nấm bệnh của vi khuẩn
Kết quả kháng nấm Fusarium sp. của nấm mốc

Kết quả quan sát vi khuẩn đối kháng nấm bệnh
Mô tả và phân loại hình dạng các chủng vi khuẩn có khả
năng đối kháng nấm bệnh
Đặc điểm của 3 chủng nấm mốc N1.3, N1.2, N1.4
So sánh số lượng bào tử thu được trong 5 công thức lên
men tạo chế phẩm.
Kết quả tỉ lệ nảy mầm

Trang
6
28
28
29
30
30
31
34
35
37
40
42


DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐỒ THỊ
Ký hiệu
Hình
Hình 2.1
Hình 2.2
Hình 2.3
Hình 3.1

Hình 3.2
Hình 3.3

Tên hình
Sơ đồ thí nghiệm
Ví trí lấy mẫu trên bản đồ
Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất chế phẩm
Mẫu bệnh được lấy ở các vườn
Tản nấm Fusarium sp.
Bào tử nấm Fusarium sp. đã phân lập

Trang
17
23
26
26
27

Hình 3.4

Kết quả kháng nấm bệnh Fusarium của các chủng Bacillus
CF1.10, CF1.11, CF4.9.

32

Hình 3.5

Tản nấm Fusarium sp. đối chứng sau 5 ngày nuôi cấy

33


Hình 3.6

Hiệu quả ức chế nấm bệnh Fusarium sp. của nấm N1.1

33

Hinh 3.7
Hình 3.8
Hình 3.9
Hình 3.10
Hình 3.11
Hình 3.12
Hình 3.13

Hiệu quả ức chế nấm bệnh Fusarium sp. của các chủng
nấm N1.2, N1.3 và N3.8 sau 5 ngày nuôi cấy
Tản nấm N1.3, N1.2, N1.1 phát triển trên môi trường PDA
Kết quả quan sát 3 chủng nấm mốc N1.3, N1.2, N1.1
dưới kính hiển vi( 100x.)
Sự phát triển của chủng CF1.11 và N1.1 sau 5 ngày cấy
trên cùng một đĩa thạch
Chế phẩm VSV sau khi được sấy khô và đóng gói:
Hạt cà phê giống không nảy mầm
Cây cà phê nảy mầm

34
37
38
39

41
43
44


MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cà phê là cây công nghiệp lâu năm được trồng ở nước ta hơn 100 năm nay, và
là một trong mười mặt hàng xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam hiện nay.
Được xác định là một trong những cây công nghiệp xuất khẩu chủ lực, chỉ sau
cây lúa, loại cây này đã và đang đóng một vai trò quan trọng trong ngành nông
nghiệp Việt Nam [2]. Năm 2012 Việt Nam xuất khẩu 1,76 triệu tấn cà phê, đạt kim
ngạch 3,73 tỉ USD, tăng cả về số lượng và giá trị so với năm 2011 [29] . Ngành cà
phê đã tham gia có hiệu quả vào các chương trình kinh tế xã hội như định canh định
cư, xóa đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho hàng triệu lao động trong đó có
một phần là các đông bào dân tộc ít người ở miền núi, đặc biệt là các vùng đệm ở
các vườn quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên. Nhờ đó cuộc sống ổn định cho người
dân, các hoạt động khai thác rừng, săn bắt thú đã được giảm đáng kể.
Kon Tum là một trong năm tỉnh Tây Nguyên có tiềm năng đất đai và điều kiện
sinh thái khá thuận lợi để phát triển cây cà phê. Diện tích cà phê của tỉnh Kon Tum
năm 2012 là 12,158 ha, diện tích thu hoạch là 10,805 ha với sản lượng đạt mức hơn
27 nghìn tấn [2]. Cũng như nhiều địa bàn khác trong tỉnh, huyện Kon Rẫy cũng có
những điều kiện thuận lợi để phát triển cây cà phê. Người dân sống trên địa bàn
huyện Kon Rẫy phần lớn sống chủ yếu dựa vào nông nghiệp, mà cây cà phê chính
là một trong những cây trồng mang lại nguồn thu nhập cao cho người dân. Tuy
nhiên, điều kiện nước ta không những thích hợp với cây cà phê mà còn phù hợp với
rất nhiều loại vi sinh vật (VSV ) gây bệnh cho cây, các vườn cà phê đã xuất hiện
nhiều bệnh gây thiệt hại không nhỏ cho nông dân của tỉnh Kon Tum nói riêng và cả

nước nói chung. Trong đó, bệnh thối rễ do nấm Fusarium sp được cho là bệnh gây
hại chính cho cây cà phê.
Nấm Fusarium sp gây thối cổ rễ, đốm lá trên cây [3]. Chúng xâm nhiễm vào
rễ non hoặc rễ cây bị thương do tuyến trùng gây ra. Bệnh ảnh hưởng rất lớn đến
sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây cà phê. Để trị bệnh thối rễ cho cây cà
phê, người dân thường phun các loại thuốc bảo vệ thực vật, thuốc hóa học, đây là
7


biện pháp có hiệu quả nhanh nhưng lại gây độc hại, xảy ra hiện thượng kháng
thuốc, làm mất cân bằng sinh thái...Vậy nên cần tìm một biện pháp trị bệnh hiệu
quả, khắc phục được các nhược điểm do thuốc hóa học gây ra, đảm bảo sự phát
triển nông nghiệp bền vững.
Chính vì những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu
sản xuất chế phẩm vi sinh phòng, trừ nấm Fusarium sp. gây bệnh thối cổ rễ
trên cây cà phê tại huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum”
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Phân lập tuyển chọn được những chủng VSV có hoạt tính đối kháng nấm
Fusarium sp. gây bệnh thối cổ rễ trên cây cà phê tại huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum,
từ đó thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh (CPVS) phòng, trừ nấm Fusarium sp.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

Kết quả đề tài sẽ tuyển chọn được các chủng vi sinh có khả năng đối kháng
cao với nấm bệnh Fusarium sp. trên cây cà phê tại huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum,
ứng dụng chúng trong sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm
Fusarium sp.
4. TÓM TẮT PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
o Phương pháp thu thập mẫu.
o Phương pháp phân lập vi sinh vật.

o Phương pháp bảo quản giống.
o Phương pháp xác đinh, đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh của các vi sinh vật.
o Phương pháp nhuộm Gram.
o Phương pháp nhuộm bào tử.
o Phương pháp tạo chế phẩm.
o Phương pháp lây bệnh nhân tạo.
o Phương pháp định lượng vi sinh vật trong chế phẩm.
o Phương pháp xử lí số liệu.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

CÂY CÀ PHÊ

8


Cây cà phê có nguồn gốc từ các cao nguyên Kaffa (Ethiopia) và Boma (Su
Đăng), nơi có độ cao từ 1.370 - 1.830 m. Cây cà phê được trồng đầu tiên tại Yemen
vào thế kỷ XIV, sau đó được con người phát tán đến các địa phương khác [20].
Cà phê (Coffea) là một chi thực vật thuộc họ Thiến Thảo (Rubiaceac). Thân
cây cà phê có thể cao từ 5-10m khi chưa được tỉa bớt. Cây cà phê có cành thon dài,
lá cuống ngắn, xanh đậm, hình oval. Mặt trên lá có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh
nhạt hơn. Chiều dài của lá khoảng 8-15 cm, rộng 4–6 cm. Hoa cà phê màu trắng, có
năm cánh, thường nở thành chùm đôi hoặc chùm ba. Một cây cà phê trưởng thành
có từ 30.000 đến 40.000 bông hoa. Cà phê là loài cây tự thụ phấn, do đó gió và côn
trùng có ảnh hưởng lớn tới quá trình sinh sản của cây. Sau khi thụ phấn quả sẽ phát
triển trong 7 đến 9 tháng và có hình bầu dục. Trong thời gian chín, màu sắc của quả
thay đổi từ xanh sang vàng rồi cuối cùng là đỏ. Quả có màu đen khi đã chín nẫu.
Thông thường một quả cà phê chứa hai hạt. Chúng được bao bọc bởi lớp thịt

quả bên ngoài. Hai hạt cà phê nằm ép sát vào nhau. Mặt tiếp xúc giữa chúng là mặt
phẳng, mặt hướng ra bên ngoài có hình vòng cung. Mỗi hạt còn được bảo vệ bởi hai
lớp màng mỏng: một lớp màu trắng, bám chặt lấy vỏ hạt; một lớp màu vàng rời rạc
hơn bọc ở bên ngoài. Hạt có thể có hình tròn hoặc dài, lúc còn tươi có màu xám
vàng, xám xanh hoặc xanh. Thỉnh thoảng cũng gặp những quả chỉ có một hạt (do
chỉ có một nhân hoặc do hai hạt bị dính lại thành một) [35].
Hiện nay đã có trên 100 loại cà phê được phát hiện, thuộc 3 nhóm giống
chính sau: Cà phê chè (Coffea Arabica Liné) có hàm lượng cafein trong hạt từ 1,8 2,0%; Cà phê vối (Coffea Canephora var. Robusta có hàm lượng cafein trong hạt từ
2,5 - 3,0% và Cà phê mít (Coffea Liberica bull var. Excelsa) với hàm lượng cafein
trong hạt thấp từ 1,02 - 1,15% [35] [28].
Cà phê hiện nay được trồng tập trung ở Trung Mĩ, quần đảo Ăng ti, Đông
Nam Brazil, Tây và Trung Phi, Tây Nam Ấn Độ và một số nước Đông Nam Á trong
đó có Việt Nam. Trong nước, cây cà phê được trồng nhiều nhất ở Tây Nguyên,
ngoài ra còn được trồng ở các vùng Đông Nam Bộ, Bắc Trung Bộ, Trung du và
miền núi Bắc Bộ.

9


Cà phê là một loại cây có giá trị kinh tế cao, hạt cà phê là mặt hàng nông sản
xuất khẩu chủ lực của Việt Nam, chỉ đứng thứ 2 sau xuất khẩu gạo. Việc trồng và
xuất khẩu cà phê sẽ giúp người nông dân trồng cà phê làm giàu trên chính mảnh đất
của mình. Nhờ trồng cà phê, nhiều nông hộ trên địa bàn tỉnh Kon Tum cũng như
trên cả nước đã có nguồn thu nhập ổn định, đời sống được nâng cao. Ngoài giá trị
về kinh tế, trồng cà phê còn giúp thực hiện phủ xanh đất trống, đồi núi trọc, có tác
dụng rất lớn trong việc bảo vệ môi trường sinh thái.
1.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
1.2.1. Đặc điểm tự nhiên - Vị trí địa lý

Kon Rẫy là một huyện miền núi nằm ở phía đông nam tỉnh Kon Tum có tọa

độ địa lý nằm trong khoảng từ 14019’55’’ đến 14046’10’’ vĩ độ bắc, 108003’45’’ đến
108022’40’’ kinh độ đông [12].
Kon Rẫy có diện tích tự nhiên là 91.134,55 ha, phía Đông giáp huyện Kon
Plong và tỉnh Gia Lai, phía Tây giáp thành phố Kon Tum và huyện Đăk Hà, phía
Nam giáp tỉnh Gia Lai, phía Bắc giáp huyện Kon PLong và Đăk Hà [12].
Địa hình: Kon Rẫy có địa hình đa dạng bao gồm đồi núi, cao nguyên và thung
lũng xen kẽ với nhau rất phức tạp, độ cao trung bình 900 -1.200 m [12].
Khí hậu: Kon Rẫy nằm ở tiểu vùng khí hậu Tây Trường Sơn, thuộc vùng khí
hậu nhiệt đới. Nhiệt độ trung bình trong năm dao động 20-22 0C. Lượng mưa trung
bình 2.000-2.200 mm. Kon Rẫy có 2 mùa rõ rệt: mùa mưa và mùa khô, mùa
mưa thường bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 đến tháng 3 năm
sau [12].
1.2.2. Đặc điểm kinh tế - xã hội
Toàn huyện có 7 đơn vị hành chính (6 xã và 01 thị trấn). Dân số trên 25.000
người, mật độ dân cư 25 người/km 2 , được phân bổ tại 56 thôn với 62 làng, trong
đó đồng bào dân tộc thiểu số chiếm khoảng 66%, chủ yếu là Bah Nar, Xơ Đăng
[12].
Lao động: Toàn huyện có 11.866 lao động chiếm khoảng 52% dân số, trong
đó lao động nông nghiệp chiếm đa số với 89,48%, lao động phi nông nghiệp
chiếm 10,52% [12].
Kinh tế: Tốc độ tăng trưởng kinh tế bình quân giai đoạn 2006-2010 đạt
14,77%/năm. Tổng giá trị sản xuất (GTSX) năm 2010 của huyện đạt 364.554 triệu
đồng, bình quân mỗi năm GTSX tăng 26,644%.Ngành nông lâm nghiệp vẫn chiếm
10


tỷ trọng lớn 57,39%; ngành công nghiệp- xây dựng chiếm 29,83%. Ngành thương
mại - dịch vụ chiếm 12,78% [12].
1.2.3. Tiềm năng và lợi thế
Huyện Kon Rẫy nằm trên Quốc lộ 24, trung tâm huyện lỵ cách thành phố

Kon Tum 40 km, cách khu công nghiệp và cảng biển Dung Quất 185 km. Vị trí địa
lý này sẽ có nhiều điều kiện thuận lợi cuốn hút vào sự phát triển và chịu ảnh hưởng
lớn của những khu vực này trong quá trình giao lưu kinh tế, thu hút đầu tư [12].
Nhờ có nhiều cao nguyên, thung lũng, nhiều cánh đồng tương đối bằng phẳng
và rộng lớn, đất trồng đa dạng, nhiều đồng cỏ tự nhiên cùng với khí hậu nhiệt đới
gió mùa cao nguyên phân hoá theo độ cao mà huyện có điều kiện thuận lợi để phát
triển nhiều hoạt động trong nông nghiệp như trồng cây lương thực, hoa màu, cây
công nghiệp, nhiều loại rau đậu có nguồn gốc nhiệt đới, cận nhiệt và ôn đới, chăn
nuôi trâu bò, lợn. Hạn chế lớn là do địa hình dốc, khí hậu phân hoá theo mùa, nên
đất trồng dễ bị rửa trôi, bạc màu, sạt lở đất, thiên tai sâu bệnh, sương muối,...[12]
Huyện Kon Rẫy là nơi đầu nguồn của các hệ thống sông lớn, vì vậy Kon Rẫy
còn có vị trí rất quan trọng về môi trường - sinh thái và đa dạng sinh học. Nguồn
nước dồi dào, nhiều sông suối, địa hình dốc là tiềm năng lớn để phát triển thủy điện,
thủy lợi và du lịch [12].
1.2.4. Thực trạng trồng cà phê tại Kon Rẫy
Trong cơ cấu cây công nghiệp, cây cà phê là một trong những loại cây có diện
tích gieo trồng chủ yếu. Diện tích và sản lượng cà phê trên địa bàn huyện tăng
nhanh và ổn định, điều này được thể hiện ở bảng 1.1:

11


Bảng 1.1 : Diện tích và sản lượng trồng cà phê qua các năm
của huyện Kon Rẫy (Theo cục thống kê Kon Tum 2015) [4]
Năm

2010

2012


2013

2014

2015

Diện tích trồng cà phê
(Ha)

147

240

287

328

373

Sản lượng cà phê
( Tấn)

259

281

359

272


324

Cùng với việc mở rộng diện tích, công tác chọn giống, đầu tư thâm canh được
chú trọng. Các giống cà phê mới phù hợp với điều kiện sinh thái của từng vùng
được đưa vào trồng. Trong những năm qua, việc trồng cây cà phê đã góp phần quan
trọng trong việc nâng cao mức sống , làm thay đổi bộ mặt kinh tế- xã hội của Kon
Rẫy.
Tuy nhiên cây cà phê là cây công nghiệp lâu năm chịu nhiều tác động của
các yếu tố sinh học, đặc biệt là yếu tố sâu bệnh hại gây thiệt hại không nhỏ đến
năng suất cây. Trên địa bàn huyện thường xuất hiện rệp các loại, mọt đục cành,
bệnh thán thư, bệnh gỉ sắt, bệnh nấm hồng và bệnh lở cổ rễ gây thiệt hại ở nhiều
vườn cà phê.
1.3. CHẾ PHẨM VI SINH
1.3.1. Khái niệm

CPVS là những sản phẩm được sản xuất ra mà trong các sản phẩm đó có chứa
các VSV sống hoặc có nguồn gốc từ VSV mà có tác dụng tích cực đến vật nuôi, cây
trồng, cải tạo môi trường…
Ở Việt Nam chế phẩm vi sinh được sản xuất phục vụ cho nhu cầu nông
nghiệp mà chúng ta có thể hay bắt gặp như: Phân sinh học, thuốc trừ sâu sinh học
phục vụ cho cây trồng, đệm lót sinh học cho chăn nuôi…
1.3.2. Phân loại

- Theo tính chất, CPVS được chia thành 3 dạng chính: Dạng lỏng (nước), dạng
bột, dạng viên. Trong đó thường gặp dạng lỏng và dạng bột.
- Theo công dụng, chia thành các loại
+ CPVS có tác dụng xử lý chất thải, nước thải, rác thải (sinh hoạt, chăn nuôi,
trồng trọt, công nghiệp, y tế …)
12



+ CPVS có tác dụng kích thích sinh trưởng, sinh sản của vật nuôi cây trồng
1.4. CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NGHIÊN CỨU
1.4.1. Vi khuẩn Bacillus sp

Bacillus là vi khuẩn gram dương, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất,
nước, không khí do chúng có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí hay hiếu
khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này đều có khả năng sinh
ra nhiều α- amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra xenlulase, giống này
không sinh ra lipase [26].
Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình
dạng tế bào hình que với kích thước khác nhau (0,5-2,5)x(1,2-10)µm. Bacillus có
chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động [26].
Bacillus có khả năng sinh bào tử, nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình
ra ở một đầu.Thông thường bào tử được tạo ra khi tế bào đã trãi qua giai đoạn phát
triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra
một bào tử. Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được
giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ
và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm.
Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình
thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bất lợi [26].
Về dinh dưỡng : Bacilus là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng
lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu
cơ... [26]
Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như
Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus
acidocaldrius. Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (450C – 750C), hay ưa
lạnh (50C – 250C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 340C – 370C [26].
Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật. Một số loại gây độc
cho côn trùng. Bacillus có khả năng sản sinh nhiều enzyme ngoại bào (amylase,

protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp,
trong bảo vệ môi trường… Một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: Bacillus
subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus mensentericus, Bacillus pumilus…[11].
1.4.2. Nấm mốc Trichoderma sp.
13


Ở Việt Nam nấm Trichoderma được phân loại thuộc ngành nấm Mycota, lớp
nấm bất toàn Deuteromyceles, bộ nấm bông Moniliales, họ Moniliaceae, chi
Trichoderma. Hệ thống phân loại này được chấp nhận và sử dụng phổ biến [14].
Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sợi nấm đa bào có vách ngăn thủng lỗ
đơn giản, phân nhánh phức tạp. Vách tế bào bằng chitin và glucan. Nhân tế bào
được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ thủng, trong nhân có hạch
nhân. Thường có nhiều tập trung ở phân ngọn của sợi nấm. Trong các tế bào phía
sau ngọn thường chỉ có 1 -2 nhân. Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ
nhuộm màu, số lượng NST là 6 [33].
Sợi nấm sinh trưởng, phát triển thành những tảng nấm nhỏ dạng gối phẳng, có
cành bào tử đơn bào không mầu. Cành bào tử phân nhánh và các nhánh này thường
mọc đối xứng nhau hoặc theo nhiều phía. Trên cành bào tử thường có cuống đính
bào tử. Cuống đính bào tử hình chai. Bào tử hình tròn hoặc hình trứng, sáng màu,
có cấu tạo đơn bào. Bào tử có thành dầy. Kích thước bào tử thay đổi tùy loài phổ
biến từ 3,0 µm đến 4,0 µm. Đây là các nấm đối kháng sống trong đất. Thường quan
sát thấy nấm Trichoderma tồn tại trong đất ở dạng sợi nấm hoăc bào tử. Bào tử có
rất nhiều trong đất ẩm [27].
Khuẩn lạc Trichoderma phát triển rất nhanh và thành thục trong vòng
5 - 7 ngày. Trên môi trường PDA khi ủ ở nhiệt độ ở 25 0C, khuẩn lạc nấm
Trichoderma ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh
vàng khi có bào tử xuất hiện. Ở một số loài Trichoderma còn có khả năng tiết ra sắc
tố có màu vàng trên môi trường PDA. Một số loài Trichoderma còn tạo mùi đặc
trưng như Trichoderma viride tạo mùi dừa [27].

Trichoderma có khả năng sử dụng nguồn hỗn hợp cacbon và nitơ. Nguồn
cacbon và năng lượng Trichoderma sử dụng được là monosaccharide và
disaccharide, cùng với hỗn hợp polysaccharide, purin, pyrimidin, acid amin, tanin,
aldehide và acid hữu cơ. Đặc biệt là acid béo, methanol methylamin và NH 3 là
nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi cấy Trichoderma. Những nguồn
nitrogen nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh dưỡng [19].

14


Trichoderma có thể phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều
cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia. Hầu hết các loài
Trichoderma phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 - 30 0C, một số loài phát triển tốt ở 35 0C
thậm chí ở 400C. Thủy phần của môi trường lên men xốp sinh khối của
Trichoderma thích hợp là 54 - 56 %. pH thích hợp để nấm Trichoderma phát triển là
5 - 6, khi pH > 6 sinh trưởng của nấm yếu, pH < 4 sinh trưởng của nấm rất yếu [27].
Theo Widden và Scattolin (1998), nấm Trichoderma harzianum và
Trichoderma koningii phát triển nhanh ở nhiệt độ 25 oC và lấn át các loài nấm khác
[27].
Trichoderma vừa có khả năng đối kháng lại các loài nấm gây bệnh ở thực vật
vừa có khả năng phân hủy cellulose nên việc dùng Trichoderma trong phân bón là
lựa chọn tốt vừa bảo vệ được cây trồng, tăng thêm thu nhập, giảm chi phí đầu tư và
bảo vệ môi trường [25] [40].
1.4.3.

Nấm bệnh Fusarium sp.

a. Đặc điểm của nấm bệnh Fusarium sp.

Nấm Fusarium sp thuộc:

Ngành :Ascomycota
Lớp :
Deuteromycetes
Họ :
Tuberaulariaceae
Bộ:
Moniliales
Chi :
Fusarium
Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây như héo do tắc bó mạch,
thối rễ, thân và bắp, thối rễ cây non và thối củ. Một số loài gây bệnh cũng sinh sản
độc tố nấm lẫn tạp trong hạt ngũ cốc [32].
Fusarium spp. là chi lớn nhất của Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc kí
sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau, gây bệnh cho cây như héo do tắc bó
mạch, thối rễ, thân và bắp, thối rễ cây non và thối củ. Một số loài gây bệnh cũng
sinh sản độc tố nấm lẫn tạp trong hạt ngũ cốc.
Hệ sợi nấm lan tỏa khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản
trở quá trình vận chuyển nước gây héo cây. Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn,
15


sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố
tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh
phức tạp.
Nấm sống hoại sinh hoặc kí sinh trên thực vật, gặp phổ biến trong đất cũng
như vật liệu cellulose [9].
Nấm Fusarium phát triển nhanh trên môi trường PDA ở nhiệt độ 25ºC và
hình thành tản nấm có hình thể tơi xốp như bông, bằng phẳng hoặc lan rộng trên
môi trường nuôi cấy.
Mặt trên của tản nấm có thể có màu trắng, kem, vàng, vàng cam, đỏ, tím

hồng hoặc tím. Mặt dưới có thể không màu, vàng cam, màu đỏ, màu tím sẫm hay
màu nâu [ 42].
Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học thì các loài Fusarium khác
nhau sẽ phân bố ở vùng địa lý khác nhau. Sự thay đổi trong cấu trúc và đa dạng nấm
có thể do kết hợp với các vùng khí hậu đặc biệt trên thế giới [ 42].
b. Hình thức sinh sản của nấm Fusarium sp.
Fusarium có 2 hình thức sinh sản: Sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính.
Do thiếu giai đoạn sinh sản hữu tính trong vòng đời nên người ta gọi chung là nấm
không hoàn chỉnh hay nấm bất toàn [6].
• Sinh sản sinh dưỡng:
Sợi nấm: từ 1 sợi nấm riêng rẽ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ sinh trưởng và
phân nhánh thành hệ sợi nấm.
Bào tử hậu: là những tế bào hình tròn, có tế bào chất được cô đặc lại [45], có
màng dày bao bọc [ 23], thỉnh thoảng có bào tử hậu với vách tế bào xù xì hoặc có
sắc tố. Chất dinh dưỡng được chuyển từ tế bào kề bên sang tế bào ưu tiên làm tế bào
này phồng lên trong một thời gian khá dài. Khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ nẩy
mầm và phát triển thành sợi nấm mới. Bào tử hậu có thể quan sát được dưới kính
hiển vi sau 10- 14 ngày. Nhưng nhiều loài Fusarium có thời gian hình thành bào tử
chậm hơn và có khi không tạo [ 41].
• Sinh sản vô tính:
Bào tử đính được hình thành ở các loài nấm bất toàn. Đa số bào tử đính
thường xếp thành chuỗi, có khi thành từng khối, Một số bào tử đính nằm đơn độc
từng cái trên một cuống bà tử đính. Cuống bào tử đính có thể đơn bào hoặc đa bào,
không phân nhánh hoặc phân nhiều nhánh, mọc riêng lẻ hay sắp xếp từng cụm [1].

16


Bào tử đính lớn (bào tử lớn): trong suốt, được hình thành từ thể bình trên
cành bào tử có nhánh hay không có nhánh [ 44].

Bào tử lớn có kích thước 2-8 x 11-70 µm. Kích thước thường dùng để phân
biệt giữa các loài: Fusarium quá dài (F. avenaceum, F. coccophilum, F.
decemellulare...) và quá ngắn (F. xylarioides, F. larvanrum, F. poae...)
Phần đầu và cuối bào tử lớn có hình dạng và kích thước khác nhau. Phần đầu
có thể ở dạng cái móc, núm vú, hình đầu tù, hình nón. Phần cuối bào tử có dạng:
hình đầu tù, hình núm vú, hình bàn chân, hình bàn chân[41].
Bài tử đính nhỏ (bào tử nhỏ): kích thước 2-4 x 4-8 µm, được hình thành từ
cành bảo tử phân sinh phân nhánh hoặc không phân nhánh, mọc trực tiếp từ sợi
1.5.

nấm hoặc tụ lại thành dạng bọc giả trên đầu cành hoặc hình thành dạng chuỗi [15].
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NẤM BỆNH VÀ CHẾ PHẨM PHÒNG TRỪ
CHÚNG
1.5.1. Tình hình nghiên cứu nấm bệnh Fusarium sp.
a. Tình hình nghiên cứu trong nước
Theo các nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học, các bệnh do Fusarium sp.
là vấn đề quan trọng ở Việt Nam. Một vài dạng F.oxysporum cũng có thể gây thối
dưa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc dụng cụ gặt hái làm tổn thương [32].
Thối bắp chủ yếu do F.graminearum và F.verticilliodes gây ra, ngày càng trở
nên nghiêm trọng ở Việt Nam. Cả hai loài đều sinh độc tố tồn tại trong hạt.
Fusarium solani gây thối rễ trên cây họ đậu như đậu Hà Lan, đậu cô ve [32].
Fusarium decemcellulare đã được phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc
Việt Nam (L. Burgess, thông tin chưa xuất bản) và từ cà phê ở Tỉnh Đắc Lắc (TS.
Trần Kim Loang, giao tiếp riêng) [32].
Năm 2013 Nguyễn Thế Quyết, Nhữ Viết Cường, Vũ Duy Thanh, Lê Thị Ánh
Hồng, Kasem Soytong tiến hành phân lập bệnh nấm hại trong các vườn ươm cây cà
phê tại Chiềng Mung, Sơn La. Kết quả cho thấy trong các vườn ươm cây cà phê có
nhiều loại nấm gây hại, đặc biệt là các loại nấm gây hại trên rễ trong đó có
Fusarium sp [5].
Nấm Fusarium sp được cho là nguyên nhân gây bệnh héo vàng trên cà chua,

khoai tây (Vũ Triệu Mân, 1987). Đến nay đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu về loài
nấm này được biểu hiện triệu chứng như héo bó mạch, thối gốc củ quả.
Bệnh thối khô quả đậu đen, bệnh vết xám cành cam quýt do nấm Fusarium
semitetum Berk (Burgess – Nguyễn Đức Trí, 1993).
17


Bệnh thối gốc hành tây do nấm Fusarium solani Appel. Bệnh tách đôi quả táo
cũng do nấm Fusarium sp gây ra (Burgess – Nguyễn Đức Trí, 1994).
Theo Nguyễn Văn Viên (1997) cho biết vụ đông xuân 1994 ở Tiên Dương –
Đông Anh tỷ lệ cây nhiễm bệnh héo vàng trung bình 4,0%, cà chua trồng trên đất
vàn tỷ lệ cây nhiễm bệnh là 5,8%, ở chân đất cao tỷ lệ cây nhiễm bệnh là 2,2%.
Trên môi trường PDA thuốc Benlate 0,1% có tác dụng ức chế sự phát triển của tản
nấm Fusarium oxysporum.
Tháng 11/1995 Burgess cùng một nhóm các nhà nghiên cứu bệnh cây Việt
Nam đã phát hiện ra hai loại vi sinh vật cùng đồng thời có mặt trong bó mạch cây cà
chua là Fusarium sp và vi khuẩn Pseudomonas solanacearum.
b. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các loài nấm Fusarium sp đã được nghiên cứu từ khoảng đầu thế kỷ XIX. Đến
nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm Fusarium đã được công bố và có
ý nghĩa lớn trong sự phát triển của khoa học kỹ thuật.
Nghiên cứu phân loại Fusarium bắt đầu từ năm 1809 nhưng việc xác định số
loài Fusarium luôn thay đổi trên phạm vi rộng lớn: từ 9 loài theo Snyder và Hansen
(1954) đến 44 loài và 7 giống theo Booth (1971)[ 34], 65 loài và 55 giống theo
Wollenweber (1982) [43]. Cho đến bây giờ, hệ thống phân loại Fusarium vẫn còn
mơ hồ và không chắc chắn [39].
Theo Binder và Hutchinson (1959) cà chua bị bệnh héo vàng do
nấm Fusarium sẽ chết nhanh và thiệt hại lớn khi cùng bị tuyến trùng (Meloidogine
incognita) xâm nhập vì tuyến trùng làm giảm tính chống bệnh của cà chua đối với

nấm Fusarium.
Takayuki và cộng sư (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện chiếu
sáng khác nhau lên sự hình thành bào tử của F. globosum phân lập từ lúa mì ở vùng
cận nhiệt đới Nhật Bản, đồng thời đưa ra điều kiện chiếu sáng tối ưu để phân lập
Fusarium.

18


Ellner (2002) đã nghiên cứu độc tố trong khoai tây gây độc bởi F.
sambucinum.
Hussein và cộng sự (2002) đã nghiên cứu sự xuất hiện của Fusarium trên ngô
ở New Zealand. Bằng cách pha loãng và cấy trực tiếp tác giả đã phân lập được 15
loài Fusarium spp từ hạt và vỏ của 3 loài ngô.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất chế phẩm phòng trừ nấm Fusarium sp.
a. Tình hình nghiên cứu trong nước

Đã có nhiều nghiên cứu về chế phẩm sinh học phòng trừ nấm Fusarium sp. ở
Việt Nam. Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí
nghiệm hay sản xuất thử cho các mô hình chứ ít được thương mại hóa. Ngoài ra,
các nghiên cứu chủ yếu là trên cây ăn quả có múi, cây rau ( cây cà chua, cây xà
lách, ớt..), cây hồ tiêu.
Viện Công nghệ Sinh học đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm (tế bào, dịch ngoại
bào) từ vi khuẩn đối kháng Burkholderia, Pseudomonas và Bacillus có tác dụng
kiểm soát hiệu quả nấm F. oxysporum gây hại cây cà chua trong nhà lưới [21].
Hiện nay, chế phẩm sinh học từ chủng Trichoderma do Trường Đại học Cần
Thơ sản xuất được nông dân sử dụng đánh giá có tác dụng rất tốt trong việc ngăn
ngừa các loại nấm hại như Fusarium, Rhizoctonia, Phytopthora ... gây bệnh trên
cây có múi và cây rau họ bầu, bí [27].
Năm 2010 PGS.TS Nguyễn Kim Vân và cộng sự đã nghiên cứu thành công

chế phẩm nấm Trichoderma viride và phòng trừ có hiệu quả nấm Fusarium
oxysporum gây hại cà chua với quy mô nhà lưới [30].
Năm 2013 Ths. Trần Thị Lịch đã nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase
thô từ chủng Trichoderma sp. để phòng trừ nấm Fusarium sp. gây hại trên cây cà
chua [13].
Năm 2009 TS. Lưu Hoàng Ngọc và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất cao dịch
chiết của rễ cây chút chít Rumex crispus định hướng làm thuốc trừ nấm thảo mộc
phòng trừ nấm Fusarium gây bệnh héo vàng trên khoai tây và Fusarium gây bệnh
héo rũ trên cây chuối. Nghiên cứu công nghệ sản xuất cao dịch chiết của rễ cây chút

19


chít Rumex crispus định hướng làm thuốc trừ nấm thảo mộc thân thiện môi trường
[18].
Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Trần Văn Huy và cộng sự đã nghiên cứu thành công
chế phẩm SH-BV1 gồm 6 loại vi sinh vật A. beijerinckii, B. gisengihumi, S.
owasiensis, B. subtiliss, T. haianum và M. anisopliae và thảo mộc. Hiệu lực phòng
trừ nấm Fusarium spp. trong đất hồ tiêu tại Chư Sê, Gia Lai đạt 70,55 - 78,55%.
Hiệu lực phòng trừ nấm Fusarium spp. trong đất cà phê tại Đăk Song, tỉnh Đăk
Nông đạt 69,82-74,68 % [24].
b. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hàng năm trên thế giới, bệnh hại cây trồng gây ra những tổn thất to lớn cho
sản xuất nông nghiệp. Tính đến năm 2005 thì có khoảng 14% các khoản thiệt hại
trên thế giới hoàn toàn là từ các bệnh hại cây trồng gây ra, và hơn 50% các bệnh
hại cây trồng là do nấm gây ra với hàng tỷ euro thiệt hại mỗi năm (Agrios, 2005).
Trong các loại bệnh hại cây trồng thì bệnh do nấm Fusarium gây ra chiếm tỉ lệ
tương đối lớn.
Việc sử dụng ngày càng nhiều các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong
nông nghiệp sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, dẫn đến mất cân bằng trong

quần thể vi sinh vật đất có ích, tạo môi trường bất lợi đối với các sinh vật có ích
phát triển, và tạo điều kiện để nấm bệnh, các loài côn trùng có hại kháng thuốc hơn,
đồng thời cũng tiêu diệt các loài thiên địch có ích.
Chính vì vậy việc nghiên cứu chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ thực
vật đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm, đặc biệt là đối với những bệnh do
nấm Fusarium sp. gây ra. Chế phẩm được sản xuất chủ yếu từ các chủng
Trichoderma.
Ở Hungary, Liên Xô (cũ), Philippin và Thái Lan đã nghiên cứu nấm
Trichoderma và sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm này để hạn chế những nấm tồn
tại trong đất gây hại cho cây trồng nói chung như nấm Fusarium sp. và Rhizoctonia
sp.
Ở Nhật Bản đã nghiên cứu về chế phẩm Trichoderma phòng trừ nấm
Fusarium sp. Theo Yang & cs. (1996) và Wang & cs. (1996) chế phẩm nấm

20


Trichoderma viride có hiệu lực đối kháng mạnh với nấm Fusarium sp. gây bệnh lở
cổ rễ, thối xám, héo vàng trên cây cà chua và dưa chuột trong nhà kính [31] .
Hiện nay tại Mỹ, các chế phẩm PlantshieldTM và RootshieldTM từ loài
Trichoderma harzianum nòi T22 đã được khuyến cáo để sử dụng phòng trừ một số
bệnh do nấm Phytophthora, Pythium, Fusarium trên một số cây trồng. Chế phẩm
được sử dụng bằng cách phun lên lá, tưới hay bón vào đất [27].

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Các chủng vi khuẩn, nấm mốc và nấm bệnh Fusarium sp. phân lập được từ 5
vườn cà phê khác nhau trên địa bàn huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đề tài nghiên cứu tập trung vào những nội dung sau:

-

Nghiên cứu tổng quan tài liệu.
Phân lập nấm bệnh Fusarium sp., và các chủng vi sinh vật từ cây cà phê tại huyện
Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum.

21


-

Xác định hoạt tính đối kháng với nấm bệnh của các chủng vi sinh vật phân lập

-

được. Định danh các chủng VSV có hoạt tính đối kháng từ trung bình đến mạnh.
Đánh giá, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng nấm bệnh mạnh

-

nhất.
Thử nghiệm sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học phòng chống nấm Fusarium
sp .
2.3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm được thể hiện trên sơ đồ hình 2.1
Thu mẫu, phân lập nấm bệnh Fusarium sp. và các chủng VSV từ cây cà phê


Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng VSV phân lập được, định danh
các chủng VSV có hoạt tínhdđối kháng trung bình đến mạnh

Tuyển chọn chủng VSVcó hoạt tính đối kháng nấm bệnh mạnh nhất

Thử nghiệm, sản xuất CPVS phòng trừ nấm Fusarium sp.

Đánh giá chất lượng CPVS
Hình 2.1: Sơ đồ thí nghiệm

2.4.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp thu thập mẫu

Tiến hành lấy mẫu tại 5 vườn cà phê thuộc 5 xã, thị trấn trên địa bàn huyện
Kon Rẫy. Tại mỗi vườn tiến hành thu 5 mẫu tại các vị trí khác nhau, mỗi vị trí cách
nhau 50m. Địa điểm các vườn lấy mẫu được thể thiện trên bản đồ. Lấy mẫu phân
lập được chia thành 2 đợt: vào mùa mưa (tháng 8) và mùa khô (tháng 12).

22


Hình 2.2: Ví trí lấy mẫu trên bản đồ
Thu thập các mẫu cành, lá, quả tại các vườn cà phê phù hợp với mục đích thu
thập. Các mẫu thu thập được đánh số thứ tự, địa điểm lấy mẫu và để riêng từng túi
đựng mẫu tránh tạo độ ẩm, nhầm lẫn.
Đối với việc thu mẫu bệnh ta tiến hành đào vùng đất ở gần gốc cà phê cách
gốc khoảng 20-30cm, chọn những rễ tơ có triệu chứng bị bệnh biểu hiện là các
chấm đen và vết thối trên rễ và cổ rễ, dùng dao, muỗng sạch vô trùng lấy khoảng
20g mẫu cho vào túi nilon vô trùng, buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫy.

Mẫu thu về được bảo quản trong thùng đá và được vận chuyển về PTN, giữ
trong tủ lạnh. Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 24h.
2.4.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật
Phương pháp phân lập vi khuẩn: Lấy mẫu cành, lá, quả cà phê đã thu được
khử trùng bằng cồn 75% trong 1 phút. Đối với cành cần cắt thành từng đoạn nhỏ
dài 7-8 cm, đường kính cành 0,8-1cm trước khi khử trùng. Sau khi khử trùng lấy
mẫu ra hơ nhanh qua đèn cồn, sau đó cắt thành các lát mỏng có kích thước 0,5 - 1,0
(cm), cắt sâu đến phần lõi gỗ. Sau khi cắt xong cân mỗi phần 1 gam rồi cho vào ống
nghiệm có chứa môi trường PBS để qua đêm. Phân lập vi khuẩn theo phương pháp
23


pha loãng tới hạn. Lấy 0,1ml ở nồng độ 10-5 cho vào hộp lồng chứa môi trường
PDA và trang đều trên mặt thạch, nuôi ở nhiệt độ 28 oC.Theo dõi sự xuất hiện của
các khuẩn lạc, dùng que cấy tách ra từng chủng vi sinh vật khác nhau ra các hộp
lồng có chứa môi trường PDA(mỗi hộp một chủng vi sinh vật ) [17].
Phương pháp phân lập nấm mốc: Mẫu lấy về chọn những thân cành khoẻ,
tươi và không bị bệnh tiến hành rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng
bề mặt bằng cồn 70% rồi rửa lại 2 - 3 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi đã khử
trùng mẫu xong thì cắt thành từng đoạn nhỏ rồi đặt vào các hộp lồng chứa môi
trường PDA đã được hấp khử trùng. Đặt các hộp lồng đã cấy mẫu này trong ấm ở
nhiệt độ 28ơC trong khoảng 2-3 ngày để cho sợi nấm phát triển mọc trên môi
trường. Khi nấm đã mọc tiến hành tách nấm và cấy sang các hộp lồng khác có chứa
PDA, lặp lại cho tới khi được sợi nấm thuần khiết [17].
Phương pháp phân lập nấm bệnh: Mẫu bệnh được rửa dưới vòi nước. Tách
những phần mô thực vật có cả phần bị bệnh và phần không bị bệnh, sau đó cho vào
dung dịch khử trùng thích hợp ( ô xy già, cồn 70º, hoặc natri hypoclorid...) thời gian
từ 1-2 phút, cho những mảnh mẫu ra và rửa lại bằng nước cất vô trùng.Tất cả phải
tiến hành trong điều kiện vô trùng. Sau đó đặt các mẫu lên môi trường WA và để ở
nhiệt độ 25-30oC sau 1-2 ngày tiến hành quan sát, tách sợi nấm sang môi trường

PDA để phân lập khuẩn lạc thuần [5].
Môi trường phân lập:
• Môi trường PBS:
NaCl: 8,5 gam
KH2PO4: 6,8 gam
NaOH:1,16gam
Nước cất thêm đến1000 ml
pH = 7
• Môi trường PDA
Khoai tây: 200gam
D-Glucose:20 gam
Agar: 15-18 gam
Nước cất thêm đến 1000ml
• Môi trường WA:
Agar: 20g
Nước cất thêm đủ đến 1000ml
24


2.3.3. Phương pháp bảo quản giống
a. Phương pháp cấy chuyền
Các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên
thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi
sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản
có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm
bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết
[10].
b. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Trộn dịch tế bào vi sinh vật với chất bảo vệ với nồng độ thích hợp. Sau đó,
đưa vào bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ -200C .

2.3.4. Phương pháp xác định, đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh của các vi sinh vật
a. Phương pháp xác định, đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh của các vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy lắc trong môi trường dịch thể
thích hợp. Sau 3 ngày, lấy 200 µl dịch nuôi cấy quay ly tâm lấy dịch trong, nhỏ 100
µl dịch trong vào lỗ thạch được đục sẵn trong đĩa petri chứa môi trường PDA đã cấy
sẵn 3 điểm nấm Fusarium sp.
Sau 5 ngày nuôi trong điều kiện thích hợp, xác định vòng đối kháng. Hiệu lực
kháng nấm bệnh được xác định bằng đường kính vùng ức chế (D). Hiệu lực kháng
nấm bệnh của các chủng vi sinh vật được chia thành 5 cấp như sau [17]:
Hiệu lực kháng rất mạnh (++++): Đường kính vùng ức chế ≥ 20mm
Hiệu lực kháng mạnh (+++): Đường kính vùng ức chế ≥ 10mm và < 20mm
Hiệu lực kháng trung bình (++): Đường kính vùng ức chế ≥ 5mm và < 10mm
Hiệu lực kháng yếu (+): Đường kính vùng ức chế ≥ 1mm và < 5mm
Không có hiệu lực (-): Đường kính vùng ức chế <1mm
b. Phương pháp xác định, đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh của nấm mốc
nội sinh
Khả năng đối kháng của nấm mốc với nấm Fusarium sp. được đánh giá theo
phương pháp của Seiketov (1982), Bradshaw-Smith và cộng sự (1991) [27].
+ Môi trường thí nghiệm: PDA
+ Phương pháp tiến hành: Cấy đối xứng hai bên
+ Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính ức chế của tản nấm thử nghiệm đối với
Fusarium sp. sau 5 ngày
25