BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

CHU ĐỨC HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA
METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE TRONG ĐIỀU KIỆN
STRESS MẶN, HẠN Ở CÂY ARABIDOPSIS VÀ ĐẬU TƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI, 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

CHU ĐỨC HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA
METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE TRONG ĐIỀU KIỆN
STRESS MẶN, HẠN Ở CÂY ARABIDOPSIS VÀ ĐẬU TƯƠNG

Chuyên ngành

:

Công nghệ Sinh học

Mã số

:

9420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Lê Tiến Dũng
2. TS. Phạm Thị Lý Thu

HÀ NỘI, 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án
là do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nghiên cứu đã nêu trong luận án là
trung thực và chưa được ai công bố trên bất kỳ một công trình nghiên cứu nào
khác. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn, các tài liệu trích dẫn
đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả luận án

Chu Đức Hà



ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận án này, nghiên cứu sinh đã nhận được sự tận
tình giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân.
Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Lê Tiến Dũng,
TS. Phạm Thị Lý Thu, những người thầy, người cô và các anh chị đã tận tình
dẫn dắt, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên
cứu khoa học và hoàn thành luận án.
Nghiên cứu sinh xin biết ơn những ý kiến đóng góp quý báu của các
thầy, cô Ban Đào tạo Sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam,
Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp trong suốt quá trình học tập.
Nghiên cứu sinh xin chân thành cảm ơn các cán bộ, bạn bè đồng nghiệp
công tác tại bộ môn Sinh học phân tử, phòng thí nghiệm Chọn giống phân tử
Sắn - Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Tài nguyên Bền vững RIKEN
(Nhật Bản) đã chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ động viên trong suốt quá trình
thực hiện luận án. Đồng thời, luận án của nghiên cứu sinh cũng được hỗ trợ
kinh phí từ đề tài của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã
số 106-NN.02-2013.46.
Cuối cùng, nghiên cứu sinh xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên
khích lệ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2018

Tác giả luận án

Chu Đức Hà



iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................... vi
Danh mục bảng............................................................................................... viii
Danh mục hình ................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.

Tính cấp thiết của luận án ..................................................................... 1

2.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án .......................................................... 2

3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ........................................... 2

3.1.

Ý nghĩa khoa học của luận án ............................................................... 2

3.2.

Ý nghĩa thực tiễn của luận án ............................................................... 3


4.

Những đóng góp mới của luận án ......................................................... 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................. 4
1.1.

Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến đời sống thực vật ............... 4

1.1.1. Tác động của biến đổi khí hậu đối với cây trồng nông nghiệp
hiện nay ................................................................................................. 4
1.1.2. Cơ chế tác động của yếu tố ngoại cảnh bất lợi đến tế bào thực vật...... 9
1.1.3. Cơ chế đáp ứng của thực vật với điều kiện bất lợi ............................. 15
1.2.

ai trò của n ym m thionin sul oxid r ductas và quá trình
ôxi hóa m thionin ở thực vật............................................................. 18

1.2.1. Quá trình ôxi hóa m thionin ở thực vật ............................................ 18
1.2.2. Tổng quan về họ enzyme methionine sulfoxide reductase ................. 21
1.3.

M thionin và prot in giàu m thionin ở thực vật ............................. 29

1.3.1. Một vài nét về m thionin và vai trò của methionine ở thực vật ....... 29


iv


1.3.2. Prot in giàu m thionin ở thực vật ..................................................... 32
1.4.

Tiềm năng ứng dụng của enzyme methionine sulfoxide reductase
trong chọn tạo giống nhằm nâng cao tính chống chịu ở cây trồng ..... 34

CHƯƠNG II

T LIỆU À PHƯƠNG PH P NGHI N C U................... 38

2.1.

ật liệu nghiên cứu ............................................................................. 38

2.1.1.

ật liệu cho nghiên cứu tin sinh học .................................................. 38

2.1.2.

ật liệu cho nghiên cứu thực nghiệm ................................................. 38

2.2.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................... 38

2.2.1. Thời gian nghiên cứu .......................................................................... 38
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 38
2.3.


Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 39

2.3.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học ............................................. 39
2.3.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm ............................................ 47
CHƯƠNG III KẾT QUẢ À THẢO LU N ................................................. 51
3.1.

Xác định và phân tích prot in giàu methionine ở Arabidopsis .......... 51

3.1.1. Tìm kiếm, xác định và định danh g n mã hóa prot in giàu
methionine ở Arabidopsis ................................................................... 51
3.1.2. Phân loại chức năng của prot in giàu m thionin ở Arabidopsis ...... 53
3.1.3. Phân tích đặc tính cơ bản của prot in giàu m thionin

ở

Arabidopsis ......................................................................................... 55
3.1.4. Phân tích mức độ biểu hiện g n mã hóa MRP trên Arabidopsis
trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi ........................................ 60
3.1.5. Đánh giá mức độ đáp ứng của cây Arabidopsis thaliana chuyển
gen biểu hiện quá mức g n At3G55240 với điều kiện bất lợi ............ 67
3.2.

Xác định và phân tích prot in giàu M thionin ở đậu tương ............. 74

3.2.1. Tìm kiếm, xác định và định danh g n mã hóa prot in giàu
methionine ở đậu tương ...................................................................... 75


v


3.2.2. Phân loại chức năng của g n mã hóa prot in giàu m thionin ở
đậu tương ............................................................................................ 76
3.2.3. Phân tích mức độ biểu hiện của g n mã hóa prot in giàu
methionine ở đậu tương ...................................................................... 78
3.3.

Phân tích in silico họ g n mã hóa n ym MSR ở đậu tương ............ 82

3.3.1. Xác định họ g n mã hóa n ym MSRA ở g nom cây đậu tương ... 83
3.3.2. Phân tích hiện tượng lặp g n của họ g n mã hóa n ym MSRA
ở đậu tương ......................................................................................... 85
3.3.3. Phân tích một số đặc tính cơ bản của họ n ym MSRA ở đậu
tương ................................................................................................... 87
3.4.

Đánh giá đặc tính của họ g n mã hóa n ym MSR ở đậu tương ...... 90

3.4.1. Dự đoán yếu tố điều hòa cis- ở vùng promot r của họ g n mã hóa
enzyme MSR ở đậu tương .................................................................. 90
3.4.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của g n mã hóa MSR ở đậu tương
trong điều kiện thường và điều kiện ngoại cảnh bất lợi bằng tin
sinh học ............................................................................................... 93
3.4.3. Phân tích mức độ đáp ứng của g n mã hóa MSRB ở đậu tương
trong điều kiện thường và điều kiện ngoại cảnh bất lợi bằng thực
nghiệm ................................................................................................. 97
KẾT LU N À Đ NGH ........................................................................... 105
Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án .................... 106
Tài liệu tham khảo ......................................................................................... 107
Phụ lục ........................................................................................................... 128



vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ch

iế

120 RH

Thu

ng Tiếng Anh

Root hair cells isolated 120 hours after

Thu

Tế bào lông rễ thu ở thời điểm
giờ sau khi gi o

sowing
84 RH

Root hair cells isolated 84 hours after

ng Tiếng Việ

Tế bào lông rễ thu ở thời điểm

giờ sau khi gi o

sowing
ABA

Abscisic acid

Axit abscisic

Cd

Cadmium

Cadimi

CRE

Cis- regulatory element

Yếu tố điều hòa cis-

cTP

Chloroplast transited peptide

Trình tự hướng vào lục lạp

Cys

Cysteine


Cystein

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

fMet

N-Formylmethionine

N-Formylmethionin

GEO

Gene expression omnibus

Kho dữ liệu biểu hiện gen

Ile

Isoleucine

Isoleucin

JA

Jasmonic acid


Axít asmonic

Ka

Nonsynonymous substitutions per

Trị số thay thế trái nghĩa

nonsynonymous site
Ks

Synonymous substitutions per

Trị số thay thế đồng nghĩa

synonymous site
L

Leaf

Lá

Lys

Lysine

Lysin

Met


Methionine

Methionin

MetO

Methionine sulfoxide

Methionin sulfoxit

MetO2

Methionine sulfone

Methionin sulfon

Met-S-O

Methionine-S-sulfoxide

Methionin-S-sulfoxit

Met-R-O

Methionine-R-sulfoxide

Methionin-R-sulfoxit

MRP


Methionine rich protein

Prot in giàu m thionin

mRNA

Messenger RNA

ARN thông tin


vii

MS

Murashige-Skoog

Murashige-Skoog

MSR

Methionine sulfoxide reducatase

Methionin sulfoxit reducataza

MYBR

MYB recognition


Yếu tố nhận biết MYB

MYCR

MYC recognition

Yếu tố nhận biết MYC

N

Nodule

Nốt sần

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide

Nicotinamit adenin dinucleotit

phosphate

phosphat

NST

Chromosome

Nhiễm sắc thể


OPH

O-phosphohomoserine

O-phosphohomoserin

PEL

Pseudo-etiolation in light

Giả vàng úa trong ánh sáng

pI

Isoelectric point

Điểm đ ng điện

Phe

Phenylalanine

Phenylalanin

PlantCARE Plant cis-acting regulatory element

Yếu tố điều hòa cis- ở thực vật

PS


Phytosiderophore

Phytosiderophore

qRT-PCR

Quantitative Realtime PCR

PCR định lượng thời gian thực

R

Root

Rễ

RBC

RIKEN Bioresource Center

Trung tâm tài nguyên sinh học
RIKEN

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

ROS


Reactive oxygen species

Gốc hoạt động chứa ôxi

RT

Root tips

Chóp rễ

S

Sulfur

Lưu huỳnh

SA

Salicylic acid

Axít salicylic

SAM

Adenosyl-L-methionine

Adenosyl-L-Methionin

TF


Transcription factor

Nhân tố phiên mã

TraVA

Transcriptome variation analysis

Phân tích hệ thống biểu hiện

Trp

Tryptophan

Tryptophan

βAP

β-aspartyl phosphate

β-aspartyl phosphat


viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.


Tóm tắt họ g n mã hóa

n ym

m thionin

sul oxid

reductase ở một số loài trong sinh giới ....................................... 26
Bảng 2.1.

Danh sách mồi sử dụng cho phản ứng qRT-PCR ....................... 47

Bảng 3.1.

Phân loại chức năng g n mã hóa MRP trong Arabidopsis ......... 53

Bảng 3.2.

Một số phân tử MRP chứa nhiều Met ở Arabidopsis ................. 55

Bảng 3.3.

Phân tích định khu nội bào của MRP và yếu tố điều hòa ciscủa g n mã hóa MRP ở Arabidopsis .......................................... 57

Bảng 3.4.

Gen AtMRP có mức độ phiên mã đáp ứng trong điều kiện
hạn và mặn .................................................................................. 65


Bảng 3.5.

Thông tin về một số MRP có thành phần M t và kích thước
phân tử nổi bật ............................................................................ 76

Bảng 3.6.

Phân loại chức năng g n mã hóa MRP ở đậu tương th o
Mapman ...................................................................................... 77

Bảng 3.7.

G n mã hóa GmMRP có mức độ biểu hiện đáp ứng với điều
kiện hạn ở lá 6 và R ............................................................... 81

Bảng 3.8.

Thông tin chú giải về họ g n mã hóa n ym MSRA ở đậu
tương ........................................................................................... 84

Bảng 3.9.

Hiện tượng lặp gen ở họ enzyme MSRA ở đậu tương ............... 85

Bảng 3.10. Một số đặc tính cơ bản của họ n ym MSRA ở đậu tương ...... 88
Bảng 3.11. Tóm tắt kết quả phân tích biểu hiện của g n mã hóa MSRB
ở đậu tương trong điều kiện thường ......................................... 102
Bảng 3.12. Tóm tắt kết quả phân tích biểu hiện của g n mã hóa MSRB
ở đậu tương trong điều kiện hạn ............................................... 103
Bảng 3.13. Tóm tắt kết quả phân tích biểu hiện của g n mã hóa MSRB

ở đậu tương trong điều kiện mặn .............................................. 104


ix

DANH MỤC HÌNH
Hình . .

Sự chênh lệch giữa năng suất lý thuyết, tiềm năng và thực tế ..... 5

Hình . .

Kịch bản biến đổi khí hậu trên thế giới trong giai đoạn 2020 2050 ............................................................................................. 6

Hình .3.

Bản đồ xâm nhập mặn khu vực đồng bằng sông Cửu Long
năm

6 ..................................................................................... 8

Hình . .

Yếu tô bất thuận tác động đến đời sống của thực vật ................... 9

Hình .5.

Sự hình thành ROS trong tế bào thực vật .................................. 12

Hình .6.


Quá trình ôxi hóa m thionin trong tế bào ................................ 18

Hình .7.

Phản ứng khử MetO về M t thông qua sự hoạt động của
enzyme MSR ............................................................................. 22

Hình . .

ai trò của M t và SAM liên quan đến các quá trình diễn ra
trong tế bào thực vật ................................................................... 31

Hình . .

Cách tiếp cận để xác định MRP trên đối tượng Arabidopsis ..... 39

Hình . .

Tìm kiếm yếu tố điều hòa cis- trên vùng promot r của các
g n mã hóa AtMRP ở Arabidopsis .............................................. 41

Hình 3.1.

Dự đoán sự xuất hiện của 3 CRE đáp ứng với yếu tố phi sinh
học bất thuận trên vùng promot r của g n mã hóa AtMRP. .......... 59

Hình 3. .

Mức độ biểu hiện của một số gen AtMRP được tìm thấy

trên cơ sở dữ liệu GDS416 ......................................................... 62

Hình 3.3.

Dữ liệu biểu hiện của một số g n AtMRP tiêu biểu trong
các mẫu mô ở A. thaliana ........................................................... 63

Hình 3. .

Dòng chuyển g n nảy mầm trên môi trường chọn lọc ............... 68

Hình 3.5.

Hình thái cây chuyển g n ở các giai đoạn tuổi khác nhau
trên môi trường thạch.................................................................. 69

Hình 3.6.

Hình thái dòng cây chuyển g n trên giá thể đất ......................... 70


x

Hình 3.7.

Đánh giá khả năng đáp ứng của dòng cây chuyển g n và đối
chứng khi xử lý mặn ................................................................... 71

Hình 3. .


Đánh giá khả năng đáp ứng của dòng cây chuyển g n và
đối chứng khi xử lý CdCl2 .......................................................... 72

Hình 3.9.

Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dòng cây
chuyển gen RBC1 ....................................................................... 73

Hình 3.10. Thông tin về một số g n GmMRP có mức độ biểu hiện
mạnh ở các cơ quan, bộ phận trên cây đậu tương trong điều
kiện thường ................................................................................. 79
Hình 3.

. Vị trí phân bố của họ g n MSR trên g nom đậu tương ............ 86

Hình 3.

. Sơ đồ minh họa cây phân loại và cấu trúc vùng bảo thủ cho
enzyme MSRA ở đậu tương và A.thaliana................................. 89

Hình 3. 3. Dự đoán vị trí phân bố của yếu tố điều hòa cis- trên vùng
promoter của họ gen GmMSR ở đậu tương ................................ 91
Hình 3.

. Mức độ biểu hiện của họ gen GmMSR trong điều kiện
thường ở các mẫu mô cơ quan ở đậu tương. .............................. 94

Hình 3. 5. Mức độ biểu hiện của họ gen GmMSR trong điều kiện A
hạn và B mặn ở các mẫu mô cơ quan ở đậu tương .................. 95
Hình 3.16. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của họ g n mã hóa

MSRB ở đậu tương trong điều kiện thường. .............................. 98
Hình 3. 7. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của họ g n mã hóa
MSRB ở đậu tương trong điều kiện hạn ..................................... 99
Hình 3.

. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của họ g n mã hóa
MSRB ở đậu tương trong điều kiện mặn .................................. 100

Hình 3. 9. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của họ g n mã hóa
MSRB ở đậu tương trong điều kiện xử lý với ABA................. 101


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của lu n án
Điều kiện ngoại cảnh bất thuận do biến đổi khí hậu có thể gây tác động
xấu đến sinh trưởng và phát triển của nhiều đối tượng cây trồng. Ở Việt Nam,
diễn biến phức tạp của biến đổi khí hậu đã ảnh hưởng rất lớn đến tình hình và
xu thế phát triển của ngành trồng trọt, gây sụt giảm năng suất cây trồng, đ
dọa tình hình an ninh lương thực.

ì vậy, tăng cường tính chống chịu ở cây

trồng cần được coi là ưu tiên hàng đầu của ngành trồng trọt hiện nay.
Song song với công tác chọn tạo giống nhằm nâng cao tính chống chịu,
nghiên cứu cơ bản nhằm tìm hiểu và làm rõ cơ chế đáp ứng bất lợi của thực
vật cũng là một hướng đi được các nhà khoa học quan tâm. Đây là cơ sở, vừa
mang tính định hướng cho công tác chọn tạo giống cây trồng, nhằm cải thiện
và nâng cao tính chống chịu với yếu tố bất lợi. Cơ chế tác động của bất lợi phi

sinh học và sinh học đến thực vật vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn. Rất nhiều
nghiên cứu đã chứng minh sự dư thừa của một số dạng chứa ôxi nguyên tử hoạt
động trong tế bào đã gây ra những sai hỏng trên các đại phân tử, làm tổn
thương bào quan và cấu trúc nội bào, dẫn đến rối loạn quá trình chuyển hóa,
gây chết tế bào. Đặc biệt, một trong những mục tiêu dễ dàng bị ôxi hóa là các
amino acid có chứa gốc lưu huỳnh, trong đó có methionine M t . Đây là một
amino acid đóng vai trò thiết yếu trong sinh vật. Vấn đề đặt ra là có bao nhiêu
protein chứa nhiều Met trong thực vật và các g n mã hóa prot in này có đáp
ứng như thế nào trong điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Câu hỏi này, dù được khá
nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm, đến nay vẫn chưa được giải đáp một cách
thấu đáo vì vướng phải khó khăn trong cách tiếp cận và phương pháp tiến hành.
Để sửa chữa, sinh giới có hai họ enzyme, methionine-S-sulfoxide
r ductas

MSRA và methionine-R-sulfoxide reductase (MSRB), có chức


2

năng khử các gốc Met bị ôxi hóa. Methionine sul oxid r ductas

MSR được

chứng minh tham gia vào cơ chế chống chịu với điều kiện bất lợi ở cây trồng.
Nghiên cứu về họ n ym này cho phép ta có thể tiếp cận gần hơn với cơ chế
chống chịu ở thực vật, từ đó tìm ra những gen mục tiêu cho công tác chọn tạo
giống nhằm nâng cao tính chống chịu ở cây trồng.
Để giải quyết được các câu hỏi đặt ra, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu
trên cây mô hình Arabidopsis thaliana và đậu tương Glycine max) với tên
luận án “Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa methionine sulfoxide

reductase trong điều kiện stress mặn, hạn ở cây Arabidopsis và đậu tương”.
2. Mục iêu nghiên cứu của lu n án
Mục tiêu của luận án nhằm x m xét vai trò của enzyme methionine
sulfoxide reductase liên quan đến khả năng đáp ứng với điều kiện bất lợi ở
thực vật, đồng thời cũng tìm hiểu về đối tượng cần được methionine sulfoxide
reductase sửa chữa trong tế bào. Cụ thể như sau:
 X m xét và tìm hiểu prot in giàu methionine trên cây mô hình
Arabidopsis thaliana.
 Xác định và phân tích prot in giàu methionine trên đậu tương.
 Xác định và phân tích họ enzyme methionine sulfoxide reductase ở
đậu tương.
 Đánh giá mức độ biểu hiện của các g n mã hóa họ enzyme methionine
sulfoxide reductase ở đậu tương đáp ứng với điều kiện hạn và mặn.
3. Ý nghĩa khoa học à hực tiễn của lu n án
3.1. Ý nghĩa khoa học của lu n án
Kết quả của luận án đã cung cấp các dữ liệu khoa học một cách hệ
thống về vai trò của prot in giàu methionine ở A. thaliana, làm tiền đề cho
các nghiên cứu về cơ chế tác động của yếu tố bất lợi đến thực vật thông qua
quá trình ôxi hóa methionine. Song song với đó, việc xác định và phân tích họ
enzyme methionine sulfoxide reductase ở đậu tương đã cung cấp những hiểu


Luận án Full đủ ở file: Luận án full