ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------------------

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI
TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ
HỢP CHẤT SESQUITERPENE

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------------------

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ HỢP DỰA
TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA
MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÝ THỊ BÍCH THỦY

THÁI NGUYÊN - 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây là do tôi và nhóm
cộng sự nghiên cứu tại phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 5 năm
2014 đến tháng 5 năm 2015.
Thái Nguyên, ngày…. tháng …..năm 201…
Học viên

Trần Thị Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Lý

Thị Bích Thủy – Nghiên cứu viên phòng Sinh hóa thực vật – Viên Công nghệ sinh
học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu,
hướng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa chất và thiết bị trong suốt thời gian tôi
thực hiện luận văn tại phòng.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN. Đoàn Hữu Thanh và các cô chú, anh chị
cán bộ phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa
học và Công Nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều
ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo trong
nhà trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện Công
nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Tôi cũng xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia
(NAFOSTED) đã cung cấp kinh phí để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này trong đề
tài mã số 106-NN.02-2013.57.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những
người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện luận văn này.
Bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày…. tháng …..năm 201…
Học viên

Trần Thị Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN





CÁC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Giải thích

µg

Micro gram

µM

Micromol

µl

Microlit

AdR

Adrenodoxin reductase

Adx

Adrenodoxin

APS

Amonium persulphate

bp


Base pair

CYP

Cytochrome P450

CPR

Cytochrcome P450 reductase

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

FAD

Flavin adenin dinucleotid

Fdx

Ferredoxin

FdR

Ferredoxin reductase


Fldx

Flavodoxin

FMN

Flavin mononucleotide

GCMS

Gas chromatography mass spectometry

HPLC

High pressure liquid chromatography

IPTG

Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

kDa

Kilo dalton

KppG

Kali phosphate glycerol

LB


Lysogeny broth
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




NMR

Nuclear Magnetic Resonance

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

PCB

Polychlorinate biphenyl

PCR

Polymerase chain reaction

SDS – PAGE

Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide

gel electrophoresis

TB

Terrific Broth

TLC

Thin layer chromatography

v/p

Vòng/phút

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i LỜI
CẢM ƠN ...................................................................................................... II MỤC
LỤC .....................................................................................................................V DANH
MỤC CÁC HÌNH ................................................................................VII DANH MỤC
CÁC BẢNG ..........................................................................................IX MỞ ĐẦU
.......................................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................3
1.1 Cytochrome P450 ........................................................................................... 3
1.1.1 Định nghĩa và phân loại...................................................................... 3

1.1.2 Cấu trúc của cytochrome P450........................................................... 5
1.1.3. Cơ chế xúc tác của cytochrome P450 ............................................... 8
1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450 ........................................................ 8
1.2 Nghiên cứu về CYP264B1 ............................................................................. 10
1.3 Hợp chất sesquiterpene .................................................................................. 13
1.3.1 Định nghĩa và nguồn gốc.................................................................... 13
1.3.2 Phân loại sesquiterpene ...................................................................... 13
1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene .............................................. 15
1.4 Hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450 ...... 16
1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa
sesquiterpene trên thế giới và ở Việt Nam
........................................................................... 19
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................20
2. 1 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 20
2.1.1 Vật liệu ............................................................................................... 20
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................. 21
2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 22
2.1.4 Dung dịch và đệm.............................................................................. 22
2.1.5 Môi trường.......................................................................................... 23
2.2 Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




2.2.1 Nuôi cấy E.coli ................................................................................... 24
2.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

ĐHTN




nhiệt .................................................................................................. 24
2.2.3 Kiểm tra sự có mặt của gene CYP264B1, AdR và Adx .................... 25
2.2.4 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene ...................................................... 27
2.2.5. Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone .......................................
30
2.2.6 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu .............................
30
2.2.7 Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene .......................................
32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 34
3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa
CYP264B1, AdR và Adx............................................................................... 34
3.2 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene.................................................................. 35
3.2.1 Khả năng biểu hiện gene CYP264B1................................................. 35
3.2.2 Khả năng biểu hiện của Adx .............................................................. 36
3.3 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào
C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx .................................................................... 38
3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu ......................................... 39
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lên khả năng chuyển hóa cơ
chất..39
3.4.2 Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên khả năng chuyển hóa cơ chất .......
41
3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất ...............
42
3.4.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất ............

44
3.4.5 Lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa ..........................
45
3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa một số hợp chất
sesquiterpene .................................................................................................
47
3.5.1 Kết quả chuyển hóa longipinene ........................................................ 48
3.5.2 Kết quả chuyển hóa isolongifolene .................................................... 50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




3.5.3 Tinh sạch và nhận dạng sản phẩm chuyển hóa ..................................
51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................55
PHỤ LỤC ......................................................................................................................60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình
1.1


Nội dung

Trang

Cách gọi tên enzyme P450

3

Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome

5

1.2

P450

1.3

Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam

7

1.4

Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450

8

Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase


10

1.5

GeoA trên cụm 2 gene của myxobacterium Sorangium
cellulosum So ce56

1.6

Cấu trúc của nhóm sắt-lưu huỳnh

11

1.7

Cấu trúc nhóm FAD

12

1.8

Một số sesquiterpene phổ biến

13

1.9

Một số Sesquiterpene mạch thẳng

14


1.10

Một số sequiterpene mạch vòng đơn

14

1.11

Một số sesquiterpene đa vòng

15

2.1

Plasmid pET C4AA

20

2.2

Sơ đồ nghiên cứu đề tài

24

3.1

Kết quả điện di sản phẩm PCR colony

34


3.2

Cấu trúc đa gene trên vector pETC4AA

35

Phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng 400-500 nm của dịch

36

3.3

chiết tế bào C43DE3/pETC4AA sau 24 giờ cảm ứng

3.4

Kết quả điện di protein ngoại bào

37

Phân tích khả năng biểu hiện Adx với kháng thể đặc hiệu

38

3.5

bằng kỹ thuật Western blot.
Sắc ký đồ HPLC phân tích kết quả chuyển hóa nootkatone


39

3.6

bằng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA

3.7

Chuyển hóa glycerol bởi tế bào vi sinh vật

43

3.8

Cấu trúc của longipinene và isolongifolene

47

3.9

Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene

49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3.10

3.11

Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene

50

Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a) và cấu

51

trúc dự đoán bởi GCMS (b)
Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa isolongifolene (a) và cấu

3.12

trúc dự đoán bởi GCMS (b)

3.13

Cấu trúc phân tử của 15-hydroxy longipinene

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

52
52




DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng

Nội dung

Trang

2.1

Danh sách thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm

21

2.2

Danh sách các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm

22

Danh sách các dung dịch và đệm chính sử dụng trong thí nghiệm

2.3
2.4

22

Danh sách các môi trường sử dụng trong thí nghiệm

23

2.5


Thành phần phản ứng PCR

26

2.6

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

26

2.7

Thành phần gel co và gel tách

29

2.8

Bố trí thí nghiệm xác định môi trường tối ưu

31

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả

40

3.1

3.2


3.3

3.4
3.5

năng chuyển hóa cơ chất
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào đến khả năng

42

chuyển hóa cơ chất
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng

44

chuyển hóa cơ chất
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng

45

chuyển hóa cơ chất
Kết quả lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

46





MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene phổ biến ở thực vật, có công
thức phân tử là C15H24. Các dẫn xuất oxy hóa của chúng thường có hoạt tính sinh
dược học, tính chất hương liệu hoặc là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất có
giá trị [11]. Tuy nhiên, trong tự nhiên các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene
thường tồn tại với hàm lượng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng. Việt
Nam là một quốc gia có hệ thực vật phong phú và đa dạng nên việc khai thác
nguồn sesquiterpenes từ cây cỏ trong nước có ý nghĩa rất thiết thực.
Để tạo ra những dẫn xuất oxy hóa có giá trị, phản ứng oxy hóa chọn lọc bằng
con đường hóa học thường đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao và
tạo ra nhiều chất thải độc hại ảnh hưởng đến môi trường. Ngược lại, các chất xúc
tác sinh học, đặc biệt là enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) có thể thực hiện
phản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng [47]. Tuy nhiên, để thực hiện chức năng xúc
tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông
qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện
tử, gọi là các redox partner [13]. Để khắc phục điều này, xu hướng nghiên cứu gần
đây về P450 là tạo ra hệ xúc tác tế bào từ vi sinh vật tái tổ hợp mang đồng thời
gene mã hóa P450 và các redox partner của nó. Giải pháp này có lợi thế là có thể
tận dụng nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chức
năng chuyển hóa cơ chất trong môi trường tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏi
quá trình tinh sạch tốn k m.
Trong nghiên cứu trước, CYP264B1 - một enzyme cytochrome P450 có nguồn
gốc từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum Soce56 đã được phát hiện có
khả năng chuyển hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes. Hệ thống vận chuyển điện
tử cho enzyme này cũng đã được xác định, bao gồm NADPH và 2 protein vận
chuyển điện tử là AdR (Adrenodoxin reductase) và Adx (Adrenodoxin). Đặc biệt,
CYP264B1 có khả năng hydroxyl hoá chọn lọc một số hợp chất (nootkatone và / ionone) ở vị trí mà cho đến nay rất khó thực hiện được bởi các quá trình chuyển
1



hóa sinh học khác. Các dẫn xuất này đều có tính chất thú vị hơn so với các chất ban
đầu

2


như tăng hoạt tính kìm hãm sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư (dẫn
xuất của nootkatone), hay có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp
carotenoids (dẫn xuất của / -ionone) [26]. Vì vậy, CYP264B1 có tiềm năng rất
lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene thành các dẫn xuất có đặc
tính sinh học mới.
Nhằm mục đích xây dựng hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp để chuyển hóa
các hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh hóa thực vật Viện Công nghệ sinh học đã thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho
CYP264B1 và 2 redox partner của nó, được điều khiển bởi promoter T7. Trên cơ sở
đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng h
ên h h ng

ch

nh

h

ch

c c
i


c i i

h

n

2. Mục têu của đề tài
- Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống
CYP264B1.
- Ứng dụng hệ xúc tác này để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu sử dụng h xúc tác t

chuy n h

cơ ch t

+ Nhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene bằng kỹ thuật PCR
colony và giải trình tự gene.
+ Kiểm tra khả năng biểu hiện gene bằng phương pháp đo nồng độ
CYP264B1 và kiểm tra khả năng biểu hiện Adx bằng phương pháp western blot.
+ Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone bằng phương pháp HPLC.
+ Tối ưu điều kiện chuyển hóa nootkatone.
- Tách chi t và nhận dạng sản phẩm chuy n hóa
+ Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene và phân tích sản phẩm
chuyển hóa bằng kỹ thuật GCMS.
+ Tinh sạch sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký cột selicagel.
3



+ Nhận dạng cấu trúc sản phẩm bằng kỹ thuật NMR.

4


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cytochrome P450
1.1.1 Định nghĩ v

hân ại

* Định nghĩ
Cytochrome P450 (thường viết tắt là CYP hay P450) thuộc họ enzyme
monooxygenease có nhóm heme - thiolate trong trung tâm hoạt động, hấp thụ
bước sóng cực đại rất điển hình ở 450 nm khi chúng ở trạng thái khử và tạo phức
hợp với CO (cacbon monooxit) [13].
P450 có mặt trong hầu hết các sinh vật, từ eukaryote đến prokaryote, thậm
chí cả ở virus [20]. P450 xúc tác phản ứng oxy hóa khử nhiều loại hợp chất nội sinh
và ngoại sinh. Số lượng P450 cao nhất ở thực vật, ở người có 57 enzyme P450
[13]. E.coli không có enzyme P450 nào.
Tên gọi của các enzyme cytochrome P450 được quy định bởi chữ CYP, theo
sau nó là một số thứ tự Ả Rập chỉ họ gen, tiếp đó là một chữ cái viết hoa chỉ phân
họ và một số Ả Rập chỉ một gen riêng biệt. Ví dụ: CYP106A2, CYP264B1,
CYP260A1.

Hình 1.1. Cách gọi tên enzyme P450

* Phân loại
Hiện nay đã có hơn 11000 P450 khác nhau đã được tách dòng từ động
vật, thực vật, vi nấm, vi khuẩn và những động vật bậc cao khác [33].

5


Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn
điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc
một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner. Do P450 rất đa dạng
trong tự nhiên nên các redox partner của chúng cũng rất phong phú.
Dựa vào các kiểu redox protein tham gia vào chu i vận chuyển điện tử,
Hannemann và cộng sự đã phân loại P450 thành 10 nhóm khác nhau.
- Nhóm 1: bao gồm hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn và ở ty thể của tế
bào nhân chuẩn. Hệ thống thuộc nhóm này gồm 3 protein riêng biệt: một enzyme
reductase (FdR) chứa nhóm ngoại FAD có vai trò chuyển điện tử từ NAD(P)H cho
thành viên thứ 2 là một ferredoxin (Fdx) chứa cụm sắt - lưu huỳnh, đến lượt
ferredoxin lại chuyển điện tử đến enzyme cytochrome P450 để enzyme này
thực hiện chức năng xúc tác.
- Nhóm 2: bao gồm một enzyme cytochrome P450 và một cytochrome P450
reductase (CPR) phụ thuộc NADPH của mạng lưới nội chất. CPR là một enzyme
chứa 2 nhóm ngoại FAD và FMN có vai trò chuyển điện tử từ NADPH tới P450.
- Nhóm 3: mới chỉ tìm thấy duy nhất ở vi khuẩn Citrobacter braakii. Hệ thống
này bao gồm một Flavodoxin (Fldx) chứa nhóm ngoại FMN và một enzyme
cytochrome cytochrome mới là P450cin.
- Nhóm 4: được tìm thấy ở vi khuẩn cổ Sulfolobus solfataricus, bao gồm một
Fdx và một enzyme có tên gọi 2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase.
- Nhóm 5: bao gồm một enzyme reductase phụ thuộc NAD(P)H và một enzyme
cytochrome P450 dung hợp với ferredoxin (Fdx-P450).
- Nhóm 6: bao gồm một enzyme flavoprotein reductase phụ thuộc NAD(P)H và
một protein dung hợp flavodoxin-P450 (Fldx-P450).
- Nhóm 7: bao gồm một enzyme phthalate oxygenase dung hợp với P450
(PFOR-P450).
- Nhóm 8: bao gồm 1 enzyme P450 dung hợp với protein vận chuyển điện tử

tương tự ở tế bào nhân chuẩn là diflavin reductase (CPR-P450).
- Nhóm 9: bao gồm một enzyme nitric oxide reductase (P450nor) sử dụng
NADH làm chất cho điện tử. P450nor xúc tác phản ứng phụ thuộc vào và không
6


phụ thuộc vào các protein vận chuyển điện tử khác.

7


- Nhóm 10: bao gồm các P450 không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện
tử như: allene oxide synthase, fatty acid hydroperoxide lyase, divinyl ether
synthase, prostacyclin synthase và thromboxane synthase [13].

Hình 1.2. Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome P450 ở
microsome (A),mitochondria (B), vi khuẩn (C) và (D).
Trong đó:
CPR: NADPH-P450 reductase
FDR:NAD(P)H-ferredoxin
reductase
ADR: NADPH -

FDX: ferredoxin
ADX: Adrenodoxin
RH: Cơ chất
ROH: Sản phẩm.

adrenodoxin reductase


1.1.2

c củ cytochrome P450
P450 là một họ enzyme gồm nhiều isozyme có khối lượng phân tử khoảng 45-

60 kDa, trong phân tử có chứa một nhân heme ở dạng Fe protoporphyrin IX và
một chu i polypeptide.
Cấu trúc bậc I của P450 cho thấy trình tự amino acid trong phân tử của m i
chu i isozyme thường có thể khác nhau rất nhiều (có trường hợp khác đến 70%),
hơn nữa đoạn amino acid đầu N thường không giống nhau giữa các P450. Sự khác
biệt về trình tự amino acid của các isozyme trong cùng loài dao động từ 30% đến
hơn 95%. M i isozyme được mã hóa bởi một gene riêng biệt và sự khác biệt về
trình tự amino acid trong phân tử là do trình tự của các nucleotide trong gene
mã hóa protein quy định [6].
Đến nay người ta đã biết được 1200 cấu trúc bậc I của P450. Các trình tự
8


amino acid của các P450 cũng như trình tự của các nucleotide mã hóa chúng được

9


lưu trong GenBank. Trung tâm hoạt động của P450 chứa Fe protoporphyrin IX, liên
kết bởi lực hydro kỵ nước. Vị trí thứ 5 của vòng porphyrin liên kết với aminothiol
thường của gốc cysteine. Vị trí thứ 6 gắn với một phân tử nước có khả năng trao
đổi. Mặc dù có sự khác biệt về trình tự amino acid nhưng một số cấu trúc được bảo
toàn ở tất cả các isozyme, ví dụ như gốc cysteine gắn với heme bao giờ cũng ở gần
đầu carboxyl.
Trong số những cytochrome đã được tách chiết, cytochrome P450cam là

enzyme P450 đầu tiên được mô tả cấu trúc bậc I một cách hoàn chỉnh bởi Poulos và
cộng sự [2]. Hình dạng tổng thể của P450cam tương tự như một hình lăng trụ
tam giác với đường kính cực đại khoảng 60 Ǻ.

Hình 1.3. Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam
Vùng liên kết hem được mô tả bằng màu đen.
Một nguyên tử sắt hình cầu ở trung tâm của
heme

Cấu trúc bậc II của P450 cũng đã được nghiên cứu, kết quả cho thấy cả chu i
-helix và phiến β đều tồn tại trong phân tử enzyme này. Sự khác biệt trong cấu
trúc không gian của trung tâm hoạt động của P450 là nguyên nhân cho sự đặc hiệu
cơ chất của các isozyme.
Vào đầu những năm 1990, người ta đã xác định được cấu trúc của một số
enyme cytochrome P450 gồm có P450BM3 (CYP102), P450terp (CYP108), P450eryF
(CYP107) và P450nor (CYP55) [6]. Cho đến nay những chuyên gia nghiên cứu cấu
trúc tinh thể đã xác định được cấu trúc của một số P450 của vi khuẩn.
10


Mặc dù sự tương đồng về trình tự của các enzyme P450 thuộc cùng một phân

11


họ chỉ dưới 20%, nhưng các enzyme này lại có sự tương đồng lớn về phương thức
cuộn xoắn và hình học. Nhìn chung, có khoảng 13 chu i xoắn

và 4 phiến β trong


một phân tử protein P450. Cấu trúc trung tâm bảo thủ của P450 được tạo nên bởi
1 bó gồm 4 chu i xoắn xung quanh nhân heme (3 chu i xoắn song song là D, L, Ihelix và một chu i xoắn ngược là E-helix). Nhóm heme định vị giữa chu i I-helix xa
và một chu i L-helix gần và liên kết với phân tử cystein liền kề tạo thành một vùng
khoanh chứa đoạn trình tự amino acid bảo thủ của P450 là FxxGx(H/R)xCxG. Phân
tử cystein liền kề là tuyệt đối bảo thủ và nằm trên liên kết “thứ năm” của nguyên
tử sắt. Đặc biệt, phân tử cysterin tạo thành 2 liên kết hydrogen với các bộ nhóm
amide gần kề [9]. Chu i xoắn dài I-helix tạo thành 1 bức tường giữa khoang chứa
nhóm hem và trình tự amino acid tín hiệu (A/G)-Gx(E/D)T tập trung ở giữa các
chu i xoắn. Chu i xoắn I-helix cũng chứa phân tử threonine có tính bảo thủ cao
định vị ở trung tâm hoạt động và được tin rằng có tham gia vào quá trình xúc tác
[13], [29], [17]. Dựa vào trình tự amino acid của các thành viên của nhóm CYP2 và
P450cam, Gotoh và cộng sự đã cho rằng có 6 vùng tham gia vào việc nhận biết cơ
chất. Các vùng protein này được xem là rất linh hoạt và chuyển động theo sự liên
kết với cơ chất trước khi sẵn sàng cho phản ứng xúc tác [36], [9].

Hình 1.4. Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450
Trong đó: nguyên tử sắt (III) protoporphyrin-IX
liên kết với một phối tử cysteine ở gần

12