BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------

NGUYỄN THỊ THỦ

QUAN HỆ HỌ HÀNG CỦA HAI LOÀI GIUN ĐẤT
Pheretima modigliani (Rosa, 1889)
VÀ Pheretima rodericensis (Grube, 1879)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Huế, 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------

NGUYỄN THỊ THỦ

QUAN HỆ HỌ HÀNG CỦA HAI LOÀI GIUN ĐẤT
Pheretima modigliani (Rosa, 1889)
VÀ Pheretima rodericensis (Grube, 1879)
Chuyên ngành: Động vật học
Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. NGUYỄN VĂN THUẬN
2. PGS.TS. TRẦN QUỐC DUNG

Huế, 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu,
kết quả trong luận văn là trung thực, khách quan và nghiêm túc. Những tài tham
khảo cho luận văn có nguồn gốc rõ ràng.
Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Học viên

Nguyễn Thị Thủ


Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành
luận văn, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô
giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm,
Đại học Huế đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức cho
chúng tôi. Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận
văn này.
Đặc biệt, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân
thành và lời cảm ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS. TS
Nguyễn Văn Thuận và thầy giáo PGS. TS Trần Quốc
Dung đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi
điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện luận văn
này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo ở
Phòng thí nghiệm Di truyền-Vi sinh và Phòng thí
nghiệm Động vật học đã giúp đỡ và chỉ dẫn nhiệt
tình trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Hoàng Tấn
Quảng và các anh chị công tác tại Bộ môn sinh học
Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế
cùng toàn bộ cán bộ của Viện đã giúp đỡ và chỉ
dẫn nhiệt tình trong quá trình nghiên cứu hoàn
thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến những người thân trong gia đình, bạn bè luôn
quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận
văn này.


Huế, tháng 10 năm 2017
Học viên
Nguyễn Thị Thủ


MỤC LỤC

MỤC LỤC....................................................................................................1
DANH MỤC CÁC TỪ VIÊT TẮT............................................................3
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................3
DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................5
MỞ ĐẦU......................................................................................................6
1. Lý do chọn đề tài.......................................................................................6

2. Mục tiêu nghiên cứu..................................................................................7
3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................7
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................8
1.1. Tình hình nghiên cứu giun đất............................................................8
1.1.1. Về đa dạng và phân bố..................................................................8
1.1.2. Về phân loại................................................................................10
1.1.3. Về nhân nuôi...............................................................................11
1.1.4. Về di truyền.................................................................................12
1.2. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền và ứng dụng.........16
1.2.1. Các phương pháp........................................................................16
1.2.1.1. Kỹ thuật đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD)...................16
1.2.1.2. Kỹ thuật đa hình chiều dài cắt đoạn giới hạn (RFLP)............................17
1.2.1.3. Kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP)............................18
1.2.1.4. Kỹ thuật SSR..........................................................................................18

1.2.2. Ứng dụng.....................................................................................19
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........22
2.1. Vật liệu nghiên cứu...........................................................................22
2.2. Hóa chất và thiết bị...........................................................................23
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................24
2.3.1. Phương pháp thu thập mẫu.........................................................24
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu..............................................................24
2.3.2.1. Mẫu nghiên cứu đặc điểm hình thái........................................................24
2.3.2.2. Mẫu nghiên cứu đặc điểm di truyền.......................................................24

1


2.3.3. Phương pháp nghiên cứu mối quan hệ họ hàng dựa vào đặc điểm
hình thái.................................................................................................24

2.3.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số.........................................26
2.3.5. Phương pháp PCR.......................................................................27
2.3.6. Điện di DNA trên agarose gel.....................................................27
2.3.7. Phân tích kết quả RAPD bằng phần mềm TEPGA (Tool for
Populator Genetic Analysis) version 1.3 của Mark P.Miller.................28
2.3.8. Xây dựng giản đồ phả hệ bằng phần mềm NTSYS version 2.1. 28
2.3.9. Xử lý số liệu................................................................................28
CHƯƠNG III: KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................28
3.1. Mối quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Ph. modigliani (Rosa,
1889) và Ph. rodericensis (Grube, 1879) dựa vào các đặc điểm hình thái
.................................................................................................................28
3.2. Mối quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Ph. modigliani (Rosa,
1889) và Ph. rodericensis (Grube, 1879) dựa vào chỉ thị phân tử RADP32
3.2.1. DNA tổng số................................................................................32
3.2.2. Kết quả thực hiện PCR-RAPD....................................................33
3.2.2.1. Kết quả RAPD với primer OPA-03........................................................33
3.2.2.2. Kết quả RAPD với primer OPA-04........................................................33
3.2.2.3. Kết quả RAPD với primer OPB-01........................................................36
3.2.2.4. Kết quả RAPD với primer OPB-18........................................................36
3.2.2.5. Kết quả RAPD với primer OPF-04.........................................................39
3.2.2.6. Kết quả RAPD với primer OPG-17........................................................39
3.2.2.7. Kết quả RAPD với primer OPD-11........................................................42
3.2.2.8. Kết quả RAPD với primer OPN-06........................................................42

3.2.3. Hệ số tương đồng di truyền và giản đồ phả hệ của các cá thể giun
đất nghiên cứu.......................................................................................45
KÊT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ...................................................................48
1. Kết luận...................................................................................................48
2. Kiến nghị.................................................................................................48
2



TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................49
PHỤ LỤC...................................................................................................55
DANH MỤC CÁC TỪ VIÊT TẮT
AFLP

Amplified fragment length polymorphism

bp
DNA
EDTA
M
NTSYSpc
PCI
PCR
PPB
PBS
RAPD

(Đa hình độ dài các đoạn khuếch đại)
Base pair (cặp base nitơ)
Deoxyribonucleic acid
Ethylenediamine tetraacetic acid
DNA size marker (thang chuẩn kích thước của DNA)
Numerical Taxonomy System for personal computer
Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol
Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Percentage of polymorphic band (Tỷ lệ các băng đa hình)
Phosphate buffered saline

Random amplified polymorphic DNA

RFLP

(Đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên)
Restriction fragment length polymorphism

SDS
SSR
TAE

(Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế)
Sodium dodecylsulfate
Simple sequence repeat (Sự lặp lại các trình tự đơn giản)
Tris base: Acetic acid: EDTA

DANH MỤC CÁC BẢNG

3


Bảng 2.1. Các mẫu giun đất Ph. modigliani và Ph. rodericensis..........22
sử dụng trong nghiên cứu........................................................................22
Bảng 2.2. Trình tự của các primer ngẫu nhiên sử dụng trong nghiên cứu
.....................................................................................................................22
Bảng 2.3. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu.............23
Bảng 2.4. Những thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu.....................23
Bảng 3.1. Các đặc điểm hình thái và đặc tính được sử dụng để xác định
mối quan hệ họ hàng của hai loài Ph. modigliani và Ph. rodericensis. 30
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng di truyền (Jaccard’s) của hai loài giun đất31

Ph. modigliani và Ph. rodericensis dựa vào các đặc điểm hình thái.....31
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền (Jaccard’s) của các mẫu giun đất45
dựa vào chỉ thị phân tử RADP.................................................................45

4


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Các địa điểm thu mẫu giun đất...............................................25
Hình 3.1. Giản đồ phả hệ của hai loài giun đất nghiên cứu được xây dựng
bằng phương pháp UPGMA dựa vào các đặc điểm hình thái..............31
Hình 3.2. DNA tổng số của một số cá thể giun đất.................................32
Hình 3.3. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer OPA-03................34
Hình 3.4. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer OPA-04................35
Hình 3.5. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer OPB-01................37
Hình 3.6. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer OPB-18................38
Hình 3.7. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer OPF-04................40
Hình 3.8. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer OPG-17...............41
Hình 3.9. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer OPD-11................43
Hình 3.10. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer OPN-06..............44
Hình 3.11. Giản đồ phả hệ của giun đất nghiên cứu được xây dựng....46
bằng phương pháp UPGMA dựa vào chỉ thị phân tử RAPD................46

5


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Giun đất là một đại diện của lớp giun ít tơ (Oligochaeta) sống trên cạn thuộc

bộ Lumbriculida, ngành Giun đốt (Annelida). Giun đất là một trong những nhóm
động vật đất có ý nghĩa quan trọng cả về mặt lý luận và thực tiễn.
Giun đất giữ vai trò quan trọng quyết định tính chất vật lý, hóa học, sinh học
của đất. Giun đào hang sẽ làm tăng độ thông thoáng, tơi xốp và khả năng thấm nước
cho đất. Chúng ăn rác thải hữu cơ và phân của chúng chứa những chất dinh dưỡng
cần thiết cho cây.
Giun đất cũng là nhóm thức ăn giàu đạm thích hợp cho cá, gia cầm và gia
súc. Trong y học dân gian Việt Nam, giun đất được sử dụng để chữa một số bệnh
như: đậu mùa, sốt rét, hen suyễn, động kinh, vàng da, sỏi bàng quang... Ngoài ra,
giun đất còn là sinh vật chỉ thị cho mức độ thay đổi nguồn gốc của các vùng đất
cũng như mức độ ô nhiễm của đất [1].
Cho đến nay, việc nghiên cứu giun đất ở Việt Nam phần lớn chỉ tập trung vào
các vấn đề về đặc điểm sinh học, hình thái, sinh sản, sinh thái học, phân loại dựa
vào các đặc điểm trên, ít thấy tài liệu đề cập đến các nghiên cứu về giun đất bằng
các kỹ thuật sinh học phân tử.
Trong một số loài thuộc giống Pheretima có một số cặp loài có các đặc điểm
hình thái gần nhau, nhưng sai khác rõ rệt ở vị trí của lỗ nhận tinh phía lưng hoặc
phía bụng. Trong số đó thì có loài Pheretima modigliani (Rosa, 1889) và Pheretima
rodericensis (Grube, 1879) là cặp loài giun đất có các đặc điểm hình thái (nhú phụ
sinh dục ở vùng nhận tinh, kiểu môi, số lượng túi nhận tinh, đặc điểm của manh
tràng) giống nhau nhưng sai khác ở màu sắc của cơ thể và vị trí của lỗ nhận tinh
[Ph. modigliani (Rosa, 1889) lỗ nhận tinh ở phía bụng còn Ph. rodericensis (Grube,
1879) lỗ nhận tinh ở phía lưng]. Dựa trên đặc điểm hình thái, cặp loài này vẫn được
coi là cặp loài gần gũi, nhưng liệu nhận xét này có phù hợp với bản chất di truyền
hay không?
Để làm sáng tỏ mối quan hệ cũng như làm cơ sở khoa học cho việc khai thác,
bảo tồn các loài giun đất nói chung và hai loài Ph. modigliani và Ph. rodericensis
6



nói riêng, chúng tôi chọn đề tài: “Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất
Pheretima modigliani (Rosa, 1889) và Pheretima rodericensis (Grube, 1879)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định mối quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Ph. modigliani (Rosa,
1889) và Ph. rodericensis (Grube, 1879).
3. Nội dung nghiên cứu
Mối quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Ph. modigliani (Rosa, 1889) và
Ph. rodericensis (Grube, 1879) dựa vào các đặc điểm hình thái.
Mối quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Ph. modigliani (Rosa, 1889) và
Ph. rodericensis (Grube, 1879) dựa vào chỉ thị phân tử RADP.

7


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu giun đất
1.1.1. Về đa dạng và phân bố
Các công trình nghiên cứu về đa dạng, khu hệ giun đất đã được thực hiện ở
nhiều quốc gia và lãnh thổ trên toàn thế giới một cách rộng rãi.
Khu hệ giun đất được nhiều tác giả quan tâm và nghiên cứu hoàn chỉnh nhất
là khu hệ ở châu Âu và Bắc Mỹ, tiếp đến là khu hệ giun đất châu Úc, khu hệ giun
đất châu Á cũng được nhiều tác giả chú ý, đặc biệt là các khu hệ ở Đông Nam Á
nhưng ở châu Phi các dẫn liệu về giun đất còn ít được biết đến [34].
Ở các nước phụ cận Việt Nam, việc nghiên cứu giun đất đã được chú ý từ
lâu. Theo nghiên cứu của Samphon về khu hệ giun đất ở Lào đã thống kê được
68 loài, thuộc 8 giống, 7 họ, trong đó Pheretima là giống có số loài phong phú
nhất [23].
Về khu hệ giun đất Campuchia đã có các dẫn liệu ở các điểm xung quanh
thành phố Phnôm Pênh và một số thị trấn ở đồng bằng Campuchia. Kết quả nghiên
cứu đã giới thiệu 14 loài trong 5 giống [3].

Vào năm 1938 có các công trình nghiên cứu của Chen ở Trung Quốc đã
thống kê các loài giun đất ở Quảng Đông và đảo Hải Nam [38].
Về khu hệ giun đất ở Myanma có công trình của Gates (1972), tác giả đã
thông kê được 241 loài, thuộc 36 giống, 9 họ [41].
Khu hệ giun đất trên các đảo ở khu vực Đông Nam Á cũng không kém phần
phong phú và đa dạng, với 215 loài được phát hiện ở Indonesia, 94 loài ở Malaysia,
19 loài ở Singapore và khoảng 48 loài được tìm thấy ở Philippin [55], [57].
Các dẫn liệu đầu tiên về nghiên cứu giun đất ở Việt Nam được đề cập trong
công trình nghiên cứu giun đất ở Đông Dương của Perrier (1872), tác giả đã công
bố 1 loài mới là Perionyx excavatus trong mẫu thu ở Sài Gòn [52]. Đến năm 1875,
ông bổ sung thêm 3 loài giun đất cho đồng bằng sông Cửu Long, trong đó có 1 loài
mới là Ph. juliani và 2 loài lần đầu gặp ở Việt Nam là Ph. postkuma và Ph.
houlleti.
Năm 1934, Michaelsen đã cung cấp một danh sách gồm 16 loài giun đất,
8


trừ Ph. tonkinensis thu được ở Phú Thọ (miền Bắc) còn lại là ở miền Nam [27].
Trong khoảng thời gian từ 1965 đến năm 1975, do chiến tranh việc nghiên cứu
giun đất ở Việt Nam tạm thời bị gián đoạn. Trong giai đoạn này, các nhà nghiên cứu
chỉ tập trung được dẫn liệu về hình thái và sinh thái học của một vài loài giun đất phổ
biến để phục vụ cho công tác biên soạn giáo trình Động vật không xương sống [1].
Từ năm 1979, việc nghiên cứu giun đất ở Việt Nam mới được tiến hành rộng
rãi và có hệ thống nhằm phục vụ cho nhu cầu điều tra cơ bản sinh vật Bắc Việt
Nam, các dẫn liệu về thành phần loài, phân bố và địa lý động vật của giun đất được
tổng kết trong luận án tiến sĩ khoa học “Giun đất Việt Nam - Hệ thống học, khu hệ,
phân bố và địa lý động vật” của Thái Trần Bái (1983). Trong nghiên cứu này, tác
giả đã công bố được 109 loài và phân loài, thuộc 6 họ và 17 giống cho khu hệ giun
đất Việt Nam, trong số đó có 39 loài và phân loài mới cho khoa học. Ngoài ra, công
trình này còn đề cập về hệ thống phân loại học của nhóm loài Pheretima, những quy

luật tiến hóa của một số hệ cơ quan (giải phẫu so sánh hệ cơ, hệ tiêu hóa, tiến hóa
của bộ túi nhận tinh, tiến hóa của cơ quan vận chuyển của giống Pheretima).
Dựa vào thành phần loài, Thái Trần Bái đã có những nhận định về tính chất
địa động vật học của khu hệ giun đất Việt Nam, phát hiện các đặc điểm phân bố
theo các vùng cảnh quan và vùng địa lý. Giun đất nước ta phong phú các loài thuộc
giống Pheretima. Sự phân bố của các loài giun đất giữa các vùng cảnh quan sai
khác có quy luật. Vùng núi phong phú nhất về số loài trong tất cả 3 nhóm hình thái sinh thái. Số loài phát sinh ở vùng núi chiếm tỷ lệ cao nhất, số loài ở vùng đồi ít
hơn, còn vùng đồng bằng có số loài nghèo nhất.
Từ sau công trình nghiên cứu của Thái Trần Bái, đã có nhiều công trình khác
tiến hành điều tra khu hệ giun đất các tỉnh ở nước ta, mở đầu là công trình nghiên cứu
của Trần Thúy Mùi (1985) về khu hệ giun đất vùng đồng bằng sông Hồng [19]; tiếp
đến là công trình nghiên cứu khu hệ giun đất miền Tây Bắc của Đỗ Văn Nhượng
(1994) [21]; khu hệ giun đất Bình Trị Thiên của Nguyễn Văn Thuận (1994) [27]; khu
hệ giun đất Quảng Nam - Đà Nẵng của Phạm Thị Hồng Hà (1995) [10]; khu hệ giun
đất miền Đông Bắc của Lê Văn Triển (1995) [30]; khu hệ giun đất phía Nam miền
Trung của Huỳnh Thị Kim Hối (2005) [12]; nghiên cứu thành phần loài, phân bố và
định hướng ứng dụng của giun đất ở một số tỉnh duyên hải phía Nam miền Trung
(Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên) của Nguyễn Văn Thuận (2010) [28]; khu hệ giun
9


đất ở đồng bằng sông Cửu Long của Nguyễn Thanh Tùng (2013) [31].
1.1.2. Về phân loại
Có rất nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu về hệ thống phân loại giun đất
cũng có thể nói đây là một vấn đề phức tạp và còn nhiều tranh cãi.
Nghiên cứu đầu tiên của Michaelsen (1900) đã cung cấp một hệ thống phân
loại dựa trên cơ sở của phân loại học hiện đại cho nhóm loài giun đất. Ông đã xếp
1.200 loài giun đất thành 11 họ, 152 giống [50]. Đến năm 1921, Michaelsen đã xây
dựng lại hệ thống phân loại của giun đất với 21 họ.
Đối với hệ thống phân loại của Michaelsen thì Stephenson (1930) đã đơn

giản hóa chỉ còn lại 14 họ khác nhau [58].
Trong đó, họ Megascolidae là bị tranh cãi nhiều nhất. Có nhiều quan điểm
khác nhau của các tác giả hình thành các hệ thống phân loại học khác nhau. Theo
Omodeo (1958) căn cứ vào vị trí và số lượng của tuyến canxi làm cơ sở để tách ra
thêm một họ mới từ họ này. Còn Lee (1959) cho rằng đặc điểm để phân chia là vị
trí, số lượng của lỗ đực và vị trí của vi thận. Đối với Gates (1959) dựa vào cấu trúc
của tuyến tiền liệt, hệ bài tiết và vị trí của tuyến canxi là những đặc điểm quan trọng
để phân chia Megascolidae thành 4 họ Acanthodrilidae, Megascolecidae,
Octochaetidae và Ocnerodrilidae [40], [46], [51].
Đối với các họ thuộc lớp Oligochaeta sự xác định chủng loại phát sinh và
mối quan hệ phân loại học của các taxon bậc cao đã được thực hiện bằng phương
pháp Cladistics, dựa trên 68 tính trạng của 50 đại diện trong nghiên cứu của
Jamieson (1988). Kết quả đã chia nhóm giun đất thành 4 liên họ: Ocnerodriloidea,
Eudriloidea, Lumbricoidea và Megascolecoidea [43].
Năm 1993, hệ thống phân loại giun đất mới nhất đã được Reynolds và Cook
công bố. Hệ thống này chia giun đất thành 2 bộ: Moniligastrida và Haplotaxida. Bộ
Moniligastrida gồm 1 họ Moniligastridae. Bộ Haplotaxida được chia thành 2 phân bộ
(Enchytraeina và Lumbricina), 10 liên họ (Enchytraeoidea, Alluroidoidea,
Criodriloidea, Lumbricoidea, Sparganophiloidea, Biwadriloidea, Glossoscolecoidea,
Almoidea, Megascolecoidea, Ocnerodriloidea) và 22 họ (Enchytraeidae, Propappidae,
Alluroididae,

Criodrilidae,

Lumbricidae,

Komarekionidae,

Diporochaetidae,


Ailoscolecidae, Hormogasuidae, Lobatocerebridae, Sparganophilidae, Biwadrilidae,

10


Glossoscolecidae, Kynotidae, Microchaetidae, Almidae, Lutodrilidae, Megascolecidae,
Acanthodrilidae, Octochaetidae, Eudrilidae, Ocnerodrilidae) [53].
Về tình hình nghiên cứu phân loại học của nhóm loài Pheretima có các công
trình nghiên cứu như sau: Năm 1867, Kinberg đã xếp các loài thành 4 giống:
Amynthas, Nitocris, Rhodopis và Pheretima [45]. Sau đó, có nhiều tranh luận về sự
sai khác giữa các loài để xếp chúng vào giống này hay giống khác của nhiều tác giả:
Baird (1869), Vaillant (1870), Beddard (1883),...
Năm 1972, Sims và Easton sử dụng 56 tính trạng của 114 loài giun đất, ở các
holotyp, paratyp và syntyp để xác định mối quan hệ của các loài giun đất thuộc
giống Pheretima Kinberg, 1867. Hệ thống phân loại cho nhóm loài Pheretima
(Kinberg sensu Michaelsen, 1934) được xây dựng lại dựa vào tiêu chí có manh
tràng hay không có manh tràng của các taxon bậc giống và phân giống [56].
Đến năm 1979, Easton phân tích mối quan hệ của 78 loài giun đất thuộc
nhóm Pheretima không có manh tràng nhưng chỉ với 29 đặc điểm hình thái. Kết
quả, giữ nguyên các giống Archipheretima và Planapheretima, thay đổi phạm vi của
các giống Polypheretima và Metapheretima, chuyển các loài thuộc giống Ephemitra
vào giống Metapheretima, thiết lập thêm giống Pleionogaster [39].
Sau công trình nghiên cứu về hệ thống phân loại Sims & Easton (1972) và
Easton (1979) ra đời có nhiều ý kiến cho rằng đặc điểm phân chia của các giống
thật sự có cơ sở hay chưa. Đặc biệt, ở các giống của nhóm có manh tràng. Cho đến
nay, có nhiều quan điểm khác nhau về phân loại học của nhóm loài Pheretima, có
thể tạm chia thành 2 nhóm tác giả. Nhóm 1: đi theo hệ thống phân loại Sims &
Easton (1972) gồm phần lớn các tác giả như: Lee (1981), Blakemore (2002), James
(2004), Shen và Yeo (2005),... Tuy sử dụng nhưng nhiều tác giả trong nhóm này vẫn
cho rằng hệ thống trên còn nhiều điểm bất ổn, nhất là đặc điểm buồng giao phối.

Nhóm 2: chỉ chấp nhận một phần hệ thống trên như: Ishizuka (1999), Nakamura
(1999), Thái Trần Bái (1983),... vì cho rằng sử dụng đặc điểm buồng giao phối để
phân chia các taxon bậc giống là thiếu cơ sở do chúng không đặc trưng cho nhóm
chủng loại Pheretima nào và có nhiều biến đổi [1].
1.1.3. Về nhân nuôi
Giun đất là nhóm có giá trị thực tiễn cao, từ lâu đã có các nghiên cứu gây nuôi
11


giun đất nhằm cung cấp nguồn đạm cho chăn nuôi. Về hướng nghiên cứu này, năm
1984 Nguyễn Thị Minh Hòa đã nghiên cứu việc thử nghiệm quy trình nuôi giun đất ở
Hà Nội [11]. Trên cơ sở nghiên cứu thăm dò kết hợp với công tác điều tra cơ bản,
Thái Trần Bái đã đề xuất các loài giun đất có triển vọng nuôi ở nước ta là Perionyx
excavatus, Pontoscolex corethrurus, Pheretima posthuma và Ph. morrisi [2].
Một số loài giun đất phổ biến được nuôi hiện nay như: Perionyx excavatus,
Eisenia festida, Eisenia andrei, Ph. asiatica,... [2]. Ở Việt Nam, cũng có nhiều tác
giả quan tâm nghiên cứu giun quế (Perionyx excavatus) để làm thức ăn cho chăn
nuôi như Đặng Vũ Bình và cộng sự đã đánh giá khả năng tăng trưởng của giun quế
(Perionyx excavatus) trên các nguồn thức ăn khác nhau [6], Phan Thị Bích Trâm và
cộng sự đã nghiên cứu sử dụng bột đạm từ trùn quế (Perionyx excavatus) làm thức
ăn cho hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) [29],... Hiện nay, giun quế được
nuôi khá phổ biến ở Việt Nam với những quy mô khác nhau và có nhiều sản phẩm
(giun khô, bột giun, giun đông lạnh, dịch giun, phân giun,...) bán trên thị trường
nước ta và xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới.
Gần đây có một số công trình nghiên cứu quy trình gây nuôi các loài giun đất gặp
phổ biển ở một số vùng như: Pheretima aspergillum Perier, 1872 của Hồ Đắc Khánh
Ngọc [20] và Pheretima rodericensis (Grube, 1879) của Nguyễn Thị Ý Thơ [26].
Bên cạnh nuôi giun đất làm nguồn thức ăn giàu đạm cho vật nuôi, giun đất
còn được nghiên cứu gây nuôi để góp phần cải tạo đất và xử lý rác thải. Một số
nghiên cứu gần cho thấy, Lampito mauritii ngoài việc cung cấp thêm dinh dưỡng,

loài này còn có khả năng làm giảm một số kim loại nặng như chì và kẽm trong đất
[48]. Ngoài ra, nhiều loài giun đất cũng được sử dụng như là một yếu tố để chỉ thị
cho tình trạng suy thoái của môi trường [13].
1.1.4. Về di truyền
Gần đây, với sự phát triển của các phương pháp giải trình tự và phân tích
DNA đã có tác động lớn đến việc nghiên cứu mối quan hệ phân loại học ở các loài
sinh vật nói chung cũng như các loài giun đất nói riêng. Nhiều gene được khai thác,
trong đó một số có trình tự bảo tồn cao phù hợp cho việc phân tích các mối quan hệ
phân loại học ở mức độ cao trong khi một số gene khác tiến hóa ở mức độ nhanh
hơn cho phép phát hiện sự khác biệt và tương đồng giữa các cá thể trong những đơn
12


vị phân loại gần gũi và trong cùng một loài.
Qua tổng kết một vài nghiên cứu gần đây trên đối tượng giun đất của Chang
và Chen (2005), Chang (2008), Cameron (2008),… cho thấy hầu hết tập trung giải
trình tự đoạn gen cytochrome C oxidase có kích thước khoảng 648 bp trên tiểu đơn
vị I của ti thể [35], [36], [37].
Năm 2009, Meenatchi đã sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để phân tích các biến
thể di truyền trong sáu nòi Eudrilus eugeniae (Kinberg) thu thập từ sáu địa điểm ở
ba tiểu bang miền Nam Ấn Độ với 20 primer ngẫu nhiên (OPA 1, OPA 2, OPA 3,
OPA 4, OPA 5, OPA 6, OPA 7, OPA 8, OPA 9, OPA 10, OPA 11, L 14, M 3, DH 2, G
9, G 10, G 11, H 1, H 8, H 11). Kết quả nghiên cứu cho thấy ở vùng địa lý khác
nhau các đặc tính phân tử có sự biến thiên. Hệ số tương đồng E. eugeniae dao động
từ 0,54 đến 0,90. Chỉ số tương đồng di truyền cao nhất 1,0 giữa các chủng Dharwad
và Bijapur (Karnataka) tiếp theo là 0,90 giữa Nagpur (Maharastra) và Bijapur
(Karnataka). Sự tương đồng di truyền thấp nhất được ghi nhận giữa các chủng
Nagpur và Bangalore, các chủng Nagpur và Coimbatore có giá trị giống nhau về di
truyền là 0,40 [49].
Sharma (2011) đã mô tả những đặc điểm hình thái, phân tử của 24 cá thể

giun đất thu thập từ bảy địa điểm của Himachal Pradesh và ba địa điểm của Delhi
để đánh giá mức độ biến đổi di truyền. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dựa trên các
đặc điểm hình thái quan trọng thì tất cả các cá thể thu được phân thành hai loài giun
đất, đó là Eisenia fetida và Eudrilus eugeniae. Trong nghiên cứu này còn kết hợp
phân tích sự đa dạng di truyền đã được thực hiện bằng ba phương pháp đánh giá
DNA như RAPD, ISSR, và URP để xác định mối quan hệ di truyền giữa 24 cá thể
giun đất [54].
Vào năm 2013, để xác định mức biến dị di truyền và đa hình ở hai loài giun
đất đặc hữu Perionyx excavates và Perionyx ceylanensis đã được Biruntha xác định
bằng kỹ thuật RAPD. Kết quả nghiên cứu cho thấy loài P. ceylanensis đã được mô
tả về đặc tính phân tử khi nuôi cấy trong các chất nền khác nhau, trong đó DNA
không cho thấy bất kỳ thay đổi mô tả nào trong các dải băng thu được. Trọng lượng
phân tử của băng đã được tìm thấy là 13.400 bp trong tất cả các chất nền. RNA cho
thấy một số thay đổi trong các dải, trọng lượng phân tử đã được tìm thấy là 2190 bp,
13


2260 bp, 2275 bp và 2210 bp. Phân tích RADP đối với P. excavates được thu thập
từ bốn địa điểm khác nhau thì giun đất thu được ở núi Sirumalai và Dindigul (S2 &
S3) có sự giống nhau về mặt phân loại hơn so với các mẫu thu thập được từ
Vadipatti (S4) [32].
Cùng năm 2013, Biradar nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các loài giun
đất thuộc 5 họ Pontoscolex corethrurus (Glossoscolecidae); Drawida spp.
(Moniligastridae); Chaetocotoides sp., Dichogaster affinis, Lennogaster sp.
(Octochaetidae); Euginae eudrillus (Eudrillidae) và Megascolex conkanensis
(Megascolecidae) từ các địa điểm khác nhau ở phía Tây Karnataka (Ấn Độ) bằng
kỹ thuật phân tử RAPD. Nghiên cứu này đã sử dụng 20 primer khác nhau để tạo ra
263 dãy băng có tính đa hình trong tự nhiên với trung bình 13,5 amplicon trên mỗi
primer. Số amplicon tối thiểu nằm trong phạm vi từ 5 đến 19 được quan sát thấy
bằng primer L11 và số lượng tối đa các dải có primer AC-13. Hệ số tương đồng dao

động từ 0,11 đến 0,69. Kết quả cho thấy các dấu hiệu RAPD rất tốt cho phân tích đa
dạng của giun đất [33].
Ở Việt Nam, cho đến nay mới chỉ có ba nghiên cứu mối quan hệ phân loại
học bằng phương pháp sinh học phân tử trên đối tượng giun đất. Thái Trần Bái và
cộng sự (1996) đã sử dụng phương pháp điện di esterase isozyme để nghiên cứu 4 loài
Ph. peosthuma, Ph. modiglianii, Ph. rodericensis và Ph. morrisi. Phân tích các kết quả
thu được khi điện di EST của 4 loài Pheretima thì Ph. morrisi có tới 3 locut kiểm soát
còn Ph. posthuma, Ph. modiglianii và Ph. rodericensis có hệ thống emzym chỉ 2 locut
kiểm soát.
Ph. modigliani đặc trưng bởi locut Est-1 với 2 alen chuyển động nhanh
(Rf:l,14 và 1,11) có tổng tần số là 0,722 và không có các cấu tử chuyển động chậm
từ 0,51 đến 0,79 (không có locut Est-3).
Ph. posthuma đặc trưng bởi locut Est-3 với hai alen chuyển động chậm
(Rf:0,51 và 0,61). Loài này phân biệt với Ph. morrisi và Ph. modigliani bởi không
có các cấu tử Rf từ 0,80 đến 0,98 (Ph. posthuma không có locut Est-2). Giữa Ph.
posthuma và Ph. rodericensis có nhiều cấu tử Rf xấp xỉ bằng nhau, song chúng
phân biệt với nhau bởi Ph. rodericensis có các cấu tử chuyển động nhanh (Rf:l,05
và 1,10) với tổng tần số là 0,92 ở locut Est-1. Ở locut Est-3 Ph. rodericensis có các

14


cấu tử 0,79 và 0,71 với tổng tần số là 0,944. Mặc dù 2 loài này có cấu tử Rf:l,00
chung nhưng xác suất trùng nhau giữa 2 loài ở cấu tử này là rất thấp (0,03532).
Ph. morrisi và Ph. rodericensis có nhiều cấu tử có Rf giống nhau song Ph.
morrisi có các cấu tử Rf:0,88; 0,93 và 0,98 (locut Est-2) mà Ph. rodericensis không có.
Năm 2006, Trần Thị Thanh Bình và Đặng Tất Thế đã phân tích dẫn liệu
DNA của 2 loài Ph. aspergillum và Ph. robusta. Kết quả phân tích tiến hóa trình tự
gen ty thể COI của hai loài giun đất này cho thấy giữa chúng có khoảng cách di
truyền khá lớn (13,1% - 15,0%) và có sự phân hóa rõ ràng. Giữa các trình tự thuộc

loài Ph. aspergillum có sự khác biệt di truyền khá cao, với khoảng cách di truyền
đạt tới 9,8%, nhưng sự khác biệt di truyền giữa các trình tự thuộc loài Ph. robusta
lại rất thấp dưới 0,8%. Mẫu vật mã hiệu A4 có sự khác biệt di truyền lớn so với các
mẫu vật thuộc 2 loài Ph. aspergillum và Ph. robusta với với khoảng cách di truyền
từ 15,6 - 18,0% thể hiện chúng là một loài riêng biệt [5].
Năm 2012, Nguyễn Thanh Tùng đánh giá độ đa dạng sinh học của các loài
giun đất thuộc nhóm Pheretima tại đồng bằng sông Cửu Long (Amynthas
paraalexandri, A. juliani, Metaphire posthuma, M. bahli, M. peguana, M. houlleti,
Metaphire sp.8, Polypheretima elongata và P. taprobanae) trên ba phương pháp:
phân tích hình thái, điện di protêin SDS-PAGE và giải trình tự mã vạch DNA
Barcode. Đối với phân tích hình thái học dựa trên các đặc điểm hình thái quan trọng
của các giun đất được các tác giả mô tả như Thái Trần Bái (1986), Easton (1979),
Ishizuka (1999), Sims và Easton (1972). Kết quả cho thấy, mối quan hệ được xác
định trên cơ sở hình thái giữa các loài giữa M. houlleti và Metaphire sp.8 với tỷ lệ
7,14% thấp hơn 42,86% giữa P. elongata và Metaphire sp.8, giữa P. taprobanae và
Metaphire sp.8. Đối với phân tích điện di protein SDS-PAGE thì khoảng cách trung
bình là 36,66% (SD=14,53%), cao hơn 8,86% so với tính toán hình thái học
(SD=8,98). Khoảng cách này dao động từ 92,68% (100% - 7,32%) giữa M.
posthuma và A. juliani đến mức thấp nhất là 38,89% (100% - 61.11%) giữa M.
houlleti và M. bahli. Mối quan hệ giữa các loài dựa trên dữ liệu mã vạch DNA trung
bình là 16,99%, thấp nhất là 14, 32 % giữa P. elongata và P. taprobanae, cao nhất là
19,79% giữa M. bahli và A. paraalexandri. Cả 3 phương pháp đều cho kết quả
tương thích, chính xác để giải thích mối quan hệ giữa các loài trong nhóm loài gần
gũi và giữa tác taxon bậc cao (họ, giống). Mối quan hệ giữa 2 nhóm Pheretima
15


không có manh tràng và có manh tràng chỉ được thể hiện rõ khi xây dựng sơ đồ phả
hệ dựa trên trình tự DNA Barcode. Mối quan hệ giữa các loài trong giống Amynthas
và Metaphire chưa thể hiện rõ ở phương pháp hiện trạng số và điện di protein SDSPAGE, có xu hướng rõ hơn khi so sánh trình tự DNA barcode. Từ kết quả nghiên

cứu cũng đã chứng minh được Metaphire sp.8 là 1 loài gần gũi với M. houlleti [59].
Tóm lại, cho đến nay chưa thấy công bố nào về mối quan hệ họ hàng của hai
loài Ph. modigliani và Ph. rodericensis.
1.2. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền và ứng dụng
1.2.1. Các phương pháp
Hiện nay, trong nghiên cứu phân loại cũng như đa hình sinh vật, bên cạnh
những phương pháp phân loại truyền thống hiệu quả như đa hình hình thái, đa hình
kiểu nhân, thì phương pháp sử dụng chỉ thị DNA (những chỉ thị dựa trên bản chất
đa hình DNA) đang được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả. Các phương pháp phổ biến
hiện nay như: phân tích trình tự các đoạn nucleotide lặp lại đơn giản (SSR), đa hình
chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RELP), đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên
(RAPD), marker DNA ty thể (mtDNA), đa hình các đoạn khuếch đại với các primer
đặc hiệu (SCAR)… [8].
1.2.1.1. Kỹ thuật đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD)
Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) là các phân
đoạn DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên do Williams và cs (1990) phát triển
dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào kích thước genome của một cá
thể là rất lớn từ vài trăm triệu tới vài tỷ base cho nên sẽ tồn tại nhiều trình tự từ 5
đến 12 base bắt cặp với trình tự primer ngẫu nhiên. Ở những điều kiện PCR nhất
định sẽ cho một hay nhiều phân đoạn DNA (khác nhau) trên điện di đồ.
Các cá thể sinh vật cùng loài, giống, họ có genome giống nhau hoàn toàn thì
khi dùng primer ngẫu nhiên chạy PCR sẽ khuếch đại các phân đoạn DNA hoàn toàn
giống nhau. Khi genome của chúng có nhiều trình tự khác nhau, với một primer
ngẫu nhiên nào đó, các sản phẩm PCR của chúng sẽ cho một số băng DNA có kích
thước khác nhau trên điện di đồ.
Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thể trong
một quần đàn, giữa các quần đàn trong một loài hoặc giữa các loài trong một giống,
16



mà không cần biết trình tự các nucleotide sắp xếp ra sao [25].
Các bước tiến hành: tách chiết và tinh sạch DNA  PCR với primer ngẫu
nhiên  điện di sản phẩm PCR trên gel agarose  phân tích kết quả [9].
Tuy còn nhạy cảm với các điều kiện phản ứng, RAPD vẫn được sử dụng
nhiều cùng với các chỉ thị khác vì có ưu điểm:
+ Kỹ thuật thí nghiệm đơn giản, nhanh và chi phí thấp hơn.
+ Chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn, không đòi hỏi phân lập và đọc trình tự.
+ Có thể phát hiện nhiều locus cùng một lúc. Phân tích cho số lượng
mẫu lớn [9], [25].
Hạn chế của loại chỉ thị này là khó có thể chứng minh sự di truyền Mendel
của các locus và không thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp. Mặt khác, sự có mặt
của các sản phẩm PCR phụ (khác với các vùng PCR có cùng chiều dài và vì vậy trở
thành một locus đơn) đã làm hạn chế việc sử dụng chỉ thị này [8].
1.2.1.2. Kỹ thuật đa hình chiều dài cắt đoạn giới hạn (RFLP)
Phương pháp RFLP (Restrition Fragment Length Polymorphism DNA) là
DNA đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, được biết đến khi Botstein
(1980) sử dụng nó để lập bản đồ gene liên quan đến bệnh ở người.
RFLP là kỹ thuật dựa trên sự khác nhau về kích thước đoạn DNA được tạo ra
khi cắt DNA hệ gen hoặc các bào quan bằng các enzyme hạn chế. Cắt DNA bằng
enzyme hạn chế có thể tạo ra các đoạn DNA có kích thước và số lượng khác nhau ở
các cá thể quần thể và loài khác nhau. Sử dụng phương pháp phân tích Southern
blot, các đoạn DNA của hệ gen được tạo thành sau khi cắt bằng enzyme hạn chế sẽ
được phân tách bằng điện di agarose gel, sau đó được chuyển lên một màng lai và
được phát hiện bởi các mẫu dò đặc hiệu [8].
Các bước tiến hành: tách chiết và tinh sạch DNA  cắt mẫu DNA bằng
enzyme giới hạn  điện di sản phẩm DNA đã cắt  chuyển DNA đã biến tính lên
màng lai  ủ màng lai với mẫu dò  rửa màng lai và đọc kết quả bằng phóng xạ
tự ghi [9].
Tuy nhiên, sử dụng RFLP đơn giản, dễ thao tác nhưng không phân biệt được

nhiều giữa các quần đàn. Đối với mỗi locus đa hình phải thực hiện một thí nghiệm và
đây là một nhiệm vụ khó vượt qua với những bản đồ chi tiết với hàng trăm chỉ thị.

17


1.2.1.3. Kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP)
Phương pháp AFLP (Ampolified Fragement Polymorphism DNA) là DNA
đa hình phân đoạn được khuếch đại do Vos và cs tìm ra năm 1993.
AFLP là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. Giống như RFLP, cơ sở phân
tử của sự đa hình AFLP bao gồm sự mất hoặc xen các base vào giữa các trình tự cắt
hạn chế và giống như RAPD nó cũng bao gồm sự thay thế base ở các vị trí bám của
các primer PCR. Điểm khác biệt của kỹ thuật này là có gắn thêm các adaptor đã biết
trước trình tự và các đoạn DNA được cắt ra từ hệ gen. Sự xác định tính biến dị di
truyền giống như ở kỹ thuật RFLP, tuy nhiên thay vì phân tích từng locus một,
AFLP cho phép phân tích nhiều locus cùng lúc [8].
Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản các
đoạn DNA đã bị cắt bởi enzyme giới hạn. Khâu then chốt là thiết kế các đoạn
primer đặc trưng (tạo adaptor) [9].
Các bước tiến hành: tách chiết và tinh sạch DNA  cắt DNA bằng enzyme
giới hạn  nối các đoạn DNA đã cắt với adaptor  nhân bản có chọn lọc các đoạn
nối bằng PCR  điện di sản phẩm và phân tích kết quả [9], [25].
Phương pháp này có nhiều tiềm năng to lớn trong kỹ thuật phân tích đa
dạng di truyền. Tuy vậy kỹ thuật thí nghiệm phương pháp này khá phức tạp và
chi phí cao [9].
1.2.1.4. Kỹ thuật SSR
Phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats) là các đoạn lặp lại có trình tự
đơn giản còn được gọi là microsatellite được Litt và Luty phát triển thành một kỹ
thuật chỉ thị phân tử năm 1998.
Vùng vi vệ tinh, còn được biết như những đoạn lặp lại ngắn theo thứ tự hay là

lặp lại trình tự đơn giản, bao gồm những đơn vị lặp lại theo trình tự, mỗi một đơn vị dài
khoảng từ 1 đến 10 cặp base. Chúng được phân bố rộng rãi trên toàn bộ gen của nhóm
nhân thật và thường có độ đa hình cao do sự biến động số lượng của những đơn vị lặp
lại. Những thông tin dữ liệu di truyền tạo ra bởi các vị trí SSR và những thuận tiện mà
nguyên liệu cho phân tích SSR có thể thu được một cách tự nhiên từ những quần thể
sống tự do làm cho những chỉ thị này như một trong những công cụ chọn lựa ở mức độ
phân tử cho nhiều nghiên cứu quần thể và đa dạng sinh học [18].
Sự biến động về kích cỡ của các sản phẩm PCR được tạo ra bởi những khác
biệt trong số lượng của các đơn vị lặp lại. Vùng vệ tinh là những chỉ thị đồng trội.
18


Kỹ thuật SSR là kỹ thuật dựa trên cơ sở phản ứng PCR nhằm xác định các
trình tự lặp lại đơn giản. Kỹ thuật SSR được di truyền theo kiểu Mendel, là các chỉ
thị đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin cậy. Một ưu điểm khác của chỉ thị vệ
tinh là sự phong phú, phân bố đều trong genome, kích thước locus nhỏ và đa hình
cao của nó. Đây là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, đòi hỏi ít DNA khuôn mẫu và
khả năng lặp lại cao. Vì vậy, chỉ thị vệ tinh đã trở thành một loại chỉ thị phổ biến
cực kì quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền [18].
Các bước tiến hành: tách chiết và tinh sạch DNA  PCR các đoạn có trình
tự bổ sung với vùng sườn  điện di sản phẩm PCR trên gel polyacryamide  phân
tích dữ liệu [9].
Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ thị vệ tinh đòi hỏi nhiều thời gian và tốn
kém. Mỗi locus vi vệ tinh phải được xác định và vùng cạnh nó được sử dụng để
thiết kế primer cho PCR. Do sao chép lỗi của enzyme polymerase trong quá trình tái
bản DNA, những sai khác nhỏ về kích thước giữa các allele của một vùng vệ tinh cụ
thể có thể xảy ra và được thu nhận qua phóng xạ huỳnh quang tự ghi hoặc lai trên
phim X-quang [18].
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong lập bản đồ gen và phân tích
đa dạng di truyền. Hạn chế của phương pháp là thao tác còn phức tạp và chi phí cao.

1.2.2. Ứng dụng
Hiện nay, các phương pháp di truyền đã và đang được ứng dụng rộng rãi
trong nghiên cứu và xác định mối quan hệ di truyền của tất cả các loài sinh vật.
Kimberling và cộng sự (1996) bằng phương pháp sử dụng chỉ thị RAPD để
đánh giá cấu trúc di truyền của các quần thể ếch Rana pipens đã cách ly ở phía Nam
(Hoa Kỳ). Trong 14 primer ngẫu nhiên của 85 cá thể ếch nghiên cứu đã phát hiện 38
lucus đa hình. Có ba loại cấu trúc di truyền đã phát hiện trong nghiên cứu này: 2 quần
thể cho thấy có đa dạng di truyền thấp (D=0,1 và 0,04); 2 quần thể không thấy có sự
khác biệt di truyền và cho thấy có sự đa dạng trong quần thể cao (D=0,35) [44].
Ngô Thị Kim và cộng sự (2003) đã nghiên cứu rắn hổ mang theo quần thể
địa lý bằng phương pháp RAPD. Trong nghiên cứu tác giả sử dụng 7 primer thì có 3
primer RF2, RF3, RF5 không cho sản phẩm nào, chỉ có 2 primer RF1 và RF4 là cho
sản phẩm tổng hợp với 9 mẫu rắn hổ mang và 1 mẫu rắn hổ mang chúa. Đối primer
RF6 và RF7 chỉ cho sản phẩm với rắn hổ mang mà không cho sản phẩm với rắn hổ
19


mang chúa. Kết quả nghiên cứu cho thấy rắn hổ mang Việt Nam có mối quan hệ họ
hàng rất gần gũi với nhau mặc dù phân bố ở những vùng địa lý khác nhau [16].
Trần Quốc Dung và cộng sự (2008) đã dùng chỉ thị phân tử RAPD để nhận
dạng 2 quần thể nhông cát Leiolepis Cuvier, 1928 ở Thừa Thiên Huế. Kết quả
nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng RAPD để phân biệt được 2 quần thể này. Quần
thể L. guentherpetersi và quần thể L. reevesii sử dụng (primer 428) nhận dạng được
các băng 370 bp , băng 550 bp và 700 bp, đối với (primer CLR5) nhận dạng được
các băng 370 bp , băng 580 bp và 700 bp, đối với (cặp primer 101+168) nhận dạng
được băng 490 bp. Khoảng cách di truyền của hai quần thể 0,0003 [7].
Võ Thị Lan và cộng sự (2009) đã sử dụng 5 cặp primer microsatellite đặc
hiệu và 10 primer RAPD ngẫu nhiên để đánh giá sự khác biệt giữa 4 giống gà: ác
Việt Nam, ác Trung Quốc, Lơ Go và Lương Phượng. Trong 10 primer RAPD khảo
sát đã thu được chỉ thị OPA18-500 giúp phân biệt được giống gà ác Trung Quốc với

3 giống gà còn lại. Với 5 cặp primer microsatellite đã thu được chỉ thị AP24 cho
phép phân biệt 2 giống gà ác Việt Nam và gà ác Trung Quốc với 2 giống gà Lơ Go
và Lương Phượng. Khi kết hợp chỉ thị APH 24 với OPA18-500 cho phép phân biệt
2 giống gà ác Việt Nam và gà ác Trung Quốc [17].
Đinh Thị Phòng và cộng sự (2009) đã sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá độ
thuần của 10 giống tằm (Bombyx mory L.). Kết quả cho thấy khi phân tích đa hình
với 10 primer ngẫu nhiên, tỉ lệ phần trăm đồng hình nằm trong phạm vi từ 68,83%
(giống GQ11) đến 91,66% (giống GQ13). Tổng số băng DNA nhân bản được của
10 giống tằm là 333. Số băng DNA nhân bản của 10 giống tằm này dao động từ 20
(OPN05) đối với giống GQ14 đến 51 (OPP19) đối với giống GQ15. Kích thước
DNA nhân bản nằm trong khoảng từ 200 - 800 bp [22].
Trần Thanh Sơn (2012) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nhông
cát rivơ (Leiolepis reevesii Gray, 1831) ở miền Trung Việt Nam bằng kỹ thuật
RAPD, kết quả nghiên cứu cho thấy quần thể nhông cát L. reevesii ở miền Trung
Việt Nam có sự đa dạng di truyền cao [24].
Đỗ Võ Anh Khoa và cộng sự (2013) sử dụng phương pháp PCR-RFLP để
đánh giá đa dạng di truyền gen IGFBP 2 (Insulin like growth factor binding
protein 2) trên gà. Qua kết quả nghiên cứu đã phát hiện 3 đột biến điểm tại các vị
trí g.369>A (exon 2), g.1023>T (intron 2) và g.738>A (exon 3) nhờ sự nhận diện
của enzyme cắt giới hạn Bsh 1236I, Eco72 và Alw211. Tần số kiểu gen tại các
20