ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Bạch Tuyết Mai

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT
CỦA CÂY BÁN HẠ ROI - Typhonium flagelliforme
(LODD) BLUME (ARACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Bạch Tuyết Mai

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT
CỦA CÂY BÁN HẠ ROI - Typhonium flagelliforme
(LODD) BLUME (ARACEAE)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội – 2018


Lời cảm ơn
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Nguyễn Quang Huy, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời
gian trao đổi, định hƣớng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong
suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến ThS. Lê Quý Thƣởng cùng toàn thể quý thầy,
cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh cũng nhƣ quý thầy cô khoa Sinh học,
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu
trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học,
Phòng đào tạo Sau đại học, Trƣờng Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tƣ̣ nhiên đã giúp đỡ và ta ̣o
điề u kiê ̣n cho tôi hoàn thành chƣơng trình học tập và thực hiện luận văn
Cuối cùng, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, ngƣời thân và
bạn bè, những ngƣời đã đô ̣ng viên và tạo điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i nhất cho tôi có thời gian
học tập, nghiên cứu và hoàn thành luâ ̣n văn.
Hà Nội, ngày 18 tháng 1 năm 2018
Học viên cao học

.


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1 Giới thiệu chung về cây thuốc .............................................................................. 3
1.2 Các hợp chất thứ cấp có trong thực vật ................................................................ 3

1.2.1Alkaloids ............................................................................................................. 3
1.2.2Flavonoids ........................................................................................................... 4
1.2.3Tannins ................................................................................................................ 4
1.2.4 Glycoside............................................................................................................ 6
1.2.5Saponins .............................................................................................................. 6
1.3 Khái quát về họ Ráy ( Araceae ) .......................................................................... 6
1.4 Giới thiệu chung về Bán hạ roi (Typhonium flagelliforme) ................................. 7
1.4.1Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 7
1.4.2 Các hợp chất ....................................................................................................... 7
1.4.3Phân loại và Phân bố ........................................................................................... 8
1.4.4Hoạt tính sinh học của Bán hạ roi ....................................................................... 9
1.5 Khái quát về phƣơng pháp tách chiết ................................................................. 12
1.5.1 Chu trình tiền tách chiết mẫu thực vật ............................................................. 12
1.5.2Phƣơng pháp tách chiết ..................................................................................... 13
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16
2.1 Nguyên liệu......................................................................................................... 16
2.2 Hóa chất .............................................................................................................. 16
2.3 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................................. 16
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 17
2.4.1 Định tính các nhóm chất của loài Bán hạ roi ................................................... 17
2.4.2 Phƣơng pháp chiết mẫu .................................................................................... 21
2.4.3 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học ................................................................. 23
2.4.4 Phân lập các chất từ dịch chiết cây Bán hạ roi ................................................. 25


2.5 Phƣơng pháp thống kê ........................................................................................ 26
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 27
3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong Bán hạ roi ............................................. 27
3.2 So sánh các dịch chiết của Bán hạ roi ................................................................ 28
3.2.1 Dịch chiết của Bán hạ roi với EtOH ................................................................. 28

3.2.2 Dịch chiết của Bán hạ roi với MetOH .............................................................. 29
3.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học của Bán hạ roi ................................................... 29
3.3.1 Kết quả thử hoạt tính DPPH ............................................................................. 30
3.3.2 Kết quả thử độ độc tế bào ................................................................................. 30
3.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các phân đoa ̣n dich
̣ chiế t từ bán hạ
roi ..................................................................................................................... 32
3.4 Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ Bán hạ roi ........................................ 32
3.4.1 Chất TF1........................................................................................................... 33
3.4.2 Chất TF2........................................................................................................... 37
3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học các chất phân lập đƣợc từ cây Bán hạ roi .............. 41
3.5.1 Hoạt tính chống oxy hoá của các chất phân lập đƣợc ...................................... 41
3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn dịch chiết ................................... 42
3.5.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các phân đoa ̣n dich
̣ chiế t từ bán hạ
roi..............................................................................................................................43
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 44
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 45


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 So sánh các phƣơng pháp tiền tách chiết .................................................. 13
Bảng 1.2 So sánh các phƣơng pháp tách chiết truyền thống ................................... 14
Bảng 1.3 So sánh các phƣơng pháp tách chiết hiện đại ........................................... 15
Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong loài Bán hạ roi ............................. 27
Bảng 3.2 Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ roi với EtOH ........ 29
Bảng 3.3 Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ roi với MetOH ..... 29
Bảng 3.4 Giá trị EC50 trong phép phân tích DPPH với dịch chiết của Bán hạ roi .... 30

Bảng 3.5 Giá trị of IC50 với dịch chiết của Bán hạ roi với các dòng tế bào ung thƣ 30
Bảng 3.6. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các phân đoa ̣n dich
̣ chiế t ...... 32
Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất TF1 và Stigmast-4-en3-one .......................................................................................................................... 36
Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR của TF2 và hợp chất tham khảo ................................... 39
Bảng 3.9 Kế t quả thƣ̉ hoa ̣t tiń h chố ng oxy hoá của các ch ất phân lập ..................... 42
Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế phát triển tế bào của các chất phân lập từ Bán hạ roi .. 42
Bảng 3.11 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập Bán hạ roi 43


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của nicotine .................................................................... 3
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của flavonoid ................................................................. 4
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của tannin ....................................................................... 5
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của glycoside .................................................................. 6
Hình 1.5 Công thức cấu tạo của cortisol .................................................................... 8
Hình 1.6 Bán hạ roi (T. flagelliforme) ....................................................................... 8
Hình 2.1 Mẫu bột Bán hạ roi..................................................................................... 22
Hình 2.2 Quy trình ngâm chiết Bán hạ roi ............................................................... 23
Hình 2.3 Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang
học ............................................................................................................................ 24
Hình 3.1 Dịch chiết của Bán hạ roi với EtOH của trong dung môi n-hexane (1), EA
(2) và MetOH (3) ...................................................................................................... 28
Hình 3.2 So sánh giá trị IC50 của 2 dịch chiết: n-hexane và DCM với các dòng tế
bào ung thƣ ................................................................................................................ 31
Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ dịch chiết cây Bán hạ roi................................ 33
Hình 3.4 Phổ 1H-NMR của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) ................................... 34
Hình 3.5 Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) .................... 35
Hình 3.6 Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) .................... 35

Hình 3.7 Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất TF1 ................................................ 35
Hình 3.8 Công thức cấu tạo của TF1 ........................................................................ 37
Hình 3.9 Phổ H-NMR của chất TF2 ......................................................................... 40
Hình 3.10 Phổ 13C-NMR của chất TF2 ..................................................................... 40
Hình 3.11 Phổ DEPT của chất TF2........................................................................... 41
Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất TF2 là stigmasterol ................................. 41


BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
ASE
ATCC

Ý nghĩa
Kỹ thuật chiết nhanh với dung môi
Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ

DCM

Dichloromethane
Distortionless Enhancement by Polarisation

DEPT
DMEM
DMSO
DPPH
EA
EtOH
FBS

FT-IR
Hep - G2
IUCN
KB
Lu
MAE
MetOH
MTT
NCI
NCI-H23
NMR
SFE
UAE
v/v
w/v

Transfer
Môi trƣờng Dulbecco’s Modified Eagle
Dimethyl sulfoxide
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
Ethyl acetate
Ethanol
Huyết thanh phôi bò
Phổ hồng ngoại
Ung thƣ gan
Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên và Tài nguyên
Thiên nhiên
Ung thƣ biểu mô
Ung thƣ phổi
Kỹ thuật chiết bằng lò vi sóng

Methanol
3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5
diphenyltetrazolium bromide
Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa kỳ
Dòng tế bào ung thƣ phổi ngƣời
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Kỹ thuật chiết siêu tới hạn
Kỹ thuật chiết bằng sóng siêu âm
Thể tích / Thể tích
Khối lƣợng / Thể tích


MỞ ĐẦU
Cây trồng đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống đặc biệt trong nghành Y,
Dƣợc vì chúng không chỉ làm giảm ô nhiễm mà còn là phƣơng thuốc để điều trị
nhiều chứng bệnh khác nhau nhằm nâng cao sức khỏe cho ngƣời dân và phòng
chống một số bệnh hiểm nghèo. Có khoảng 4.700 loài cây đƣợc sử dụng làm thuốc
.Trong dân gian có rất nhiều thảo dƣợc cũng nhƣ các sản phẩm thiên nhiên đƣợc sử
dụng trực tiếp để làm thuốc chữa bệnh hoặc làm tiền chất cho tổng hợp hóa
dƣợc.Mỗi một loài cây có thể trị một hoặc nhiều loại bệnh khác nhau dựa trên các
hợp chất và hoạt tính sinh học của loài cây đó. Ví dụ: Diếp cá dùng để trị ho, lô hội
dùng để trị mụn, trinh nữ hoàng cung dùng để giảm thiểu ung thƣ buồng trứng và
ung thƣ cổ tử cung, bán hạ roi đƣợc dùng để trị ho suyễn, khí nghịch do đàm thấp
thủy ẩm, thấp trệ trung tiêu, nôn mửa bụng đầy, đinh nhọt, sƣng tấy. Ngoài ra, cây
bán hạ còn có rất nhiều công dụng khác nhau.Do vậy, việc nghiên cứu tách chiết và
xác định thành phần các hoạt chất sinh học có trong cây bán hạ roi nói chung và chi
Typhoniumnói riêng nhằm sử dụng và điều trị bệnh là rất quan trọng góp phần cung
cấp thêm sản phẩm thuốc có lợi cho sức khỏe ngƣời dân.
Bán hạ roi là cây thảo dƣợc thuộc họ Ráy và đƣợc trồng rộng rãi ở Ấn Độ,
Úc, Sri Lanka, Indonesia và các nƣớc châu Á khác có nhiệt độ trung bình [26]. Gần

đây, cho thấycác nhóm hợp chất thứ sinh nhƣ flavonoid, saponin, alkaloid và
terpenoid của loài cây này đã đƣợc nghiên cứu, tìm hiểu [9]. Một số các hợp chất
hóa học của bán hạ roi cũng đã đƣợc tinh sạch và xác định cấu trúc [9]. Các dịch
chiết từ bán hạ roi đƣợc xác định có chứa các hợp chất có hoạt tính chống lại sự
phát triển của nhiều dòng tế bào ung thƣ [20]. Một số nghiên cứu khác cho thấy
dịch chiết cây bán hạ roi còn có hoạt tính chống oxi hóa [10,16]. Tại Việt Nam,
trong nhiều bài thuốc dân gian lƣu truyền bán hạ roi dùng để trị ho, long đờm. Tuy
nhiên đến nay, các nghiên cứu chuyên sâu về Bán hạ roi còn chƣa nhiều, đặc biệt là
các nghiên cứu về các hoạttính sinh học từ các hợp chất mới đƣợc tinh sạch. Do đó,
trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung vào phân lập hợp chất từ cây bán hạ roi,

1


xác định các nhóm chất chính cũng nhƣ tinh sạch hợp chất vàđánh giá hoạt tính sinh
học của dịch chiết từ bán hạ roi từ các hợp chất đƣợc tách.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

Giới thiệu chung về cây thuốc
Hiện nay cây thuốc có vai trò quan trọng do chúng chứa một lƣợng lớn các

chất thực vật thứ sinh dùng để điều trị một số bệnh. Hầu hết các chất thực vật thứ
sinh nhƣ phenolic và flavonoid có tác động tích cực đến sức khỏe và phòng chống
ung thƣ, chống oxi hóa, kháng khuẩn. Hàm lƣợng các chất phenolic và flavonoid có
liên quan đến hoạt tính chống oxi hóa mà đƣợc ứng dụng để ngăn ngừa các bệnh do

tuổi tác gây ra đặc biệt là do stress oxi hóa [6].
Trong dân gian, ngƣời ta dùng cây thuốc để trị các bệnh thông thƣờng
nhƣcây diếp cá để trị ho, cây lô hội để trị mụn...Hầu hết các loại thuốc sử dụng điều
trị trong Đông y đều có nguồn gốc từ thực vật do chúng dễ kiếm và thân thiện với
môi trƣờng. Hiện nay các nhà khoa học và các y bác sĩ có xu hƣớng áp dụng cây
thuốc trong điều trị bệnh nhằm giảm thiểu các tác dụng phụ cũng nhƣ tránh hiện
tƣợng kháng kháng sinh.
1.2

Các hợp chất thứ sinh có trong thực vật
1.2.1 Alkaloid
Alkaloid là các bazơ hay hợp chất có chứa nitơ.Các alkaloid thƣờng gặp là

morphine, strychnine, quinine, ephedrine, và nicotine (Hình 1.1).Alkaloid đƣợc tìm
thấy chủ yếu trong thực vật và phổ biến trong các thực vật có hoa.Cấu trúc hóa học
của alkaloid rất đa dạng.Thông thƣờng, một alkaloid chứa ít nhất 1 nguyên tử nitơ
trong cấu trúc amin.Hầu hết alkaloid có một hoặc nhiều nguyên tử nitơ.Nó đóng vai
trò là một phần của vòng tuần hoàn các chất trong tự nhiên [32].

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chất nicotine

3


Alkaloid thƣờng đƣợc phân loại dựa trên cấu trúc hóa học.Ví dụ:Alkaloid
chứa vòng tuần hoàn indole đƣợc gọi là indole alkaloid. Ngoài ra, alkaloid có thể
đƣợc phân loại theo các hệ thống sinh học, tại vị trí mà chúng có tác dụng. Ví dụ,
các

alkaloid


thuốc

phiện

xảy

ra

trong

cây

thuốc

phiện

(Papaver

somniferum).Alkaloid thƣờng đƣợc dùng để giảm đau và thuốc gây mê [32].
1.2.2 Flavonoid
Flavonoid (Hình 1.2) là một nhóm gồm khoảng 4000 hợp chất polyphenolic
có mặt trong tự nhiên, đƣợc tìm thấy phổ biến trong thực vật. Dựa theo sự khác biệt
các nhóm chức và vị trí của chúng trong khung 15 - carbon (aglycon), flavonoid
đƣợc chia thành một số nhóm nhỏ bao gồm:Flavone, flavanone, flavonol,
isoflavonoid, anthocyanidin, và chalcones [24].
Thông thƣờng, các flavonoid có màu vàng, ngoài ra chúng còn có màu xanh,
tím hoặc không màu.

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của flavonoid [13]

1.2.3 Tannin
Tannin (thƣờng đƣợc gọi là axit tannin) (Hình 1.3) là polyphenol tan trong
nƣớc mà tồn tại chủ yếu trong thực phẩm thực vật [12].

4


Hình 1.3 Công thức cấu tạo của tannin[13]
Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Dựa vào cấu trúc ta có thể chia
tannin thành 4 nhóm chính: gallotannin, ellagitannin, tannin phức hợp và tannin
ngƣng tụ [11].
−

Gallotannin là toàn bộ tannin mà ở đó các đơn vị galloyl hoặc dẫn xuất meta-

depsidic của chúng gắn các đơn vị polyol, catechin hoặc triterpenoid khác nhau.
−

Ellagitannin là tannin mà có ít nhất 2 đơn vị galloyl có C–C liên kết với
nhau và không chứa một đơn vị catechin liên kết glycosid.

−

Tannin phức hợp là tannin mà đơn vị catechin gắn với 1 liên kết glycoside

của 1 gallotannin hoặc 1 đơn vị ellagitannin.
−

Tannin ngƣng tụ là toàn bộ proanthocyanidin oligomeric và polymeric đƣợc


hình thành bằng sự liên kết C-4 của một catechin với C-8 hoặc C-6 của catechin
đơn sắc kế tiếp.
Trong y học, đặc biệt ở châu Á nhƣ ở Nhật Bản và Trung Quốc, các chất
đƣợc chiết xuất từ thực vật có chứa tannin đƣợc sử dụng nhƣ chất làm se, chống
tiêu chảy, thuốc lợi tiểu, chống lại các khối u dạ dày và tá tràng, chống sƣng tấy
[11].

5


1.2.4 Glycoside
Glycoside (Hình 1.4) là một hợp chất hữu cơ đƣợc hình thành bởi sự ngƣng
tụ của một phân tử đƣờng với một phân tử hữu cơ, với điều kiện là phần hydroxy
của acetal đƣờng đƣợc tham gia vào sự ngƣng tụ.

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của glycoside[13]
1.2.5 Saponin
Saponin là một nhóm các hợp chất tự nhiên có tính chất hoạt tính bề mặt.Các
hợp chất này cho thấy sự biến thiên về kiểu, cấu trúc và thành phần của chuỗi
hydlycone và các chuỗi oligosaccharide.Saponin có tác dụng hạ cholesterol trong
huyết tƣơng ở ngƣời và đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm nguy cơ mắc
các bệnh mãn tính. Hơn nữa, saponin còn cho thấy tác dụng gây độc tế bào mạnh
mẽ để chống lại dòng tế bào ung thƣ[30].
1.3 Khái quát về họ Ráy ( Araceae )
Họ Ráy thuộc nhóm thực vật hạt kín và chúng là cây thân thảo 1 lá mầm. Có
114 chi và khoảng 3.750 loài đƣợc biết đến trong họ Ráy [15] và ở Việt Nam, có
khoảng 30 chi và 130 - 140 loài. Họ Ráy đƣợc nghiên cứu ngày càng phổ biến và
các nhà nghiên cứu đã phát hiện đƣợc các hợp chất thứ sinh có trong các cây thuộc
họ này nhƣ tannin, axit béo, cerebroside và glucoside [22].
Họ Ráy đƣợc trồng và sử dụng phổ biến ở các nƣớc châu Á trong đó có Việt

Nam do nhiều cây có hoạt tính sinh học cao.Trong dân gian, ngƣời dân sử dụng cây
thuộc họ Ráy để làm lành vết thƣơng, vết ngứa, giảm ho, kháng lại các chủng vi
khuẩn có hại...

6


1.4 Giới thiệu chung về Bán hạ roi (Typhonium flagelliforme)
Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume (Araceae) hay Bán hạ roi đƣợc biết
đến là Rodent tuber (trong tiếng Anh) hoặc Keladi tikus (trong tiếng Malai). Đây là
cây thảo dƣợc đƣợc sử dụng nhƣ liệu pháp thay thế một số loại thuốc ở Malaysia để
điều trị ung thƣ [8].
1.4.1 Đặc điểm hình thái
Bán hạ roi là cây thảo dƣợc.Cây bán hạ roi có thể cao đến 30 cm với củ trắng
và dài; Lá có bẹ, cuống lá dài, phiến lá có nhiều hình dạng khác nhau và khá đa
dạng.Phiến lá có thể nguyên hay chia thùy. Phần thân dài 15,37 ± 1,17 cm và chiều
rộng rộng nhất là 1,44 ± 0,07 cm. Thân đƣợc chia làm 4 phần: Phần giáp thấp 0,41
± 0,03 cm, phần trung gian 1,48 ± 0,14 cm, phần bẹ 0,34 ± 0,05cm và phần dƣới
cùng màu vàng chanh 12,92 ± 1,25 cm [16, 21].
Hoa tập hợp thành cụm bông mo thƣờng màu trắng hoặc màu vàng. Quả
mọng hay đóng, hình trứng dài 6mm
Các hợp chất có trong cây
Trong hơn 1 thập kỉ trở lại đây, các nhà nghiên cứu và các nhà khoa học đã
nghiên cứu phát hiện, phân biệt, tách và xác định đƣợc nhiều hợp chất khác nhau có
trong dịch chiết của T. flagelliforme.
Vì thuộc lớp Araceae, bán hạ roi chứa flavonoid mà có rất nhiều hoạt tính
sinh học.Các hợp chất phytochemical có hoạt tính sinh học là alkaloid, flavonoid,
saponin, sterol (Hình 1.5), cerebrocide, và glycoside [26]. Dịch chiết hexane đƣợc
báo cáo là chứa hydrocarbon no and axit aliphatic, trong khi dịch chiết ethyl acetate
chứa axit amin béo thơm [9].Bán hạ roi cũng chứa các loại enzyme nhƣ peroxidase,

laccase, tyrosinase, reductase và riboflavin reductase [16].

7


Hình 1.5 Công thức cấu tạo của cortisol

1.4.2 Phân loại và Phân bố
1.4.2.1

Phân loại

Dựa trên Sách đỏ IUCN, Bán hạ roi đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới: Plantae
Ngành:Tracheophyta
Lớp: Liliopsida
Bộ: Arales
Họ: Araceae
Chi: Typhonium
Loài: T. flagelliforme

Hình 1.6 Bán hạ roi (T. flagelliforme)

8


1.4.2.2

Phân bố


Bán hạ roi phân bố chủ yếu ở các nƣớc châu Á có khí hậu vừa phải [26]. Do
đó rất dễ dàng tìm thấy loài cây này.
Bán hạ roi có nguồn gốc từ các nƣớc Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Singapore
và Trung Quốc, phía nam của Ấn Độ và Sri Lanka và phía bắc Úc [7, 17, 18]. Nó
phát triển trong vùng đất hoang có môi trƣờng ẩm và râm và không tiếp xúc trực
tiếp với ánh nắng mặt trời [7, 21, 25].Tại Việt Nam, bán hạ roi có thể tìm thấy ở
miền Bắc Việt Nam nhƣ Phú Thọ, các tỉnh miền Trung và miền Nam của Việt Nam
(hình 1.6).
Bán hạ roi đƣợc trồng rộng rãi vì nó có hoạt tính sinh học cao.
1.4..4. Hoạt tính sinh học của Bán hạ roi
Bán hạ roi có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao [26].Bán hạ roi
có nhiều tác dụng tốt đến sức khỏe. Loài cây này đƣợc sử dụng rộng rãi ở các nƣớc
Đông Nam Á để trị nhiều loại bệnh nhƣ trị ho, giảm sƣng, cầm máu, điều trị các vết
thƣơng [9]. Đặc biệt, bán hạ roi đƣợc dùng để kìm hãm sự phát triển của nhiều dòng
tế bào ung thƣ. Hơn thế nữa, loài cây này còn có khả năng kháng viêm, giảm đau và
an thần, kháng khuẩn và chống oxi hóa [9].
1.4.4.1.

Kháng viêm, giảm đau và an thần

Bán hạ roi chứa steroid và flavonoid [28] nên loài cây này có hoạt tính
này.Steroid kháng viêm hay corticosteroid đƣợc dùng để loại bỏ stress, giảm đau và
làm lành vết thƣơng. Corticosteroid là hoocmon steroid đƣợc tạo ra trong tuyến
thƣợng thận của động vật có xƣơng sống.Có hai loại corticosteroid chính là
glucocorticoid và mineralocorticoid. Chúng đều tham gia vào các quá trình sinh lý
trong cơ thể bao gồm phản ứng căng thẳng, miễn dịch, điều hòa viêm, chuyển hoá
carbohydrate, protein dị hóa, lƣợng chất điện phân trong máu và hành vi[19].
Corticosteroid ức chế sự hình thành axit arachidonic, do đó giải phóng các chất gây
viêm nhƣ prostaglandin, leukotrien. Chúng cũng ức chế sự tạo thành các chất trung
gian viêm, ức chế sự giãn mạch và tăng tính thấm mao mạch ở vết thƣơng.


9


Flavonoid cũng có khả năng kháng viêm, giảm đau và an thần. Flavonoid có
thể phá vỡ cấu trúc vi khuẩn và vi rút để bảo vệ cơ thể. Chúng kìm hãm
hyaluronidase mà gây ra sự chảy máu dƣới da nhằm giảm thiểu sự phát triển của
loại bệnh này. Flavonoid có khả năng giảm cholesterol trong máu, hạ huyết áp, do
đó ngăn chặn đƣợc các bệnh về tim mạch. Flavonoid có tác dụng tích cực đối với
bệnh Parkinson và có thể cải thiện trí nhớ ở ngƣời cao tuổi[13].
1.4.4.2.

Chống oxi hóa

Chất chống oxi hoá là những chất có thể bảo vệ tế bào khỏi những tác động
gây ra bởi các phân tử không ổn định gọi là các gốc tự do. Chất chống oxi hoá
tƣơng tác và ổn định các gốc tự do từ đó có thể ngăn ngừa một số các gốc tự do có
hại [10].Trong dân gian, bán hạ roi dùng để trị mụn nhọt, ghẻ lở và loại bỏ độc do
côn trùng cắn, do đó loài cây này có khả năng chống oxi hóa.
Bán hạ roi là chất chống oxi hóa vì nó chứa flavonoid, hợp chất có hoạt tính
chống oxi hóa cao.Flavonoid nhƣ flavonol và flavone chứa nhóm catechol có tính
chống oxi hóa cao [9].
Bán hạ roi còn chứa các hợp chất giúp loại bỏ độc tính trong hệ tuần
hoàn.Loài cây này có chứa protein ribosome inacting (RIP), chất chống oxi hóa và
chống nhiễm khuẩn [31].
1.4.4.3.

Kháng khuẩn

Vi khuẩn là các vi sinh vật prokaryote đƣợc tìm thấy ở mọi môi trƣờng sống

mà chất hữu cơ có mặt. Một số lƣợng lớn các vi khuẩn gây bệnh ở thực vật và động
vật kể cả con ngƣời. Vi khuẩn gây bệnh gây hại tế bào vật chủ bằng cách tấn công
trực tiếp hoặc bởi 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố [22].
Họ Ráy có khả năng kìm hãm hầu hết các loại vi khuẩn gồm cả Gram dƣơng
và Gram âm nhƣ: E.coli, B.subtilis, S.aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa [22].
Các nghiên cứu cho thấy bán hạ roicó khả năng kháng khuẩn.
Cả lá và củ của bán hạ roi đều có hoạt tính kháng khuẩn.Dịch chiết hexane từ
củ bán hạ roi có khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn Gram âmP.

10


aeruginosa(đƣờng kính 11 ± 1,0 mm) và S. Choleraesui (đƣờng kính 12 ± 1,1 mm).
Dịch chiết hexane với lá bán hạ roi có hoạt tính kháng khuẩn với P.aeruginosa[16].
1.4.4.4.

Chống ung thư

Các gốc tự do gây hại cho cơ thể có thể dẫn đến ung thƣ [10]. Ung thƣ là quá
trìnhgồm nhiều giai đoạn bao gồm giai đoạn khởi đầu, lây lan (tăng nhanh các tế
bào của giai đoạn đầu) và cuối cùng là giai đoạn phát triển của khối u ác tính. Ung
thƣ gây tử vong cho con ngƣời [20].
Bán hạ roi có khả năng cao để trị một số dòng tế bào ung thƣ [28]. Nhóm
hợp chất đƣợc có nhiều khả năng trị ung thƣ đƣợc nghiên cứu là nhóm flavonoid vì
flavonoid giúp ngăn quá trình oxi hóa của các gốc tự do. Các hợp chất chống ung
thƣ có thể tìm thấy ở các bộ phận khác nhau của cây bao gồm cả rễ, củ, thân và
lá[26]. Một số loại ung thƣ đã đƣợc nghiên cứu thử nghiệm với dịch chiết của bán
hạ roi là ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ
vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, tuyến tụy, ung thƣ gan, máu (bạch cầu), ung thƣ ruột [20,
23, 27,28, 29].

Với ung thƣ đại tràng, bán hạ roi tác động lên tế bào ung thƣ với COX-2 là
mục tiêu. Celecoxib, một chất ức chế COX - 2 có chọn lọc, đã đƣợc sử dụng nhƣ là
kiểm soát dƣơng tính. Dixon và cộng sự đã cho rằng celecoxib là một chất tiềm
năng để chống ung thƣ ruột kết [23].Với ung thƣ vú, ung thƣ cổ tử cung và ung thƣ
buồng trứng, các chất trong nhóm flavonoid trong bán hạ roi có xu hƣớng làm tăng
hàm lƣợng estrogen để giảm sự phát triển của khối u.
1.4.4.5.

Ứng dụng của Bán hạ roi

Do có tiềm năng sinh học cao, Bán hạ roi đƣợc áp dụng trong nhiều lĩnh vực.
Trong dân gian, Bán hạ roi ngoài việc sử dụng làm thuốc còn đƣợc sử dụng làm
thức ăn và thức ăn cho lợn.
Việc sử dụng Bán hạ roi làm dƣợc liệu từ lâu đã đƣợc thực hiện bởi ngƣời
Philippine và Trung Quốc. Loài cây này đã đƣợc ngƣời Trung Quốc uống để điều
trị thƣơng tích và ngƣời Philippine đã sử dụng các chất flavour nhƣ một chất chống
đông máu. Toàn bộ cây bán hạ roi đã đƣợc dùng làm nƣớc với mật ong để làm ngọt

11


và có thể làm thuốc để cai nghiện, kháng khuẩn, kháng virut và chống ung thƣ [21].
Ngƣời dân còn sử dụng loài cây này để trị ho, long đờm.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy Bán hạ roi còn có thể đƣợc sử dụng nhƣ
phƣơng pháp điều trị bệnh. Bán hạ roi do có hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ do đó
nó có thể đƣợc áp dụng nhƣ phƣơng pháp điều trị ung thƣ.
Loài cây này cũng chữa đƣợc bệnh hen suyễn [16].
1.5. Khái quát về phƣơng pháp tách chiết
Việc chiết xuất là cần thiết để cô lập và chiết xuất các thành phần của thực
vật để áp dụng trong ngành công nghiệp y tế dựa trên tầm quan trọng của cây trồng

đối với sức khoẻ.Có nhiều phƣơng pháp tách chiết và mỗi loài cây, thảo dƣợc có thể
phù hợp với một hoặc nhiều phƣơng pháp khác nhau (bảng 1.1).
1.5.1. Chu trình tiền tách chiết mẫu thực vật
Lựa chọn mẫu thực vật phù hợp trƣớc khi tách chiết rất quan trọng. Ta cần
lựa chọn mẫu phù hợp nhất để đem lại các kết quả tốt nhất sau khi tách chiết.
1.5.1.1.

Mẫu tươi và mẫu khô

Các mẫu khô đƣợc ƣu tiên hơn vì chúng chứa hàm lƣợng flavonoid cao hơn
so với mẫu tƣơi và thời gian bảo quản mẫu khô lâu hơn [6].
1.5.1.2.

Mẫu nghiền và mẫu bột

Sử dụng các mẫu này có thể làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa mẫu thực vật và
các dung môi chiết xuất. Các mẫu bột chứa các hạt nhỏ hơn các mẫu nghiền, dẫn
đến sự tiếp xúc bề mặt tốt hơn.Trong khi đó việc nghiền mẫu chỉ làm mẫu nhỏ hơn,
do đó mẫu bột phổ biến hơn [6].
1.5.1.3.

Phương pháp tiền tách chiết

Có 4 phƣơng pháp tiền tách chiết: Sấy khô bằng khí, sấy bằng lò vi sóng, sấy
khô và sấy đông khô(Bảng 1.1) [6].

12


Bảng 1.1 So sánh các phƣơng pháp tiền tách chiết [6]

Phƣơng

Sấy bằng khí

pháp

Sấy bằng lò vi
sóng

Cách sử

Sử dụng các loại khí

Sử dụng bức xạ

dụng

riêng lẻ hoặc hỗn hợp

điện từ

3 - 7 ngày, vài tháng

Ngắn hơn sấy

cho đến một năm

bằng khí

Thời gian


Đặc điểm

Ƣu điểm

Không sử dụng nhiệt
độ cao

Có hiện tƣợng
làm nóng đồng
thời

Các hợp chất chịu

Nhanh

nhiệt đƣợc bảo toàn

Sấy khô

Sấy đông
khô

Sử dụng

Dựa vào

năng lƣợng

hiện tƣợng


nhiệt

thăng hoa

Ngắn hơn
sấy bằng
khí
Có thể sử
dụng với
nhiều loại
nhiệt độ

Qua đêm
(12h)
Không làm
mất hoạt
tính

Không làm

Hàm lƣợng

mất hoạt

phenolic

tính

cao hơn


Đôi khi
Thời gian tiến hành
Hạn chế

lâu
Mẫu có thể bị nhiễm
bẩn ở điều kiện nhiệt
độ không ổn định

Đôi khi gây ra
sự giảm thiểu
lƣợng
phytochemicals

không có

Mẫu bị mất

ảnh hƣởng

do tỏa ra

đáng kể

trong bình

đến hoạt

đông.


động chống Tốn kém
oxi hoá

1.5.2. Phƣơng pháp tách chiết
Có nhiều phƣơng pháp tách chiết kể cả phƣơng pháp truyền thống và hiện
đại với mục đích là tách đƣợc hợp chất mong muốn. Các phƣơng pháp tách chiết
truyền thống bao gồm: Ngâm, truyền, thấm và sắc; Chiết bằng máy chiết Soxhlet
(Bảng 1.2).

13


Các phƣơng pháp tách chiết hiện đại bao gồm: Chiết bằng lò vi sóng (MAE),
chiết bằng sóng siêu âm (UAE), chiết nhanh với dung môi (ASE) và chiết siêu tới
hạn (SFE)(Bảng 1.3). ASE và SFE đƣợc sử dụng ít vì tốn kém và hiệu quả thấp.
Mỗi phƣơng pháp phù hợp với mẫu chiết và dung môi chiết khác nhau. Dung môi
chiết có thể phân cực hoặc không phân cực, ví dụ: Nƣớc, ethanol, methanol, nhexane, ethyl acetate [6].
Phƣơng

Bảng 1.2 So sánh các phƣơng pháp tách chiết truyền thống [9]
Đặc điểm
Ƣu
Nhƣợc
Ứng dụng

pháp

điểm


điểm

- Ngâm là phƣơng pháp lấy bột thực vật Dễ

Chất thải Dùng để

ngâm với dung môi nhiệt độ phòng ít dàng

vẫn

tách chiết

nhất 3 ngày để giải phóng các chất và

chứa

P. guajava

Ngâm,

phytochemical hòa tan. Sau đó, hỗn hợp đơn

dung

L, G.

truyền,

này đƣợc lọc qua màng lọc, nhiệt đƣợc giản


môi

atriviridis, P.

chuyển giao và các dung môi chiết sẽ xác

oleracea,

và

định loại hợp chất chiết xuất.

C.caudatus,

sắc

- Truyền và sắc có quy trình tƣơng tự nhƣ

M.oliefera

thấm

quá trình ngâm, thời gian nhanh hơn.
- Thẩm thấu có nguyên tắc tƣơng tự 3
phƣơng pháp trên.
Mẫu mịn đƣợc đặt trong một túi xốp hoặc Chỉ

Dễ cháy, Dùng để tách

"bao" đƣợc làm từ giấy lọc hoặc xenlulô cần


tốn kém, chiết A.

Chiết

mạnh nằm trong buồng của thiết bị một

gây

bằng

Soxhlet. Dung môi chiết xuất đƣợc đun lƣợng

ô nhiễm (Neem), M.

máy

nóng trong bình đáy và bay hơi vào nhỏ

oliefera, C.

chiết

buồng mẫu, ngƣng tụ trong bình ngƣng dung

asiatica

Soxhlet

và nhỏ giọt. Khi lƣợng chất lỏng tiếp cận môi

cánh tay siphon, dung dịch trong bình
cạn và quá trình này tiếp tục.

14

indica


Bảng 1.3 So sánh các phƣơng pháp tách chiết hiện đại [6]
Phƣơng

Đặc điểm

Ƣu điểm

Nhƣợc điểm

Ứng dụng

pháp

Chiết
bằng lò
vi sóng
(MAE)

Lò vi sóng tƣơng tác với cực Thời gian

Hạn chế các


Dùng để

của vật liệu phân cực và cực có tách chiết

hợp chất

chiết xuất

thể gây nóng ở gần bề mặt của giảm

phenolic nhỏ

triterpene từ

vật liệu và nhiệt đƣợc truyền Cải thiện sự

C.asiatica,

bằng cách dẫn.

D.hispida,

phục hồi của

MAE có thể đƣợc coi là chất phân tích

A.paniculata

phƣơng pháp có lợi cho các
phân tử cực và dung môi có

hằng số điện môi cao.

Chiết
bằng
sóng
siêu âm
(UAE)

Sử dụng sóng siêu âm từ 20 Thời gian

Sóng siêu âm

kHz đến 2000 kHz để tăng bề tách chiết

trên 20 kHz có chiếtW.

mặt tiếp xúc giữa dung môi và nhanh.

thể có ảnh

mẫu và độ thấm của thành tế Sử dụng ít

hƣởng đến các C.formosum

bào. Nhƣ vậy tính chất của tế dung môi

phytochemical

bào thay đổi tế bào để giải Chi phí thấp


hoạt động

phóng các hợp chất và tăng

thông qua sự

cƣờng sự vận chuyển khối

hình thành của

lƣợng của dung môi vào tế bào

các gốc tự do.

thực vật.

15

Dùng đểtách

somnifera,


CHƢƠNG 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

2.1

Bán hạ roi từ Phú Thọ và đƣợc phân loại bởi ThS. Nguyễn Anh Đứcbộ môn

Thực vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. Các mẫu cây
đƣợc sấy khô, nghiền thành bột và bảo quản ở nơi khô ráo. Mẫu bột đƣợc ngâm
trong ethanol và methanol ở nhiệt độ phòng.
Ethanol đƣợc chọn là dung môi đầu tiên cho quá trình chiết Bán hạ roi (Hình
2.2).Ethanol là dung môi đƣợc sử dụng rộng rãi trong quá trình tách chiết các hợp
chất phenol từ thực vật dựa trên tính hiệu quả cao của dung môi này. Chúng tôi tiến
hành các thí nghiệm với 2 nồng độ khác nhau của ethanol là 80% và 96% nhằm
mục đích thu đƣợc polyphenol tổng số và từ đó phân tích xem hợp chất nào thể hiện
hoạt tính sinh học của Bán hạ roi.
Máy cô quay đƣợc sử dụng để loại bỏ dung môi. Sau đó cặn ethanol khô
đƣợc ngâm lần lƣợt trong các dung môi n-hexane, ethyl acetate và cuối cùng là
methanol.Cặn methanol khô đƣợc ngâm trong dung môi dichloromethane.
Dung môi trong cao chiết đƣợc loại bỏ hoàn toàn nhờ công đoạn cô quay ở
50oC. Sắc ký cột với các hệ dung môi khác nhau và các máy quang phổ đƣợc sử
dụng để phân lập các hợp chất có trong cao chiết.
Hóa chất

2.2
−

Các hóa chất, dung môi sử dụng cho quá trình tách chiết nhƣ: ethanol, n -

hexane, ethylacetate, methanol và dichloromethane có nguồn gốc từ các hãng
Merck (Đức), hay Sigma (Mỹ).
−

Silica gel 60 (0,04 - 0,063 mm) đƣợc sử dụng cho sắc ký cột (230-400 mesh

ASTM).
2.3


Thiết bị thí nghiệm
− Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào
− Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ)
− Cân phân tích (Presica – Italy)

16


− Kính hiển vi ngƣợc (Zeizz)
− Máy cô quay Stuart RE300DB (England)
− Máy quang phổ DEPT, FT-IR, NMR, vàGenios Tecan
− Máy ly tâm (Universal 320R)
− Sắc ký cột
− Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170)
− Tủ cấy sinh học an toàn cấp II
− Tủ hút LabTech LFH 2150 (LabTech – Hàn Quốc)
− Tủ lạnh (-25oC; -80oC)
− Tủ sấy (Memmert – Đức)
Và các trang thiết bị khác trong phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Sinh lý thực
vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học.
2.4

Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1 Định tính các nhóm chất của loài Bán hạ roi
Chúng tôi đã áp dụng các phƣơng pháp theo tài liệu tham khảo[1].
Phản ứng định tính glycosid tim
Cân 5g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml
ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml.

Thêm vài ml chì acetat 30%, khuấy đều. Để lắng, lọc dịch vào một cốc có mỏ dung
tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì
acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết,
khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Lắc dịch chiết với hỗn
hợp cloroform / ethanol (4:1), lắc 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp dịch chiết cloroform
trong ethanol vào một cốc có mỏ đã đƣợc sấy khô.
Gộp các dịch chiết cloroform và loại nƣớc bằng natri sulfat khan. Chia đều
dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã đƣợc sấy khô. Đem cô cách thủy đến khô. Cắn
thu đƣợc đem tiến hành làm các phản ứng định tính.

17