BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM

Biên soạn: KS. PHẠM MINH NHỰT
ThS. BÙI ĐỨC CHÍ THIỆN

- 2009 -


GIỚI THIỆU
Trong xã hội ngày nay, đời sống của con người ngày càng được nâng cao và
nhu cầu về ăn uống càng phải được cải thiện. Tuy nhiên, cuộc sống của con người
càng được nâng cao thì thời gian dành cho việc ăn uống càng giảm xuống. Chính vì
thế, những bữa ăn nhanh, những quán cơm vỉa hè là những lựa chọn thích hợp đối với
những con người bận rộn. Do đó, việc đánh giá và quản lý nguồn thực phẩm là điều
hết sức cần thiết để có thể hạn chế tối đa khả năng ngộ độc thực phẩm.
Đây chính là tiền đề để ra đời mơn học Phân tích đánh giá chất lượng thực
phẩm, góp phần giúp cho sinh viên có cái nhìn khái qt về những ngun nhân gây
ngộ độc thực phẩm đồng thời biết được các phương pháp phân tích, đánh giá chất
lượng của nguồn thực phẩm. Và nội dung thực hành của môn học này giúp cho sinh
viên có thể tự tay mình có thể phân tích và đánh giá mức độ vệ sinh an tồn của thực
phẩm đối với một số các chỉ tiêu vi sinh vật và một số các chỉ tiêu hóa lý thực phẩm.
Trong nội dung của môn thực hành này, sinh viên sẽ được làm quen với quy
trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh như quy trình định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí,
coliform tổng số, Staphylococcus aureus, quy trình định tính E. Coli, Salmonella. Các

quy trình phân tích này dựa trên tiêu chuẩn ngành và tiêu chuẩn Việt Nam và các quy
trình này cũng được áp dụng rộng rãi ở khá nhiều phịng thí nghiệm vi sinh tại các cơ
quan, công ty. Thông thường, các quy định về vi sinh vật hiện diện trong mẫu thực
phẩm thông thường cho phép có sự hiện diện của TPC, coliform tổng số và S. aureus
với số lượng nhất định do đó phải tiến hành định lượng còn đối với hai chỉ tiêu E. Coli
và Salmonella tuyệt đối không được phép hiện diện trong thực phẩm nên chỉ cần phân
tích định tính.
Tơi hy vọng sau môn học thực hành này, sinh viên sẽ tích lũy được ít nhiều kiến
thức thực tế về phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm và hy vong nó sẽ trở thành
một phần trong hành trang để các bạn bước vào đời.

2


MỤC LỤC
PHẦN 1: KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM
Bài số 1: Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) trong thực phẩm
Bài số 2: Định lượng tổng số Coliform trong thực phẩm
Bài số 3: Định tính E. Coli trong thực phẩm
Bài số 4: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm
Bài số 5: Định tính Salmonella trong thực phẩm
PHẦN II: KIỂM NGHIỆM HÓA LÝ THỰC PHẨM
Bài số 6: Phương pháp phát hiện nhanh màu độc và không độc
Bài số 7: Xác định hàm lượng chất béo trong sữa theo phương pháp Adam – Rose
– Gottlieb
Bài số 8: Xác định hàm lượng protein trong sữa theo phương pháp kết tủa
Bài số 9: Xác định độ ẩm nguyên liệu
Bài số 10: Phương pháp phát hiện nhanh hàn the

3



PHẦN I

KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY BỆNH
TRONG THỰC PHẨM

4


CÁC QUY TẮC AN TỒN TRONG PHỊNG KIỂM NGHIỆM VI SINH
Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật. Khi
làm việc với vi sinh vật, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế
bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml). Nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh
nên cần luôn luôn cẩn thận với tất cả các chủng đang thao tác.Mặt khác, nhân viên
kiểm nghiệm cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có các acid hoặc những
hóa chất có độc tính. Do vậy, cần tuân thủ một số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn
cho bản thân và cho những người khác trong phịng thí nghiệm như sau:
-

Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật.

-

Khơng ăn uống, hút thuốc trong phịng kiểm nghiệm. Mang khẩu trang khi thao

tác với vi sinh vật.
-

Mặc áo blouse trong thời gian làm việc.


-

Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 700 hoặc

dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô. Thực
hiện tương tự cho hai tay. Chú ý chưa đốt đèn cồn hoặc đèn Bunsen khi tay chưa khô
cồn. Lặp lại việc sát trùng này sau khi hồn thành cơng việc.
-

Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống

nghiệm mơi trường, bình ni cấy.
-

Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất

diệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc.
-

Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có

nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Lưu ý tránh đưa tay,
tóc qua ngọn lửa. Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài.
-

Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút

bằng miệng.
-


Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả mảnh vỡ

vào một túi rác riêng.
-

Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng.

-

Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử

trùng trước khi thải bỏ vào các bãi rác. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần
được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng.
5


-

Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp petri lên nhau.

-

Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hơ

hấp.
-

Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy


vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào khơng khí.
-

Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phịng thí nghiệm.

6


Bài số 1: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TPC)
----------------------------------1.1. Định nghĩa
Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong
mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.
1.2. Nguyên tắc
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu
khí ở 300C/72h + 6h hoặc 370C/48h + 6h
1.3. Môi trường sử dụng
-

Mơi trường pha lỗng mẫu: Saline Pepton Water (SPW) hoặc Buffer Pepton
Water (BPW)

-

Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA)

1.4. Dụng cụ
-

Đĩa petri


-

Ống nghiệm

-

Tủ ấm 300C

1.5. Quy trình phân tích
25g mẫu + 225ml SPW đồng nhất trong 30 giây
pha loãng 10-1

độ

Pha loãng trong nước muối sinh lý
độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vơ trùng. Sau
đó đổ mơi trường PCA đã được làm nguội đến 450C

Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội úp ngược
nhiệt độ 300C trong 72h

đem ủ ở

7


Đọc kết quả các kết quả từ 25 – 250 khuẩn lạc


Tính tốn kết quả:
N
A =-----------------------------------n1V1f1 + …+ niVifi
1.6. Thuyết minh quy trình
1.6.1. Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 90
ml (hoặc 225 ml) dung dịch pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập
mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá
2,5 phút. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ
có được dung dịch pha lỗng là 10-1.
Dich pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette
(pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng
đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha lỗng 10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được
các độ pha lỗng cần thiết.
1.6.2. Đổ đĩa
Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ 30 – 300 tế bào vi sinh vật.
Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha lỗng vào giữa đĩa
petri vơ trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2 – 3 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào
mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 45 – 500C. Trộn đều
mẫu vào môi trường bằng cách xoay trịn đĩa petri xi và ngược chiều kim đồng hồ từ
3 – 5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc
1.6.3. Ủ
Các đĩa được lật ngược lại và nuôi ủ ở 300C trong 72 giờ
1.6.4. Đọc kết quả

8


Hình 1: Tổng số vi sinh vật hiếu khí

Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm
từ 30 – 300 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu
được tính như sau:
N
A (CFU/g)

=
n1Vf1 + … + niVfi

Trong đó:

A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào mơi trường
f: độ pha loãng tương ứng

9


Bài số 2: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORMS
-------------------------2.1. Định nghĩa Coliforms
Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí
tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ.
Nhóm coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật.
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong
thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện
của các vi sinh vật gây bệnh khác.
2.2. Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên mơi trường thạch chọn

lọc thích hợp chứa lactose. Sau khi ủ 370C + 10C trong 24 – 48 giờ, đếm số lượng
khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường
chọn lọc Coliforms là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng
thời mơi trường cịn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và các tác nhận chỉ thị
như neutral red, crystal violet. Khẳng định các dòng khuẩn lạc đặc trưng bằng môi
trường canh chọn lọc như canh BGBL.
2.3. Môi trường sử dụng
-

Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)

-

Violet Red Bile Agar (VRB)

-

Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

2.4. Dụng cụ
-

Đĩa petri

-

Ống nghiệm

-


Ống Durnham

-

Chai thủy tinh 250 ml

-

Tủ ấm 370C

2.5. Quy trình phân tích
25g mẫu + 225ml SPW

đồng nhất trong 30 giây

độ pha loãng 10-1

10


Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vơ trùng. Sau đó đổ mơi
trường TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30’

Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h

Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối
mật, đường kính > 0.5 mm


Ở mỗi đĩa chọn 3 – 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL

Ủ 370C + 0,5 trong 24 giờ

Tỷ lệ xác nhận R:
Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL
R = --------------------------------------------------Số khuẩn lạc đã cấy

Tổng số Coliforms (cfu/g)
N
A = --------- x R
nVf

11


2.6. Thuyết minh quy trình
2.6.1. Chuẩn bị mẫu
Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Nhưng q trình pha lỗng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng mẫu chứa
khoảng <100 khuẩn lạc
2.6.2. Cấy mẫu
Cấy chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất
vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mỗi đĩa xuất
hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc.
Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội
đến 450C, trộn đều dịch mẫu với mơi trường bằng cách xoay trịn đĩa petri xi và
ngược chiều kim đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để phục hồi
khả năng của Coliforms. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông
đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 + 10C trong 24 giờ.

2.6.3. Đọc kết quả
Chọn các đĩa có số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc
Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm và đường kính >0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có
vùng tủa muối mật

Hình 2: Khuẩn lạc Coliforms trên mơi trường VRB
2.6.4. Khẳng định
Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã
đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh BGBL và ủ
ở 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durnham.
Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khẩn lạc khẳng
định

12


Hình 3: Kết quả khẳng định Coliforms trên mơi trường BGBL
2.6.5. Tính tốn kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Coliforms theo
công thức:
N
A (CFU/g hay CFU/ml)

=

xR
n1vf1 + … + nivfi

Trong đó:


N: tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
v: thể tích cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha lỗng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỷ lệ xác nhận

Kết quả Coliforms được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ có cơ
số thập phân.

13


Bài số 3: ĐỊNH TÍNH E.COLI
---------------3.1. Định nghĩa
Coliforms là những trực khuẩn gram âm, khơng sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí
tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ.
Coliforms chịu nhiệt là coliforms có khả năng lên men lactose, sinh acid và sinh
hơi ở nhiệt độ 440C trong 24 – 48 giờ.
Coliforms phân (feacal Coliform) là coliform nhiệt có thử nghiệm indol trong mơi
trường tryptom dương tính.
E.Coli là coliforms phân có nghiệm pháp IMViC lần lượt là + + - -.
3.2. Nguyên tắc
Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay khơng phát hiện
E.Coli trong một khối lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh (BGBL), kiểm tra trên môi trường phân lập
(EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC)
3.3. Mơi trường sử dụng
-

Mơi trường TSA


-

Canh BGBL

-

Môi trường EMB

-

Canh Trypton

-

Canh MR - VP

-

Thạch Simmon Citrate

-

Thuốc thử Kovac’s

-

Thuốc thử Methyl Red

-


Thuốc thử α-naphtol 5%

-

KOH 40%

3.4. Dụng cụ
-

Đĩa petri

-

Ống nghiệm - ống Durnham

-

Bể điều nhiệt 440C

-

Tủ ấm 370C
14


25 g mẫu
3.5. Quy trình phân
tích + 225 ml SPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây
độ pha loãng 10-1


Lấy 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào 10 ml môi trường BGBL

Ủ ở 440C + 0,5 trong 24 giờ

Chọn các ống sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB.
Mẫu khơng sinh hơi được coi là âm tính E. Coli

Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của E. Coli trên EMB: trịn lồi, đường kính
<0,5mm, có ánh kim tím

Cấy chuyển sang TSA

Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ

Cấy vào môi trường 1 trypton, 2 MR-VP, 1 Simmons Citrate

Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ

Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC

Kết luận
15


3.6. Thuyết minh quy trình
3.6.1. Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị mẫu tương tự như bài 1

3.6.2. Tăng sinh
Cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 10ml canh
BGBL, ủ 440C trong 24 giờ.
3.6.3. Phân lập
Sau 24 giờ, chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (mơi trường đục và có
sinh hơi) và cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB. Ủ ở 370C trong 24 giờ
Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli: khuẩn lạc tròn, màu tím, có bờ đều, đường kính 0,5
mm, có ánh kim tím.

Hình 4: Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên mơi trường EMB
3.6.4. Khẳng định
Những khuẩn lạc nghi ngờ được thực hiện qua các bước thử nghiệm sinh hóa (thực
hiện nghiệm pháp IMViC).
Chọn ít nhất 2 khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy chuyển sang môi
trường rắn không chọn lọc (môi trường TSA), ủ ở 370C trong 24 giờ.
Các thử nghiệm sinh hóa được dùng để khẳng định E.Coli như sau:

1

3
2
Hình 5: Các thử nghiệm sinh hóa

4

(1): Thử nghiệm Indole
(2): Thử nghiệm Methyl red
16



(3): Thử nghiệm Voges – Proskauer
(4): Thử nghiệm Citrate
STT

Thử nghiệm sinh hóa

Kết quả

1

Indol

+

2

Methyl Red

+

3

Voges Proskauer

-

4

Khả năng sử dụng citrate


-

3.6.5. Báo cáo kết quả
Phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 10 g (25 g) mẫu

17


Bài số 4: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS
---------------------4.1. Nguyên tắc
Cấy trang một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch chọn lọc. Sau khi
ủ và đếm những khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng và khơng đặc trưng của S.
aureus. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các đặc trưng
khác. Kết quả được xác định bằng số khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, nồng độ pha
lỗng và hệ số xác nhận.
4.2. Mơi trường sử dụng
-

Môi trường BP

-

Môi trường TSA

-

Huyết tương thỏ

4.3. Quy trình thực hiện
25g mẫu + 225ml SPW đồng nhất trong 30 giây

pha loãng 10-1

độ

Lấy 1 ml mẫu ở độ pha lỗng 10-1 cho vào đĩa mơi trường
BP có bổ sung egg yolk

cấy trang

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48h

KL đặc trưng của S.aureus trên BP: trịn, lồi, có tâm đen và
có quầng sáng bao quanh

Chọn 5 KL đặc trưng cấy chuyển trên môi trường TSA

Cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2 ml huyết tương thỏ

18


Ủ ở 370C và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu khơng có biểu hiện ngưng
kết sẽ ủ tiếp tục đến 24 giờ. Xác định tỷ lệ ngưng kết R

Tổng số S. aureus (cfu/g)
N
S = --------------nVf
4.4.

Thuyết minh quy trình


4.4.1. Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị mẫu như tương tự bài 1
4.4.2. Cấy mẫu
Dùng micropipette chuyển 0,1ml dịch mẫu đã pha lỗng vào mơi trường BP. Dùng
que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho đến khi khô. Thực hiện lặp lai 3 đĩa BP ở
mỗi nồng độ pha loãng. Ủ ở 370C trong 48 giờ đối với môi trường BP.
4.4.3. Đọc kết quả
Sau 48 giờ, trên môi trường Baird Parker khuẩn lạc S. aureus có đường kính
khoảng 0,5 – 1 mm, lồi, đen bóng, có vịng sáng rộng khoảng 1 – 2 mm bao quanh.
Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa có các khuẩn lạc có các đặc điểm trên và tiếp tục ủ đến
48 giờ. Sau 48 giờ, các khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5 mm, vòng
sáng rộng khoảng 2 – 4 mm. Có một số dịng S. aureus khơng tạo các khuẩn lạc có các
đặc điểm trên. Cần đếm và đánh dấu cả 2 dạng khuẩn lạc.

Hình 6: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường BP
4.4.4. Khẳng định
19


Trên môi trường BP: Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng
từ môi trường BP cấy vào môi trường TSA. Ủ ở 370C trong 24 giờ. Cấy sinh khối vi
sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường huyết tương thỏ. Ủ ở 370C. Theo dõi phản
ứng đông tụ huyết tương trong 2, 4, 6, 8, 24 giờ. Tính tỷ lệ khẳng định trên các khuẩn
lạc đặc trưng và khơng đặc trưng.
4.4.5. Tính tốn kết quả
Số lượng S. aureus trong mẫu được tính như sau:
10
Số S. aureus (CFU/g)


=

(Nt x Ht + Na x Ha)
F1 + F2

Trong đó: F: độ pha lỗng
Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng
Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng
Số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng ĐHT dương tính
Ht =
Số khuẩn lạc đặc trưng
Số khuẩn lạc không đặc trưng cho phản ứng dương tính
Ha =
Số khuẩn lạc khơng đặc trung

20


Bài số 5: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
--------------5.1. Ngun tắc
Phát hiện có hay khơng có Salmonella trong khối lượng mẫu xác định. Quy trình
phát hiện Salmonella trong thực phẩm được thực hiện qua 4 bước:
-

Tiền tăng sinh

-

Tăng sinh chọn lọc


-

Phân lập

-

Khẳng định

5.2. Môi trường sử dụng
-

Môi trường canh RV

-

Môi trường XLD

-

Môi trường TSA

-

Môi trường TSI

-

Môi trường Mannitol Phenol Red both

-


Môi trường Urea broth

-

Mơi trường LDC

5.3. Quy trình thực hiện
25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây
độ pha loãng 10-1

Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h

Lấy 0,1 ml canh trường cho vào 10 ml môi trường RV

Ủ ở 420C + 0,5 trong 24 giờ

21


Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 370C, 24h

KL đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm
đen đơi khi tâm đen q lớn bao trùm của khuẩn lạc, môi trường quanh
chuyển sang màu đỏ

Cấy chuyển sang môi trường TSA

Ủ ở 370C trong 24 giờ


Cấy chuyển vào mơi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI,
Mannitol phenol red broth, Urea broth, LDC both

Ủ ở 370C trong 24 giờ

Biểu hiện đặc trưng của Salmonella: Trên TSI: đỏ/vàng/ H2S (+)/ gas
(+); Mannitol (+); Urea (-), LDC (+)

Kết luận: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25 g mẫu
5.4. Thuyết minh quy trình
5.4.1. Tiền tăng sinh

22


Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thường: cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng. Thêm
225ml dung dịch pepton đệm và đồng nhất mẫu. Thời gian đồng nhất mẫu có thể là 15
hoặc 30 giây tùy theo từng loại mẫu. Ủ 370C trong 24 giờ.
5.4.2. Tăng sinh chọn lọc
Trộn môi trường canh sau khi đã ủ 24 giờ trước khi cấy chuyển 0,1ml sang môi
trường tăng sinh chọn lọc RV. Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 420C trong thời gian 24 giờ
5.4.3. Phân lập
Dùng que cấy vòng lấy một vịng sinh khối vi sinh vật từ mơi trường tăng sinh
chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc cho Salmonella như: XLD, BPLS, BSA,
HE … Cường độ chọn lọc, mức độ đặc trưng và hình thái biểu hiện của khuẩn lạc
Salmonella trên từng môi trương khác nhau. Để nhận dạng và chọn lọc được tất cả các
dòng Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau:
-

Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay khơng có tâm đen.


Một số dịng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc. Môi trường XLD chuyển
sang màu hồng.

Hình 7: Khuẩn lạc Salmonella trên mơi trường XLD
-

Mơi trường BPLS: các khuẩn lạc Salmonella có màu hồng nhạt, trong suốt,

xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển thành đỏ.

23


Hình 8: Khuẩn lạc Salmonella trên mơi trường BPLS
Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 370C trong 22 – 26 giờ.
Sau khi ủ, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella để khẳng định bằng các thử
nghiệm sinh hóa và thử nghiệm các đặc tính kháng nguyên.
5.4.4. Khẳng định
Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết
thanh. Từ mỗi mơi trường phân lập, cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi
trường không chọn lọc (môi trường TSA), ủ ở 370C trong 24 giờ, các khuẩn lạc xuất
hiện trên môi trường này được sử dụng để thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
a. Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa
Các thử nghiệm sinh hóa chính được sử dụng cho Salmonella là lên men glucose,
lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, ODC, LDC, mannitol. Các chủng
Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau:
-

Thử nghiệm trên môi trường KIA hoặc TSI: Salmonella chỉ lên men được


glucose trong các mơi trường nói trên vì thế phần nghiêng có màu đỏ, phần sâu có màu
vàng. Đa số các dịng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện màu đen
trên mơi trường. Có thể có hiện tượng sinh hơi qua làm vỡ thạch môi trường này hoặc
môi trường bị đẩy lên trên rạo ra một khoảng trống bên dưới ống nghiệm.

Hình 9: Kết quả trên mơi trường TSI
-

Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy, môi trường chuyển thành kiềm, màu

môi trường được chuyển sang màu ban đầu

24


Hình 10: Thử nghiệm LDC (+)
-

Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi

pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam.

Hình 11: Thử nghiệm Urea (-)
-

Lên men mannitol (+): mơi trường sau khi ni cấy bị acid hóa chuyển sang

màu vàng.


Hình 12: Thử nghiệm Mannitol (+)
-

Thử nghiệm Indol, VP (-)

b. Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh
Thử nghiệm kháng huyết thanh phải được thực hiện song song với mẫu trắng (dung
dịch nước muối sinh lý) nhằm loại trừ khả năng ngưng kết giả. Dùng kháng huyết
thanh Salmonella polyvalent O và Salmonella polyvalent H. Phản ứng dương tính khi
25