TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
-------------------------

LÊ THỊ NGỌC SÂM

ẢNH HƢỞNG CỦA BAP (6 – benzyl amino purin) VÀ
NAA (α – napthalene acetic acid) ĐẾN QUÁ TRÌNH

PHÁT SINH HÌNH THÁI MÔ NUÔI CẤY
CỦA GIỐNG CÚC VÀNG HÈ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
TRƢỜNG KHOA
ĐẠI HỌC
SƢ–PHẠM
SINH
KTNNHÀ NỘI 2
------------------------KHOA
SINH – KTNN
-------------------------

LÊ THỊ NGỌC SÂM

LÊ THỊ NGỌC SÂM

ẢNH HƢỞNG CỦA BAP (6 – benzyl amino purin) VÀ
NAA (α – napthalene acetic acid) ĐẾN QUÁ TRÌNH

PHÁT SINH HÌNH THÁI MÔ NUÔI CẤY
ẢNH HƢỞNG
CỦA
BAP VÀ
NAA
ĐẾN
QUÁ TRÌNH
CỦA
GIỐNG
CÚC
VÀNG
HÈ
PHÁT SINH HÌNH THÁI MÔ NUÔI CẤY CỦA
GIỐNG CÚC VÀNG HÈ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
KHÓA
LUẬN
TỐT
NGHIỆP
ĐẠI
Chuyên
ngành:
Sinh
lý học thực
vậtHỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH

PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH

HÀ NỘI, 2018
Hà Nội, 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Nguyễn Văn Đính –
Khoa Sinh KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình hƣớng dẫn,
động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình
của TS. La Việt Hồng, cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý học
thực vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân
đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh
lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều
kiện thuận lợi về thiết bị, phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, 14 tháng 05 năm 2018
Sinh viên


Lê Thị Ngọc Sâm


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi do PGS.TS
Nguyễn Văn Đính hƣớng dẫn và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự
khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa
đƣợc ai công bố.
Hà Nội, 14 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Lê Thị Ngọc Sâm


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA

α- Napthalene acetic acid

BAP

6- Benzyl amino purin

MS

Murashige và Skoog

ĐHSP


Đại học Sƣ phạm

Cs

Cộng sự

TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................
MỤC LỤC ...................................................................................................................
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài. .........................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu ...................................................................................3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu. .................................................................................3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. .....................................................3
NỘI DUNG................................................................................................................ 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 4
1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây hoa cúc ......................................4
1.1.1. Đặc điểm phân loại ..............................................................................4
1.1.2. Phân bố các giống hoa cúc trồng .......................................................5
1.1.3. Đặc điểm hình thái ...............................................................................5
1.1.4. Điều kiện sinh thái của cây hoa cúc ...................................................6

1.2.Tình hình nghiên cứu nhân giống cúc trên thế giới và ở Việt Nam ..........8
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ...............................................................8
1.2.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam ...............................................................10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................ 12
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...............................................................................12
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................12
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ..........................................................12


2.1.3. Điều kiện nuôi cấy..............................................................................12
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................13
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................13
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................14
2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu. ...................................................................... 15
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 16
3.1. Đặc điểm phát sinh hình thái từ mô lá của giống hoa cúc Vàng Hè .....16
3.1.1.

Sự tạo mô sẹo (callus) ....................................................................16

3.1.2.

Sự phát sinh chồi từ mô sẹo lá.......................................................18

3.2. Đặc điểm giải phẫu mô sẹo từ lá của giống hoa cúc Vàng Hè ..............21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 27


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1

Công thức thí nghiệm.

Bảng 3.1

Số chồi phát sinh trên các môi trƣờng khác nhau, sau 5 tuần nuôi
cấy.


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1

Các mảnh lá đƣợc cắt từ thân cây hoa cúc.

Hình 3.1

Mô sẹo hình thành từ cuống lá trên môi trƣờng MS với BAP
0,75mg/l và NAA 0,25mg/l.

Hình 3.2

Mô sẹo hình thành từ mép lá trên môi trƣờng MS với BAP
1,5mg/l và NAA 0,25mg/l.

Hình 3.3

Mô sẹo hình thành ở mặt tiếp xúc với môi trƣờng nuôi cấy trên
môi trƣờng MS với BAP 1,5mg/l và NAA 0,25mg/l.


Hình 3.4

Mô sẹo bắt đầu hình thành sau 10 – 14 ngày nuôi cấy trên môi
trƣờng MS với BAP 0,5mg/l và NAA 0,25mg/l.

Hình 3.5

Các nốt nhỏ li ti xuất hiện sau 10 ngày nuôi cấy.

Hình 3.6

Chồi mọc riêng lẻ trên môi trƣờng MS với BAP 0,25mg/l và
NAA 0,5mg/l.

Hình 3.7

Chồi mọc thành cụm trên môi trƣờng MS với BAP 0,5mg/l và
NAA 0,25mg/l.

Hình 3.8

Chồi hoàn chỉnh trên môi trƣờng MS với BAP 0,75mg/l và
NAA 0,25mg/l.

Hình 3.9

Chồi hoàn chỉnh trên môi trƣờng MS với BAP 0,5mg/l và
NAA 0,25mg/l

Hình 3.10


Mô sẹo biệt hóa thành rễ trong môi trƣờng MS với BAP 0,75
mg/l và NAA 0,25 mg/l.

Hình 3.11

Mô sẹo biệt hóa thành rễ trong môi trƣờng MS với BAP 0,5
mg/l và NAA 0,25 mg/l.

Hình 3.12

Lát cắt ngang qua v ng tạo mô sẹo của lá cúc sau 3 tuần nuôi
cấy trên môi trƣờng MS với BAP 1,5mg/l và NAA 0,25mg/l.


Hình 3.13

Li be bắt màu hồng cacmin trên môi trƣờng MS với BAP 0,75
mg/l và NAA 0.25 mg/l.

Hình 3.14

Các vòng Li be màu hồng đậm hình thành sau 5 tuần nuôi cấy
trên môi trƣờng MS với BAP 0,5 mg/l và NAA 0,25 mg/l.

Hình 3.15

Các trung tâm mô phân sinh ngọn chồi hình thành trên môi
trƣờng MS với BAP 0,75mg/l và NAA 0,25mg/l.



MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài.
Hiện nay, ngành sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển mạnh và
mang tính thƣơng mại cao. Ở Việt Nam trong những năm gần đây xuất khẩu
hoa tƣơi đã trở thành một ngành sản xuất có thu nhập cao và cho năng suất ổn
định cho ngƣời sản xuất. Trong đó, hoa cúc là một trong những loại hoa đƣợc
trồng phổ phổ biến nhất.
Hoa cúc (Chrysanthemum) có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản,
Việt Nam và một số nƣớc Châu Âu. Hoa cúc không chỉ hấp dẫn ngƣời tiêu
d ng về màu sắc, hình dáng và m i thơm kín đáo mà còn thu hút các nhà sản
xuất kinh doanh bởi đặc trƣng rất bền. Với các ƣu thế đó, hoa cúc đang đƣợc
các nhà trồng hoa chú trọng đầu tƣ và phát triển.
Ở Việt Nam năm 2002 trồng hoa cúc với diện tích 1.484 ha chiếm tới
16,84% các chủng loại hoa, đạt giá trị 129,49 tỷ đồng, năm 2003 với diện tích
1.760 ha, đạt giá trị 142,054 tỷ đồng, chiếm 20,04% giá trị hoa cây cảnh cả
nƣớc [41].
Hiện nay việc nhân giống hoa cúc kết hợp với công nghệ nuôi cấy mô
tế bào thực vật để tạo ra cây con nhanh chóng và sạch bệnh đang đƣợc phổ
biến rộng rãi. Một số công trình nghiên cứu hoa cúc kết hợp sử dụng công
nghệ nuôi cấy mô tế bào:
Năm 2016, Hoàng Thị Thanh – Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 [16] đã nghiên
cứu: “Xây dựng quy trình nhân nhanh năm giống hoa cúc (tím huế, pha lê,
phan trắng, pháo hoa, kim cƣơng) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”.

1


Năm 2014, Phạm Thị Tƣơi - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 [17] đã nghiên
cứu: “Xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01 (Chrysanthemum

maximum Seiun - 3) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”.
Trong số các giống cúc hiện nay tại Việt Nam, cúc Vàng Hè là giống
có năng suất cao, các đặc điểm về chất lƣợng hoa lại ph hợp với nhu cầu
xuất khẩu nên hiện đang trồng phổ biến. Để nâng cao năng suất cây trồng
ngƣời ta đã d ng các chất điều tiết sinh trƣởng để điều chỉnh quá trình sinh
trƣởng, phát triển của cây trồng. Một số công trình nghiên cứu sự ảnh hƣởng
của chất điều tiết sinh trƣởng lên quá trình sinh trƣởng và phát triển của hoa:
Năm 2005, Trần Văn Hoàng – Đại học Nông Lâm TP.HCM [8] đã
nghiên cứu “Ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng đến quá trình nuôi
cấy In vitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium”.
Tạ Nhƣ Thục Anh và cs năm 2008 [1] đã nghiên cứu đề tài “Bƣớc đầu
nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát sinh
hình thái của mô lá cây hoắc hƣơng (Pogostemon cablin (Blaco) Benth) nuôi
cấy in vitro”.
Tuy nhiên, sử dụng các chất điều tiết sinh trƣởng này nhƣ thế nào và
dùng với nồng độ bao nhiêu đê mang lại hiệu quả tốt nhất? Chính vì những lí
do này mà tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của BAP và NAA
đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy của giống cúc Vàng Hè” để
chọn môi trƣờng ph hợp tạo ra số lƣợng cây con lớn, đồng đều và sạch bệnh
trong thời gian ngắn, làm tiền đề cho việc cung cấp cây giống có chất lƣợng
tốt phục vụ cho sản xuất, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen.

2


2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP và NAA đến cây hoa cúc Vàng Hè
nhằm mục đích xác định đƣợc công thức ph hợp cho quá trình phát sinh hình
thái của giống cúc Vàng Hè.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu.

Nghiên cứu đặc điểm phát sinh hình thái của mô lá hoa cúc Vàng Hè
dƣới ảnh hƣởng của BAP và NAA.
Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu mô sẹo từ lá của hoa cúc Vàng Hè dƣới
ảnh hƣởng của BAP và NAA.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.
 Ý nghĩa khoa học:
Cung cấp tƣ liệu khoa học cho nghiên cứu tác động của BAP và NAA
đến kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa cúc Vàng Hè.
 Ý nghĩa thực tiễn:
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đƣa ra công thức ph hợp nhất
cho sự phát sinh hình thái giống hoa cúc Vàng Hè, góp phần xây dựng quy
trình nhân giống cây hoa cúc Vàng Hè bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô; phục
vụ nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong lai tạo giống.

3


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây hoa cúc
1.1.1. Đặc điểm phân loại
* Hoa cúc là loại cây hai lá mầm (Dicotyledonace) thuộc phân lớp
cúc (Asterydae), bộ cúc (Asterales), họ cúc (Asteraceae), phân họ giống hoa
cúc (Asteroideae), chi Chrysanthemum. Theo nghiên cứu của Langton (1989)
cho biết trên thế giới có hơn 7000 giống cúc đã đƣợc đƣa vào sử dụng với
chủng loại và màu sắc đa dạng. Qua hai cuộc hội thảo quốc tế về họ
Asteraceae năm 1994 đã có sự thống nhất tƣơng đối về hệ thống học của họ
này. Họ cúc trên thế giới đƣợc xếp trong 2 phân họ, 13 tông [15]. Ở Việt
Nam có 2 phân họ và 12 tông nhƣng hiện tại chia làm 17 tông. Họ cúc có
khoảng 1550 chi với 23.000 loài.

* Theo Nguyễn Quang Thạch và Đặng Văn Đông (2002) [15] đã dựa
cánh hoa để chia hoa cúc làm 2 nhóm là cúc đơn và cúc kép.
- Cúc đơn: Thƣờng là dạng hoa nhỏ đƣờng kính hoa từ 2-5 cm, chỉ có
1-3 hàng cánh ở vòng ngoài c ng còn vòng trong là cánh hoa rất nhỏ thƣờng
đƣợc gọi là cồi hoa.
- Cúc kép: Hoa có đƣờng kính từ 5-15 cm, có nhiều cánh xếp từng
vòng sít nhau, có loại cánh dài cong, có loại cánh ngắn.
* Dựa vào thời vụ trồng: dựa vào đặc tính chịu nhiệt của hoa cúc để
phân loại và thƣờng phân ra làm hai loại đó là cúc đông và cúc hè. Cúc đông
là một số giống có nguồn gốc ôn đới, có tính chịu lạnh và trồng chủ yếu vào
mùa đông. Cúc hè là một số giống chịu nhiệt độ cao trồng đƣợc vào m a hè.

4


1.1.2. Phân bố các giống hoa cúc trồng
Hoa cúc lần đầu tiên đƣợc trồng ở Trung Quốc nhƣ một loại thực vật có
hoa khoảng 500 năm trƣớc công nguyên. Các giống cúc đã đƣợc giới thiệu từ
Trung Quốc đến Nhật Bản trong thế kỉ thứ 8 sau công nguyên. Hà Lan dƣờng
nhƣ là quốc gia đầu tiên ở Châu Âu nhập khẩu hoa cúc vào năm 1688 nhƣng
nó không thể sống.
Đến năm 1789, ba giống đƣợc nhập khẩu vào Pháp từ Trung Quốc
trong đó chỉ có 1 giống sống sót và đƣợc trồng ở Anh năm 1975. Tám giống
sau đó đƣợc Anh nhập vào từ Trung Quốc vào đầu thế kỉ 19 và nó tăng dần
lên con số 48 giống vào năm 1826.
Năm 1836, hoa cúc đƣợc đƣa tới Tasmania từ Anh và đƣợc trồng ở
New South Wales, Australia năm 1843, nó cũng đƣợc đƣa đến Victoria (Mĩ)
vào năm 1855 và đến lƣợt New Zealan vào năm 1960.
Ngày nay, hoa Cúc đƣợc trồng rộng rãi trên thế giới. Ở Việt Nam đầu
thế kỉ thứ XIX, hoa cúc đã đƣợc trồng thành các v ng chuyên canh. Hiện nay

Đà Lạt có diện tích trồng hoa cúc lên tới 5000 ha; Hà Nội đã hình thành
những v ng chuyên canh nhƣ: Tây Tựu (Từ Liêm) diện tích xấp xỉ 200 ha,
quận Tây Hồ diện tích 70 ha đảm bảo cung cấp hoa cho ngƣời tiêu d ng.
1.1.3. Đặc điểm hình thái
* Hệ rễ cây hoa cúc: rễ ch m, mọc cạn, theo chiều ngang, phân bố ở tầng
mặt từ 5-20cm. Kích thƣớc các rễ trong bộ rễ cúc chênh lệch nhau không
nhiều, số lƣợng rễ rất lớn. Có 2 loại rễ là rễ mầm và rễ thứ sinh.
* Thân cây hoa cúc: Thuộc thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy, càng lớn
càng cứng, cây dạng đứng hoặc bò. Thân có ống tiết nhựa mủ trắng, mạch có
bản ngăn đơn.

5


* Bộ lá cây hoa cúc: Lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻ th y
lông chim, phiến lá mềm mỏng có thể to hoặc nhỏ, màu sắc xanh đậm hoặc
nhạt, mặt trên gân hình mạng. Mặt dƣới bao phủ một lớp lông tơ.
* Hoa cây hoa cúc: Hoa có nhiều màu sắc khác nhau thích nghi với thụ phấn
nhờ côn tr ng.
* Quả cây hoa cúc: Quả đóng (quả khô không mở), 1 hạt (phát triển từ lá
noãn). Hạt có nội nhũ tế bào.
1.1.4. Điều kiện sinh thái của cây hoa cúc
Theo Nguyễn Quang Thạch (2002) [15] cho thấy cây cúc yêu cầu một
số điều kiện sinh thái sau:
- Đất trồng: Cây hoa cúc ƣa đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều m n, giàu dinh
dƣỡng, đất thoát khí, giữ ẩm tốt nhƣng không ứ nƣớc. pH thích hợp từ 6-7, độ
ẩm 60-70% và độ ẩm không khí thích hợp khoảng 55 – 65% là thuận lợi cho
cây sinh trƣởng và phát triển.
- Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp cho hoa cúc sinh trƣởng và phát triển tốt
là 150C- 200C. Ở thời kì cây con và thời kì ra hoa cây có yêu cầu nhiệt độ cao

hơn. Nếu nhiệt độ không thích hợp, cây sẽ sinh trƣởng và phát triển kém, cho
hoa với chất lƣợng kém, màu sắc không tƣơi, tuổi thọ trung bình giảm…
- Ánh sáng: Cây cúc là cây ngắn ngày, ƣa ánh sáng, ánh sáng ảnh
hƣởng rất lớn tới sự ra hoa và phân hóa mầm hoa của cây cúc.
- Độ ẩm: Độ ẩm đất thích hợp khoảng 60 0C- 700C và độ ẩm không khí
thích hợp khoảng 55 0C-650C là thuận lợi cho cây sinh trƣởng và phát triển.
Độ ẩm tƣơng đối của không khí và đất ảnh hƣởng trực tiếp đến sự quang hợp
và hô hấp của cây hoa cúc. Nếu độ ẩm đƣợc ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây
hút dinh dƣỡng và muối khoáng thuận lợi, cây sinh trƣởng tốt, năng suất và
phẩm chất hoa cao.

6


- Dinh dƣỡng: Nếu thiếu dinh dƣỡng cây sẽ còi cọc, hoa nhỏ và sâu
bệnh hại dễ xâm nhập và phát triển. Nếu bón phân không cân đối, thừa dinh
dƣỡng đạm, cây phát triển vóng cao, dễ bị lốp đổ và khả năng chống chịu
kém.
+ Đạm: Có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trƣởng và phát triển của
cây, tham gia vào cấu tạo diệp lục. Thiếu đạm cây sinh trƣởng kém, cho hoa
nhỏ, nhanh tàn, lá vàng úa, nếu thiếu trầm trọng cây sẽ ngừng sinh trƣởng và
chết. Tuy nhiên, thừa đạm cây sẽ mọc um t m, lá nhiều và yếu ớt dễ phát sinh
bệnh. Hoa cũng yếu dễ bị gục ngã và nhanh tàn.
+ Lân: Giúp cho bộ rễ cây phát triển khoẻ mạnh là tiền đề cho quá
trình sinh trƣởng và phát triển của cây sau này. Lân giúp cho hoa bền, đẹp.
Thiếu lân lá thƣờng có màu tím, màu tím từ mép lá lan dần vào bên trong.
Hoa nhỏ, chóng tàn, màu sắc nhợt nhạt. Trong quá trình sinh trƣởng của cây,
cây cần lân nhiều vào giai đoạn sinh trƣởng sinh thực tức là khi ra hoa kết
qủa. Vì vậy, cần phải hiểu nhu cầu của cây để cung cấp lân vào các gi ai đoạn
hợp lý.

+ Kali: Giúp cho cây cứng cáp, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của
môi trƣờng và sâu bệnh hại. Cây cần kali nhiều vào lúc ra hoa, giúp cành hoa
cứng cáp, màu sắc hoa tƣơi, bền lâu. Nếu thiếu kali thì đầu chóp lá già, bắt
đầu vàng và chết khô, sau đó là phần thịt lá .
+ Canxi: Giúp cho cây chống chịu tốt với điều kiện bất lợi. Thiếu
canxi trên lá non xuất hiện những đốm màu xanh nhạt, nghiêm trọng hơn là bị
chết khô.

7


1.2.Tình hình nghiên cứu nhân giống cúc trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Do giá trị kinh tế cũng nhƣ giá trị sử dụng của cây hoa rất cao mà trên
thế giới có rất nhiều nƣớc đi sâu nghiên cứu kỹ thuật trồng hoa, kỹ thuật nhân
và tạo giống hoa mới.
Năm 1990 khi nghiên cứu về ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng
dinh dƣỡng, Lunegent và Wardly (1990) [28] đã kết luận: Đoạn thân cúc cao
1-2 cm cho phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy Benzyl Adenin thì chúng
hình thành 2-3 chồi so với mẫu bản và không có rễ bất định, còn trong môi
trƣờng 0,1- 0,3 mg/l axit Indol Butyric thì hình thành 1-2 chồi và có rễ bất
định.
Năm 1990, Kenth và Toress [24] đã nuôi cấy mô thành công từ đoạn
thân và lá của giống hoa cúc màu tím trên môi trƣờng MS. Tỷ lệ hình
thành chồi đạt 100% và trung bình các cây đƣợc nuôi cấy mô sau 3-4 tháng
đã ra hoa.
Sun-Ja Kim và cộng sự (2004) [35] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của
chất lƣợng ánh sáng đến tăng trƣởng chiều dài thân và lá của của cây
cúc trong nuôi cấy in vitro.
Khattak A. M. và cộng sự (2004) [25] đã tiến hành thí nghiệm nghiên

cứu về ảnh hƣởng của ánh sáng bổ sung và mật độ trồng hoa cúc đến chiều
cao cây hoa cúc.
Việc sử dụng đỉnh sinh trƣởng để nuôi cấy in vitro cũng đƣợc thực hiện
thành công bởi Fukai, Goi và Tanaka (1991) [22]. Các tác giả đã nghiên cứu
phƣơng pháp tối ƣu để tạo mẫu vô tr ng có tỷ lệ sống và tái sinh chồi cao
nhất. Kết quả thí nghiệm cho thấy, bảo quản chồi đỉnh cúc trƣớc nuôi cấy 2
ngày trong điều kiện lạnh dần cứ 0,20C/phút đến -400C với 10% dimethyl

8


sufoide và 3% glucose cho tỷ lệ sống và tái sinh chồi rất cao, có loài lên tới
100%.
Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các bộ phận khác
của cây hoa cúc để nuôi cấy nhƣ đoạn thân, mẫu lá,... cho thấy các đoạn thân
có khả năng tái sinh chồi cao hơn các mẫu lá. C ng năm đó Lu, Nugent,
Wardley [27] đã thành công trong việc tái sinh cây trực tiếp từ những đoạn
thân của hoa cúc Chrysanthemum morifolium Ramat trên môi trƣờng cơ bản
MS có bổ sung 0,2 - 0,5 mg/l BAP và 0,2 - 2 mg/l NAA, tỷ lệ tạo chồi cao
nhất là 100%. Đối với những đoạn thân của cây đã thành thục, khả năng phát
sinh chồi cao hơn. Ngƣời ta còn có thể nhân giống hoa cúc bằng cách tái sinh
callus từ các mẫu cấy thân và lá. Ngoài ra, việc sử dụng cánh hoa, quả để làm
nguyên liệu nuôi cấy tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp cũng đƣợc nhiều nhà
khoa học nghiên cứu.
Các nhà khoa học Benetka và Pavingerova, 1995 [20] đã sử dụng
kỹ thuật chuyển gen lạ vào genome của giống hoa để tạo ra giống mới, giống
cúc Chrysanthemum (Dendranthma grandiflora Tzvelev.) CV. “White
Snowdon” đƣợc chuyển gen (pTiB6S3 T-DNA) của Agrobaceerium
tumefacciens (B6S3 T-DNA) hoặc gen GUS trong cấu trúc di truyền.
Mitouchkina và cs, 2000 [32] đã nghiên cứu chuyển gen rolC bằng

việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đến biến đổi hình dáng cây
và cấu trúc hoa cúc. Đoạn gen rolC dƣới tác động của đoạn promoter 35S
trên plasmid pPCV003 với dòng vi khuẩn Agrobacterium GV3101 đƣợc
chuyển vào cây hoa cúc White Snowdon, hay còn gọi là giống Bông tuyết
(CN42).

9


1.2.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về cây cúc cũng khá phong
phú, tuy nhiên hiện nay hƣớng nghiên cứu chủ yếu là nhân giống in vitro:
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô là Nguyễn
Xuân Linh và các cộng sự năm 1998 thì khả năng tái sinh và nhân giống của
cây cúc là rất cao: cúc CN93 với hệ số nhân là 611 /năm, vàng Đài Loan
510-610/năm, cúc hồng Đài Loan 310-410 /năm và cúc đỏ Hà Lan 311/năm.
Quy trình nhân giống nuôi cấy mô trên cây hoa cúc gồm có 5 bƣớc cơ bản:
tạo nguyên liệu khởi đầu, tạo và nhân nhanh chồi trong môi trƣờng dinh
dƣỡng nhân tạo, tạo cây hoàn chỉnh, đƣa cây ra vƣờn ƣơm và đƣa cây giống
trồng ra ruộng sản xuất. Nguồn cấy mô ban đầu là các đỉnh sinh trƣởng, các
mầm bất định ở nách lá, mô lá… ngoài ra việc nuôi cấy mô cũng có thể dùng
đoạn thân, lá, đài, cánh hoa, nhị… làm mẫu cấy.
Nguyễn Thị Diệu Hƣơng, Dƣơng Tấn Nhựt (2004) [5] khi nghiên cứu
hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống cây hoa cúc (Chrysanthemum indicum
L.) sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng trong môi trƣờng 1/2
MS đã bổ sung BAP kết hợp với NAA, IAA, IBA theo sự biến thiên của các
chất kích thích sinh trƣởng. Kết quả cho thấy trong môi trƣờng 1/2 MS có bổ
sung NAA (0,2-0,5 mg/l), IBA (0,2-0,5 mg/l) đều tạo rễ cho chồi cây hoa cúc
tốt hơn trong môi trƣờng 1/2 MS có bổ sung IAA (0,2-0,5 mg/l).
Đặng Văn Đông (2005) đã nghiên cứu 4 phƣơng pháp nhân giống là:

tách mầm giá, giâm cành từ cây mẹ chọn lọc trong vƣờn, nuôi cấy mô tế
bào, giâm cành từ cây mẹ nuôi cấy mô tế bào.
Để nâng cao chất lƣợng của các cây giống hoa cúc nuôi cấy in vitro
thông qua nuôi cấy thoáng khí, Dƣơng Tấn Nhựt và cs (2005) [12] tiến hành
thí nghiệm nuôi cấy cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) trong các hộp nhựa
tròn có đục lỗ và hộp không đục lỗ. Kết quả cho thấy trọng lƣợng tƣơi và
10


chiều cao cây trong hộp 1 lỗ thoáng khí cao hơn rõ ràng so với cây đƣợc cấy
trong hộp không thoáng khí, có tỉ lệ sống cao, sinh trƣởng, phát triển tốt khi ra
vƣờn ƣơm.
Tác giả Trần Thị Thu Hiền và cộng sự (2007) [ 7 ] đã nghiên cứu
phƣơng pháp nhân giống hoa cúc CN97 bằng nuôi cấy mô tế bào đã đƣa ra
kết luận: ở giai đoạn nhân nhanh, môi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA là
môi trƣờng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh phù hợp nhất cho chồi cúc in vitro.
Năm 2009, tác giả Dƣơng Tấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam [ 1 1]đã
công bố công trình Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng của
cây hoa Cúc (Chrysanthemum morifolium cv. “nut”) nuôi cấy Invitro đã
nghiên cứu ảnh hƣởng của ánh sáng đơn sắc đỏ, cam, vàng, lục, lam, chàm,
tím trong quá trình nuôi cấy in vitro của loài này.
Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Đình Lâm, Dƣơng Tấn Nhựt năm 2012
[13] trong báo cáo khoa học của Tạp chí khoa học và công nghệ đã nghiên
cứu ảnh hƣởng của loại mẫu cấy và hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả
năng tái sinh chồi cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat. Cv.
“Jimba”) nuôi cấy in vitro.

11



CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Giống cúc Vàng Hè. Do Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
- Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, panh gắp, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, pipet,
kéo, bình xịt cồn, …
- Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: nồi hấp khử tr ng,
máy cất nƣớc 2 lần, máy đo pH, cân kỹ thuật, tủ lạnh Hitachi, tủ lạnh sâu,
buồng cấy vô tr ng, cân phân tích.
- Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản : MS + 30 g/l đƣờng sacharose + 7 g/l agar
và chất điều hòa sinh trƣởng của hãng Dulchefa, Hà Lan, pH môi trƣờng là
5,8. Các chất điều hoà sinh trƣởng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy với
các tổ hợp và nồng độ khác nhau. Hấp vô tr ng ở 117 độ trong 15 phút. Các
chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc sử dụng: BAP (6-benzyl amino purin), NAA
(α-napthalene acetic acid).
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy
Tất cả các thí nghiệm đều thực hiện ở điều kiện nhân tạo:
- Nhiệt độ nuôi cấy: 25- 280C
- Độ ẩm trung bình: 50% - 70%
- Ánh sáng: Sử dụng đèn chiếu sáng huỳnh quang
12


- Cƣờng độ chiếu sáng: 2000- 3000 Lux
- Thời gian chiếu sáng: từ 6h – 18h hằng ngày.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc
lại. Các mẫu đƣợc cấy là các lá có kích thƣớc tƣơng đối bằng nhau (Hình 2.1),
chất lƣợng tƣơng đƣơng nhau, đƣợc cắt từ cây cấy vào công thức thí nghiệm
(Bảng 2.1).

Hình 2.1. Các mảnh lá đƣợc cắt từ thân cây hoa cúc
Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm
Công thức

BAP (mg/l)

NAA (mg/l)

Công thức 1

0,25

0,25

Công thức 2

0,5

0,25

Công thức 3

0,75


0,25

Công thức 4

1,25

0,25

Công thức 5

1,5

0,25

Công thức 6

0,25

0,5

Công thức 7

0,5

0,5

Công thức 8

0,75


0,5

13


2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
a) Phương pháp quan sát hình thái mô nuôi cấy bằng kính hiển vi soi nổi
- Bƣớc 1: Cắm dây nguồn điện, bật nguồn sáng.
- Bƣớc 2: Đặt mẫu vật ngay chính giữa bàn mang mẫu, dùng kẹp để giữ
mẫu.
- Bƣớc 3: Điều chỉnh thị kính để quan sát với độ phóng đại 20x.
- Bƣớc 4: Chụp ảnh mẫu vật trên kính [39].
b) Phương pháp giải phẫu mô nuôi cấy
Mô nuôi cấy đƣợc giải phẫu sau 7, 14, 28, 35 ngày nuôi cấy.
Cách tiến hành [40] :
 Cắt mẫu bằng tay:
- Cầm vật cắt bằng tay trái.
- Tay phải cầm lƣỡi dao lam để cắt (dùng một miếng giấy lọc (thấm) làm
thớt cắt).
- Cắt lát thật mỏng thẳng góc với trục của mẫu vật, không nháy lại lát
cắt, lát cắt phải đảm bảo vuông góc với trục thẳng của vật cắt.
 Nhuộm kép lát cắt:
- Bƣớc 1: Ngâm mẫu vào nƣớc javen trong khoảng từ 15-20 phút.
- Bƣớc 2: Rửa sạch mẫu bằng nƣớc cất ba lần.
- Bƣớc 3: Ngâm mẫu trong axit axetic khoảng 2-5 phút.
- Bƣớc 4: Rửa sạch bằng nƣớc cất ba lần.
- Bƣớc 5: Đƣa mẫu nhuộm trong dung dịch xanh metylen trong 15-20
giây.
- Bƣớc 6: Lấy mẫu ra rửa sạch bằng nƣớc cất.
- Bƣớc 7: Nhuộm mẫu trong dung dịch carmin khoảng 30 phút.

- Bƣớc 8: Lấy mẫu ra rửa sạch bằng nƣớc cất.
- Bƣớc 9: Lên kính bằng glyxerin hoặc bằng nƣớc cất.
14


- Bƣớc 10: Đƣa mẫu vật lên kính hiển vi quan sát.
- Bƣớc 11: Ghi lại các hình ảnh bằng máy ảnh.
2.3.Địa điểm tiến hành nghiên cứu.
+ Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật
và vƣờn thực nghiệm, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
+ Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8 /2017 - 4 /2018.
2.4. Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm
Số liệu thực nghiệm đƣợc phân tích theo các tham số thống kê gồm
trung bình mẫu, độ lệch chuẩn, phân tích thống kê số liệu ANOVA 1 yếu tố
và kiểm tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phƣơng pháp LSD của
Fisher trên phần mềm Excel 2010 [10].

15