NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO CHITOSAN
LÀM CHẤT HẤP PHỤ PROTEIN
ỨNG DỤNG TRONG DẪN TRUYỀN THUỐC


i

MỤC LỤC
Trang
TRANG PHỤ BÌA..…………………………………………………………………0
MỤC LỤC.................................................................................................................. i
DANH MỤC HÌNH ẢNH.........................................................................................ii
DANH MỤC PHỤ LỤC...........................................................................................v
1.5.1.1. Cấu trúc của protein.......................................................................27
1.5.1.2. Chức năng của protein...................................................................29
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Tóm tắt phương pháp điều chế hạt nano chitosan làm chất dẫn các loại
thuốc, protein hoặc gen khác nhau...........................................................................12
Bảng 1.2. Chỉ số MIC (μg/ml ) và MBC (μg/ml) của chitosan, nano chitosan (CNP),
nano chitosan nhốt Cu (CNP-Cu) và doxycycline...................................................25
Bảng 1.3. Giá trị MIC và MBC ức chế E. coli, S. choleraesuis và S. aureus (µg/ml)
................................................................................................................................. 26
Bảng 1.4. Tên các acid amin-đơn phân tạo nên protein...........................................27
Bảng 1.5. Các loại protein chức năng......................................................................29
Bảng 3.1. Đặc điểm hạt nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác nhau.....51
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP đến tính chất hạt nano chitosan.................59
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến tính chất hạt nano chitosan................................66
Bảng 3.4. Những mũi IR chính (cm-1) của CS và nano CS-TPP.............................70
Bảng 3.5. Cường độ hấp thu của các dung dịch protein có nồng độ khác nhau.......74
Bảng 3.6. Số liệu khảo sát hiệu suất hấp phụ và khả năng hấp phụ protein.............76

ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo chitin và chitosan.........................................................8
Hình 1.2. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương..........................12
Hình 1.3. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ...................................................13
Hình 1.4. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương.......................14
Hình 1.5. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion............................................15
Hình 1.6. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo............................................16
Hình 1.7. Hình minh họa những cơ chế hấp thu dưỡng chất....................................24
Hình 1.8. Ảnh hiển vi lực nguyên tử (AFM) của tế bào S. choleraesuis sau khi xử lý
với nano chitosan theo thời gian. Chưa xử lý (A), xử lý 30 phút (B), xử lý 1 giờ (C),
xử lý 1,5 giờ (D), xử lý 2 giờ (E), xử lý 3 giờ (F)....................................................25
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu.....................................................................................34
Hình 2.2. Máy đo pH IQ Scientific Instruments (A), máy khuấy từ IKA RET
control-visc (B)........................................................................................................35
Hình 2.3. Máy ly tâm UNIVERSAL 32R HETTICH ZENTRIFUGEN..................35
Hình 2.4. Máy đông cô TELSTAR LYOQUEST.....................................................36
Hình 2.5. Máy sắc ký thẩm thấu gel GPC AGILENT 1100 Series...........................37
Hình 2.6. Hệ thống hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM JSM 7401F.........38


iii

Hình 2.7. Hệ thống hiển vi điện tử truyền qua JEM-1400.......................................39
Hình 2.8. Máy nhiễu xạ tia X Bruker XRD-D8 ADVANCE....................................39
Hình 2.9. Máy đo phổ FT- IR BRUKER EQUINOX 55..........................................40
Hình 2.10. Máy đo phổ Raman HORIBA JOBIN YVON.......................................40
Hình 2.11. Máy quang phổ UV-Vis-NIR-V670, JACCO.........................................41

Hình 3.1. Ảnh FE-SEM của chitosan khi chưa tạo nối............................................44
Hình 3.2. Ảnh FE-SEM chụp phần dung dịch còn lại sau khi ly tâm tách hạt nano
chitosan...................................................................................................................45
Hình 3.3. Phản ứng tạo nối ngang cộng hóa trị giữa chitosan và glutaraldehid.......47
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của natri TPP................................................................47
Hình 3.5. Cơ chế tương tác giữa CS và TPP............................................................48
Hình 3.6. Mối quan hệ giữa tinh thể và nối ngang ion: (a) chitosan tinh thể ban đầu;
(b) chitosan tạo nối ngang ion thấp; (c) chitosan tạo nối ngang ion cao..................48
Hình 3.7. Ảnh hưởng của lực cắt đến sự hình thành hạt nano.................................49
Hình 3.8. Ảnh chụp bột nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác nhau (từ
trái qua phải): phương pháp tạo gel ion với TPP và phương pháp tạo nối ngang cộng
hóa trị với glutaraldehid...........................................................................................50
Hình 3.9. Ảnh FE-SEM của hạt nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác
nhau (từ trái qua phải): phương pháp tạo nối ngang cộng hóa trị với glutaraldehid,
phương pháp gel ion với tripolyphosphat (TPP)......................................................51
Hình 3.10. Ảnh chụp dung dịch nano chitosan điều chế từ các tỷ lệ CS/TPP khác
nhau (từ trái qua phải): 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1...........................................................52
Hình 3.11. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 3:1.. 54
Hình 3.12. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là
3:1............................................................................................................................ 54
Hình 3.13. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 4:1.. 55


iv

Hình 3.14. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là
4:1............................................................................................................................ 55
Hình 3.15. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 5:1.. 56
Hình 3.16. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là
5:1............................................................................................................................ 56

Hình 3.17. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 6:1.. 57
Hình 3.18. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là
6:1............................................................................................................................ 57
Hình 3.19. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 7:1.. 58
Hình 3.20. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là
7:1............................................................................................................................ 58
Hình 3.21. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP đến kích thước hạt...................................59
Hình 3.22. Ảnh chụp dung dịch nano chitosan điều chế ở những điều kiện pH khác
nhau (từ trái qua phải): 4,0; 4,5; 5,0; 5,5.................................................................61
Hình 3.23.Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH=4,0........................62
Hình 3.24. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan ở pH=4,0.............62
Hình 3.25. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH=4,5.......................63
Hình 3.26. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan ở pH=4,5.............63
Hình 3.27. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH=5,0.......................64
Hình 3.28. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan ở pH=5,0.............64
Hình 3.29. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH=5,5.......................65
Hình 3.30. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan ở pH=5,5.............65
Hình 3.31. Ảnh hưởng của pH đến kích thước hạt nano chitosan............................66
Hình 3.32. Ảnh TEM của hạt nano điều chế ở pH=4,0; tỉ lệ chitosan/TPP là 6:1....69
Hình 3.33. Phổ IR của chitosan (a) và hạt nano chitosan (b)...................................70
Hình 3.34. Phổ Raman của chitosan........................................................................71


v

Hình 3.35. Phổ Raman của hạt nano chitosan..........................................................71
Hình 3.36. Giản đồ XRD của CS và nano CS-TPP..................................................73
Hình 3.37. Cường độ hấp thu của các dung dịch protein có nồng độ khác nhau.....75
Hình 3.39. Hiệu suất hấp phụ protein ở những liều lượng hạt nano chitosan khác
nhau......................................................................................................................... 77


DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Kết quả đo GPC của chitosan nguyên liệu..............................................85
Phụ lục 2. Kết quả đo GPC của chitosan nguyên liệu..............................................86
Phụ lục 3. Phổ FT-IR của protein BSA nguyên liệu.................................................87
Phụ lục 4. Phổ FT-IR của chitosan nguyên liệu.......................................................88
Phụ lục 5. Phổ FT-IR của nano CS-TPP...................................................................89
Phụ lục 6. Phổ Raman của chitosan nguyên liệu.....................................................90
Phụ lục 7. Phổ Raman của nano CS-TPP.................................................................92
Phụ lục 8. Giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan nguyên liệu....................................92
Phụ lục 9. Giản đồ nhiễu xạ tia X của nano CS-TPP...............................................93
Phụ lục 11.Phổ UV-Vis protein BSA nồng độ 20 µg/ml..........................................96
Phụ lục 12. Phổ UV-Vis protein BSA nồng độ 30 µg/ml.........................................97
Phụ lục 13. Phổ UV-Vis protein BSA nồng độ 40 µg/ml.........................................97
Phụ lục 14. Phổ UV-Vis protein BSA nồng độ 50 µg/ml.........................................98
Phụ lục 15. Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha loãng, sử dụng hạt nano
CS-TPP ở liều lượng 0,25 mg..................................................................................99
Phụ lục 16. Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha lõang, sử dụng hạt nano
CS-TPP ở liều lượng 0,50 mg................................................................................100


vi

Phụ lục 17. Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha loãng, sử dụng hạt nano
CS-TPP ở liều lượng 1,0 mg..................................................................................101
Phụ lục 18. Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha loãng, sử dụng hạt nano
CS-TPP ở liều lượng 1,5 mg..................................................................................102
Phụ lục 19. Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha loãng, sử dụng hạt nano
CS-TPP ở liều lượng 2,0 mg..................................................................................103



7

MỞ ĐẦU
Ngày nay, với sự phát triển trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khoẻ con
người, nhiều công nghệ mới đã được sử dụng rộng rãi mà tiêu biểu là ứng dụng của
công nghệ nano vào quá trình tổng hợp những chất dẫn thuốc mới.
Nhiều loại peptid và protein được ứng dụng làm thuốc vì khả năng chọn lọc
cao và điều trị hiệu quả. Dẫn truyền thành công những thuốc protein này là chủ đề
nghiên cứu trong nhiều năm nay của ngành dược.
Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong
những năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó ở kích thước nano. Chitosan
là dạng deacetyl hóa từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, được tìm thấy ở loài động
vật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm. Với nhiều tính năng như tính tương
thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thành
nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dược sinh học. Ngoài ra, chitosan còn có khả năng
bám lên bề mặt niêm mạc và xâm nhập vào niêm mạc. Do đó, hạt nano chitosan trở
thành hệ thống phân phối thuốc có tiềm năng lớn [31].
Cùng với xu thế trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu chế tạo vật liệu nano
chitosan. Đồng thời khảo sát khả năng hấp phụ protein của hạt nano chitosan nhằm
ứng dụng trong dẫn truyền thuốc. Các kết quả sẽ được đánh giá bằng nhiều phương
pháp phân tích hóa lý khác nhau như FT-IR, Raman, XRD, FE-SEM và TEM.
Thành công của đề tài sẽ tạo điều kiện sản xuất ra sản phẩm nano chitosan với giá
thành thấp để có thể thực hiện những nghiên cứu tiếp theo, nhất là sớm ứng dụng
nano chitosan làm chất dẫn thuốc góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.


8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về chitosan
1.1.1. Cấu trúc của chitosan
Chitosan là một loại polime carbohydrate tự nhiên có thể tạo ra bằng cách
deacetyl hoá chitin. Chitosan có thể tìm thấy trong tự nhiên từ động vật giáp xác
như tôm, cua. Chitosan còn có thể được tìm thấy từ những loài vi sinh vật như nấm,
men.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo chitin và chitosan
Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH 2) thay thế
nhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C2. Chitosan được cấu tạo từ các mắc xích Dglucosamin liên kết với nhau bởi liên kết α-(1-4)-glycoside [15], [25].


9

1.1.2. Tính chất chitosan
• Không độc, tính tương ứng sinh học cao và có khả năng phân huỷ sinh học
nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến
môi trường.
• Cấu trúc ổn định.
• Tan tốt trong dung dịch acid loãng (pH<6,3) và kết tủa ở những giá trị pH
cao hơn, hoá tím trong dung dịch iod.
• Có tính kháng khuẩn tốt.
• Là hợp chất cao phân tử nên trọng lượng phân tử của nó giảm dần theo thời
gian do phản ứng tự cắt mạch. Nhưng khi trọng lượng phân tử giảm thì hoạt
tính kháng khuẩn và kháng nấm không bị giảm đi.
• Có khả năng hấp phụ cao đối với các kim loại nặng.
• Ở pH < 6,3, chitosan có tính điện dương cao.
• Trong phân tử chitosan có chứa nhóm –OH, -NHCOCH 3 trong các mắt xích
N-acetyl-D-glucosamin có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amin, vừa là
amid. Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế

O-, dẫn xuất thế N-.
• Mặt khác chitosan là những polime mà các monome được nối với nhau bởi
các liên kết α-(1-4)-glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất
như: acid, bazơ, tác nhân oxy hoá và các enzyme thuỷ phân [15], [25].
1.1.3. Ứng dụng của chitosan
Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dược độn trong làm
cốm, tá dược ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng. Chitosan-colagen
hỗn hợp làm giảm cholesterol trong máu làm giảm sự hấp thụ lipid. Chitin được
dùng làm da nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ khâu trong phẫu thuật.
Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì
hương vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tương, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau
quả tươi, làm trong nước quả ép, giữ màu sắc và hương vị tự nhiên của sản phẩm.


10

Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệp
nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm. Trong nông nghiệp, oligochitosan làm thuốc
tăng trưởng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc diệt nấm bệnh
cho thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tươi cho cây nuôi cấy mô.
Trong khoa học kỹ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuyếch đại của
kính hiển vi, xử lý nước thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein,
phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm…[15], [25].
1.2. Tổng quan về nano chitosan
Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong
những năm gần đây. Với nhiều tính năng như tính tương thích sinh học, phân hủy
sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng
dụng dược sinh học [31].
Nano chitosan do có kích thước siêu nhỏ (từ 10 đến 1000 nm) nên dễ dàng đi
qua màng tế bào, có thể đưa vào cơ thể qua nhiều đường khác nhau như dùng ngoài

da, dùng bằng đường miệng, qua mũi…. Nano chitosan có diện tích và điện tích bề
mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học mang thuốc, vaccin, vectơ
chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư… Khi sử dụng nano chitosan làm
chất dẫn thuốc, thuốc điều trị được bảo vệ bởi những hạt nano chitosan khỏi sự
phân huỷ sinh học, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể do kích thước rất
nhỏ có thể đưa thuốc đến đúng mục tiêu điều trị, do đó nano chitosan làm chất dẫn
thuốc có hiệu quả điều trị rất cao [28].
Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục
đích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát
triển vectơ chitosan hướng đích thuốc trên những tế bào ung thư. Một số đề tài tiêu
biểu là điều chế hạt chitosan composit với acid polyacrylic để điều khiển và kéo dài
thời gian phóng thích thuốc, điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc
đến mắt, biến tính với N-trimetyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đường mũi,
tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [11]. Ngoài ra, nano chitosan còn
được nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn [9], [24], ứng dụng trong thực phẩm chức


11

năng [5], [6]. Nhiều công trình cũng tiến hành nghiên cứu về kích cỡ, điện tích bề
mặt hạt nano chitosan vì đây là những đặc tính rất quan trọng quyết định hiệu quả
gây nhiễm gen, gắn kết các phân tử protein trên hạt nano [12]. Tuy nhiên, các kết
quả đạt được rất khác nhau [10], [20], [21], [30], [32].
Ở nước ta, số lượng bài nghiên cứu về nano chitosan rất ít. Mức độ cập nhật
của các nghiên cứu trong nước so với các nghiên cứu của các nhà khoa học khác
trên thế giới còn thấp, chỉ có nhóm của PGS. TS. Nguyễn Anh Dũng [2] và nhóm
của TS. Trần Đại Lâm [3] nghiên cứu về vấn đề này. Các khảo sát này bước đầu cho
thấy những kết quả khả quan trong việc ứng dụng chitosan làm chất mang vaccin,
thuốc. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chưa đi sâu vào khảo sát thực nghiệm và
đánh giá kết quả tạo hạt nano chitosan, chưa đáp ứng được hết những tiềm năng to

lớn mà công nghệ tạo hạt nano chitosan hứa hẹn sẽ mang đến cho con người.
1.3. Các phương pháp chế tạo nano chitosan
Hiện nay có nhiều phương pháp tạo nano chitosan. Phương pháp được sử
dụng nhiều nhất là tạo gel ion, ưu điểm của phương pháp này là quá trình chuẩn bị
đơn giản và không cần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do
đó phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và
thực phẩm chức năng [28].
Những yếu tố ảnh hưởng đến tính chất hạt nano chitosan như kích thước hạt
và sự tích điện bề mặt là khối lượng phân tử và độ deacetyl hoá của chitosan. Hiệu
quả thu giữ thuốc của hạt nano chitosan phụ thuộc vào giá trị pK a và độ hoà tan của
thuốc. Thuốc kết hợp với chitosan qua tương tác tĩnh điện, liên kết hidro, ….
Sự lựa chọn phương pháp tổng hợp nano chitosan còn phụ thuộc vào bản
chất của những phân tử hoạt động cũng như những yêu cầu dẫn truyền khác nhau
[11].


12

Bảng 1.1. Tóm tắt phương pháp điều chế hạt nano chitosan làm chất dẫn các
loại thuốc, protein hoặc gen khác nhau.
Phương pháp điều chế nano chitosan
Thuốc/ protein/ gen
Gel ion
Insulin, ricin, BSA, cyclosporine A
Phương pháp giọt tụ/kết tủa
DNA/doxorubicin
Hợp nhất giọt nhũ tương
Acid gadopentetic
Mixen đảo
Doxorubicin

Theo S.A. Agnihotri (2004), có 5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano
chitosan là: Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking), phương
pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ
tương (emulsion-droplet coalescence), phương pháp tạo gel ion (ionic gelation) và
phương pháp mixen đảo (reverse micellar) [4].
1.3.1. Phương pháp khâu mạch nhũ tương
Hỗn hợp nhũ tương nước trong dầu (w/v) được tạo ra bằng cách phân tán
dung dịch chitosan trong dầu. Những giọt lỏng được làm bền bởi chất hoạt động bề
mặt. Dung dịch nhũ tương sau đó được khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợp
như glutaraldehid. Hai nhóm –CHO của glutaraldehid sẽ phản ứng với nhóm –NH 2
của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan.

Hình 1.2. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương
1.3.2. Phương pháp giọt tụ/kết tủa


13

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung
dịch kiềm. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếp
xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc
etandiamin. Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm
để tạo hạt nano.

Hình 1.3. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ.
1.3.3. Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương
Phương pháp này lần đầu được sử dụng vào năm 1999. Phương pháp này sử
dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa. Thay
vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan kết
hợp với các giọt NaOH. Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng với

thuốc tạo ra trong paraffin lỏng. Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dung


14

dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như trên. Khi cả hai hệ nhũ
tương này được trộn lại với tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một
cách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ.

Hình 1.4. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương.
1.3.4. Phương pháp tạo gel ion
Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích
điện dương và một polyanion như tripolyphosphate. Kỹ thuật này có ưu điểm là giai
đoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trường nước. Đầu tiên chitosan được
hoà tan vào dung dịch acid acetic. Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để


15

tạo hạt nano chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng. Kích
thước và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan
và polyanion khác nhau.

Hình 1.5. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion.
1.3.5. Phương pháp mixen đảo
Trong phương pháp này, người ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung
môi hữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo. Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc
được thêm từ từ với tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch. Pha lỏng
được giữ sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ trong suốt. Sau đó tác nhân tạo nối
ngang dược thêm vào và khuấy qua đêm. Cô quay loại dung môi. Phần còn lại phân

tán lại trong nước. Dung dịch muối thích hợp được thêm vào để kết tủa chất hoạt
động bề mặt. Hỗn hợp được ly tâm. Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang
thuốc được chiết ra, cho qua màng thẩm tách 1 giờ. Đông cô chất lỏng thu được cho
ta bột thuốc.


16

Hình 1.6. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo.
1.4. Ứng dụng của hạt nano chitosan
1.4.1. Chất mang dẫn truyền thuốc
1.4.1.1. Phân loại theo con đường sử dụng
Hạt nano chitosan có kích thước nhỏ nên nó thích hợp cho nhiều con đường
sử dụng thuốc khác nhau [28].
• Sử dụng bên ngoài đường tiêu hóa
Các hạt nano có thể được dùng trong tĩnh mạch bởi vì đường kính của các
mao mạch máu nhỏ nhất là khoảng 4 µm. Sự phân bố sinh học của các hạt nano có
thể thay đổi tùy thuộc vào kích cỡ, điện tích bề mặt và tính kỵ nước của chúng. Các
hạt có bán kính lớn hơn 100 nm sẽ bị hấp thu nhanh chóng bởi hệ lưới-nội mô trong
gan, lá lách, phổi và tủy xương. Ngược lại, những hạt nhỏ hơn có xu hướng có thời
gian luân chuyển kéo dài.
Các loại thuốc hứa hẹn nhất đã được nghiên cứu rộng rãi để dẫn truyền theo
cách này là những tác nhân kháng ung thư. Sau khi tiêm vào tĩnh mạch, nhiều hệ
thống hạt nano bao gồm nano chitosan có xu hướng tích lũy lại trong một số khối u
(Brasseur, 1980; Kreuter, 1994). Những hạt nano chitosan mang doxorubicin làm
chậm sự tăng trưởng của khối u và nâng cao tỷ lệ sống sót của những con chuột bị


17


cấy khối u. Ngoài ra, những hạt nano chitosan có kích thước nhỏ hơn 100 nm được
tạo ra cho thấy đã tránh khỏi hệ lưới-nội mô và luân chuyển trong máu được lâu
hơn.
Dẫn truyền những dược chất kháng bệnh như là kháng khuẩn, kháng virus,
kháng nấm và kháng ký sinh là một hướng sử dụng khác của hạt nano (Bender,
1996; Page-Clisson, 1998; Soma, 2000). Chỉ số điều trị của thuốc kháng nấm thấp,
thời gian bán hủy của những dược chất kháng virus ngắn và khả năng thâm nhập
vào tế bào bị bệnh trong khoang nội bào của thuốc kháng sinh kém làm cho những
hạt nano trở thành những ứng viên dẫn truyền lý tưởng. Những hạt nano một mặt
nâng cao hiệu quả điều trị, mặt khác làm giảm tác dụng phụ độc hại của thuốc. Trên
lý thuyết, nano chitosan là hệ thống chất mang hấp dẫn cho những loại thuốc này vì
chúng có nhiều thuận lợi như có bề mặt ưa nước và kích thước nano nhỏ hơn
100 nm. Ngoài ra, sử dụng trong cơ và dưới da cũng có thể là hướng dẫn truyền
khác của hạt nano bởi vì khả năng giảm kích ứng tại điểm tiêm và bảo vệ thuốc
không bị enzym phân hủy (Little, 1962).
• Sử dụng qua đường uống
Ý tưởng hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị enzym phân hủy trong bộ
máy tiêu hóa dẫn đến sự phát triển các hạt nano thành những hệ thống dẫn truyền
những phân tử lớn, protein và polynucleotid. Phương pháp này được nghiên cứu
rộng rãi sau một báo cáo rằng lượng đường trong máu của những con chuột mắc
bệnh tiểu đường giảm sau khi uống những hạt nano insulin (Damge,1990). Kích
thước hạt nhỏ hơn 500 nm là một yếu tố then chốt cho phép vận chuyển qua niêm
mạc ruột theo cơ chế endocytotic. Bên cạnh enzym, màng nhầy ngăn cản sự
khuyếch tán của thuốc và hạt nano, những rào cản hấp thụ biểu mô là chướng ngại
chính chống lại sự hấp thụ thuốc protein qua thành ruột. Do đó, hoạt tính của thuốc
có thể được cải thiện bằng cách kiểm soát kích thước hạt cùng với kéo dài thời gian
lưu giữ thuốc trong bộ máy tiêu hóa. Trong số những hạt nano polyme, hạt nano
chitosan là chất dẫn thuốc lý tưởng vì chúng làm tăng mức hấp thu thuốc.



18

Khả năng cải thiện mức hấp thu của chitosan đã được nghiên cứu rộng rãi.
Đặc tính bám dính của chitosan là do tương tác giữa chitosan tích điện dương và
niêm mạc tích điện âm. Điều này làm kéo dài thời gian tương tác của thuốc và bề
mặt hấp thụ.
• Sử dụng đường mắt
Các hạt nano được nhận thấy là chất mang tiềm năng để dẫn truyền đường
mắt sau nhiều quan sát thấy rằng nhiều loại hạt nano có khuynh hướng bám chặt
vào bề mặt biểu mô mắt. Kết quả kéo dài thời gian lưu giữ, tốc độ đào thải thuốc
chậm hơn so với những phương pháp điều trị mắt truyền thống, do đó cải thiện
dược tính của thuốc. Vì vậy, những hạt nano đã được dùng để dẫn thuốc kháng
viêm, kháng dị ứng cho những mục tiêu điều trị viêm mắt.
Chitosan đã được sử dụng như là chất mang dẫn thuốc điều trị chứng viêm
mắt bởi vì tác động thúc đẩy mức hấp thu thuốc. Chitosan không chỉ gia tăng thời
gian tương tác với giác mạc qua tương tác tĩnh điện giữa điện tích dương của nó và
niêm mạc tích điện âm, nó còn có khả năng xuyên qua lớp niêm mạc, nâng cao
dược tính của thuốc. Nhóm của Felt (1999) tìm thấy dung dịch chitosan kéo dài thời
gian lưu giữ thuốc kháng sinh trên giác mạc của thỏ. Những tác động tương tự cũng
được quan sát thấy khi sử dụng những hạt nano chitosan. Những hạt này được giữ
trên giác mạc và kết mạc của thỏ ít nhất 24 giờ. Nhóm của De Campos (2001) phát
hiện thấy sau khi sử dụng những hạt nano chitosan trên thỏ, hầu hết thuốc được tìm
thấy trong những mô ngoài mắt, giác mạc và kết mạc trong khi chỉ một lượng thuốc
nhỏ được tìm thấy trong những mô trong mắt, mống mắt và chất dịch lỏng.
1.4.1.2. Phân loại theo ứng dụng trong điều trị bệnh
• Hoạt tính kháng ung thư
Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicine để ức chế
khối u trên chuột. Kết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicine độc lập thì khối u ở
chuột vẫn tăng lên 900 mm 3 sau 50 ngày và chết, trong khi đó ở thí nghiệm ly giải
chậm doxorubicine trong hạt nano chitosan kích thước khối u giảm chỉ còn 170

mm3 và chuột vẫn sống sau 90 ngày thí nghiệm.


19

L. Qi (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt nano
chitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tính
cảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S 180 và hepatoma H
22. Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung thư với liều uống 2,5
mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59% và liều 0,5mg/kg là 43-53%,
trong khi đó chitosan chỉ là 30%.
Kết quả cũng cho thấy kích thước hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng ung
thư càng cao. Hoyoung (2008) nghiên cứu PEG-hạt nano chitosan làm tá chất thuốc
chống tới tế bào đích ung thư. Kích thước hạt nano khoảng 350 nm. Hiệu quả chống
ung thư khi sử dụng hạt nano chitosan rất cao trên tế bào gây ung thư phổi ở chuột
A549 đồng thời làm giảm độc tính của thuốc chống ung thư [3].
• Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc
Angela (2001) nghiên cứu thải chậm thuốc cyclosporin A (Cry A) bằng cách
hấp phụ trong dung dịch chitosan và hạt nano chitosan. Lượng thuốc phóng thích
trong thí nghiệm hấp phụ trên hạt nano chitosan luôn luôn gấp 2,5-3 lần so với đối
chứng là dung dịch Cry A. Kết quả là nồng độ Cry A trong máu thỏ thí nghiệm luôn
luôn cao hơn so với nhóm đối chứng và hấp phụ trong dung dịch chitosan.
El-Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan để cố định thuốc
cycloporin A để uống, kích thước hạt nano là 150 nm. Kết quả cho thấy hiệu suất
mang thuốc là 94%, nồng độ cycloporin A trong máu là 2760 ng/ml cao gấp 2,5 lần
so với hạt nano sodium glycolate. Hoạt tính của cyclosporin A cố định trong hạt
nano chitosan tăng 72%, gelatin nano chitosan chỉ tăng 18%, riêng sodium
glicholate lại giảm tới 36% so với đối chứng.
Xinge Zhang (2008) nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thu insulin qua niêm
mạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-nano chitosan, kích thước hạt nano là 150300 nm. Hiệu quả hấp thu insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu PEG-nano chitosan

cao hơn so với PEG-chitosan là 30-40%. Kích thước hạt nano càng nhỏ, diện tích bề
mặt hạt càng lớn và điện tích dương trên bề mặt càng cao là nguyên nhân ảnh
hưởng đến khả năng hấp thu insulin vào máu qua niêm mạc mũi. Shedaghi (2008)


20

hạt nano chitosan trimetyl để làm vật liệu li giải chậm insulin. Kết quả cho thấy
động học ly giải của insulin nhốt trong hạt nano chitosan trimetyl ổn định và kéo dài
hơn.
Kevin (2001) sử dụng hạt nano chitosan mang thuốc doxobucin (DOX),
anthracyline.
Zing Zhang (2007) nghiên cứu phức hợp nano oleyl-chitosan (OCH) mang
thuốc thải chậm doxorubicine trong phòng trị ung thư. Hiệu suất hấp phụ thuốc là
52,6%. Động học ly giải chậm thuốc phụ thuộc pH môi trường được ghi nhận trong
hình cho thấy lượng pH 7,4 tốc độ ly giải thấp hơn trong môi trường acid pH 3,8.
Shadeghi (2008) nghiên cứu hấp phụ insulin trên vật liệu nano chitosan, nano
dietylmetylchitosan (DEMC) và nano trimetylchitosan (TMC). Kết quả về động học
ly giải chậm insulin khá ổn định cho cả ba vật liệu hạt nano [3].
1.4.2. Chất mang dẫn truyền vaccine
Một lượng lớn protein kháng nguyên và chữa bệnh đã được phát hiện. Tuy
nhiên, ứng dụng chúng còn khó khăn do phương pháp dẫn truyền protein thích hợp
chưa có sẵn. Việc tạo ra những chất mang để dẫn vaccine qua những lớp niêm mạc,
ví dụ niêm mạc ruột và mũi đã được thử nghiệm. Được dùng làm chất mang
vaccine, chitosan được chuyển thành những dạng khác nhau: dạng viên, dạng hạt,
hạt micro và hạt nano. Các thông tin tích lũy trong những năm qua cho thấy tầm
quan trọng của kích thước và lợi thế của hạt nano so với hạt micro. Cụ thể hơn, các
nhà nghiên cứu đã tìm thấy số lượng hạt nano qua biểu mô ruột nhiều hơn số lượng
hạt micro. Do đó, việc điều chế những hạt nano chitosan làm chất mang dẫn truyền
vaccine đã thu hút được nhiều chú ý [7].

Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan để mang vaccin
tetanus qua niêm mạc mũi. Kích thước hạt nano là 350 nm, điện tích là +40 mV, có
hiệu suất mang vaccin tetanus là 50-60%. Kháng thể IgG ở thí nghiệm sử dụng hạt
nano chitosan cao gấp lần so với sử dụng kháng nguyên tetanus tự do sau 2 tuần,
tăng gấp 15 lần sau 12 tuần và 25 lần sau 24 tuần. Kháng thể đặc hiệu ở thí nghiệm


21

sử dụng hạt nano chitosan cao hơn so với đối chứng gấp 2,5 lần và tăng lên theo
thời gian từ 2-24 tuần [3].
Amadi (2007) nghiên cứu sử dụng trimetyl nano chitosan làm tá chất cho
một tiểu đơn vị (subunit) của vaccin cúm H 3N2. Kích thước hạt nano chitosan là
800 nm. Hiệu suất hấp phụ kháng nguyên (LE) là 78%, khả năng hấp phụ kháng
nguyên (LC) là 13% (w/w). Kết quả miễn dịch cho thấy là các chỉ số miễn dịch HI,
IgG ở thí nghiệm trimetyl nano chitosan là 103 và 105 cao hơn so với antigen trong
đệm PBS là 0,8.102 và 103, và chỉ số IgG trong thí nghiệm sử dụng nano chitosan
cũng cao hơn 102 lần so với tá chất là dung dịch trimetyl chitosan [3].
Những hạt nano được điều chế bằng phương pháp vi nhũ và phương pháp tạo
nối ngang cộng hoá trị đều không thích hợp cho việc sử dụng làm chất dẫn vaccine.
Trong khi đó những hạt nano chitosan tạo nối ngang với TPP sử dụng làm chất dẫn
vaccine đã được nghiên cứu rộng rãi.
Điểm đến của vaccine có thể ảnh hưởng đến hiệu quả hấp thu. Các hạt nano
chitosan cho thấy là chất dẫn truyền hiệu quả cho những nhiều phân tử lớn qua
đường mũi, khí quản, miệng và niêm mạc mắt (Janes, 2001; Van der Lubben, 2001;
Takeuchi, 2001; Dyer, 2002) [7].
1.4.3. Chất mang dẫn truyền gen
Những hệ thống dẫn truyền không virus (non-virus) trong liệu pháp gen đã
được đề xuất để thay thế những vector virus. Chúng làm giảm tối thiểu phản ứng
miễn dịch từ vật chủ. Hơn nữa, chúng định được mục tiêu, dễ bảo quản và sản xuất

lượng lớn. Những lợi thế này tạo động lực cho sự phát triển của chúng. Polyme
cation được nhận thấy là chất mang hứa hẹn trong số những hệ thống dẫn truyền
gen không virus. Chất mang gen polyme nổi lên với hiệu quả chuyển gen, xác định
mục tiêu điều trị và khả năng tương thích sinh học tốt.
Chitosan là một vector không virus thích hợp cho dẫn truyền gen. Tương tác
giữa chitosan và DNA là tương tác tĩnh điện (Roy, 1997; MacLaughlin, 1998) .
Tương tác điện này mạnh đến nỗi phức chitosan-DNA không bị tách ra cho đến khi
nó vào trong tế bào. Chitosan và những dẫn xuất của chitosan tụ lại bảo vệ DNA


22

khỏi sự phân hủy DNAse. Những hạt nano chitosan/DNA có khoảng phân bố kích
cỡ hẹp được tạo ra bởi quá trình giọt tụ. Những hạt nano chitosan/DNA có kích
thước từ 20-500 nm nhỏ hơn những hệ thống polyme khác nên thâm nhập vào tế
bào thuận lợi hơn qua cơ chế endocytosis và/hoặc pynocytosis, làm tăng tốc độ gây
nhiễm (Mao, 1997; Sato, 2001).
Những hệ thống dẫn truyền gen dựa trên chitosan cũng có thể gắn thêm
ligand để có tương tác tế bào cụ thể, như transferrin hoặc galactose (Mutara, 1996;
Erbacher, 1998; Park, 2001; Christopher, 2001; Gao, 2003; Kim, 2004).
Kết quả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong cơ thể sống đều cho thấy khi
hạt nano chitosan/DNA vào trong cơ thể, chúng nhanh chóng di chuyển khỏi máu
và bám trên những cơ quan khác nhau. Kích cỡ hạt khác nhau thì phân bố trên
những cơ quan khác nhau (Mao, 2001; Yoo, 2005). Hàng loạt nghiên cứu trong ống
nghiệm và trong cơ thể sống cho thấy chitosan là vật liệu thích hợp để dẫn truyền
vaccine DNA và gen không virus [7].
1.4.4. Ứng dụng trong thực phẩm chức năng
Sự phát triển những thực phẩm có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe tạo
ra cơ hội nâng cao sức khỏe cộng đồng. Kết hợp những chất có hoạt tính sinh học
vào trong thực phẩm như peptid, vitamin là cách thức đơn giản để tạo ra những thực

phẩm chức năng mang lợi những lợi ích sinh lý và giảm thiểu những rủi ro bệnh tật.
Tuy nhiên, hiệu quả ngăn chặn bệnh của những sản phẩm này nằm ở khả năng bảo
quản được hoạt tính sinh học của những thành phần hoạt tính. Đây là một thách
thức lớn bởi vì hầu hết các phân tử này có thời gian lưu giữ trong dạ dày ngắn, tính
thấm và độ tan kém trong ruột. Hơn nữa chúng không bền trong những điều kiện
chế biến thực phẩm hoặc trong bộ máy tiêu hóa (pH, enzym, sự hiện diện của những
dưỡng chất khác). Những hệ thống bao giữ (encapsulation system) có thể được sử
dụng để vượt qua những giới hạn này. Tuy nhiên, vì được dùng trong những ứng
dụng thực phẩm, những hệ thống dẫn truyền phải được công nhận là an toàn [5].
Trong số những hệ thống dẫn truyền này, hạt nano chitosan thu hút nhiều chú
ý trong những năm gần đây do khả năng bám dính vào niêm mạc và xuyên qua lớp


23

niêm mạc. Kích thước nhỏ giúp chúng kéo dài thời gian lưu giữ trong bộ máy tiêu
hóa. Những công trình mới nhất cũng chỉ ra toàn bộ những hạt nano chitosan có thể
được hấp thu vào tế bào người [6].
Β-lactoglobulin (βlg), một loại protein chính trong sữa của động vật nhai lại,
đã được dùng nhiều trong thực phẩm do có giá trị dinh dưỡng. Khả năng tạo gel,
nhũ tương cho phép chúng trở thành nguyên liệu lý tưởng để bao giữ các hợp chất
có hoạt tính sinh học. Nó còn có khả năng kháng lại sự phân rã do pepsin có trong
dạ dày.
Lingyun Chen (2005) điều chế những hạt nano core-shell chitosan/βlactoglubulin làm chất mang dưỡng chất. Những hạt nano chitosan được phủ lớp
protein βlg này có khả năng bảo vệ những chất dinh dưỡng chống lại acid và pepsin
trong dạ dày. Khi tiến vào đường ruột, lớp phủ βlg bị phân rã bởi pancreatin, còn hạt
nhân chitosan bám vào trong thành ruột, tạo thuận lợi cho sự hấp thu dưỡng chất.
Như vậy hạt nano chitosan phủ βlg có hai tác dụng: lớp vỏ bảo vệ dưỡng
chất trong dạ dày còn hạt nhân cải thiện thời gian lưu giữ dưỡng chất trong thành
ruột, đồng thời điều khiển tốc độ phóng thích chúng.

Protein thực phẩm đã được điều chế thành nhiều loại chất nền ở dạng gel, hạt
micro, hạt nano đáp ứng yêu cầu cho những ứng dụng trong thực phẩm chức năng.
Khả năng kiểm soát kích cỡ hạt protein quyết định tốc độ phóng thích dưỡng chất
và lượng hấp thu vào cơ thể. Ở dạng gel và hạt micro, những dưỡng chất được
phóng thích khỏi chất nền để hấp thu vào thành ruột. Trong khi đó, hạt nano cải
thiện khả năng hấp thu dưỡng chất bằng cách kéo dài thời gian lưu giữ trong thành
ruột hoặc hấp thu trực tiếp bởi biểu mô ruột.


24

Hình 1.7. Hình minh họa những cơ chế hấp thu dưỡng chất
1.4.5. Hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan được nghiên cứu trong nhiều tài liệu.
Theo những nghiên cứu trước, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong môi trường
acid là do sự proton hóa nhóm NH2 tại vị trí C2 của D-glucosamin. Chitosan mang
điện dương sẽ tạo nối trên bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện âm, phá vỡ màng bằng
cách làm thoát những thành phần chứa bên trong hoặc bằng cách ức chế sự truyền
dưỡng chất vào trong tế bào [24].
Hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn chitosan
thông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan. L. Qi
(2004) nghiên cứu chế tạo nano chitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn. Hạt nano
chitosan được chuẩn bị bằng phương pháp tạo gel trong tripolyphosphat (TPP), kích
thước hạt 40 nm. Các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên
4 loại vi khuẩn E. coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus cho thấy hoạt