ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA HÓA HỌC

Nguyễn Minh Lân

XÁC ĐỊNH AMINO ACID TRONG THỰC
PHẨM BỔ SUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC).

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Hóa Dược
(Chương trình đào tạo chuẩn)

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA HÓA HỌC

Nguyễn Minh Lân

XÁC ĐỊNH AMINO ACID TRONG THỰC
PHẨM BỔ SUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy
Ngành Hóa Dược
(Chương trình đào tạo chuẩn)

Cán bộ hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Việt Hương.

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN!
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ
Thị Việt Hương đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em từ những bước đi đầu tiên
trong khóa luận này. Đặc biệt trong suốt thời gian qua với sự quan tâm và chỉ bảo
sâu sắc của Cô, em đã thực hiện và hoàn thành tốt bản khóa luận này.
Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cô, các anh, các chị
ở Viện Công nghiệp và Thực phẩm đã luôn hướng dẫn, đặc biệt là ThS. Lê Văn
Trọng và Cử nhân Vũ Thị Thu Trang đã tạo điều kiện và giúp đỡ em thực hiện đề tài
này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo trong bộ môn Hóa hữu cơ
và trong khoa Hóa học, các anh chị thuộc phòng phân tích hữu cơ, bạn bè khóa K58
khoa Hóa học và tất cả người thân đã luôn động viên và giúp đỡ em trong thời gian
qua.
Trong quá trình làm đề tài, em còn gặp không ít khó khăn trong qua trình tìm
kiếm tài liệu, thông tin, thiếu thốn thời gian. Do đó trong đề tài này không tránh
khỏi việc thiếu sót. Kính mong thầy cô và các bạn có ý kiến đóng góp để đề tài của
em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày

tháng 5, năm 2017.

Nguyễn Minh Lân



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

Gas chromatography–

Sắc ký khí ghép khối

mass spectrometry
High Performance Liquid

phổ
Sắc ký lỏng hiệu năng

Chromatography
Liquid chromatography–

cao
Sắc ký lỏng ghép khối


mass spectrometry
Liquid

phổ

GC/MS
LC
LC/MS

LC/MS/MS

ChromatographTandem
MassSpectrometer

Sắc ký lỏng ghép hai lần
khối phổ

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitative

Giới hạn định lượng

High pressure liquid


Sắc ký lỏng

chromatography

hiệu năng cao

CE

Capillary electrophoresis

Điện di mao quản

IS

Internal standard

Chất nội chuẩn

RF

Fluorescence Detector

Đầu dò huỳnh quang

HPLC


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................2
1.1 Tổng quan về Amino acid...........................................................................2
1.1.1 Thành phần và cấu tạo của Amino acid....................................................2
1.1.2 Tính chất chung của amino acid...............................................................3
1.1.3 Amino acid trong thực phẩm....................................................................4
1.2 Các phương pháp phân tích Amino acid trong thực phẩm.......................6
1.2.1 . Phương pháp điện di...............................................................................6
1.2.2 . Phương pháp Sắc ký khí (GC)................................................................7
1.2.3 . Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).........................................................8
1.3 Phương pháp xác định amino acid bằng HPLC........................................9
1.3.1 Nguyên tắc chung về phương pháp sắc ký lỏng HPLC.............................9
1.3.2 Pha tĩnh trong HPLC...............................................................................10
1.3.3 Pha động trong HPLC.............................................................................11
1.3.4 Detector trong HPLC..............................................................................12
1.4 Xác nhận giá trị đặc trưng của phương pháp phân tích.............................12
1.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)..........................12
1.4.2 Độ chính xác của phép đo.......................................................................13
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.............................................................................20
2.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu...........................................................20
2.2.

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất.......................................................................20

2.2.1. Thiết bị....................................................................................................20
2.2.2. Dụng cụ..................................................................................................20
2.2.3. Hóa chất..................................................................................................20
2.2.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn.......................................................................21
2.3. Đánh giá các thông số phân tích..............................................................22
2.3.1. Xây dựng đường chuẩn...........................................................................22
2.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng..............................................22

2.3.3. Độ chụm.................................................................................................23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................24
3.1. Đánh giá phương pháp phân tích............................................................24
3.1.1 Điều kiện chạy máy..............................................................................24
3.1.2 Khảo sát đường chuẩn............................................................................24
3.1.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)..........................36
3.1.4 Độ lặp lại................................................................................................36
3.2. Phân tích mẫu thực tế...............................................................................42


3.2.1 Quy trình xử lý mẫu................................................................................42
KẾT LUẬN.............................................................................................................46
1.
Điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC.......................................................46
2.

Đánh giá phương pháp phân tích:...........................................................46

3.

Phân tích hàm lượng amino acid trong mẫu thực phẩm chức năng......46

Phụ Lục..................................................................................................................47
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Amino acid

2

Hình 1.2: Đồng phân lập thể của Alanine


6

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

1

Hình 3.1: Đường chuẩn của Aspartate

27

Hình 3.2 Đường chuẩn của Serine

27

Hình 3.3

28

Đường chuẩn của Glutamine

Hình 3.4 Đường chuẩn của Glycine

28

Hình 3.5 Đường chuẩn của Hystidine

29

Hình 3.6 Đường chuẩn của Arginine


29

Hình 3.7

30

Đường chuẩn của Threonine

Hình 3.8 Đường chuẩn của Alanine

30

Hình 3.9 Đường chuẩn của Proline

31

Hình 3.10 Đường chuẩn của Cysteine

31

Hình 3.11 Đường chuẩn của Tyrosine

3

Hình 3.12 Đường chuẩn của Valine

3

Hình 3.13 Đường chuẩn của Methionine


33

Hình 3.14 Đường chuẩn của Lysine

33

Hình 3.15 Đường chuẩn của Isoleucine

34

Hình 3.16 Đường chuẩn của Leucine

34


Hình 3.17 Đường chuẩn của Aspartate

35

Hình 3.18 Sắc ký đồ chuẩn Amino acid 50µM

35

Hình 3.19 Sắc ký đồ LOQ của Amino Acid

36

Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317050) test A

43


Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317050) test B

43


DANH MỤC BẢNG


Bảng 1.1: Các Amino acid thường gặp

2

Bảng 2.1: Nồng độ Amino acid chuẩn làm việc

21

Bảng 2.2: Nồng độ chất nội chuẩn

22

Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa diện tích pic (chất chuẩn : nội chuẩn) và nồng độ (chất
chuẩn : nội chuẩn)
35
Bảng 3.2: Độ lặp lại của Aspartate ; Serine ; Glutamine ; Glycine

37

Bảng 3.3: Độ lặp lại của Hystidine , Arginine , Threonine , Alanine


38

Bảng 3.4: Độ lặp lại của Proline Cysteine Tyrosine Valine

39

Bảng 3.5: Độ lặp lại của Methionine Lysine Isoleucine Leucine Phenylalanine

.40

Bảng 3.6: Độ lặp lại của Phenylalanine

41

Bảng 3.7: Nồng độ các amino acid của mẫu 0317005

44

Trang9


MỞ ĐẦU
Amino acid là thành phần chính tạo nên giá trị dinh dưỡng riêng biệt của các
phân tử protein, rất cần thiết cho sự sống. Giá trị dinh dưỡng của protein được quyết
định bởi mối liên quan về số lượng và chất lượng của các amino acid khác nhau
trong protein đó. Chúng đóng vai trò quan trọng như là chất trung gian trong quá
trình chuyển hóa cũng như tổng hợp protein, cũng là những đơn vị cấu trúc cơ bản
của protein. Amino acid không chỉ “xây dựng các tế bào và phục hồi các mô”, mà
còn tạo ra kháng thể chống lại virus và vi khuẩn để đảm bảo cho sự sinh tồn của con
người.

Thực phẩm chức năng (TPCN) là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc
là sản phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các chất “chức năng”. Ở
Việt Nam TPCN ngày càng trở nên quen thuộc với người dân Việt Nam và được
nhiều người tin tưởng sử dụng. Ngày nay, amino acid được bổ sung nhiều vào các
sản phẩm TPCN giúp tăng cường hiệu quả của thực phẩm. Tuy nhiên vẫn chưa có
nhiều nghiên cứu phân tích thành phần amino acid của các sản phẩm TPCN tại Việt
Nam.
Do đó, đề tài “Nghiên cứu, xác định thành phần Amino acid trong thực
phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” là một
đề tài nghiên cứu mới có ý nghĩa thực tiễn và cần thiết nhằm góp phần giúp cơ quan
chức năng đưa ra những đánh giá quy định nhằm bảo vệ sức khỏe, quyền lợi con
người và môi trường sống.

10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về Amino acid

1.1.1. Thành phần và cấu tạo của Amino acid


Amino acid là đơn vị cấu tạo protein. Amino acid là chất hữu cơ, phân tử
có chứa nhóm: carboxyl (-COOH) và nhóm amino (-NH2) gắn với carbon
ở vị trí α.




Hầu hết amino acid thu nhận được khi thủy phân protein đều ở dạng L-αamino acid. Như vậy các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi
là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R).

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Amino acid


Dựa vào tính chất của gốc R các amino acid được chia làm 5 nhóm:
- Nhóm 1: gồm 7 amino acid có R không phân cực, kỵ nước: glycine,
alanine, proline, valine, leucine, isoleucine và methionine.
- Nhóm 2: gồm 3 amino acid có gốc R chứa nhân thơm: phenylalanine,
tyrosinetryptophan.
- Nhóm 3: gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: serine,
threonine, cystein, aspargine và glutamine.
- Nhóm 4: gồm 3 amino acid có R tích điện dương: lysine, histidine và
arginine.
- Nhóm 5: gồm 2 amino acid có gốc R tích điện âm: aspartate và
glutamate



Các amino acid thường gặp là những amino acid thường có mặt trong
thành phần của các loại protein. Chúng có khoảng 20 loại và được thu

11


nhận khi thủy phân protein.

12



Tên
Amino acid
Glycine
Alanine
Proline
Valine
Leucine
Isoleucine
Methionine
Phenylalani
Tyrosine
Tryptophan
Serine
Threonine
Cysteine
Aspargine
Glutamine
Lysine
Hystidine
Arginine
Aspartate
Glutamate

Tên amino acid theo danh pháp
α-aminoacetic
α -aminopropionic
α -pỉolidincarboxylic
α -aminoisovaleric
α -aminoisocaproic

α -amino-β-metylvaleric
α -amino-δ-metyltiobutiric
α -amino-β-phenylpropionic
α -aminoβ-hydrogengenxyphenylpropionic
α -amino-β-indolylpropionic
α -amino-β-hydroxypropionic
α -aminoβ-hydrogengenxybutiric
α -amino-β-tiopropionic
Amid của aspartate
Amid của glutamate
α,ε-diaminocaproic
α -amino-β-imidazolpropionic
α -amino-δ-guanidinvaleric
α -aminosucinic
α -aminoglutarate

Tên
viết tắt
Gly
Ala
Pro
Val
Leu
Ile
Met
Phe

Ký Khối lượng
hiệu
mol

G
75
A
89
P
115
V
117
L
131
I
131
M
149
F
165

Tyr

Y

181

Trp
Ser

W
S

204

105

Thr

T

119

Cys
Asn
Gln
Lys
His
Arg
Asp
Glu

C
B
Q
K
H
R
D
E

121
132
146
146

155
174
133
147

Bảng 1.1: Các Amino acid thường gặp
1.1.2. Tính chất chung của amino acid


Các Amino acid thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường
như glyxine, alanine, valine, serine, histidine, triptophan; một số loại có
vị đắng như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt
hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium
glutamate).



Các amino acid thường dễ tan trong nước và khó tan trong alcohol, ether
(trừ proline và hydrogenxyproline), chúng cũng dễ hòa tan trong acid và
kiềm loãng (trừ tyrosine).



Các amino acid trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối
(trừ glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có

13


thể làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái.



Trong phân tử amino acid có nhóm carboxyl -COOH nên có khả năng
nhường proton (H+) thể hiện tính acid, mặt khác có nhóm amin -NH2
nên có khả năng nhận proton nên thể hiện tính base. Vì vậy amino acid
có tính chất lưỡng tính.Trong môi trường acid, amino acid ở dạng cation
(tích điện dương), nếu tăng dần pH amino acid lần lượt nhường proton
thứ nhất chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện), và tiếp tục tăng
pH Amino acid sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dạng anion (tích
điện âm).

Hình 1.2: Đồng phân lập thể của alanine
1.1.3. Amino acid trong thực phẩm
Có 2 loại amino acid khác nhau trong cơ thể: thiếu yếu và không thiếu yếu.
Amino acid không thiếu yếu là những loại amino acid có thể tự sản xuất trong quá
trình tổng hợp các chất khác trong cơ thể.
Với các amino acid thiếu yếu, cơ thể không tự sản xuất được và do đó cách
duy nhất để có được chúng là thông qua các thực phẩm mà cơ thể tiêu thụ. Một số
sản phẩm giàu đạm như các các loại hạt, đậu, đậu nành thể cung cấp cho cơ thể đầy
đủ tất cả các amino acid thiếu yếu.

14


Amino acid cần thiết cho sự chuyển hoá bình thường của các chất dinh
dưỡng khác, đặc biệt là các vitamin và khoáng chất, bởi nó tham gia cấu trúc trong
các enzym. Khi thiếu amino acid, nhiều vitamin thì sẽ không phát huy đầy đủ chức
năng của chúng. Amino acid kích thích sự thèm ăn vì thế nó giữ vai trò chính tiếp
nhận các chế độ ăn khác nhau. Thiếu protein sẽ gây ra các rối loạn như ngừng sinh
trưởng hoặc chậm phát triển, mỡ hoá gan, rối loạn hoạt động nhiều tuyến nội tiết

(giáp trạng, sinh dục), thay đổi thành phần protein máu, giảm khả năng miễn dịch
sinh học của cơ thể và tăng tính cảm thụ của cơ thể với các bệnh nhiễm khuẩn.
Trong quá trình tiêu hóa, hệ tiêu hóa phá vỡ tất cả các protein thành các
amino acid để đưa vào máu, và sau đó các tế bào sử dụng các amino acid như các
nguyên liệu xây dựng cơ bản. Mức protein khuyến nghị hằng ngày là 0,8 gram cho
mỗi kg trọng lượng cơ thể. Một hộp cá ngừ chứa khoảng 32 gram protein, một ly
sữa chứa khoảng 8 gram protein. Nên không phải quá khó khăn để đáp ứng đủ
lượng protein hằng ngày.
Hiện nay, các loại TPCN thường được bổ sung thêm một lượng amino acid
nhất định. Các sản phẩm dành cho trẻ em thường được bổ sụng Lysine . Lysine làm
tăng cảm giác ngon miệng, gia tăng chuyển hóa, hấp thu tối đa dinh dưỡng, hiệu
quả cho việc tăng cân. Các sản phẩm sữa dành cho người tăng cân, tập thể hình có
chứa nhiều Glutamine. Glutamine giúp tăng cường hệ miễn dịch, hỗ trợ các chức
năng tiêu hóa và đóng góp một phần ba nhu cầu nitơ cần thiết cho cơ thể. Ngoài ra,
các sản phẩm từ thiên nhiên như tảo biển, linh chi, sữa ong chúa,... các hoại cốm vi
sinh cũng có chứa các loại amino acid cần thiết để đảm bảo nh cầu của cơ thể cũng
như tăng hiệu quả của sản phẩm.

15


Hình 1.3: Một số thực phẩm chức năng
Amino acid là thành phần dinh dưỡng quan trọng nhất, chúng có mặt trong
thành phần của nhân và chất nguyên sinh của các tế bào. Quá trình sống là quá trình
trao đổi chất thường xuyên của protein. Vì vậy, hằng ngày cần ăn vào một lượng
đầy đủ Amino acid cho việc duy trì sự sống, sự sinh trưởng, phát triển, sinh sản; cho
quá trình lao động và học tập.
1.2.

Các phương pháp phân tích Amino acid trong thực phẩm


1.2.1. . Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp điện di dựa vào tính chất tích điện của các amino acid
trong môi trường có pH nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các amino
acid tích điện dương (+) sẽ chạy về phía cực (-), các amino acid tích điện âm
(-) sẽ chạy về cực (+). Do khả năng tích điện không giống nhau trong điện
trường giữa các amino acid vì vậy tốc độ di chuyển của các amino acid không
giống nhau trong điện trường. Kết quả các amino acid phân bố trải ra trên giá
thể (giấy hoặc polyamide).

16


Hình 3.5: phương pháp điện di

Mei Musa Ali Omar và cộng sự [15] đã phát triển nghiên cứu phương pháp
điện di mao quản kết hợp với detector UV để xác định amino acid: Proline, Valine,
Glutamine, Alanine, Asparagine, Serine trong thực phẩm Sudan. Amino acid trong
các mẫu được dẫn xuất với 4-chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-Cl) trước
khi phân tích CE-UV. Điều kiện phản ứng: 100mM đệm borat ở pH 8,5; thời gian
60 phút; nhiệt độ 70oC và NBD-Cl 40mM và phát hiện ở 475 nm. Phương pháp này
đã thu được khoảng tuyến tính của tất cả các amino acid trong phạm vi nồng độ 2,540 ppm (R2> 0,9981). Giới hạn phát hiện (LOD) trong khoảng 0,32-0,56 ppm. Độ
thu hồi từ 85% đến 108%, (n = 3).
Shigeki Akamatsu và cộng sự [17] đã sử dụng phương pháp điện di mao
quản để phân tích amino acid trong các sản phẩm sữa ong chúa.Việc tách CE sử
dụng dung dịch acid formic 1M (pH 1.8) như điện. Dung môi pha động là etanol
75%. Kết quả thu được là các giới hạn phát hiện (LOD) dao động 0,61-10,5 mg
(trọng lượng khô/g cho mỗi amino acid). Độ thu hồi từ 88,3-108,6%, và độ lệch
chuẩn tương đối RSD <10%. Phương pháp này được cho là hữu ích trong việc phân
biệt không chỉ trong những sản phẩm khác nhau mà còn giữa các sản phẩm và mật

ong.
1.2.2. . Phương pháp Sắc ký khí (GC)
Sắc ký khí là một phương pháp chia tách trong đó pha động là một chất khí
( được gọi là khí mang) và pha tĩnh là một vi lớp chất lỏng hoặc polyme được phủ

17


trên một lớp rắn đặt trong một ống thủy tinh hoặc kim loại được gọi là cột (tương tự
cột tách phân đoạn được sử dụng trong chưng cất).
Nozal và cộng sự [14] đã nghiên cứu và phát triển khí sắc ký (GC) với ion
hóa ngọn lửa (FID) để phân tích Amino acid trong mật ong. Phương pháp này cho
phép xác định số 22 amino acid tự do trong mẫu mật ong. Các khí mang (N2) có tốc
độ dòng ở mức 1,6 ml / phút (đo ở 50 oC). Nitơ (30 ml / phút), hydro (35 ml / phút)
và khí tổng hợp (350 ml / phút) được sử dụng như các loại khí phụ trợ. Các chương
trình nhiệt độ lò như sau: nhiệt độ ban đầu 110 oC, tăng 26oC/phút đến 320oC. Kết
quả xác định được giới hạn phát hiện của các amino acid từ 0,112 và 1,795 ppm. Độ
thu hồi khoảng 90%, R2> 0,99%. Phương pháp này đã được xác nhận và áp dụng
cho một bộ 74 mẫu mật ong thuộc bốn nguồn gốc thực vật khác nhau: Eucaliptus,
hương thảo.
Ayat H. Bani Rashaid và cộng sự [8] đã nghiên cứu Amino acid trong mẫu
tóc người. Các bước chuẩn bị mẫu bao gồm thủy phân acid protein bằng acid
hydrochloric và trimetylsilyl (TMS). Dẫn suất sử dụng N,O-bis (trimetylsilyl) và
trifluoroacetamide (BSTFA). Các điều kiện dẫn suất tối ưu là: Dung môi phản ứng
là acetonitrile, nhiệt độ 100 ° C, và thời gian phản ứng là 30 phút. Phương pháp này
đã thu được kết quả như sau: Giới hạn phát hiện trong khoảng 0,04-0,1 mmol/L,
giới hạn định lượng trong khoảng từ 0,1-0,5 mmol/L, độ phục hồi từ 80% và 110%,
và khoảng tuyến tính tốt nhất là 1-300 mmol/L với hệ số tương quan R2> 0,99.
1.2.3. . Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng vai trò vô cùng

quan trọng trong việc phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong
việc tách và phân tích các chất.
Aoyama và cộng sự [9] sử dụng HPLC phân tích amino acid trong mẫu
huyết thanh chuột. Phân tích sử dụng NBD-F (4- fluoro-7-nitro-2,1,3benzoxadiazole) như là một thuốc thử dẫn xuất huỳnh quang. Quá trình phân tích
toàn bộ đã được hoàn toàn tự động từ dẫn suất, tiêm để tách HPLC và định lượng.
Các điều kiện phản ứng dẫn xuất được đánh giá lại và tối ưu hóa. Amino acid được
dẫn xuất của NBD-F trong 40 phút ở nhiệt độ phòng, trong đệm borat (pH 9.5). Các
dẫn xuất đã được tách ra trong vòng 100 phút và fluorometrically phát hiện ở 540

18


nm với sự kích thích ở 470 nm. Giới hạn phát hiện đối với các amino acid là trong
khoảng 2,8-20 ppm. Các đường cong hiệu chuẩn là tuyến tính trong khoảng 0,2
pmol đến 20 pmol. Hệ số tương quan là 0,999.
Kelly và cộng sự [12] đã xác định 24 amino acid trong rượu vang và rượu
nho. Phương pháp sử dụng với thuốc thử N-acetyl-L-cysteine, trên cột C18 (3mm x
25cm). Detector được đặt ở bức sóng kích thích 330nm và phát hiện ở 440nm.
Dung môi sử dụng: A: đệm acetat 0.05M( pH 6.5) – methanol ( 95-5).
B: methanol – acetonitrile (70 - 30)
Thời gian (phút)
0
4.5
10
16
20
25
32
35


%A
97
95
81
73
58
52
40
97

%B
3
5
19
27
42
48
60
3

Kết quả thu được khoảng tuyến tính được xác định trong phạm vi 0,25-10 ppm. Hệ
số tương quan là 97-101%, độ lặp lại RSD <3%.
Wang Xing và cộng sự [20] đã xác định thành phần amino trên cây Thiên
Nam Tinh bằng phương pháp HPLC ghép 2 lần khối phổ (LC-MS/MS). Phương
pháp sử dụng với phenyl isothiocyanate (PITC) là thuốc thử dẫn xuất, các hợp chất
được tách ra và xác định trên một cột C18(250 mm × 4,6 mm, 5 µm) nhiệt độ cột là
35 ℃; được phát hiện ở 254 nm. Dung môi sử dụng tách rửa là A: đệm acid acetic
0,05 mol/L(pH 6,5); B: acetonitrile 0,05 mol / L. Điều kiện rửa giải gradient được
biểu diễn qua bảng sau:
Thời gian (phút)


%A

%B

0~15

97~87

3~13

15~22

87~83

13~17

22~25

83~77

17~23

25~35

77~75

23~25

35~45


75~70

25~30

19


Kết quả nghiên cứu thu được 15 amino acid có trong cây Thiên Nam Tinh.
Khoảng tuyến tính tốt: Glu trong khoảng 2-100 ppm, Arg trong khoảng 6-300 ppm,
những amino acid khác trong khoảng 0,8-40 ppm, với hệ số tương quan R2≥
0,9995. Độ thu hồi là 95% -105% và RSD < 3%.
1.3.

Phương pháp xác định amino acid bằng HPLC

1.3.1. Nguyên tắc chung về phương pháp sắc ký lỏng HPLC.
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách
dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố
liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc
phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của
chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác
nhau và tách ra khỏi nhau. Sơ đồ cấu tạo thiết bị HPLC bao gồm:
1- Bình chứa dung môi pha động
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4- Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5- Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt )
6- Detector ( nhận tín hiệu )

7- Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận, tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều
khiển hệ thống HPLC.
8- In dữ liệu .

20


Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có tính đặc thù riêng,
đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký phân bố lỏng – lỏng và sắc ký trao đổi lỏng –
rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn,…
1.3.2. Pha tĩnh trong HPLC.
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm. Tuỳ
theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia
làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-LC) và sắc ký pha ngược (RP-LC)
•

•

Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica
trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm
chức phân cực: -NH2, -CN...), pha động là các dung môi hữu cơ không phân
cực như: n-hexan, toluene.... Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân
cực hay ít phân cực.
Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không
phân cực, loại thông dụng nhất là –C 18H37, còn pha động phân cực: nước,
methanol, axetonitril....Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của
pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có
độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực .


1.3.3. Pha động trong HPLC.

21


Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các
chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa
giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được
các điều kiện sau:
•

Pha động phải trơ với pha tĩnh.

•

Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững và không bị phân hủy
trong quá trình chạy sắc ký.

•

Pha động phải có độ tinh khiết cao.

•

Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân
bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký.

•


Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích.

•

Pha động phải không quá đắt.

Có thể chia pha động làm hai loại:
 Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để
phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực
như MeOH, ACN. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết
ngược.
 Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như
xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua
(CS2), chlorobutan, CCl4, toluene...
Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng
rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ
phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha
động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.
1.3.4. Detector trong HPLC.
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ
thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.
-

Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có
khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến
(VIS).

22



1.4.

-

Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng
phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần
phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh
quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm
có khả năng phát huỳnh quang.

-

Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim
loại chuyển tiếp....

Xác nhận giá trị đặc trưng của phương pháp phân tích.
1.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ).

Giới hạn phát hiện là lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện
được đảm bảo sự khác biệt với mẫu trắng tới 95% ; thông thường LOD được chấp
nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần tín hiệu nhiễu đường nền, thường
lấy
=3
Trong đó: N - Độ nhiễu trung bình đường nền.
S - Chiều cao píc của chất cần phân tích.
Giới hạn xác định là lượng nhỏ nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử
có thể định lượng được trong điều kiện tiến hành phép thử. Thông thường, LOQ
được lấy từ 3 đến 5 lần LOD.
Tiến hành xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng bằng cách thêm
chuẩn trên nền mẫu thực ở mức nồng độ giảm dần. Ở nồng độ chất phân tích có tỉ

số tín hiệu S/N ≈ 3 được chọn làm nồng độ giới hạn phát hiện và S/N ≈ 10 được
chọn làm giới hạn nồng độ giới hạn định lượng [6].
1.4.2. Độ chính xác của phép đo.
Độ chính xác của phép đo được đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm
là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức
độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực [1].
 Độ thu hồi (độ đúng)
Công thức tính độ thu hồi:

23


Trong đó:

R%: Độ thu hồi (%).
Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ppb).
. Ctt: Nồng độ chất phân tích phát hiện được (ppb).

 Độ lặp lại (độ chụm) của phép đo được xác định theo các đại lượng S 2 và CV.

24


Trong đó:

CV: hệ số biến động của phép đo.
S: Độ lệch chuẩn.
: diện tích pic trung bình.
n: số lần đo.
RSD: độ lệch chuẩn tương đối


25