Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài gấm (paphiopedilum concolor) bằng phương pháp in vitro từ chồi nách

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.08 MB, 79 trang )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

PHẠM THỊ NAM
Tên đề tài
NGHIÊN CƢ́U KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GẤM
(Paphiopedilum concolor) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO
TỪ CHỒI NÁCH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hê ̣đào ta ̣o

: Chính quy

Chuyên ngành: Công nghê ̣sinh ho ̣c
Khoa

: CNSH-CNTP

Khoá học

: 2013-2017

Thái Nguyên, năm 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

PHẠM THỊ NAM
Tên đề tài
NGHIÊN CƢ́U KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GẤM
(Paphiopedilum concolor) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO
TỪ CHỒI NÁCH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hê ̣đào ta ̣o

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghê ̣sinh ho ̣c

Khoa

: CNSH-CNTP

Khoá học

: 2013-2017

Giảng viên hƣớng dẫn 1: GS TS. Ngô Xuân Bình
Giảng viên hƣớng dẫn 2: ThS. Nguyễn Thi Ti
̣ n
̀ h

Thái Nguyên, năm 2017

i

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trƣờng

, Ban chủ nhiê ̣m khoa Công

nghê ̣ sinh ho ̣c và Công nghê ̣ thƣ̣c phẩ m , trong thời gian thƣ̣c tâ ̣p tố t nghiê ̣p em đã
thƣ̣c hiê ̣n đề tài

: “Nghiên cƣ́u khả năng nhân nhanh

lan Hài Gấm

(Paphiopedilum concolor) bằ ng phƣơng pháp in vitro từ chồi nách”
Trang đầ u tiên của khoá luâ ̣n này em xin gƣ̉i lời cảm ơn tới Ban giám hiê ̣ u nhà
trƣờng, Ban chủ nhiê ̣m khoa Công nghê ̣ Sinh ho ̣c và Công nghê ̣ Thƣ̣c phẩ m cùng
các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài
nghiên cƣ́u này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biế t ơn sâu sắ c, em xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành
tới thầy giáo GS.TS. Ngô Xuân Bình và cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình, giảng viên
khoa Công nghê ̣ Sinh ho ̣c và Công nghê ̣ Thƣ̣c phẩ m đã tâ ̣n tình chỉ bảo , giúp đỡ và
hƣớng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Đồng thời, em xin cám ơn tha ̣c si ̃ Ma Thi ̣Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt
nhấ t cho em trong suố t quá trình thƣ̣c tâ ̣p tố t nghiê ̣p.
Cuố i cùng , em xin cảm ơn gia đình đã ta ̣o điề u kiê ̣n vâ ̣t chấ t và luôn là chỗ
dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập , cảm ơn bạn bè đã hết lòng động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thƣ̣c tâ ̣p , cũng nhƣ là quá trình làm báo cáo

thƣ̣c tâ ̣p thời

gian có ha ̣n không tránh khỏi những sai sót. Em rấ t mong nhâ ̣n đƣơ ̣c nhƣ̃ng ý kiế n
đóng góp của thầ y cô và các ba ̣n để đề t ài của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Lời cuố i em xin kiń h chúc các thầ y , cô giáo trong nhà trƣờng , trong khoa
Công nghê ̣ Sinh ho ̣c và Côn g nghê ̣ thƣ̣c phẩ m , cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ ,
thành công trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017
Sinh viên thƣc̣ hiêṇ

Phạm Thị Nam

ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Thiế t bi,̣ dụng cụ nghiên cứu ....................................................................26
Bảng 4.1. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ,̣ thời gian khƣ̉ trùng của
HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy)..............................36
Bảng 4.2. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của một số môi trƣờng đế n khả năng tái
sinh chồ i lan Hài P. concolor (sau 40 ngày nuôi cấy) ..............................................37
Bảng 4.3. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài
P. concolor (sau 30 ngày nuôi cấy)...........................................................................39
Bảng 4.4. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của BA kế t hơ ̣p với Kinetin đế n khả năng
nhân nhanh lan Hài P. concolor (sau 30 ngày nuôi cấy)………………………….. 41
Bảng 4.5. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của dịch chiết chuối đế n khả năng nhân
nhanh lan Hài P. concolor (sau 30 ngày nuôi cấy) ...................................................43
Bảng 4.6. Kết quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA đế n khả năng ra rễ cây

lan Hài P. concolor (sau 30 ngày nuôi cấy) ..............................................................45
Bảng 4.7. Kế t quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của NAA kế t hơ ̣p với than hoa ̣t tính đế n
khả năng ra rễ cây lan Hài P. concolor(sau 30 ngày nuôi cấy) ................................47
Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể tới khả năng sinh trƣởng và
phát triển của lan Hài P. concolor.............................................................................49

iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1 Đoa ̣n thân mang chồi ngủ, chồi nách của cây lan Hài P. concolor. ..........25
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến
khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài P. concolor ................28
Hình 4.1. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣, thời gian của HgCl 2 đến khả năng tạo vật
liê ̣u vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) ...........................................................................36
Hình 4.2. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ BA đế n khả năng nhân nhanh lan Hài
P.concolor (sau 30 ngày nuôi cấy)............................................................................39
Hình 4.3. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ BA tố t nhấ t kết hợp với Kinetin đế n khả
năng nhân nhanh lan Hài P. concolor (sau 30 ngày nuôi cấy) .................................41
Hình 4.4. Biể u đồ ảnh hƣởng của dịch chiết chuối đế n khả năng nhân nhanh lan Hài
P. concolor (sau 30 ngày nuôi cấy)...........................................................................43
Hình 4.5. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA đế n khả năng ra rễ giố ng lan Hài P.
concolor (sau 30 ngày nuôi cấy) ...............................................................................45
Kế t quả thí nghiê ̣m đƣơ ̣c thể hiê ̣n qua hình 4.6: .......................................................47
Hình 4.6. Biể u đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA kết hợp với THT đế n khả năng ra rễ
lan Hài P. concolor (sau 30 ngày nuôi cấy) ..............................................................47
Hình 4.7: Ảnh hƣởng của một số giá thể tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của
lan Hài P. concolor ...................................................................................................50

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
B5

:

Gamborg cs, 1976

BA

:

6-Benzyl amino purine

CS

:

Cộng sự

CT

:

Công thức

CV

:

Coeficient of Variation

Đ/C

:

Đối chứng

Kinetin

:

6-Furfurylaminopurine

LSD

:

Least Singnificant Difference Test

MS

:

Murashighe và Skoog, 1962

MT

:

Môi trƣờng

NAA

:

α-Napthalene acetic acid

P. malipoens

:

Paphiopedilum malipones

THT

:

Than hoạt tính

WPM

:

Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980

v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...........................................................................iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
Phần 1 MỞ ĐẦU .........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................2
1.3. Yêu cầ u của đề tài ................................................................................................2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................3
Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIÊU
̣ ...............................................................................4
2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) ................................................................4
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc .....................................................................................4
2.1.1.1. Phân loại .........................................................................................................4
Về mă ̣t thƣ̣c vâ ̣t ho ̣c, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là: ...........................................4
2.1.1.3 Đặc điểm sống [2]. ..........................................................................................5
2.2. Tổng quan về lan Hài P. concolor ........................................................................7
2.2.1. Nguồ n gố c và sƣ̣ phân bố lan Hài P. concolor ở Việt Nam..............................7
2.2.2. Hình thái: ...........................................................................................................7
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồ ng giố ng lan Hài P. Concolor. ......................8
2.2.4. Các phƣơng pháp nhân giống vô tính lan Hài P.Concolor ...............................9
2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào ........................................................................10
2.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào ...........................................................10
2.4. Các vấn đề thƣờng gặp trong nhân giống invitro ...............................................10
2.4.1. Tính bất định về mặt di truyền ........................................................................10
2.4.2. Sự nhiễm mẫu..................................................................................................11
2.4.3 Sự hóa thủy tinh thể .........................................................................................11
2.4.4. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu ...........................................................11

2.5. Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp nuôi cấy mô ............................................12
2.5.1. Ƣu điểm ...........................................................................................................12

vi

2.5.2. Nhƣợc điểm .....................................................................................................13
2.6. Quy trình nhân giống in vitro [9]. ......................................................................13
2.6.1. Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc .........................................................................13
2.6.2. Thiết lập hệ thống cấy vô trùng ......................................................................13
2.6.3. Nhân nhanh chồi .............................................................................................14
2.6.4. Tạo rễ ..............................................................................................................14
2.6.5. Chuyển cây ra đất trồng ..................................................................................14
2.7. Tình hình nghiên cứu nhân giống lan Hài trên thế giới và trong nƣớc ..............15
2.7.1. Trên thế giới ....................................................................................................15
2.7.2. Trong nƣớc ......................................................................................................19
Phần 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............25
3.1. Vâ ̣t liê ̣u, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................25
3.1.1. Đối tƣợng, vâ ̣t liê ̣u nghiên cƣ́u ........................................................................25
3.1.2. Hoá chất sử dụng .............................................................................................26
3.1.3. Thiế t bi,̣ dụng cụ nghiên cứu ...........................................................................26
3.2. Phạm vi, điạ điể m và thời gian nghiên cƣ́u ........................................................26
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................26
3.2.2. Điạ điể m nghiên cƣ́u .......................................................................................27
3.2.2. Thời gian nghiên cƣ́u ......................................................................................27
3.3. Nô ̣i dung nghiên cƣ́u ..........................................................................................27
3.4. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u ....................................................................................27
3.4.1. Chuẩ n bi ̣môi trƣờng nuôi cấ y in vitro ............................................................27
3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu quy trình nhân giống ..............................................28
3.4.3. Phƣơng pháp bố trí thí nghiê ̣m ........................................................................... 28

3.5. Phƣơng pháp thu thập, xƣ̉ lý số liê ̣u và chỉ tiêu đánh giá ..................................33
3.5.1. Thu thập số liệu ...............................................................................................33
3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................................33
3.5.3. Phƣơng pháp sử lý số liệu ...............................................................................34
Phần 4 KẾT QUẢNGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................................35
4.1. Kết quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣, thời gian của chấ t khƣ̉ trùng HgCl 2
đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. ...........................................................................35

vii

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của một số môi trƣờng đến khả năng tái sinh
chồi lan Hài P. concolor tƣ̀ đoa ̣n thân mang chồ i ngủ , chồi nách. ...........................37
4.3. Kết quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của một số Cytokintine đế n khả năng nhân
nhanh lan Hài P. concolor .........................................................................................38
4.3.1. Kết quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của BA đế n khả năng nhân nhanh lan Hài P.
concolor. ....................................................................................................................38
4.3.2. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của BA kế t hơ ̣p với Kinetin đế n khả năng nhân nhanh
lan Hài P. concolor ...................................................................................................40
4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của dịch chiết chuối tới khả năng nhân nhanh
chồi lan Hài P. concolor............................................................................................42
4.5.Kết quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của NAA và than hoa ̣t tính đế n khả năng ra rễ
của cây lan Hài P. concolor ......................................................................................44
4.5.1. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ NAA đế n khả năng ra rễ của cây lan Hài
P. concolor ................................................................................................................44
4.5.2. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của NAA kế t hơ ̣p với than hoa ̣t tính (THT) đến khả
năng ra rễ cây lan Hài P. concolor. ...........................................................................46
4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể tới khả năng sinh trƣởng và phát
triển của lan Hài P. concolor.....................................................................................48

Phầ n 5 ........................................................................................................................51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ...................................................................................
51
̣
5.1. Kế t luâ ̣n ..............................................................................................................51
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................52

1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong các quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới,
đƣợc công nhận là một quốc gia ƣu tiên cao cho bảo tồn toàn cầu. Hệ sinh thái của Việt
Nam giàu có và đa dạng với nhiều kiểu rừng, nhiều loài động, thực vật độc đáo không
có ở nơi nào trên thế giới [14]. Phong lan mọc khắp nơi trên thế giới tuy nhiên tập
trung những loài phong lan đẹp nhất phải kể đến hai khu vực là Châu Mỹ và Châu
Á nhiệt đới. Việt Nam nằm trong khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh một
trong nhiều loài phong lan đẹp nhất thế giới. Theo đánh giá của giáo sƣ Averyanov,
Việt Nam có 158 chi và khoảng 900 loài. Theo tác giả Trần Duy Quý và cs đã thống
kê và phát hiện, ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan. Đây là quốc gia có nguồn
tài nguyên thực vật và đặc biệt là họ Lan phong phú bậc nhất trong khu vực Châu
Á. Không có nơi nào mà sự đa dạng của các loài lan hài lại cao hơn ở Việt Nam. Có
thể thấy 18 loài lan hài thuộc chi Paphiopedilum cùng với vô số các dạng lai tự
nhiên của chúng. Năm trong số các loài lan hài chỉ có ở Việt Nam mà không có ở
nơi nào khác. Nhu cầu tiêu thụ các loài hoa lan có màu sắc sặc sỡ này rất lớn, nên
những ngƣời đi tìm hoa lan sẵn sàng trèo lên những vỉa đá dốc ở những vùng xa xôi
hẻo lánh để thu hái chúng. Việc thu hái nhƣ vậy đã gây nên những tác động tàn phá

nghiêm trọng. Một loài lan hài đã bị tuyệt chủng ở Việt Nam, một loài bị đe dọa ở
mức độ cực kỳ nguy cấp, và 15 loài khác ở mức độ nguy cấp (trong đó hầu hết các
loài đã rất gần với mức độ cực kỳ nguy cấp).
Hài Gấm, có tên khoa học là Paphiopedilum concolor (P. concolor), là một
trong nhƣ̃ng loài lan đă ̣c hƣ̃u quý hiế m của khu vực Đông Á. Hài P. Concolor - Lan
Hài nở hoa vào mùa Xuân và mùa Thu và có một hoa mỗi cụm. Lan Hài P.
Concolor phân bố ở Myanma, Thái Lan, Việt Nam nhƣ tại miền Bắc Việt Nam. Là
loài Hài rất quý mới đƣợc phát hiện, có hoa to, màu sắc sặc sỡ, lạ mắt và rất đẹp, rất
đƣợc ƣa chuộng ở các thị trƣờng Lan nƣớc ngoài. Tính đa dạng về màu sắc và hình
dáng của cánh hoa bên và môi là điều hấp dẫn nhất đối với những ngƣời trồng và lai
tạo Lan Hài.

2

Giống nhƣ thực trạng các loài lan Hài khác loài lan Hài P. concolor cũng bị khai
thác ồ ạt khiến chúng bị đe dọa tiêu diệt và đang biến mất nhanh chóng khỏi nơi
sống tự nhiên của chúng [20]. Trƣớc thực trạng bi đe
̣ doa ̣ nghiêm tro ̣ng nhƣ v ậy
việc bảo tồn, phát triển loài lan này hết sức cần thiết.
Đặc thù riêng của lan Hài P. concolor là cây sinh trƣởng chậm, tỷ lệ nảy
mầm của hạt trong tự nhiên thấp. Vì vậy việc nghiên cứu nhân giống lan Hài rất
đƣợc chú trọng nhằm mục đích thƣơng mại và bảo tồn nguồn gen thực vật quý
hiếm. Trƣớc đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các loài lan Hài bằng
nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ gieo hạt, tách mầm nhƣng những phƣơng pháp
này vẫn còn nhiều nhƣợc điểm nhƣ chất lƣợng cây không đồng đều, chất lƣợng cây
thấp và số lƣợng cây ít…Để khắc phục đƣợc điều này, phƣơng pháp nhân giống in
vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Phƣơng pháp này cho số lƣợng
cây lớn, chất lƣợng cao, đồng đều và sạch bệnh. Đây là điều mà phƣơng pháp
truyền thống không thực hiện đƣợc. Hiện nay, nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in

vitro đang phát triển mạnh mẽ có thể tạo ra số lƣợng cây con lớn, sạch bệnh, ổn
định về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và đáp ứng đƣợc giá cả phải chẳng
của thị trƣờng đƣợc coi là một giải pháp lý tƣởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy
cơ bị tuyệt chủng. Trƣớc thực trạng đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

:

“Nghiên cƣ́u khả năng nhân nhanh lan Hài Paphiopedilumconcolor (Hài Gấm)
bằng phƣơng pháp in vitro từ chồi nách”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cƣ́u thành công quy trin
̀ h nhân nhanh lan Hài P. Concolor tƣ̀ chồ i nách
bằng phƣơng pháp in vitro.
1.3. Yêu cầ u của đề tà i
- Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến
hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng tái sinh
chồ i lan Hài P. concolor.

3

- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ một số Cytokinine đế n khả năng nhân
nhanh chồ i lan Hài P. concolor.
- Xác định đƣợc ả nh hƣởng của nồng độ một số A uxin và than hoa ̣t tin
́ h đến
khả năng ra rễ cây lan Hài P. concolor.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của giá thể đến sự sinh trƣởng và phát triển của
cây lan Hài P. concolor giai đoạn vƣờn ƣơm.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào
kiến thức lý thuyết đƣợc học thông qua hoạt động thực tiễn.
- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy đƣợc kinh nghiệm thực tế
cũng nhƣ tác phong làm việc
, nghiên cứu khoa học phục vu ̣ cho cho công tác sau này
.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân
giống cây lan Hài P. concolor bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp
phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô.
1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn
Đề xuất đƣợc quy trình nhân nhanh giống lan Hài P. Concolor bằng phƣơng
pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lƣợng lớn cây lan Hài P. concolor góp phần bảo tồn
giống hoa quý hiếm trƣớc nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho
nghiên cứu khoa học.

4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀ I LIỆU
2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum)
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc
2.1.1.1. Phân loại
Về mă ̣t thƣ̣c vâ ̣t ho ̣c, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:
- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thƣờng đƣơ ̣c go ̣i là Hài Vệ Nữ, phân bố
ở các vùng ôn đới.
- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồ m khoảng 25
loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.
- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ

Nam Ấn Đô ̣ và Đông Hymalaya đế n Philippine

, New Guinea và Quầ n đả

o

Solomon.
Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi
Cypripedioideae, họ phụ
(Orchidales), phân lớp Hành

Epidendroideae, họ Lan

Paphipedilum, thuô ̣c tông ,
(Orchidaceae), bô ̣ lan

(Liliidae), lớp mô ̣t lá mầ m

(Monocotyledoneae),

ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thƣ̣c vâ ̣t (Plantae) [1].
2.1.1.2. Nguồ n gố c
Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Viê ̣t
Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này đƣợc tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và
miền Bắ c Viê ̣t Nam, mỗi loa ̣i trong chi này đề u có khu phân bố rấ t ha ̣n chế .
Hầ u nhƣ tấ t cả các loài lan đề u bắ t nguồ n tƣ̀ các tổ tiên kiể u hypoxis có sáu
mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài go ̣i là ba lá đài và ba mả nh bao vòng trong
gọi là ba cánh hoa ) và sáu nhị đực (ba nhi ̣đƣ̣c ở vòng ngoài và ba nhi ̣đƣ̣c ở vòng
trong). Xu hƣớng tiế n hoá của ho ̣ Lan là giảm số lƣơ ̣ng nhi ̣đƣ̣c và sƣ̣ dính liề n giƣ̃a
nhị đực hữu thụ với nhị cái là s ự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của

họ Lan. Sƣ̣ giảm liên tu ̣c số lƣơ ̣ng nhi ̣đƣ̣c dẫn đế n sƣ̣ hin
̀ h thành các nhóm lan có
ba, hai hay mô ̣t nhi ̣đƣ̣c tồ n ta ̣i trong hoa . Trong ho ̣ Lan , chi lan Hài (thuô ̣c tông
Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1; 20].

5

2.1.1.3 Đặc điểm sống [2].
Các loài lan Hài ở Viê ̣t Nam có thể chia thành hai nhóm riêng . Mô ̣t nhóm phân
bố ở vùng núi đá vôi phiá Bắ c Viê ̣t Nam tƣ̀

đô ̣ cao mă ̣t nƣớc biể n lên đế n 1600m,

nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat

, đá phiế n và cát kế t ở đô ̣ cao tƣ̀

700m - 2200m. Ngoài ra có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe
nƣ́t hay rià của các vách núi dựng đứng đá Granit [4].
Lan Hài của Viê ̣t Nam có thể số ng trên đấ t , bám đá và phụ sinh mùn . Các loài
số ng trên đấ t thƣờng mo ̣c ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rƣ̀ng , ở nơi sƣờn núi dốc,
các nền đất có nhiều lá rơi bi ̣phân huỷ ma ̣nh và giàu chấ t mùn . Các loài lan Hài
mọc trên đá thƣờng mọc dƣới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán
mỏm đá và ngay bên dƣới các đƣờng đỉnh

, chủ yếu là các

. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống

bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rƣ̀ng mâ y mù ẩ m đô ̣ cao 1200-1500m [4].
Tại Việt Nam , lan Hài thƣờng phân bố ở vùng có lƣơ ̣ng mƣa lớn , ẩm độ cao .
Tuy nhiên do đă ̣c trƣng là vùng khí hâ ̣u nhiê ̣t đới gió mùa nên chúng thƣờng phải
trải qua mô ̣t giai đoa ̣n khô ha ̣n . Sƣ̣ xuấ t hiê ̣n lá dày , dai và mo ̣ng nƣớc là hƣớng
thích nghi tốt để cây có thể sống sót đƣợc qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ
nhanh chóng phu ̣c hồ i khi mùa mƣa trở la ̣i . Độ ẩm xung quanh rễ , kiể u đấ t và đô ̣
pH, sƣ̣ có mă ̣t của các nấ m rễ , tác nhân thụ phấn và cƣờng độ ánh sáng là các nhân
tố quan tro ̣ng trong sƣ̣ hiǹ h thành và phát triể n của quầ n thể lan Hài .
Trong rƣ̀ng nguyên sinh , lan Hài phân bố đề u nhau ở c ác hƣớng của sƣờn núi .
Nhƣng trong các vùng rƣ̀ng đã bi ̣xuố ng cấ p , lan Hài có khuynh hƣớng phát triể n ở
các sƣờn núi phía Bắc , Đông Bắ c và T ây Bắ c của núi . Ngày nay , thƣờng chỉ tim
̀
thấ y lan Hài mo ̣c thành tƣ̀ng đám nhỏ . Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con
ngƣời, sƣ̣ thay đổ i các điề u kiê ̣n môi trƣờng và viê ̣c thu hái lan để bán là nhƣ̃ng
nguyên nhân chính gây ra sƣ̣ tuyê ̣t chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắ p các
vùng của Việt Nam.
2.1.1.4. Hiê ̣n trạng cây lan Hài Viê ̣t Nam và phương thức bảo tồn
Lan Hài là chủng ho ̣ lan có giá tri ̣thƣơng ma ̣i cao , đƣợc sƣu tầm và tìm kiếm
rất nhiều . Với sƣ̣ hiê ̣n hƣ̃u của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Viê ̣t Nam là

6

mô ̣t trong các quố c gia có nguồ n lan Hài tƣ̣ nhiên phong phú . Không nhƣ̃ng phong
phú về chủng loại , Viê ̣t Nam còn có nhiề u loài lan đă ̣c hƣ̃u có giá tri ̣thẩ m mĩ cao ,
đƣơ ̣c thế giới ƣa chuô ̣ng [3]. Vì vậy tin
̀ h tra ̣ng thu thâ ̣p và xuấ t khẩ u lan Hài mô ̣t
cách ồ ạt , không kiể m soát dẫn đế n viê ̣c lan Hài ngày càng hiế m trong tƣ̣ nhiên

.

Đồng thời với tình trạng môi trƣờng tự nhiên bị khai thác cạn kiệt nhƣ hiện nay

,

lan Hài càng biế n mấ t nhanh chóng .
Trƣớc tình hình lan Hài ca ̣ n kiê ̣t ngoài thiên nhiên , nhiề u chƣơng trình quố c
gia về bảo tồ n loài hoa quý này đã đƣơ ̣c triể n khai , chủ yếu là thu thập , phân loa ̣i,
nghiên cƣ́u về các loài lan Hài và bảo tồ n môi trƣờng số ng tƣ̣ nhiên của chúng . Mô ̣t
công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam
của nhóm tác giả Leonid Averyanov , Phillip Cribb , Phan Kế Lô ̣c và Nguyễn Tiế n
Hiê ̣p năm 2004 [1].
Một mạng lƣới rộng khắp các khu bảo tồn đã đƣợc thành lập ở Việt Nam. Đặc
biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài nhƣ:
- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà
(Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.
- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo
tồn loài P. callosum.
- Vƣờn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng
Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thƣợng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn
P.dalatensis.
- Vƣờn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò
(Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum.
- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P.emersoii,
P.hangianum, P. malipoense varijackii.
- Vƣờn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum.
- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.
- Vƣờn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha
đang bảo tồn loài P. malipoense

7

Bên ca ̣nh đó , nhiề u nhà khoa ho ̣c đã nghiên cƣ́u và ƣ́ng du ̣ng phƣơng pháp
nuôi cấ y mô tế bào thƣ̣ c vâ ̣t in vitro nhằ m nhân nhanh số lƣơ ̣ng lớn lan Hài . Đầu
tiên phải k ể đến tác gi ả Dƣơng Tấ n Nhƣ̣t , ngƣời đầ u tiên nuôi cấ y thành công lan
hài Hồng năm 2005. Sau đó đã có nhiề u nhà nghiên cƣ́u khác đã nuôi cấ y

in vitro

thành công n hiề u loài lan Hài khác nhƣ hài Hằ ng , hài Tam Đảo bằng các phƣơng
pháp nuôi cấy mô khác nhau .
2.2. Tổng quan về lan Hài P. concolor
2.2.1. Nguồ n gố c và sự phân bố lan Hài P. concolor ở Việt Nam
Trong tự nhiên, các loài lan Hài (Paphiopedilum) thƣờng gặp trên các đƣờng
đỉnh dốc núi có độ cao từ 500 – 600m trở lên, dƣới tán rừng thƣa, dƣới những cây
tùng, cây bách của kiểu rừng rêu á nhiệt đới, rất đa dạng các loài thực vật. Không
khí những nơi này luôn ẩm, mát, là thiên đƣờng của các loài lan rừng và độc đáo
nhất trong số đó vẫn là các loài lan Hài.
So với các loài lan Hài khác, Hài P. concolor có phân bố trên các núi, các đảo đá
vôi ở độ cao thấp nhất, có những nơi gần nhƣ sát mực nƣớc biển. Rất có thể đây là một
trong những loài lan Hài đƣợc tìm thấy sớm nhất ở Việt Nam và với cái tên “vạn điểm
hài” cũng đã nói lên tất cả vẻ đẹp của loài hoa màu vàng nhạt, cùng hàng ngàn những
đốm màu đỏ không đồng nhất trên cả mặt trƣớc của bông hoa [20]. Loài cây này có lá
thuôn bầu dục hẹp, trổ hoa rộ dịp giáp Tết. Hoa mầu phớt hồng, thoảng hƣơng thơm,
cánh môi dạng túi gần tròn và hồng tía, trông y hệt chiếc hài nhung. Đây là một loài
đặc hữu Việt Nam đang bị đánh giá là cạn kiệt ngoài tự nhiên.
Lan Hài P. concolor phân bố ở phiá Bắ cViê ̣t Nam (Lào Cai, Yên Bái, Bắc
Cạn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Tam Đảo (Vĩnh Phúc)vàthế giới phân bố ở Lào,
Campuchia, Thái Lan, Trung Quốc

2.2.2. Hình thái:
- Lan Hài P.concolor là loài lan đất, không thân, cỏ mọc trên đá.
- Dạng lá : Có 4 – 6 lá xếp thành 2 hàng và mọc thành đám,lá thuôn tù, trải
rộng ra hai bên, dài 10 - 18cm, rộng 4 - 5cm, mặt trên có các đốm khảm xanh thẫm
và xanh nhạt xen kẽ, thƣờng có đốm tím, tía rất đẹp.

8

- Dạng hoa:
Cụm hoa cao 5 - 7cm, mang 1 - 3 hoa. Hoa lớn đƣờng kính 5 - 7cm, màu vàng
có đốm nhỏ màu đỏ, hoa có mùi táo thơm ngọt ngào rất quyến rũ. Cánh đài lƣng
gần tròn, cong lõm, cuống dài tới 8 cm, phủ lông trắng rất đẹp tía hoặc xanh, có
đốm tím dầy.Hai cánh tràng hơi chúc xuống, cánh môi dạng túi dài 4cm, hơi nhọn ở
gốc, mép cuộn vào trong,nhị sinh sản 2, nhị lép vàng có đốm đỏ.
+ Lá đài lƣng hình trứng rộng tới hình mũi giáo- bầu dục với mũi nhọn ở chóp,
dài 4,4-7,1 cm, rộng 1,8-4,5 cm, có lông tơ trắng lƣa thƣa ở mặt trong, không có ở
bên ngoài.
+ Lá đài hợp hình trứng rộng tới hình mũi giáo-trứng, nhọn hoặc đôi khi có 2
răng ở chóp, 2 gờ ở lƣng, dài 3,8-5,3 cm, rộng 2,4-4,8 cm.
+ Môi nằm ngang, hình túi sâu, dài 4,5- 6,5 cm, rộng 3,8-5,4 cm, gần nhƣ hình
cầu, mép không cuộn vào trong, có lông tơ trắng phía trong gốc, lông mịn bên ngoài.
+ Nhị lép lồi, từ hình trứng rộng tới thuôn, dài 13-14 mm, rộng 11-13 mm, cụt
ở chóp, gần nhƣ không có cuống, vàng có đốm đỏ và lông nhung ở nửa dƣới, có gờ
ở lƣng, có bƣớu lồi tròn trên bề mặt ở nửa trên.
- Dạng quả: Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình tru ̣, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nƣ́t.
Quả chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.
- Dạng rễ: Rễ chùm, màu nâu.
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan Hài P. Concolor.
- Nhiê ̣t đô :̣ Theo quy luâ ̣t chung, nhƣ̃ng cây có lá màu xanh thƣờng thić h số ng

ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình , ban đêm là tƣ̀ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C.
Các loài Hài có lá vằn thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm , ban đêm
là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C.
- Ánh sáng : Lan Hài không cầ n ánh sáng mă ̣t trời đầ y đủ

. Hầ u hế t lan

Hài ƣa ánh sáng yếu , điề u kiê ̣n ánh sáng nhân ta ̣o cho các loài lan tƣ̀
22.000 lux . Nế u lá bi ̣vàng hoă ̣c phát hoa ng

ắn chứng tỏ chúng đang dƣ ánh

sáng , nế u lá màu xanh đâ ̣m và mề m hoă ̣c phát hoa dài
ánh sáng .

11.000 -

, yế u , chúng đang thiếu

9

- Độ ẩm không khí : Không khí ẩ m và lƣu thông tố t là rấ t cầ n thiế t

, nhấ t là

trong mùa hè , giúp giảm thiể u nguy cơ nhiễm nấ m bê ̣nh và giƣ̃ cho cây không bi ̣
khô quá nhanh . Độ ẩm có thể đƣợc nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các
khay sỏi nhe ̣ với 50% đô ̣ ẩ m là lý tƣởng.
- Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoă ̣c 14:14:14, bổ sung

khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg 2+ 20-30mg/l. Tƣới nƣớc đâ ̣m trƣớc và sau khi bón phân ,
nế u thấ y đầ u lá bi ̣nâu khô thì nên dƣ̀ng hẳ n viê ̣c tƣới phân . Sang châ ̣u khi giá thể
trồ ng có dấ u hiê ̣u mu ̣c nát .
- Giá thể trồng: P. Concolor có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi tr

ộn thêm

chất lá mục, than củi, xỉ than tổ ong, dớn, xơ dừa, sỏi, vỏ thông và có thể tƣới thêm
phân bón 2lầ n/ tuầ n trong suố t mùa sinh trƣởng của cây lan .
2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài P.Concolor
- Phƣơng pháp tách chiế t thông thƣờng : Lan Hài P. Concolor là loài đơn thân
nên chỉ có thể tách chồ i non ra khỏi cây me ,̣ trồ ng vào chin
́ h giƣ̃a châ ̣u mới. Cầ n cô ̣t
chă ̣t cây vào châ ̣u bằ ng mô ̣t cây tƣ̣a sau đó

phun mô ̣t dung dich
̣ NAA 0,1 ppm và

vitamin B 1 và treo cây vào nơi thoáng mát . Sau khi cây bén rễ thì bổ sng uthêm
chấ t trồ ng vào châ ̣u sau đó đă ̣t cây vào nơi có điề u kiê ̣n ánh sáng thić h hơ ̣p cho sƣ̣
phát triển lâu dài của cây [16].
- Phƣơng pháp cấ y mô : Đây là phƣơng pháp duy nhấ t hiê ̣n nay có thể nhân
giố ng lan Hài trên quy mô công nghiê ̣p

, cây con đƣơ ̣c sản xuấ t hoàn toàn giố ng

nhau tƣ̀ mô ̣t cây bố me ̣ . So với phƣơng pháp tách chiế t thông thƣờng có tố c đô ̣
phát triển 1cây/năm thì phƣơng pháp nuôi cấ y mô sẽ sản xuấ t đƣơ ̣c khoảng

4triê ̣u

cây/năm. Các loài lan Hài thƣờng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Murashige

&

Skoog 1962, Heller, Vacin & Went có bổ sung chấ t điề u hoà sinh trƣởng nhƣ
NAA, 2,4D, BA, TDZ, Kinetin...trong điề u kiê ̣n vô trùng hoàn toàn . Nhờ tiế n bô ̣
khoa ho ̣c , ngày nay ngƣời ta có thể cấy nhiều bộ phận khác nhau của cây lan để
hình thành các thể giống protocorm nhƣ đỉnh sinh trƣởng hay chồi bên
lá, đố t thân hoă ̣c rễ [26].

, cọng hoa,

10

2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào
2.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào
2.3.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học ngƣời Đức là ngƣời đầu tiên khởi
xƣớng ý tƣởng nuôi cấ y mô tế bào thƣ̣c vâ ̣t . Ông đƣa giả thuyế t về tin
́ h toàn năng
của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời”
. Theo ông
mỗi tế bấ t kì của cơ thể sinh vâ ̣t đa bào đề u có khả năng ti

ềm tàng để phát triển

thành một cơ thể hoàn chỉnh . Theo quan điể m của sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i thì mỗi tế bào
riêng rẽ đã phân hoá đề u mang toàn bô ̣ lƣơ ̣ng thông tin di truyề n cầ n thiế t và đủ của

cả sinh vật đó . Khi gă ̣p điề u kiê ̣ n thuâ ̣n lơ ̣i , mỗi tế bào đề u có thể phát triể n thành
mô ̣t cá thể hoàn chỉnh . Đó là tính toàn năng của tế bào và là cơ sở lý luâ ̣n của
phƣơng pháp nuôi cấ y mô tế bào thực vật [2].
2.3.1.2 Sự phân hoá tế bào
Sƣ̣ sinh trƣở ng của tế bào gồ m hai giai đoa ̣n : Giai đoa ̣n phân chia tế bào và
giai đoa ̣n dañ của tế bào . Trong hai giai đoa ̣n này tế bào chƣa có nhƣ̃ng đă ̣c trƣng
riêng về cấ u trúc và chƣ́c năng . Sau đó các tế bào bắ t đầ u phân hoá thành cá c mô
chuyên hoá để đảm nhâ ̣n các chƣ́c năng khác nhau , các tế bào trong giai đoạn này
có đặc trƣng riêng về cấu trúc và chức năng . Có thể nói rằng sự phân hoá tế bào là
sƣ̣ chuyể n tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá [2].
2.3.1.3. Sự phản phân hoá tế bào
Sƣ̣ phản phân hoá tế bào là qua trình ngƣơ ̣c la ̣i với sƣ̣ phân hoá tế bào . Các tế
bào đã phân hoá trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của
mình, trong nhƣ̃ng điề u kiê ṇ thích hơ ̣p , chúng có thể quay lại đóng vai trò nhƣ các
mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới [2].
2.4. Các vấn đề thƣờng gặp trong nhân giống invitro
2.4.1. Tính bất định về mặt di truyền
Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh
trƣởng. Tần số biến dị thƣờng khác nhau và không lặp lại. Tần số biến dị trong
nuôi cấy mô sẹo thƣờng cao hơn nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Tần số biến dị xảy ra
còn phụ thuộc vào các yếu tố:

11

- Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy.
- Loại mô cấy.
- Số lần cấy chuyển nhiều hay ít [16].
2.4.2. Sự nhiễm mẫu
Do môi trƣờng nuôi cấy có nhiều chất dinh dƣỡng cho mô tế bào thực vật phát

triển thì đồng thời nó cũng là môi trƣờng thích hợp cho các loài nấm và vi khuẩn
phát triển. Sự nhiễm mẫu xảy ra có thể là do nồi hấp không đạt yêu cầu, yêu cầu về
điều kiện vô trùng trong phòng cấy không đảm bảo hoặc do thao tác của ngƣời nuôi
cấy [16].
2.4.3 Sự hóa thủy tinh thể
Hiện tƣợng thủy tinh thể là một dạng bệnh lí của cây bị mất nƣớc khi chuyển
cây từ môi trƣờng in vitro ra môi trƣờng ngoài. Những biện pháp hạn chế sự thủy
tinh thể:
- Giảm bớt sự hút nƣớc của câybằng cách tăng nồng độ đƣờng trong môi
trƣờng cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao.
- Tránh gây thƣơng tổn trên mẫu cấy khi khử trùng.
- Giảm hàm lƣợng ethylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng
cƣờng ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy [16].
2.4.4. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu
Trong quá trình nuôi cấy mô, thƣờng thấy hiện tƣợng hóa nâu hay hóa đen
mẫu khiến cho sự sinh trƣởng của mẫu bị chậm lại, thậm chí hƣ mẫu. Hiện tƣợng
này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hay polyphenol, chúng có nhiều
trong mô già hơn mô non. Các biện pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:
- Tách các phân tử phenol ra khỏi môi trƣờng.
- Ngăn chặn hoạt động của enzym phenolaza.
- Giảm lƣợng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trƣờng lỏng giống môitrƣờng rắn.
- Chuẩn bị mẫu có vết cắt nhỏ.
- Gây vết thƣơng nhỏ nhất trên mẫu khi khử trùng.
- Sử dụng mô mẫu cấy nhỏ từ mô non [16].

12

2.5. Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp nuôi cấy mô
2.5.1. Ưu điểm

- Tạo ra số lƣợng lớn cây đồng nhất về mặt di truyền.
- Có thể nhân giống từ bất cứ bộ phận nào của cây.
- Khắc phục đƣợc đặc tính khó nhân giống, hệ số nhân giống thấp và tính bất
thụ ở cây trồng, rút ngắn thời gian nhân giống.
- Kiểm soát đƣợc các yếu tố gây bệnh cho cây, tạo ra các dòng cây sạch bệnh.
- Ứng dụng vào lĩnh vực di truyền nhằm tạo ra những giống mới mà phƣơng
pháp truyền thống không làm đƣợc nhƣ: giống đơn bội, giống đa bội,…
- Là công cụ giúp bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật.
- Là công cụ để nghiên cứu đặc tính sinh lí thực vật.
- Cảm ứng đƣợc sự trẻ hóa của mô, do vậy sự sinh trƣởng của những cây nuôi
cấy in vitro thƣờng mạnh hơn vì chúng đã đƣợc trẻ hóa và sạch bệnh.
- Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống ex vitro.
- Một số cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính nhƣ các cây đơn bội, cây bất
thụ đực, cây bất thụ do đột biến,… có thể đƣợc duy trì và nhân giống nhờ phƣơng
pháp nhân giống in vitro.
- Phƣơng pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen.
- Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tƣợng hữu dụng trong việc lai soma:
+ Do cây in vitro đƣợc nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn
dinh dƣỡng và điều kiện môi trƣờng) nên có thể sản xuất cây con quanh năm.
+ Có thể sử dụng cây mẹ in vitro để sử dụng cho các bƣớc nhân giống tiếp theo.
+ Nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng mẫu cấy ban đầu rất nhỏ nên có điều kiện để
chọn mẫu đƣợc kỹ càng.
+ Các cây sạch bệnh có thể dễ dàng trao đổi với các nơi khác nhau do cây có
kích thƣớc nhỏ và không trồng trong đất [2; 9].
- Phƣơng pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm giá thành của sản
phẩm tăng cao [2; 9].

13

2.5.2. Nhược điểm
- Việc nhân giống in vitro đòi hỏi có kỹ thuật cao, phòng nuôi cấy yêu cầu về
trang thiết bị đắt tiền, yêu cầu cao về mức độ vô trùng.
- Kiểu gen thực vật không ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy.
- Đặc biệt đối với một số loại cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.
- Việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm rất khó thực hiện. Cây dễ bị
héo do khí khổng hoạt động không ổn định. Cây rất dễ bị sâu bệnh tấn công, vì vậy
giá thể dùng làm môi trƣờng sống của cây cần đƣợc xử lí cẩn thận. Tỉ lệ sống của
cây con khi chuyển ra vƣờn ƣơm rất thấp.
- Đối với một số mô, việc vô trùng mẫu trƣớc khi đƣa vào cấy rất khó thực hiện.
- Khả năng tái sinh cây có thể bị mất do việc cấy chuyền mô sẹo nhiều lần.
- Phƣơng pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm giá thành của
sản phẩm tăng cao [2; 9].
2.6. Quy trình nhân giống in vitro [9].
2.6.1. Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Vì trong nuôi c ấy in vitro cây con sẽ mang nhƣ̃ng đă ̣c tin
́ h và tin
́ h tra ̣ng của
cây me ̣ ban đầ u nên trong giai đo

ạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thâ ̣n , cây me ̣

thƣờng là cây có nhiề u đă ̣c tính ƣu viê ̣t , khoẻ, có giá trị kinh tế cao. Sau đó, chọn cơ
quan để lấ y mẫu thƣờng là mô non , đoa ̣n thân có chồ i ngủ , lá non hoặc hoa non ...
Mô cho ̣n để nuôi c ấy thƣờng là mô có khả năng tái sinh cao tr ong môi trƣờng nuôi
cấ y sa ̣ch bê ̣nh , giƣ̃ đƣơ ̣c các đă ̣c tin
́ h sinh ho ̣c quý của cây me ̣ , ít nguy cơ biến dị.
Tuỳ theo điều kiện, giai đoa ̣n này có thể kéo dài 3-6 tháng [4].
2.6.2. Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Là giai đoạn chuyể n m ẫu vâ ̣t từ ngoài vào môi trƣờng nuôi cấy để t ạo nguyên

liê ̣u sa ̣ch bê ̣nh cho nhân giố ng , giai đoa ̣n này đƣơ ̣c tiế n hành theo các bƣớc : Khƣ̉
trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn b ị các môi trƣ ờng nuôi cấy. Cấ y mẫu vâ ̣t vào ố ng
nghiê ̣m hoă ̣c biǹ h nuôi cấ y có sẵn môi trƣờng nhân ta ̣o (giai đoa ̣n này là giai đoa ̣n
cấ y mẫu in vitro). Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấ m, virus sẽ đƣơ ̣c
nuôi trong phòng nuôi cấy với đi ều kiện nhiệt độ ánh sáng phù h ợp. Sau mô ̣t thời

14

gian nhấ t đinh
̣ , tƣ̀ mẫu nuôi cấ y đã bắ t đầ u xuấ t hiê ̣n các cu ̣m tế bào hoă ̣c các cơ
quan hoă ̣c các phôi vô tính . Giai đoa ̣n này phu ̣ thuô ̣c vào tƣ̀ng đố i tƣơ ̣ng đem nhân
giố ng, thông thƣờng kéo dài tƣ̀ 2-12 tháng hoặc ít nhất 4 lầ n cấ y chuyể n [4].
2.6.3. Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoa ̣n sản xuấ t cây nhân giố ng quyế t đinh
̣ hiê ̣u quả của quá trình
nuôi cấ y mô , cây đƣơ ̣c nhân nhanh theo nhu cầ u của ngƣời nuôi cấ y . Khi mẫu cấ y
sạch đã đƣợc tạo ra, tƣ̀ đó nhâ ̣n đƣơ ̣c các cu ̣m chồ i và các phôi vô tính sinh trƣởng
tố t trong quá trình nuôi cấ y sẽ bƣớc vào giai đoa ̣n sản xuấ t . Ngƣời ta cầ n ta ̣o ra tố c
đô ̣ nhân nhanh cao nhấ t trong điề u kiê ̣n nuôi cấ y

. Thành phần và điều kiện môi

trƣờng cầ n tố i ƣu hoá để ta ̣o đƣơ ̣c mu ̣ c tiêu nhân nhanh [1]. Đối với môi trƣ ờng
nhân chồ i , ngƣời ta sƣ̉ du ̣ng các chấ t kić h thić h sinh trƣởn g thuô ̣c nhóm cytokinin
(BAP, Kinetin) với nồ ng đô ̣ khác nhau tuỳ tƣ̀ng đố i tƣơ ̣ng cây

. Quy trin
̀ h cấ y

chuyể n để nhân nhanh chồ i thƣờ ng trong khoảng 1-2 tháng tuỳ loài cây. Tỷ lệ nhân
nhanh khoảng 2-8 lầ n sau mô ̣t lầ n cấ y chuyể n . Nhìn chung giai đo ạn này thƣờng
kéo dài 10-36 tháng. Giai đoa ̣n nhân nhanh chồ i tƣ̀ mô ̣t vài chồ i ban đầ u không nên
kéo dài quá lâu để tránh sƣ̣ hin
̀ h thành biến dị soma.
2.6.4. Tạo rễ
Các ch ồi hình thành trong quá trình nuôi c

ấy có thể phát triể n rễ tƣ̣ sinh

,

nhƣng thông thƣờng các chồ i này phải cấ y chuyể n sang mô ̣t môi trƣờng khác để
kích thích tạo rễ. Đối với môi trƣờng tạo rễ, ngƣời ta thƣờng sƣ̉ du ̣ng chấ t kích thích
sinh trƣởng thuô ̣c nhóm auxin nhƣ α-NAA, IAA, IBA. Thông thƣờng giai đoa ̣n này
kéo dài 2-8 tuầ n tuỳ đố i tƣơ ̣ng. Khi cây có đủ các bô ̣ phâ ̣n thân , lá, rễ với kić h thić h
nhấ t đinh
̣ đảm bảo cho sinh trƣởng , phát triển bình thƣ ờng ngoài tƣ̣ nhiên , ngƣời ta
mới tiế n hành giai đoa ̣n tiế p theo là đƣa cây ra ngoài môi trƣờng tƣ̣ nhiên .
2.6.5. Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoa ̣n đầ u cây đƣơ ̣c chuyể n tƣ̀ điề u kiê ̣n vô trù ng trong ố ng nghiê ̣m
ra ngoài môi trƣờng tƣ̣ nhiên . Giai đoa ̣n này quyế t đinh
̣ khả năng ƣ́ng du ̣ng của quy
trình nhân giống in vitro. Đa số các loài cây trồ ng chỉ sau khi chồ i đã ra rễ ta ̣o thành
cây hoàn chin̉ h với kić h thƣớc nhấ t đinh
̣ mới đƣơ ̣c huấ n luyê ̣n và chuyể n ra ngoài

15

vƣờn ƣơm. Cây nuôi cấ y in vitro đƣơ ̣c sinh trƣởng và phát triể n trong nhƣ̃ng điề u
kiê ̣n tố i ƣu về nhiê ̣t đô ̣ , đô ̣ ẩ m , pH, dinh dƣỡng ... Vì vậy , trƣớc khi đƣa ra trồ ng ,
ngƣời ta cầ n huấ n luyê ̣n cây để thić h nghi với điề u kiê ̣n tƣ̣ nhiên . Quá trình thích
nghi với điề u kiê ̣n bên ngoài của cây ở giai đoa ̣n đầ u yêu cầ u cầ n đƣơ ̣c chăm sóc
đă ̣c biê ̣t . Vì vậy , cây đƣơ ̣c chuyể n tƣ̀ môi trƣờng tƣ̀ baõ hoà hơi nƣớc sang vƣờn
ƣơm với nhƣ̃ng điề u kiê ̣n khó khăn hơn , nên vƣờn ƣơm cầ n phải đáp ƣ́ng các yêu
cầ u: che cây non bằ ng nilon và có hê ̣ thố ng phun sƣơng cung cấ p đô ̣ ẩ m và làm mát
cây; giá thể trồng cây có thể là đ ất mùn, hoă ̣c các hỗn hơ ̣p nhân ta ̣o kh ông chƣ́a đấ t ,
mùn cƣa và bọt biể n... Giai đoa ̣n này đòi hỏi 4-16 tuầ n.
2.7. Tình hình nghiên cứu nhân giống lan Hài trên thế giới và trong nƣớc
2.7.1. Trên thế giới
Tài nguyên di truyền cây trồng là di sản ngàn đời của nhân loại và nằm trong
những tài nguyên quý giá nhất hiện nay. Vài chục năm trở lại đây, do nhiều
nguyên nhân khác nhau, sự đa dạng di truyền cây trồng đã và đang đứng trƣớc mối
đe doạ bị thu hẹp và bị mất đi.
Trên trái đất, hầu nhƣ nơi nào có thực vật là có phong lan. Cây hoa lanmọc ở
khắp năm châu, bốn bể, từ miền gió tuyết lạnh cho đến sa mạc khô hạn, từ miền núi
cao rừng thẳm cho đến các đồng cỏ miền bình nguyên và ngay cả vùng sình lầy, đâu
đâu cũng có lan sinh sống.
Tuy nhiên đa số các loài lan mọc tập trung ở các rừng cây nhiệt đới, ở các
nƣớc Châu Á nhƣ: Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam…
Để bảo tồn đa dạng sinh học, một số cách thức và nguyên tắc đã đƣợc các nƣớc áp
dụng đó là bảo tồn nguyên vị (insitu) và bảo tồn chuyển vị (ex – situ). Trong những thập
kỷ gần đây, cùng với sự phát triển về khoa học công nghệ, các thành tựu khoa học kỹ thuật
mới đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất giống lan.
Tình hình bảo tồn, phát triển các loài lan
Tại Ấn Độ, các tác giả L. C. DE, R. P. MEDHI [28] đã nghiên cứu về tính đa
dạng và các phƣơng pháp bảo tồn các loài lan quý hiếm vùng Đông Bắc Ấn Độ, các tác
giả đã khẳng định trên toàn Ấn Độ có khoảng 1.331 loài hoa lan, thuộc 186 chi, trong

16

đó vùng Đông Bắc Ấn Độ duy trì số lƣợng cao nhất với khoảng 856 loài. Trong số đó
có 34 loài có nguy cơ tuyệt chủng cần bảo tồn, bao gồm loài P. hirsutissimum. Các tác
giả đã khẳng định vấn đề ô nhiễm môi trƣờng, sự nóng lên toàn cầu, thƣơng mại hóa
nông nghiệp và lâm nghiệp, trồng trọt và khai thác quá mức là những nguyên nhân
chính cho sự mất đa dạng. Ấn Độ đã tăng cƣờng về bảo tồn đa dạng sinh học bằng cách
thực hiện một loạt các hành vi, quy tắc, luật lệ, quy định, thỏa thuận và mạng lƣới phát
triển các khu bảo tồn.
Lan Hài (Paphiopedilum Pritz) là một chi lan đẹp trong họ lan (Orchidaceae
Juss) thuộc họ phụ Cypripedioideae. Hơn 2 thập kỷ trở lại đây, lan hài ngày càng
đƣợc chú ý nhiều hơn ở trên thế giới không chỉ trong việc nuôi trồng, lai tạo mà còn
cả trong việc sƣu tầm phát hiện những loài lan hài mới. Chính vì vậy chỉ trong một
thời gian ngắn, thế giới đã có một loạt các loài lan hài mới đƣợc phát hiện và ghi
nhận nhƣ Paph. armeniacum Chen et Liu (1982); Paph. malipoense Chen et Tsi
(1984); Paph. Emersonii Koopowitz et Cribb (1986); Paph. Henryanum Braem
(1987); Paph. Malipoense var jackii Hua (1995); Paph.herrmannii Fuchs et
Reisinger (1995); Paph. Helenae Aver (1996); Paph. Hiepii Aver (1998); Paph.
tranlienianum Gruss & Perner (1998) và Paph.hangianum Perner & Gruss (1999).
Để tạo điều kiện sống tốt nhất cho các giống lan hài đƣợc thuần hóa. Koopowitz và
Hasegawa (1991) [27] đã xác định điều kiện ánh sáng nhân tạo cho hầu hết các loài lan
hài là từ 11.000 - 22.000 lux. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn là cây quá thừa ánh
sáng, còn nếu lá mềm, màu xanh đậm hoặc phát hoa dài, yếu, là bởi do thiếu ánh sáng.
Cây từ rừng về không ra hoa nguyên nhân chính là ánh sáng và nhiệt độ không phù hợp
.
Ngoài ra, ánh sáng có vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt giống
, sự tiếp xúc với
ánh sáng sẽ ức chế sự nảy mầm và có thể dẫn dến hiện tƣợng ngủ của hạt gây khó khăn
cho quá trình nhân giống.

Ở Ấn Độ Chyuam-Yih Ng và Norihan Mohd (2011), đã nghiên cứu nhân giống
Paphiopedilum trong in vitro thông qua phƣơng pháp hình thành các thể protocorm thứ
cấp từ thể protocorm sơ cấp đƣợc phát triển từ callus có nguồn gốc từ thân. Các thể
protocorm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ½ MS có bổ sung các nồng độ BA và

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài gấm (paphiopedilum concolor) bằng phương pháp in vitro từ chồi nách

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về