BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỮU MINH QUÂN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT FLAVONOID TỪ
KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỮU MINH QUÂN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT FLAVONOID TỪ
KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC
Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS. Trần Anh Vũ
DS. Phan Nguyễn Trƣờng Thắng

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018


XÁC NHẬN CỦA GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN
Nội dung


TÓM TẮT
Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ đại học – Năm học 2017-2018

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT FLAVONOID TỪ
KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.)
NGUYỄN HỮU MINH QUÂN
Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS. Trần Anh Vũ
DS. Phan Nguyễn Trƣờng Thắng
Đặt vấn đề
Khổ sâm bắc có 2 thành phần chủ yếu là alkaloid và flavonoid và từ lâu đƣợc sử
dụng trong y học Trung Hoa để chữa nhiều bệnh, đồng thời dƣợc điển Hồng Kông
2012 có chuyên luận khổ sâm bắc dựa trên thành phần alkaloid của cây này. Tuy
nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy thành phần flavonoid trong cây khổ sâm
bắc có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý và đƣợc nhiều nhà nghiên cứu đề nghị
cần đánh giá thành phần flavonoid trong kiểm nghiệm dƣợc liệu này. Do đó, đề tài
tiến hành phân lập flavonoid từ rễ khổ sâm bắc để có nguồn chất đối chiếu cho việc
đánh giá.
Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
Đối tượng: Rễ khổ sâm bắc của Công ty cổ phần sản xuất chế biến nông lâm sản
Dƣợc liệu sạch Đăk Nông, thu hái tháng 7/2017, đã đƣợc định danh bằng kỹ thuật
DNA bởi nhóm nghiên cứu 2017.
Phương pháp nghiên cứu: (1) Chiết xuất, phân lập và tinh chế 1 flavonoid từ rễ khổ
sâm bắc. (2) Kiểm tra tinh khiết và xác định cấu trúc chất thu đƣợc bằng các

phƣơng pháp phổ nghiệm. (3) Xác định hàm lƣợng chất phân lập bằng phƣơng pháp
quy về phần trăm diện tích peak trên HPLC với quy trình đƣợc thẩm định.
Kết quả
(1) Từ 4,05 kg rễ khổ sâm bắc chiết đƣợc 903 g cao ethanol toàn phần. Từ 302 g
cao ethanol toàn phần thu đƣợc 3,30 g cao phân đoạn. Từ cao phân đoạn này tinh
chế thu đƣợc 316 mg SF1 và 91 mg SF2.
(2) Xác định cấu trúc SF1 và SF2 bằng các phƣơng pháp phổ nghiệm lần lƣợt là
isoxanthohumol và sophoraflavanone G.
(3) Hàm lƣợng theo phƣơng pháp quy về phần trăm diện tích peak trên HPLC cùa
isoxanthohumol và sophoraflavanone G phân lập lần lƣợt là 98,76% và 95,70% với
quy trình đã đƣợc thẩm định đạt tƣơng thích hệ thống, đƣờng tuyến tính, độ đặc
hiệu, độ lặp lại và độ chính xác trung gian.
Kết luận
Phân lập thành công 2 flavonoid với độ tinh khiết cao, xác định đƣợc cấu trúc và
thu đƣợc lƣợng đáng kể để tiếp tục thiết lập chất đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm
thành phần flavonoid trong rễ khổ sâm bắc.


ABSTRACT
Final essay for the degree of BS. Pharm. – Academy year: 2017-2018
STUDY ON ISOLATION OF A FLAVONOID CONSTITUENT FROM
KUSHEN (Sophora flavescens Ait.)
NGUYEN HUU MINH QUAN
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Tran Anh Vu
Ph. Phan Nguyen Truong Thang
Introduction
Sophora flavescens Ait. has two main constituents are alkaloids and flavonoids and
has been used in oriental medicines in China for thousands years to treat various of
diseases, and Hong Kong pharmacopeia 2012 has a monograph for Sophora
flavescens in evaluating alkaloids constituents. However, it has been recently

recorded by lots of scientists that the remarkably biological effects of flavonoids
constituents and they has also suggested the requirement for assessing the quality of
Sophora flavescens in flavonoids contents. According to this issue, we conduct a
study on isolation of a flavonoid constituent from root of Sophora flavescens.
Materials and methods
Materials: Roots of Sophora flavescens was collected in Dak Nong in July, 2017.
Methods: (1) Extract, isolate and pure one flavonoid from roots of Sophora
flavescens. (2) Test for purity and identify structure of isolated substances. (3)
Determine the content of isolated compounds by calculating percentage of peak area
on High performance liquid chromatography method, the using method is validated.
Results
(1) 903 g ethanol extract from 4,05 kg Roots of Sophora flavescens was
chromatographed to acquire 3,3 g IV fraction. This fraction continued to
chormatograph and pure on HPLC preparation to acquire 316 mg SF1 and 91 mg
SF2.
(2) Identify structures of isolated compounds by NMR spectrum was carried out to
define SF1 is isoxanthohumol and SF2 is sophoraflavanone G.
(3) The content of isolated isoxanthohumol and sophoraflavanone G by calculating
percentage of peak area on HPLC method were determined respectively as 98,76%
and 95,70%. The using method was completely validated.
Conclusion
Isolate successfully 2 flavonoids compounds from roots of Sophora flavescens with
high purity, determined structures and significant amounts to establish references
standards for evaluating quality of flavonoid contents in roots of Sophora flavescens


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

MỤC LỤC
MỤC LỤC


............................................................................................................. i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH & SƠ ĐỒ ................................................................................. vi
CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ.....................................................................................1
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................2
2.1.

Tổng quan về cây khổ sâm bắc .................................................................2

2.1.1.

Tổng quan về thực vật học ..................................................................2

2.1.2.

Tổng quan về thành phần hóa học ......................................................3

2.1.3.

Tác dụng dƣợc lý.................................................................................6

2.1.4.

Công dụng và liều dùng ......................................................................8

2.2.


Các phƣơng pháp chiết xuất phân lập.......................................................8

2.2.1.

Các phƣơng pháp chiết xuất ................................................................8

2.2.2.

Các phƣơng pháp phân lập, tinh chế ...................................................9

2.2.3.

Các phƣơng pháp đánh giá hợp chất phân lập đƣợc ...........................9

CHƢƠNG 3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................13
3.1.

Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................13

3.1.1.

Nguyên liệu .......................................................................................13

3.1.2.

Hóa chất, dung môi ...........................................................................13

3.1.3.

Dụng cụ, trang thiết bị.......................................................................13


3.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................14

3.2.1.

Chiết xuất, phân lập và tinh chế flavonoid........................................14

3.2.2.

Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc chất phân lập ................16

3.2.3.
Xây dựng quy trình xác định hàm lƣợng chất phân lập bằng phƣơng
pháp HPLC quy về phần trăm diện tích peak ...........................................................17
3.2.4.

Sơ bộ xác định hàm lƣợng chất phân lập trong dƣợc liệu rễ khổ sâm ..
...........................................................................................................19
i


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ & BÀN LUẬN................................................................21
4.1.

Chiết xuất, phân lập và tinh chế flavonoid .............................................21


4.1.1.

Khảo sát dung môi chiết xuất ............................................................21

4.1.2.

Chiết xuất cao rễ khổ sâm bắc ..........................................................22

4.1.3.

Phân lập các flavonoid ......................................................................22

4.2.

Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hợp chất phân lập ..............29

4.2.1.

Đánh giá hợp chất SF1 đã phân lập ..................................................29

4.2.2.

Đánh giá hợp chất SF2 đã phân lập ..................................................35

4.3.
Xây dựng quy trình xác định hàm lƣợng chất phân lập bằng phƣơng
pháp HPLC quy về phần trăm diện tích peak ...........................................................41
4.3.1.

Xác định hàm lƣợng hợp chất isoxanthohumol (SF1) phân lập đƣợc ..

...........................................................................................................41

4.3.2.
Xây dựng quy trình xác định hàm lƣợng hợp chất sophoraflavanone
G (SF2) phân lập đƣợc ..............................................................................................48
4.4.
Sơ bộ xác định hàm lƣợng isoxanthohumol và sophoraflavanone G trong
dƣợc liệu rễ khổ sâm .................................................................................................54
4.4.1.

Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu .....................................................54

4.4.2.
Tiến hành định lƣợng sơ bộ isoxanthohumol và sophoraflavanone G
trong dƣợc liệu ..........................................................................................................54
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ .................................................................58
5.1.

Kết luận ...................................................................................................58

5.2.

Đề nghị....................................................................................................58

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................59

ii


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ tắt

Từ nguyên

13

13

1

C-NMR

H-NMR

1

ngh a tiếng Việt

C - Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hƣởng từ hạt nhân
C13

H - Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hƣởng từ hạt nhân
proton


BĐM

Bình định mức

Bình định mức

DCM

Dichloromathane

Diclorometan

DĐHK

Dƣợc điển Hồng Kông

Dƣợc điển Hồng Kông

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dimetyl sulfoxid

DSC

Differential scanning calorimetry

Phân tích nhiệt quét vi sai


EC50

Half maximal effective concentration

Nồng độ có hoạt tính tối đa
50% đối tƣợng thử nghiệm

EtOAc

Ethyl acetate

Ethyl acetat

HPLC

High
performance
chromatography

HSV

Herpes simplex virus

Virus herpes đơn dạng

IC50

Half maximal inhibitory concentration

Nồng độ ức chế tối đa 50%

đối tƣợng thử nghiệm

IR

Infrared Spectroscopy

Phƣơng pháp phổ hồng
ngoại

MeOH

Methanol

Methanol

MS

Mass spectrum

Khối phổ

n-Bu

n-Butanol

n-Butanol

NMR

Nuclear Magnetic Resonance


Cộng hƣởng từ hạt nhân

PA

Pure analyses

Tinh khiết phân tích

PDA

Photodiod Array

Dãy diod quang

PE

Petrolium Ether

Ete dẩu hỏa

RP-18

Reverse phase - 18

Pha tỉnh đảo cho sắc ký

RSV

Respiratory Syncytial Virus


Virus hợp bào hô hấp

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng

liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

iii


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Một số cấu trúc flavonoid đáng chú ý trong Sophora flavescens ...............4
Bảng 2.2. Cấu trúc một số isoflavon nổi bật có tác dụng sinh học trong Sophora
flavescens ....................................................................................................................5
Bảng 2.3. Một số công trình nghiên cứu phân lập flavonoid từ rễ khổ sâm bắc
Sophora flavescens Ait. .............................................................................................10
Bảng 4.4. Khối lƣợng cắn thu đƣợc với các dung môi chiết khác nhau ...................21
Bảng 4.5. Các phân đoạn sắc ký cột từ cao ethanol toàn phần .................................22
Bảng 4.6. Các phân đoạn sắc ký cột từ cao phân đoạn IV ........................................24
Bảng 4.7. Chƣơng trình pha động sắc ký phân đoạn C.............................................25
Bảng 4.8. Các thông số thăm dò điều kiện sắc ký HPLC điều chế phân đoạn C .....26
Bảng 4.9. Chƣơng trình pha động định tính SF1 ......................................................30
Bảng 4.10. Bảng so sánh số khối lý thuyết và số khối chất SF1 ..............................32
Bảng 4.11. Bảng so sánh phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6, ppm và 1H-NMR

(500MHz, DMSO-d6, ppm) của SF1 và isoxanthohumol .....................................34
Bảng 4.12. Chƣơng trình pha động định tính SF2 ....................................................36
Bảng 4.13 Bảng so sánh số khối lý thuyết và số khối chất SF2 ...............................38
Bảng 4.14. Bảng so sánh phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6, ppm và 1H-NMR
(500MHz, DMSO-d6, ppm) của SF2 với phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6,
ppm và 1H-NMR (300MHz, DMSO-d6, ppm) của sophoraflavanone G [29].40
Bảng 4.15. Chƣơng trình pha động định lƣợng SF1 .................................................41
Bảng 4.16. Các thông số sắc ký tƣơng ứng với đỉnh SF1 sau sáu lần tiêm liên tiếp
(n=6) ..........................................................................................................................42
Bảng 4.17. Chuẩn bị mẫu cho khảo sát khoảng tuyến tính .......................................44
Bảng 4.18. Kết quả tuyến tính của diện tích đỉnh theo nồng độ mẫu thử .................44
Bảng 4.19. Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ lặp lại ..................................................45
Bảng 4.20. Kết quả thẩm định độ lặp lại của quy trình xác định hàm lƣợng
isoxanthohumol .........................................................................................................45
Bảng 4.21. Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ tái lập ..................................................46
iv


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Bảng 4.22. Kết quả thẩm định độ tái lập của quy trình xác định hàm lƣợng
isoxanthohumol .........................................................................................................46
Bảng 4.23. Kết quả độ chính xác trung gian ở 2 ngày và 2 hệ thống HPLC khác
nhau ...........................................................................................................................47
Bảng 4.24. Kết quả hàm lƣợng isoxanthohumol phân lập ........................................47
Bảng 4.25. Các thông số sắc ký tƣơng ứng với đỉnh SF2 sau sáu lần tiêm liên tiếp
(n=6) ..........................................................................................................................48
Bảng 4.26. Chuẩn bị mẫu cho khảo sát khoảng tuyến tính .......................................50
Bảng 4.27. Kết quả tuyến tính diện tích đỉnh theo nồng độ mẫu thử
sophoraflavanone G ..................................................................................................50

Bảng 4.28. Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ lặp lại ..................................................51
Bảng 4.29. Kết quả thẩm định độ lặp lại của quy trình xác định hàm lƣợng
sophoraflavanone G ..................................................................................................51
Bảng 4.30. Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ tái lập ..................................................52
Bảng 4.31. Kết quả thẩm định độ tái lập của quy trình xác định hàm lƣợng
isoxanthohumol .........................................................................................................52
Bảng 4.32. Kết quả độ chính xác trung gian ở 2 ngày và 2 hệ thống HPLC khác
nhau ...........................................................................................................................53
Bảng 4.33. Kết quả hàm lƣợng sophoraflavanone G phân lập .................................53
Bảng 4.34. Chƣơng trình pha động ...........................................................................54
Bảng 4.35. Các thông số sắc ký tƣơng ứng với đỉnh isoxanthohumol sau sáu lần
tiêm liên tiếp (n=6) ....................................................................................................55
Bảng 4.36. Các thông số sắc ký tƣơng ứng với đỉnh sophoraflavanone G sau sáu lần
tiêm liên tiếp (n=6) ....................................................................................................55
Bảng 4.37. Kết quả thí nghiệm định lƣợng sơ bộ isoxanthohumol (SF1) và
sophoraflavanone G (SF2) trong dƣợc liệu ...............................................................56

v


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

DANH MỤC HÌNH & SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng quát phân lập flavonoid từ rễ khổ sâm bắc .....................15
Hình 2.1. Cây khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait ................................................ 2
Hình 2.2. Nhóm thế isoprenyl và lavandulyl trên các flavonoid ................................3
Hình 2.3. Cấu trúc một số pterocarpan từ rễ khổ sâm bắc ..........................................5
Hình 4.4. Kết quả sắc ký lớp mỏng của khảo sát chiết .............................................21
Hình 4.5. Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn từ sắc ký cột cao ethanol toàn phần ......23
Hình 4.6. Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn từ sắc ký cột cao phân đoạn IV .............24

Hình 4.7. Sắc ký đồ HPLC phân tích phân đoạn C ...................................................25
Hình 4.8. Sắc ký đồ thăm dò điều kiện HPLC điều chế phân đoạn C ......................27
Hình 4.9. Sắc ký đồ khảo sát peak 1 và 2 trên HPLC phân tích ...............................28
Hình 4.10. Sắc ký đồ HPLC điều chế phân đoạn C ..................................................29
Hình 4.11. Kết quả định tính SF1 bằng sắc ký lớp mỏng .........................................29
Hình 4.12. Sắc ký đồ định tính bằng HPLC hợp chất SF1 phân lập.........................31
Hình 4.13. Phổ UV hợp chất SF1..............................................................................31
Hình 4.14. Phổ hấp thu hồng ngoại IR hợp chất SF1 ...............................................32
Hình 4.15. Phổ ESI-MS của hợp chất SF1 phân lập .................................................32
Hình 4.16. Cấu trúc hợp chất SF1 – isoxanthohumol ...............................................34
Hình 4.17. Kết quả định tính SF2 bằng SKLM ........................................................35
Hình 4.18. Sắc ký đồ định tính bằng HPLC hợp chất SF2 phân lập.........................37
Hình 4.19. Phổ UV hợp chất SF2..............................................................................37
Hình 4.20. Phổ hồng ngoại hợp chất SF2 .................................................................38
Hình 4.21. Phổ ESI-MS của hợp chất SF2 phân lập .................................................38
Hình 4.22. Cấu trúc hợp chất SF2 – sophoraflavanone G ........................................41
Hình 4.23. Sắc ký đồ HPLC đánh giá tính đặc hiệu của quy trình định lƣợng SF1 .43
Hình 4.24. Đƣờng biểu diễn mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh của
isoxanthohumol .........................................................................................................44

vi


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Hình 4.25. Sắc ký đồ HPLC đánh giá tính đặc hiệu của quy trình xác định hàm
lƣợng sophoraflavanone G ........................................................................................49
Hình 4.26. Đƣờng biểu diễn mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh của
sophoraflavanone G ..................................................................................................50
Hình 4.27. Đồ thị ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm lƣợng % isoxanthohumol

và % sophoraflavanone G định lƣợng đƣợc trong dƣợc liệu (a) và cắn thu đƣợc (b)
...................................................................................................................................57

vii


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô Khoa
Dƣợc – Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh, những ngƣời đã dành trọn tâm
huyết và tri thức để giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em và những kiến thức này
không chỉ là nền tảng cho quá trình thực hiện khóa luận mà còn là hành trang để em
bƣớc vào đời một cách vững chắc.
Để hoàn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cô TS.
Trần Anh Vũ đã quan tâm, giới thiệu để em thực hiện đề tài tại viện Kiểm Nghiệm
Thuốc TP.HCM đồng thời tạo điều kiện tốt nhất cho em đƣợc thực hiện đề tài, cảm
ơn cô đã định hƣớng và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình nghiên cứu.
Em chân thành cảm ơn thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Vinh, anh DS. Phan Nguyễn
Trƣờng Thắng, ngƣời đã luôn bên cạnh dìu dắt, động viên, giúp đỡ và chỉ bảo em
một cách tận tình suốt trong quãng thời gian từ những ngày đầu thực hiện đề tài cho
đến lúc hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn tất cả các anh chị kiểm nghiệm viên tại khoa Kiểm nghiệm Đông
dƣợc – Dƣợc liệu, khoa Vật lý – Đo lƣờng, khoa Kiểm nghiệm các dạng Bào chế,
khoa Kiểm nghiệm Nguyên liệu, Khoa Thiết lập Chất chuẩn và Chất đối chiếu và
Khoa Nghiên cứu Phát triển. Thân gửi lời cảm ơn đến những ngƣời bạn cùng thực
hiện đề tài đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ nhau trong suốt thời gian vừa
qua.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất, song
không thể tránh khỏi những hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm cũng nhƣ thiếu sót

mà bản thân em chƣa thấy đƣợc. Em rất mong nhận đƣợc sự đóng góp ý kiến từ
thầy cô để khóa luận đƣợc hoàn chỉnh hơn.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn tất cả!

viii


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

CHƢƠNG 1.

Đặt vấn đề

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.) từ lâu đã đƣợc sử dụng trong y học cổ
truyền Trung Hoa để chữa nhiều bệnh nhƣ lỵ, mụn nhọt, lở loét, giun và ký sinh
trùng [1]. Những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy thành phần hóa học có hoạt tính
đặc trƣng của dƣợc liệu này là alkaloid với các tác dụng sinh học đáng chú ý nhƣ
chống loạn nhịp tim, bảo vệ gan, kháng viêm,…[2] Trên thị trƣờng đặc biệt là
Trung Quốc và Hoa Kỳ đã có nhiều sản phẩm là thuốc hay thực phẩm chức năng từ
Sophora flavescens nhƣ thuốc tiêm Yanshu, Fufang kushen, viên nén Kushen Pian,
thực phẩm bổ sung Kushen Hawaii Pharm và Kushen Nature’s Health đƣợc sản
xuất từ dƣợc liệu này đồng thời việc đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu khổ sâm bắc đã
đƣợc dƣợc điển Hồng Kông 2012 [3] quy định dựa trên 3 thành phần alkaloid là
matrine, oxymatrine và sophoridine. Cùng với alkaloid, thành phần flavonoid trong
dƣợc liệu khổ sâm bắc cũng đã đƣợc nghiên cứu từ lâu [4, 5, 6, 7] với hàng trăm
hợp chất flavonoid đƣợc phân lập trong hơn 5 thập kỷ qua với nhiều tác dụng dƣợc
lý quý báu nhƣ kháng tế bào ung thƣ, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng nhiều
chủng virus nhƣng thành phần này vẫn chƣa trở thành chỉ tiêu trong đánh giá chất

lƣợng dƣợc liệu khổ sâm bắc. Gần đây, nhiều tác giả khoa học trên thế giới đã đề
nghị nên đƣa nhóm hợp chất flavonoid trở thành một trong những chỉ tiêu chất
lƣợng của dƣợc liệu này [7].
Tại Việt Nam, cây khổ sâm bắc đƣợc du nhập, nhân giống và đƣợc trồng với quy
mô lớn ở Đắk Nông và Sapa, tuy vậy chỉ có ít chế phẩm là thực phẩm chức năng
nhƣ Ninh Tâm Vƣơng và Nữ Vƣơng ra đời. Bên cạnh đó, dƣợc điển Việt Nam V
vẫn chƣa có chuyên luận về dƣợc liệu khổ sâm bắc gây khó khăn cho việc kiểm tra,
đánh giá chất lƣợng nguồn dƣợc liệu khổ sâm bắc trong nƣớc cũng nhƣ ngoại nhập
và cho công tác kiểm soát, đánh giá chất lƣợng những chế phẩm từ dƣợc liệu này
trên thị trƣờng. Nhận thấy tầm quan trọng của nhóm hợp chất flavonoid cùng với
vấn đề đánh giá toàn diện dƣợc liệu khổ sâm bắc, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài
“Nghiên cứu phân lập một flavonoid từ khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.)”
với các mục tiêu sau:
- Chiết xuất, phân lập và tinh chế 1 flavonoid từ rễ khổ sâm bắc.
- Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc chất phân lập.
- Xây dựng quy trình xác định hàm lƣợng flavonoid phân lập đƣợc.

1


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

CHƢƠNG 2.

Tổng quan tài liệu

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về cây khổ sâm bắc
2.1.1. Tổng quan về thực vật học

2.1.1.1. Vị trí phân loại
Tên khoa học: Sophora flavescens Ait. (tên khoa học khác là Sophora angustifolia)
Tên thông thường: Khổ sâm bắc
Tên Việt Nam: Dã hòe, Khổ cốt, Khổ sâm cho rễ, Sơn đậu căn, Ðịa sâm…
Theo hệ thống phân loại Takhtajan A.L (2009), cây Khổ sâm bắc có vị trí phân loại
thuộc ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), phân lớp
Hoa hồng (Rosidae), liên bộ Đậu (Fabanae), bộ Đậu (Fabales), họ Đậu (Fabaceae),
chi Sophora, loài Sophora flavescens Ait. [8].
Một số cây khác cũng mang tên Khổ sâm cần chú ý phân biệt:
- Croton tonkinensis Gagnep., họ Thầu dầu (Euphobiaceae) - Khổ sâm cho lá
- Brucea javanica (L.) Merr., họ Thanh thất (Simarubaceae) - Sầu đâu cứt chuột
(Sầu đâu rừng), Khổ sâm cho quả.
2.1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái
Khổ sâm bắc là cây bụi nhỏ, cao 0,5 - 1,2 m. Rễ hình trụ dài, vỏ ngoài màu vàng
trắng. Thân phân nhiều cành, cành non có lông tơ rải rác. Lá kép lông chim lẻ mọc
so le, gồm 5 - 10 đôi lá chét hình mác dài 3 - 4 cm, rộng 1 - 2 cm, dốc thuôn, đầu
nhọn hoặc hơi tù, mặt trên nhẵn, mặt dƣới lông mịn màu xám. Cụm hoa mọc ở kẽ lá
hoặc đầu cành thành chùm dài 10 - 20 cm. Hoa màu vàng nhạt, đài 5 răng hình
chuông, tràng 5 cánh không đều, nhị 10, rời nhau, bầu có lông mịn. Quả đậu, thắt lại
giữa các hạt, thuôn dài 5 - 12 cm, đƣờng kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; hạt 3
- 7, hình cầu, màu đen [1, 2].

(a) Toàn cây trên mặt đất

(b) Bộ phận dùng – Rễ [3]

Hình 2.1. Cây khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait

2



Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Tổng quan tài liệu

2.1.1.3. Phân bố sinh thái, thu hái và chế biến
Khổ sâm bắc có nguồn gốc ở Trung Quốc, đƣợc nhập vào Việt Nam vào đầu những
năm 1970. Là cây sống nhiều năm, về mùa đông, phần trên tàn lụi, phần gốc còn lại
sẽ nảy mầm vào giữa mùa xuân năm sau. Cây ƣa sáng ƣa ẩm, thích nghi với điều
kiện của nƣớc ôn đới ẩm và vùng nhiệt đới núi cao, nhiệt độ trung bình năm khoảng
15oC. Cây trồng ở Sa Pa sinh trƣởng tốt, ra hoa nhiều, nhƣng không có quả. Khổ
sâm bắc có thể đƣợc trồng để lấy dƣợc liệu, điển hình ở công ty cổ phần sản xuất
chế biến nông lâm sản dƣợc liệu sạch Đắk Nông. Bộ phận dùng là rễ phơi khô
(Sophorae Flavescentis Radix). Thu hái củ, rửa sạch đất cát, thái phiến, phơi khô;
hoặc đem củ tƣơi ngâm nƣớc vo gạo nếp một đêm, rửa sạch, để trong 3 giờ rồi thái
phiến, phơi khô [1].
2.1.2. Tổng quan về thành phần hóa học
Sophora flavescens, tính đến năm 2015, đã có hơn 200 hợp chất đƣợc phân lập từ
dƣợc liệu này bao gồm 124 flavonoid (15 flavonols, 41 flavanones, 13 flavanonols,
27 isoflavones, 3 isoflavanones, 2 homoisoflavones, 7 chalcones, 2 biflavonoids, và
14 pterocarpans); 47 alkaloids, 9 terpenoids và 26 chất là thành phần khác (nhƣ
lignan, phenylpropanoid, coumarin và phenolic acid) [7]. Trong đó 2 nhóm hoạt
chất chủ yếu đó là flavonoid và alkaloid.
Flavonoid
Flavonoid là một trong những thành phần có hoạt tính sinh học chính của Sophora
flavenscens và đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều. Hơn 124 hợp chất nhóm flavonoid đã
đƣợc phân lập, trong số đó kushenol A, B, C, E, F, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, U,
V, W và X, kurarinone, isokurarinone, norkurarinone, (2S)-2’-methoxykurarinone,
kurarinol, neokurarinol, norkurarinol, kosamol A, leachianone A, leachianone G,
sophoraflavanone G, 8-lavandulylkaempferol, formononetin, và isoxanthohumol có

những tác dụng sinh học in vitro và cả in vivo [7].
Cấu trúc các flavonoid từ rễ Sophora flavescens thông thƣờng đƣợc isoprenyl hóa
và lavandulyl hóa là dạng thƣờng thấy của các flavonoid phân lập từ rễ hay thân [4].
Những nhóm thế này ở dạng C-isoprenyl và C-lavandulyl tại vị trí C-6 và C-8.

A

B

C

D

Hình 2.2. Nhóm thế isoprenyl và lavandulyl trên các flavonoid

3

E


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Tổng quan tài liệu

Bảng 2.1. Một số cấu trúc flavonoid đáng chú ý trong Sophora flavescens
Khung hợp chất

Flavanon

Flavonol


Flavanonol

Chalcon

Hợp chất
Kushenol A
Kushenol B
Kushenol E
Kushenol F
Kushenol P
Kushenol Q
Kushenol R
Kushenol S
Kushenol T
Kushenol U
Kushenol V
Kushenol W
Kurarinone
2S-2’methoxykurarinone
Kurarinol
Isokurarinone
Neokurarinol

R1
H
H
H
H
H

H
CH3
H
H
CH3
H
H
CH3

R2
H
A
A
C
H
H
H
H
H
H
A
H
H

R3
H
H
H
H
H

H
H
H
H
H
H
H
H

R4
C
C
A
H
D
E
C
A
D
C
H
A
C

R5
OH
OH
OH
OH
OCH3

OH
OH
OH
OH
H
OH
OH
OH

R6
H
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
H
OH
OH
OH
OH

R7
H
H
H
H
H

H
H
H
H
H
OCH3
OCH3
H

CH3
CH3
H
CH3

H
H
H
H

H
H
H
H

C
D
C
C

OCH3

OH
OCH3
OCH3

OH
OH
OH
OH

H
H
H
H

Leachianone A
Sophoraflavanone G
Desmethylanhydroicaritin
8-lavandulyl
-kaempferol
Kusenol C
Sophoflavescenol
Kusenol H
Kusenol L
Kusenol M
Kusenol X
Kosamol A

H
H


H
H

H
H

C
C

OCH3
OH

OH
OH

H
H

H

A

H

-

-

-


-

Kuraridin

H
H
CH3
CH3
H
H
H
H
H

C
C
A
H
A
A
H
B
C

H
OH
H
H
H
H

H
H
H

D
A
C
C
C
CH3

OH
OH
OH
OH
OH
OH

OH
OH
OH
OH
OH
-

-

Kuraridinol

CH3


H

D

H

OH

-

-

Xanthohumol

CH3

H

A

H

H

-

-

Kushenol D


CH3

H

C

H

OCH3

-

-

4


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Tổng quan tài liệu

Các isoflavon đƣợc phân lập nhƣ daidzein, formononetin, calycosin, ononin,… Vài
isoflavon có tác dụng bảo vệ tế bào gan nhƣ 3’-hydroxy-4’-methoxyisoflavone-7-Oβ-D-xylopyranosyl-(1-6)-β-D- glucopyranoside, 3’-hydroxy-4’-methoxyisoflavone7-O-β-D-apiofuranosyl-(1-6)-β-Dglucopyranoside
và
4’-Hydroxy-3’methoxyisoflavone-7-O-β-D-xylopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside.
Bảng 2.2. Cấu trúc một số isoflavon nổi bật có tác dụng sinh học trong Sophora flavescens
Khung hợp chất

Hợp chất

Formononetin

Isoflavon

A

B

3’-hydroxy-4’methoxyisoflavone-7-O-βD-apiofuranosyl-(1-6)-βD- glucopyranoside
4’-Hydroxy-3’methoxyisoflavone-7-O-βD-xylopyranosyl-(1-6)-βD-glucopyranoside.
3’-hydroxy-4’methoxyisoflavone-7-O-βD-xylopyranosyl-(1-6)-βD- glucopyranoside

R1

R2

R3

H

OCH3

H

B

OCH3

OH


A

OH

OCH3

A

OCH3

OH

Các pterocarpan đƣợc phân lập cũng có một số đặc tính sinh học đáng chú ý, một
vài pterocarpan nhƣ kushecarpin D, maackiain, pterocarpin, trifolirhizin.

Kushecarpin D

Maackiain

Trifolirhizin

Pterocarpin

Hình 2.3. Cấu trúc một số pterocarpan từ rễ khổ sâm bắc

5


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH


Tổng quan tài liệu

Alkaloid
Rễ và hoa chứa nhiều alkaloid thuộc nhóm quinolizidin, trong đó matrin và
oxymatrin là các alkaloid chủ yếu trong rễ; 8-dehydrosophoramin, 7,11dehydromatrin, methylcytisin, anagyrin, mamanin, kuraramin, isokuraramin là các
alkaloid chủ yếu trong hoa, trong đó mamanin và kuraramin là các chất chuyển hóa
của methylcytisin và anagyrin. Ngoài ra còn có sophoranol, sophocarpin, 5episophocarpin, isomatrin, sophocarpin N-oxyd, sophoralin, sophoramin [2].
Triterpenoid
Cho đến nay, chỉ có 9 hợp chất triterpen đƣợc phân lập gồm lupeol, lupenone,
monogynol B, β-amyrenol, soyasaponin І và sophoraflavoside І, II, III, IV [7].
2.1.3. Tác dụng dƣợc lý
2.1.3.1. Kháng khối u
Hợp chất nhóm flavonoid trong khổ sâm bắc cho tác dụng kháng khối u nhiều tiềm
năng hơn so với nhóm alkaloid [10]. Tính kháng khối u của Sophora flavescens
đƣợc thử nghiệm trên các dòng tế bào ngƣời nhƣ SK-OV-3 (buồng trứng), A549,
SK-MEL-2 (da), HT29 (đại tràng), NCI-H460 (phổi), XF498 (hệ thống thần kinh
trung ƣơng), HCT-15 (đại tràng), HL-60 (bạch cầu dòng tủy) và SPC-A-1 (phổi); và
dòng tế bào S180, H22,…[7]. Trên in vitro, dịch chiết nƣớc của Sophora flavescens
ức chế tăng trƣởng dòng tế bào EAC (Erlich ascites carcinoma) với tỷ lệ từ 50-66%,
dịch chiết ethanol ức chế tế bào u đại tràng HT29 với tỷ lệ cao (định lƣợng bằng
MTT), cao toàn phần có tỷ lệ ức chế tế bào u đến 52% cần có chứa cả matrine và
các flavonoid [7]. Trong in vivo, flavonoid toàn phần phân lập từ Sophora
flavescens ức chế tăng trƣởng của nhiều dòng tế bào u nhƣ tế bào u gan H22, S180,
tế bào u phổi Lewis, tế bào u thực quản Eca-109 và dòng tế bào u phổi H460 với tỷ
lệ ức chế lần lƣợt 40%, 82,14%, 59,74%, 42,71% và 46,8% [7]. Kurarinone, (2S)2’-methoxykurarinone, leachianon A và sophoraflavone G (những flavanon có C-8
đƣợc lavandulyl hóa) có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của nhiều dòng tế bào [10,
11, 12]. Desmethylanhydroicaritin ức chế dòng tế bào u não U87MG và có nhiều
tiềm năng trở thành tác nhân trị liệu u não [5].
2.1.3.2. Kháng viêm – giảm đau
Dịch chiết và cả những hợp chất phân lập từ khổ sâm bắc có đặc tính kháng viêm in

vitro và in vivo thông qua ức chế sản xuất các yếu tố gây viêm nhƣ COX-2, iNOS,
NO, IL-8, IL-6 và TNF-α [7]. Sophoraflavanon G, kuraridin, kurarinon và
isoxanthohumol có hoạt tính ức chế COX-2, iNOS, IL-6 cho thấy khả năng điều trị
viêm khớp dạng thấp và trifolirhizin ức chế sự biểu hiện của TNF-α, IL-6, COX-2
6


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Tổng quan tài liệu

trong đại thực bào và ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ [13], [14]. Ngoài ra,
nghiên cứu gần đây cho thấy thành phần giàu prenyl flavonoid của khổ sâm bắc (đã
loại hết alkaloid) ức chế viêm khớp mạnh với liều uống trên chuột thử nghiệm 10100 mg/kg/ngày và cho tác dụng giảm đau[14].
2.1.3.3. Kháng dị ứng - hen suyễn
Một trong những công dụng của khổ sâm bắc là điều trị các bệnh lý dị ứng bao gồm
viêm da dị ứng và hen suyễn. Trên mô hình chuột viêm da dị ứng, liều uống 50-200
mg/kg cao methanol làm giảm đáng kể đáp ứng ngứa trên chuột [15]. Đồng thời cao
nƣớc từ Sophora flavescens làm giảm đáng kể dị ứng đƣờng hô hấp do hen suyễn
trên chuột và ức chế co thắt cơ trơn hô hấp do cảm ứng bởi aceylcholine [6].
2.1.3.4. Kháng vi sinh vật
Sophora flavescens có khả năng ức chế nhiều loài vi khuẩn nhƣ Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shigella, Shigella flexneri,
Staphylococcus citreus, Staphylococcus albus và Bacillus paratyphosus B in vitro
[7]. Sophora flavescens đã đƣợc báo cáo khả năng ức chế các nhóm virus nhƣ HSV
type 1 và type 2, RSV, rotavirus… Một số flavonoid trong thành phần rễ khổ sâm
bắc có tác dụng kháng virus nhƣ kurarinol, kushenol H, kushenol K ức chế HSV
type 1 và 2 [7]. Dịch chiết methanol rễ khổ sâm bắc có tác dụng kháng mạnh
Toxoplasma gondii với EC50=0,2 mg/mL, dịch chiết cồn ức chế in vitro với
Neospora caninum và dịch chiết nƣớc ức chế đáng kể Giardia lamblia và Eimeria

tenella [7]. Năm 2012, Liu và cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng nấm của cao
aceton rễ khổ sâm bắc trên Candida albicans (tỷ lệ ức chế 33%) và Saccharomyces
cerevisiae (tỷ lệ ức chế 23%) [16].
2.1.3.5. Tác động trên hệ tim mạch
Tác động trên hệ tim mạch của các thành phần trong rễ khổ sâm bắc nhƣ chống loạn
nhịp tim, chống xơ hóa tế bào cơ tim, tác dụng dãn mạch và tác động trên sự co thắt
cơ tim gây ra bởi dịch chiết ethanol, methanol, nƣớc hoặc các phân đoạn alkaloid và
flavonoid toàn phần từ Sophora flavescens trên các mô hình động vật thử nghiệm và
cả mô hình in vitro [7].
2.1.3.6. Tác dụng khác
Nhóm prenyl trong cấu trúc của kushenol A, kurarinon và kuraridin có vai trò quan
trọng đối với hoạt tính ức chế trên adenosin monophosphat phosphodiesterase [2].
Formononetin và kushenol F cho tác động ức chế MAO-B [17]. Kushenol A,
kurarinon, sophoraflavanone G, 2'-methoxykurarinon và kurarinol có hoạt tính ức
chế alpha-glucosidase mạnh và kết quả cho thấy nhóm 8-lavandulyl là yếu tố quan
7


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Tổng quan tài liệu

trọng cho hoạt tính ức chế này [18]. (2S)-2′-methoxykurarinon, sophoraflavanone
G, leachianon A và (-) kurarinon có hoạt tính chống sốt rét Plasmodium falciparum.
Youn Chul Kim và cộng sự cho rằng nhóm methoxy trong khung flavanon đóng vai
trò quan trọng đối với hoạt tính chống sốt rét [19].
2.1.3.7. Độc tính
Năm 2008, viên nang Zhixue một dạng bào chế có chứa cao chiết ethanol của 2
dƣợc liệu là Cortex Dictammi và rễ cây Sophora flavescens đã đƣợc Cục Quản lý
Dƣợc và Thực phẩm Trung Quốc thu hồi vì phản ứng có hại gây độc tế bào gan

nghiêm trọng ghi nhận trên 7 ca đƣợc báo cáo trên tạp chí Hepatogastroenterology
năm 2010 [20]. Sau đó, Qianqian Yu cùng cộng sự dựa trên báo cáo đó đã tiến hành
nghiên cứu và phát hiện tác dụng độc tế bào gan là do thành phần prenyl flavonoid
của Sophora flavescens gây ra. Thành phần prenyl flavonoid chính gây độc tế bào
gan đƣợc xác định in vivo và in vitro là kurarinone và sophoraflavanone G [21]. Do
đó nhóm nghiên cứu của Qianqian Yu cùng cộng sự đã đề nghị kiểm soát hàm
lƣợng 2 hợp chất kurarinone và sophoraflavanone G ở một hàm lƣợng cho phép
trong chế phẩm và không gây độc tính trên gan ngƣời [21].
2.1.4. Công dụng và liều dùng
Trong Y học cổ truyền khổ sâm bắc dùng chữa lỵ, chảy máu ruột, hoàng đản, tiểu
tiện không thông có máu, sốt cao hóa điên cuồng, trị bệnh giun và ký sinh trùng.
Nƣớc sắc đặc dùng rửa mụn nhọt, lở loét. Ngày dùng 10-12 g dạng thuốc sắc bột
hoặc chia 3 lần uống trong ngày [1].

2.2. Các phƣơng pháp chiết xuất phân lập
2.2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất
Các phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu nhƣ ngâm lạnh, ngấm kiệt, đun hồi lƣu, chiết
siêu âm,... với dung môi nhƣ ethanol, nƣớc, methanol,...[22]. Đối với dƣợc liệu khổ
sâm bắc, Komatsu và cộng sự (1970) đã chiết xuất dƣợc liệu này bằng methanol với
phƣơng pháp ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng [23]. Những công trình gần đây đƣợc các
tác giả thực hiện chiết xuất bằng ethanol có nồng độ cao, có hoặc không có sử dụng
nhiệt độ. Nhìn chung các nghiên cứu trƣớc đây chiết xuất Sophora flavescens bằng
những dung môi thông dụng, đa năng, dễ bay hơi nhƣ methanol, ethanol độ cồn
khác nhau với phƣơng pháp chiết xuất đơn giản nhƣ ngâm lạnh, ngấm kiệt hay đun
hồi lƣu (Bảng 2.3).

8


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH


Tổng quan tài liệu

2.2.2. Các phƣơng pháp phân lập, tinh chế
Sau khi chiết xuất dƣợc liệu thu đƣợc cao toàn phần, tiếp theo tiến hành các phƣơng
pháp phân lập tinh chế đã đƣợc sử dụng nhƣ chiết lỏng – lỏng, sắc ký cột cổ điển,
sắc ký cột chân không, sắc ký cột pha đảo, sắc ký với pha t nh là hạt sephadex LH20,... để thu đƣợc các phân đoạn tinh sạch hơn [22]. Đối với dƣợc liệu khổ sâm bắc
chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là xu hƣớng thực hiện
phân lập các hợp chất flavonoid trên dƣợc liệu khổ sâm mà đƣợc nhiều tác giả thực
hiện trong nghiên cứu của mình. Các dung môi nhƣ diethyl ether, dichloromethane,
ethyl acetate, n-butanol và nƣớc đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng.
Sau đó các dịch chiết này đƣợc cô đặc thành cao và đƣợc lựa chọn để thực hiện các
phƣơng pháp tinh chế khác. Các cao phân đoạn này đƣợc tinh chế qua sắc ký cột
pha thuận với một số hệ dung môi nhƣ hexan – aceton, dichloromethane –
methanol, dichloromethane – ethyl acetate, benzen - ethyl acetate. Đặc biệt Ryu Shi
Yong và cộng sự (1997) đã tiến hành chọn lọc các phân đoạn sau sắc ký cột pha
thuận dựa trên tác dụng kháng tế bào u của cao để tiếp tục tinh chế trên sắc ký cột
[11]. Sook Kyung Hyun và cộng sự (2008); Hyung-Jun Won và cộng sự (2015);
Chang-Won Kang và cộng sự (2016) đã tinh chế các phân đoạn từ sắc ký cột pha
thuận bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi methanol – nƣớc và thu đƣợc các
hợp chất tinh khiết [5, 24, 31]. Yi Shen và cộng sự (2013); Chang-Won Kang và
cộng sự (2016) và Rong Huang cùng cộng sự (2017) sử dụng sephadex LH-20 để
tinh chế các cao phân đoạn từ sắc ký cột silica gel pha thuận [5, 25, 26]. Năm 2013,
Yi Shen và cộng sự với phƣơng pháp HPLC điều chế đã thu đƣợc 24 hợp chất tinh
khiết [25]. Năm 2017, Rong Huang cùng cộng sự đã cô lập đƣợc một chất mới chƣa
từng đƣợc công bố trƣớc đây là 8-(3-hydroxymethyl-2-butenyl)-5,7,2′,4′tetrahydroxyflavanone bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế [26].
2.2.3. Các phƣơng pháp đánh giá hợp chất phân lập đƣợc
2.2.3.1. Đánh giá độ tinh khiết hợp chất phân lập được
- Kiểm tra bằng SKLM: hợp chất phân lập đƣợc đánh giá trên bản SKLM khai
triển bằng 3 hệ dung môi pha động có độ phân cực khác nhau, phát hiện các vết

bằng đèn UV, thuốc thử chung hay thuốc thử đặc hiệu [22].
- Kiểm tra bằng HPLC phân tích: hợp chất phân lập đƣợc đánh giá trên HPLC
phân tích bằng chƣơng trình sắc ký phù hợp.
2.2.3.2. Xác định cấu trúc chất phân lập
Dùng các kỹ thuật phổ nghiệm nhƣ IR, UV, MS, NMR để xác định cấu trúc hóa học
phẳng và không gian trong một số trƣờng hợp đã đƣợc các tác giả sử dụng để xác
định cấu trúc các chất phân lập đƣợc [5, 10, 11, 23, 31, 26, 27].
9


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Tổng quan tài liệu

Bảng 2.3. Một số công trình nghiên cứu phân lập flavonoid từ rễ khổ sâm bắc
Sophora flavescens Ait.
STT

Năm

Tác giả

Đối tƣợng
M., Rễ
Sophora
T., angustifolia (tên
K., gọi khác)

1


1970

Komatsu
Tomimori
Hatayama
Mikuriya N. [23]
Komatsu
M., Rễ khô Sophora
Kyogoku
K., flavescens (20 kg)
Hatayama K., [27]
Li Jun Wu et al [28] Bột rễ Sohphora
flavescens (10 kg)

2

1973

3

1984

4

1997

Ryu S.Y., Lee H.S., Rễ khô cắt nhỏ S.
Kim Y.K., Kim S.H. flavescens(3kg)
[29]


4

2003

Soo Jin Kim, Kun Rễ khô Sophora
Ho Son, Hyun Wook flavescens
(3,65
Chang, Sam Sik kg)
Kang, Hyun Pyo

Nội dung
Tóm tắt phƣơng pháp chiết xuất, phân lập & kết quả
Chiết xuất bằng MeOH, lắc phân bố cao MeOH với ether. Lắc cao ether với dung
dịch KOH 5%, lấy lớp nƣớc acid hóa và lắc lại với ether. Lấy lớp ether này qua
sắc ký cột pha thuận. Thu đƣợc isoxanthohumol, xanthohumol và
isoanhydroicaritin, noranhydroicaritin
Chiết 3 lần với MeOH nóng, cô cạn thành cao. Tiến hành sắc kí cột cao MeOH
với hexan – aceton (2:1 – 1:2). Thu đƣợc 3 g isokurarinon, 5 mg formononetin, 10
g norkurarinol, 15 g kuraridinol, 0,5 g neokurarinol, 40 g kurarinol.
Đun hồi lƣu với MeOH, lắc phân bố với EtOAc, sắc ký cột cao EtOAc thu đƣợc
120 mg kushenol A, 600 mg kushenol B, 150 mg kushenol C, 60 mg kushenol D,
30 mg kushenin.
Chiết xuất với methanol, lắc phân bố cao methanol thu đƣợc 35g cao DCM, 50g
cao EtOAc. Sắc ký cột pha thuận phân đoạn DCM với dung môi DCM-MeOH
gradient thu 6 phân đoạn, chọn phân đoạn 4 và 5 dựa trên tác dụng độc tế bào cao
hơn. Tiến hành tƣơng tự với cao EtOAc. Tinh chế các phân đoạn có tính độc tế
bào cao và thu đƣợc 72 mg formononetin, 55 mg kushenol E, 250 mg kushenol B,
480 mg sophoraflavanone G, 30 mg kushenol L, 500 mg kushenol M, 110 mg
kuraridin, 120 mg kurarinone, 20 mg kushenol N
Ngâm với ethanol 80% ở nhiệt độ phòng, lắc cao ethanol thu đƣợc với DCM,

EtOAc, và n-butanol thu đƣợc 128,4; 25,5 và 280,3 g cao tƣơng ứng. Từ cao
DCM, tiến hành sắc ký silica gel rửa bằng DCM-EtOAc (gradient) cho 43 phân
đoạn. Phân đoạn 2 đƣợc tinh chế trên silica gel bằng benzen-ethyl acetat (10: 1)

10


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

Kim [30]
5

2006
Jin Hyo Kim, Young
et al[18]

6

2008

Sook Kyung Hyun,
Won-Hee Lee, Da
Mi Jeong, Youngsoo
Kim, Jae Sue Choi
[24]

7

2015


Hyung-Jun Won và
cộng sự [31]

8

2006 và
2016

Hee Jin Jung và
cộng sự [32]
Chang-Won Kang và
cộng sự [5].

Tổng quan tài liệu

thu đƣợc sophoraflavanon G (120 mg). Phân đoạn 33 sử dụng benzen-ethyl acetat
(3: 2) thu đƣợc 80 mg kuraridin và 220 mg kurarinon.
Chiết xuất với MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc cao MeOH với cloroform, thu đƣợc
27 g cao cloroform. Đem sắc ký cột.
Rễ khô Sophora
Thu đƣợc 410 mg kushenol A, 270 mg kurarinon, 230 mg sophoraflavanon G,
flavescens (1 kg)
170 mg 2-methoxykurarinon, 890 mg kurarinol, 13 mg 8-prenylkaempferol, 210
mg isoxanthohumol, 97 mg kuraridin và 47 mg maackian.
Bột rễ (1 kg) S. Đun hồi lƣu với MeOH trong 3h, lắc phân bố, thu đƣợc DCM (28 g), EtOAc (23
flavescens
g), n-butanol (71 g) và nƣớc (104 g). Phân đoạn cao EtOAc (23 g) đƣợc sắc ký
rửa giải trên cột silica gel bằng DCM-MeOH (gradient) thu đƣợc 17 phân đoạn.
Phân đoạn 15 (1,5 g) đƣợc tinh chế trên cột silica gel với DCM- MeOH (gradient)
để thu đƣợc 150 mg kurarinol và 50 mg kuraridinol. Phân đoạn 16 (15,4 g) đã

đƣợc tinh chế trên cột silica gel (hexan-ethyl acetate, gradient), và sắc ký cột RP18 (70% MeOH) thu đƣợc trifolirhizin (700 mg) .
Rễ
khô
S. Chiết xuất với MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc phân bố cao MeOH với n-hexan,
flavescens (5 kg)
chloroform, EtOAc và n-butanol đƣợc 3,9 g; 22 g; 33,5 g và 38,9 g cao tƣơng
ứng. Tiến hành sắc kí cao EtOAc với hệ dung môi chloroform-ethyl acetate
(gradient) đƣợc 21 phân đoạn. Sắc ký pha đảo phân đoạn 15 (2 g) với hệ dung
môi MeOH-H2O (gradient) đƣợc 12 phân đoạn. Tiến hành sắc ký pha đảo phân
đoạn 15-9 (120 mg) với dung môi MeOH-H2O (70:30) thu đƣợc 53 mg kuraridin.
Rễ S. flavescens Chiết xuất với MeOH, lắc phân bố thu đƣợc 114g cao DCM, 124g cao EtOAc,
(5kg)
305 g n-butanol, 524 g cao nƣớc. 70 g Cao DCM sắc ký pha thuận với dung môi
DCM-MeOH (gradient) thu 18 phân đoạn. Phân đoạn 9 tinh chế với hệ DCMMeOH (gradient) thu đƣợc 30mg trans-hexadecylsinapic acid, 20 mg 4-hydroxy3-methoxy-(6aR,11aR)-8,9-methylene dioxy-pterocarpan, 140 mg (-)-maackiain,

11


Khóa luận tốt nghiệp DSĐH

9

2013

Yi Shen, Zi-Ming
Feng, Jian-Shuang
Jiang, Ya-Nan Yang,
and
Pei-Cheng
Zhang [25]


10

2017

Rong Huang, Yi Liu,
Lin-Lin Zhao, Xi-xin
Chen, Feng Wang,
Wei Cai & Lei Che
[26]

Tổng quan tài liệu

15 mg xanthohumol. Phân đoạn 10 thu đƣợc 30 mg formononetin. Phân đoạn 11
sắc ký cột bằng DCM-MeOH (gradient) thu đƣợc 20 mg
desmethylanhydroicaritin, 50 mg (2S)-2'-methoxykurarinone, 35 mg (2S)-3β,7,4'trihydroxy- 5- methoxy- 8 -(ɤ,ɤ- dimethylallyl)-flavanone, 50 mg (2S)-7,4'dihydroxy-5-methoxy-8-( ɤ,ɤ-dimethylallyl)-flavanone. Phân đoạn 14 qua cột
sephadex và 1 cột pha đảo thu đƣợc 100 mg umbelliferone, 20 mg kuraridin. Phân
đoạn 15 qua sắc ký cột hệ DCM-MeOH (gradient) thu đƣợc 200 mg trifolirhizin.
Bột rễ sấy khô Chiết xuất với ethanol 70%. Lắc phân bố cao ethanol thu đƣợc cao PE, EtOAc, n(40kg)
Bu. Phân đoạn n-Bu qua cột Diaion HP-20, hệ EtOH-H2O gradient thu đƣợc 6
phân đoạn (A, B, C, D, E, F). Phân đoạn B và C theo nguyên tắc xử lý trên cột
sephadex LH-20, rồi sử dụng HPLC điều chế, phân đoạn D đƣợc tinh chế qua cột
pha thuận trƣớc khi đƣợc xử lý trên cột sephadex LH-20 và HPLC điều chế để thu
đƣợc 12 dẫn chất của dibenzoyl, 5 isoflavone glycoside mới cùng 8 hợp chất đã
biết trong cây khổ sâm bắc.
Rễ khô Kushen Chiết xuất với ethanol 95% ở 70 oC, cao thu đƣợc lắc phân bố thu đƣợc 350 g cao
(10kg)
EtOAc. Sắc ký cao này qua cột pha thuận hệ DCM-MeOH (gradient) thu 10 phân
đoạn. Phân đoạn B, D, E qua cột sephadex LH-20, cột pha đảo C-18 và HPLC
bán điều chế thu đƣợc 8 hợp chất trong đó có một chất lần đầu tiên đƣợc công bố

là 8-(3-hydroxymethyl-2-butenyl)-5,7,2′,4′-tetrahydroxyflavanone, 7 chất còn lại
đã biết: (2R)-3α,7,4′-trihydroxy-5-methoxy-8-prenylflavanone, (2R)-3β,7,4′trihydroxy-5-methoxy-8prenylflavanone,
3,7-dihydroxycoumarin,
shandougenines B, specionin, kushenol N và kushenol I.

12