BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN BỆNH DO MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE
DỰA VÀO BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ, PHÂN LẬP VÀ
KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT PCR TRÊN PHỔI
HEO THỊT CÓ BỆNH TÍCH NGHI NGỜ

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN NGỌC HOA XUÂN
Ngành: DƯỢC THÚ Y
Niên khóa: 2004 – 2009

Tháng 08/2009


CHẨN ĐOÁN BỆNH DO Mycoplasma hyopneumoniae DỰA VÀO
BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ, PHÂN LẬP VÀ KẾT HỢP VỚI
KỸ THUẬT PCR TRÊN PHỔI HEO THỊT
CÓ BỆNH TÍCH NGHI NGỜ

Tác giả

NGUYỄN NGỌC HOA XUÂN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng Bác sĩ ngành
Dược thú y

Giáo viên hướng dẫn:

ThS. Nguyễn Thị Phước Ninh
BSTY. Lâm Thị Tú Anh
BSTY. Đỗ Tiến Duy

Tháng 08 năm 2009
i


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin gởi lời biết ơn đến ba mẹ đã hết lòng chăm lo, nuôi dưỡng con
khôn lớn.
Xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM, Ban chủ
nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu của tôi.
Xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô trong Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tận
tình truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức khoa học chuyên môn, cũng như về thực
tế đời sống trong suốt 5 năm qua. Đó là những kiến thức vô cùng quý giá, là hành
trang không thể thiếu cho mỗi sinh viên trước khi bước vào đời.
Xin trân trọng biết ơn cô Nguyễn Thị Phước Ninh, thầy Đỗ Tiến Duy và chị Lâm
Thị Tú Anh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong
quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Xin cảm ơn Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y, Ban quản lý Viện nghiên cứu công
nghệ sinh học và môi trường Trường Đại học Nông Lâm, Ban quản lý Trạm Thú Y
quận Bình Thạnh, Ban giám đốc xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn các anh chị làm việc ở Bệnh Viện Thú Y, các anh chị làm việc và
nghiên cứu ở trung tâm thí nghiệm hóa sinh đã giúp đỡ tôi rất nhiều khi thực tập.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn bè của tôi đã giúp đỡ, chia sẻ với tôi những
vui buồn, khó khăn trong suốt thời gian học tập và thực tập.


ii


TÓM TẮT
Đề tài “Chẩn đoán bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại
thể, phân lập và kết hợp với kỹ thuật PCR trên phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ”
được tiến hành tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong, Bệnh Viện Thú Y và
Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường Trường Đại học Nông Lâm, thời
gian từ ngày 02/03/09 đến ngày 21/08/09.
Nghiên cứu này nhằm góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán Mycoplasma
hyopneumoniae (MH) trong phòng thí nghiệm.
Chúng tôi tiến hành đánh giá những mẫu phổi có bệnh tích chung theo công
thức của Christensen (1999) và những mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH theo
Rice (2000) rồi thu thập một số mẫu phổi nghi ngờ nhiễm MH để phân lập trên môi
trường Friis’ và xác định sự có mặt của MH bằng kỹ thuật PCR.
Qua khảo sát 183 mẫu phổi, chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau:
− Tỷ lệ phổi có bệnh tích chung trong đánh giá là 84,15 % (154/183), mức độ
hư hại trung bình chung trên phổi đánh giá là 39,37 %.
− Tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng do MH trên heo thịt giết mổ là 70,78 %
(109/154). Điểm trung bình của các phổi nghi ngờ do MH là 1,150 điểm. Trên những
phổi có bệnh tích nghi ngờ nhiễm MH xuất hiện từ 1 đến 4 loại bệnh tích. Trong đó,
những phổi có 2 loại bệnh tích chiếm tỷ lệ cao nhất (44 %).
Chúng tôi thu thập 20 mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ, sau khi phân lập và
kiểm tra PCR, kết quả thu được như sau:
− Việc phân lập MH từ mẫu phổi nghi ngờ trên môi trường thạch Friis’ cho
kết quả dương tính 40 %.
− Kỹ thuật PCR để xác định MH trên phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH cho
kết quả dương tính là 15 %.

iii



MỤC LỤC
Trang tựa......................................................................................................................... i
Lời cảm ơn..................................................................................................................... ii
Tóm tắt.......................................................................................................................... iii
Mục lục ......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vi
Danh sách các hình ...................................................................................................... vii
Danh sách các bảng .................................................................................................... viii
Danh sách các biểu đồ, sơ đồ ....................................................................................... ix
Chương 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
U

1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu .............................................................................................2
1.2.1. Mục đích.........................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu...........................................................................................................2
Chương 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN .........................................................................................3
2.1. Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm ...........................................................3
2.1.1. Lịch sử và phân bố địa lý ...............................................................................3
2.1.2. Căn bệnh.........................................................................................................4
2.1.3. Truyền nhiễm học ..........................................................................................6
2.1.4. Triệu chứng ....................................................................................................8
2.1.5. Bệnh tích ........................................................................................................9
2.1.6. Chẩn đoán.....................................................................................................10
2.1.7. Điều trị .........................................................................................................11
2.1.8. Phòng bệnh...................................................................................................12
2.2. Môi trường nuôi cấy MH....................................................................................12
2.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ..............................................14

2.3.1. Giới thiệu sơ lược về PCR ...........................................................................14
2.3.2. Nguyên tắc của phương pháp PCR ..............................................................14
2.3.3. Thành phần của phản ứng PCR....................................................................15
2.3.4. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR ..............................................................18
iv


2.3.5. Phương pháp điện di trên gel .......................................................................19
2.4. Sơ lược một số nghiên cứu về phân lập MH và ứng dụng kỹ thuật PCR trong
chẩn đoán MH............................................................................................................19
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH.......................................21
3.1. Thời gian và địa điểm .........................................................................................21
3.1.1. Thời gian ......................................................................................................21
3.1.2. Địa điểm .......................................................................................................21
3.2. Đối tượng nghiên cứu .........................................................................................21
3.3. Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm...........................................................................21
3.3.1. Dụng cụ ........................................................................................................21
3.3.2. Vật liệu .........................................................................................................21
3.4. Nội dung thí nghiệm ...........................................................................................22
3.5. Phương pháp tiến hành .......................................................................................22
3.5.1. Đánh giá mức độ hư hại của phổi ................................................................22
3.5.2. Phân lập MH từ phổi nghi ngờ bị suyễn heo ...............................................24
3.5.3. Phản ứng PCR để xác định MH ...................................................................25
3.6. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................28
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................29
4.1. Kết quả đánh giá bệnh tích đại thể trên phổi ......................................................29
4.1.1. Đánh giá bệnh tích chung trên phổi .............................................................29
4.1.2. Đánh giá bệnh tích đại thể trên phổi có tính định hướng do MH ................33
4.2. Kết quả phân lập MH trên môi trường thạch Friis’ ............................................39
4.3. Kết quả xác định MH bằng kỹ thuật PCR từ mẫu phổi ......................................43

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................46
5.1. Kết luận...............................................................................................................46
5.2. Đề nghị................................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................47
PHỤ LỤC ......................................................................................................................49

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APP

: Actinobacillus pleuropneumoniae

BHI

: Brain Heat Infusion broth

bp

: base pair

CF

: complement fixation

ctv

: cộng tác viên


DNA

: deoxyribonucleic acid

dNTP

: deoxyribonucleic triphosphate

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EDTA

: Ethylene Diamine Tetracetic Acid

IHA

: Indirect hemagglutination

kb

: kilobase

MH

: Mycoplasma hyopneumoniae

PRRS


: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

PBS

: phosphate buffered saline

PCR

: Polymera Chain Reaction

PPLO

: Pleuro-Pneumoniae-Like-Organism

SDS

: Sodium Dodecyl Sulfat

SPF

: Specific Pathogen Free

Taq

: Thermus aquaticus

TBE

: Tris borate EDTA


TE

: Tris EDTA

Tm

: temperature melting

UI

: unit international

UV

: utral violet

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1: Nguyên tắc của phản ứng PCR (theo Phạm Hùng Vân, 2008) .....................15
Hình 4.1: Phổi bị nhục hóa có tính đối xứng (mũi tên).................................................34
Hình 4.2: Khuẩn lạc MH mọc trên môi trường thạch Friis’ sau 3 ngày nuôi cấy (mũi
tên) với độ phóng đại (10 x 10) .....................................................................................40
Hình 4.3: Khuẩn lạc MH mọc trên môi trường thạch Friis’ sau 7 ngày nuôi cấy với độ
phóng đại (10 x 10)........................................................................................................40
Hình 4.4: Khuẩn lạc MH mọc trên môi trường thạch Friis’ sau 10 ngày nuôi cấy với độ
phóng đại (10 X 10).......................................................................................................41
Hình 4.5: Kết quả điện di để kiểm tra DNA tổng số từ khuẩn lạc ................................43
Hình 4.6: Kết quả chạy PCR mẫu phân lập trên thạch Friis’ ........................................43

Hình 4.7: Kết quả điện di DNA tổng số mẫu ly trích từ phổi .......................................45
Hình 4.8: Kết quả chạy PCR mẫu ly trích từ phổi.........................................................45

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................22
Bảng 4.1: Tỷ lệ phổi có bệnh tích trong đánh giá .........................................................29
Bảng 4.2: Mức độ hư hại chung trên phổi.....................................................................30
Bảng 4.3: Các bệnh tích thường gặp trên phổi heo đánh giá (n = 154) ........................32
Bảng 4.4: Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH trong đánh giá..............................34
Bảng 4.5: Điểm trung bình trên phổi nghi ngờ do MH .................................................35
Bảng 4.6: Số lần xuất hiện của các bệnh tích trên phổi nghi do MH ............................38
Bảng 4.7: Số dạng bệnh tích xuất hiện trên cùng một phổi...........................................38
Bảng 4.8: Kết quả phân lập MH từ phổi nghi ngờ ........................................................39
Bảng 4.9: Kết quả xác định MH từ khuẩn lạc nghi ngờ bằng kỹ thuật PCR ................42
Bảng 4.10: Kết quả xác định MH bằng kỹ thuật PCR từ mẫu phổi ..............................44

viii


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Mức độ hư hại trung bình của các thùy phổi ............................................31
Biểu đồ 4.2: Mức độ hư hại hư hại trung bình của phổi ...............................................31
Biểu đồ 4.3: Các bệnh tích thường gặp trên phổi heo đánh giá ....................................33
Biểu đồ 4.4: Điểm trung bình của các thùy phổi nghi ngờ do MH ...............................36
Biểu đồ 4.5: Điểm trung bình của các phổi nghi ngờ do MH .......................................36
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập MH ......................................................................................25


ix


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh viêm phổi địa phương trên heo (hay bệnh suyễn heo) được Kobe (người
Đức) phát hiện đầu tiên vào năm 1933 mặc dù lúc đó ông chưa phân lập được tác nhân
gây bệnh. Sau đó, bệnh được phát hiện ở khắp nơi trên thế giới. Đây là một bệnh rất
phổ biến, xảy ra ở mọi lứa tuổi của heo, do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra. Mặt
dù heo bệnh có tỷ lệ chết thấp nhưng con vật gầy ốm, tăng trọng kém, tiêu tốn nhiều
thức ăn, thuốc men điều trị. Từ đó, gây thiệt hại rất lớn đến kinh tế của người chăn
nuôi.
Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh viêm phổi địa phương một cách nhanh chóng và
chính xác để điều trị bệnh kịp thời là yêu cầu đặt ra cho cả thế giới. Có nhiều phương
pháp chẩn đoán bệnh như dựa vào bệnh tích đại thể, vi thể, phân lập mầm bệnh, làm
các phản ứng huyết thanh học, phản ứng PCR, dùng kỹ thuật Xquang…Trong đó, mỗi
phương pháp lại có những ưu điểm và khuyết điểm riêng. Việc lựa chọn phương pháp
nào còn tùy thuộc vào điều kiện kinh tế, quy mô và tình trạng bệnh ở trại, trình độ
khoa học kỹ thuật của quốc gia.
Kỹ thuật PCR được xem như phương pháp chẩn đoán Mycoplasma
hyopneumoniae tối ưu nhất do có độ chính xác cao, ít tốn kém thời gian, không phụ
thuộc vào sự sống hay chết của Mycoplasma hyopneumoniae và chi phí để chẩn đoán
cũng không quá cao. Trong khi đó, việc chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae bằng
nuôi cấy phân lập thường gặp nhiều khó khăn vì chúng đòi hỏi môi trường giàu dinh
dưỡng, thời gian mọc khá lâu (7 – 14 ngày), dễ bị tạp nhiễm bởi các vi khuẩn khác và
nấm. Tuy nhiên, việc phân lập Mycoplasma hyopneumoniae là việc làm vô cùng cần
thiết và được xem là “tiêu chuẩn vàng” cho việc kết luận sự hiện diện của Mycoplasma
hyopneumoniae trên heo.
Từ thực tế đó, được sự đồng ý của Bộ môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, Khoa Chăn

Nuôi Thú Y, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh và dưới sự hướng dẫn của

1


ThS. Nguyễn Thị Phước Ninh, BSTY. Đỗ Tiến Duy, BSTY. Lâm Thị Tú Anh, chúng
tôi thực hiện đề tài:
“Chẩn đoán bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể,
phân lập và kết hợp với kỹ thuật PCR trên phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Chẩn đoán bệnh viêm phổi địa phương bằng cách phân lập Mycoplasma
hyopneumoniae kết hợp với kỹ thuật PCR trên phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ, từ
đó góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae trong
phòng thí nghiệm .
1.2.2. Yêu cầu
Đánh giá mức độ hư hại chung của phổi qua bệnh tích đại thể theo phương pháp
của Christensen (1999) và mức độ hư hại của phổi nghi ngờ do Mycoplasma
hyopneumoniae theo phương pháp của Rice (2000).
Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae từ mẫu phổi heo có bệnh tích nghi ngờ.
Làm phản ứng PCR từ mẫu phổi và từ khuẩn lạc mọc được trên môi trường
nuôi cấy.

2


Chương 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1. Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm
Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm còn gọi là bệnh viêm phổi dịch vùng

hay bệnh suyễn heo do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra. Bệnh thường tồn tại dưới
dạng mãn tính với đặc điểm gây viêm phế quản phổi tiến triển chậm.
Tỷ lệ heo mắc bệnh khá cao nhưng tỷ lệ chết thường thấp nếu không ghép với
các bệnh khác (Trần Thanh Phong, 1996). Đặc điểm của heo bệnh là ho kéo dài nhiều
tuần, heo chậm lớn, sức đề kháng yếu. Nếu Mycoplasma hyopneumoniae kết hợp với
các mầm bệnh gây viêm phổi khác sẽ tạo nên tình trạng viêm phổi nặng với triệu
chứng sốt cao, ho nhiều, khó thở.
Bệnh viêm phổi địa phương là bệnh đường hô hấp trên heo phổ biến nhất và
gây thiệt hại kinh tế lớn nhất cho tất cả các nước trên thế giới. Thiệt hại này càng
nghiêm trọng hơn khi nhiễm đồng thời các tác nhân cảm nhiễm khác, quản lý kém và
điều kiện môi trường không tốt. Heo bệnh sẽ tăng chỉ số chuyển hóa thức ăn khoảng
25 %, giảm tăng trọng 15 – 20 %, thậm chí có nhiều trường hợp không tăng trọng sau
vài tháng nuôi dưỡng (Trần Thanh Phong, 1996). Bệnh gây thiệt hại kinh tế do kéo dài
thời gian nuôi thịt, tăng tử số trên heo, tốn kém nhiều thuốc để điều trị.
2.1.1. Lịch sử và phân bố địa lý
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Kobe (người Đức) phát hiện ra bệnh viêm
phổi mãn tính trên heo vào năm 1933 và Kobe gọi đó là bệnh cúm heo.
Năm 1948, Pula phát hiện ra bệnh này ở khắp lục địa Úc. Bệnh này cũng được
thấy ở Anh do Gunrujani (1951) và Ben (1952, 1956) tìm ra và họ gọi đó là bệnh viêm
phổi heo do vius. Sau đó, có rất nhiều công bố khác cho thấy bệnh xuất hiện ở khắp
các nước Pháp, Mỹ, Thụy Sỹ, Hungari, Bỉ, Phần Lan. Bệnh cũng có ở châu Á (Trung
Quốc, Nhật Bản, Việt Nam) và châu Phi.

3


Ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1959 từ heo nhập nội và lan tràn
nhanh chóng khắp miền Bắc, nhất là những vùng nuôi heo nái sinh sản như Nam Hà,
Ninh Bình, Thái Bình…
Mãi đến năm 1964, hai nhà bác học Anh là Goodwin và Oaileston mới phân lập

được vi khuẩn gây bệnh nhưng chưa chứng minh được những vi khuẩn này thuộc
nhóm Mycoplasma. Năm 1965, Mare và Switzer ở Mỹ cũng đã phân lập được vi
khuẩn gây bệnh trong môi trường không có tế bào và quan sát được sự hình thành
khuẩn lạc Mycoplasma trên môi trường thạch, rồi tiến hành gây bệnh cho heo thí
nghiệm. Mare và Switzer kết luận rằng họ đã phân lập được một loài Mycoplasma mới
và đề nghị đặt tên là Mycoplasma hyopneumoniae. Họ gọi bệnh do Mycoplasma
hyopneumoniae gây ra là “Bệnh viêm phổi heo do Mycoplasma”.
Cũng trong năm 1965, Goodwin và ctv đề nghị đặt tên tác nhân gây bệnh là
Mycoplasma suipneumoniae. Sau đó, người ta chứng minh rằng không thể phân biệt
về mặt huyết thanh học giữa Mycoplasma hyopneumoniae với Mycoplasma
suipneumoniae.
Ngoài ra, Stemke (1997) cho biết giữa Mycoplasma hyopneumoniae và
Mycoplasma flocculare có phản ứng chéo, do đó việc chẩn đoán bằng huyết thanh học
có thể bị nhầm lẫn.
2.1.2. Căn bệnh
Theo nhiều tác giả (Hodges, 1969; Ojata, 1968; Switzer, 1965; Goodwin,
1965…) thì Mycoplasma hyopneumoniae là nguyên nhân chính gây bệnh viêm phổi và
có rất nhiều căn bệnh khác đóng vai trò thứ phát làm bệnh diễn biến phức tạp hơn, gây
thiệt hại nghiêm trọng hơn như virus (virus cúm, virus Aujeszky, Adenovirus,
Enterovirus…), Riskettsia, Clamydia, vi khuẩn (Bordetella bronchiseptica, E.coli và
Salmonella… đặc biệt là Pasteurella multocida) (Trần Thanh Phong, 1996).
Căn bệnh được phân loại theo Holt (1994):
− Bộ Mycoplasmatales
− Họ Mycoplasmataceae
− Giống Mycoplasma
Các loài Mycoplasma thường gặp trên heo:
4


− Mycoplasma hyopneumoniae (phổ biến nhất): gây bệnh viêm phổi địa

phương
− Mycoplasma hyorhinis: gây tình trạng viêm khớp và viêm đa thanh dịch
mãn tính ở heo từ 3 – 10 tuần tuổi
− Mycoplasma synoviae: gây viêm khớp ở heo 12 – 14 tuần tuổi
− Mycoplasma floculare: không gây bệnh nhưng thường có mặt trong đường
hô hấp của heo
™ Đặc điểm chung của Mycoplasma
Theo Quinn và ctv (1998), Mycoplasma thuộc lớp Mollicute, là những
Procaryote nhỏ nhất, qua được lọc 0,22 μm. Chúng thiếu gen tổng hợp thành tế bào
nên chỉ được bao bọc bởi màng bào tương; thành phần gồm protein, glycoprotein,
glycolipid và phospholipid. Vì không có thành tế bào nên Mycoplasma rất mềm và có
nhiều hình dạng như hình cầu, bầu dục, sợi, xoắn, vòng. Mycoplasma thuộc Gram âm
nhưng chúng bắt màu rất yếu với thuốc nhuộm Gram; thường được nhuộm bằng
phương pháp Giemsa, Romanowsky.
Mycoplasma có cả DNA và RNA, chúng mang bộ gen nhỏ nhất trong tất cả cơ
thể sống tự do (khoảng từ 580 kb đến 1380 kb và có ít hơn 300 gene). Tổng thành
phần Guanine và Cytosine trong ADN thấp (23 – 40 %); tỷ lệ đó phân bố không đều
trên bộ gen, có những vùng rất cao lại có những vùng rất thấp.
Nuôi cấy và phân lập Mycoplasma rất khó vì nó đòi hỏi dinh dưỡng môi trường
khá cao, mọc chậm, dễ bị lấn át bởi các vi khuẩn khác và nấm. Hầu hết các
Mycoplasma sống kị khí tùy nghi hoặc hiếu khí, cần bổ sung 5 – 10 % CO2, nhiệt độ
thích hợp là 370C, pH 7 – 8. Trong môi trường thạch, khuẩn lạc của Mycoplasma có
dạng trứng chiên kích thước nhỏ, đường kính 0,02 – 0,5 mm sau 2 – 6 ngày nuôi cấy,
có thể quan sát bằng kính lúp hoặc kính hiển vi (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên,
2001).
Phân bố tự nhiên: Mycoplasma có thể sống ký sinh hay hoại sinh, tuy nhiên
phần lớn sống ký sinh. Mycoplasma chỉ sống và phát triển mạnh ở một số vật chủ cụ
thể (dải thích nghi hẹp), ví dụ những loài gây bệnh cho người thì hoàn toàn khác biệt
với các loài gây bệnh ở động vật khác như gặm nhấm hoặc nhai lại. Mycoplasma gây
bệnh tự nhiên ở động vật có vú, chim, bò sát, chân đốt, thực vật và cá. Theo Đỗ Tiến

5


Duy (2004) thì những loài Mycoplasma gây bệnh hay không gây bệnh đều có thể tìm
thấy trên màng nhày đường hô hấp, tiêu hóa, sinh dục và tuyến vú.
Sức đề kháng: Mycoplasma rất nhạy cảm với các tác nhân vật lý, tác nhân hóa
học do không có thành peptidoglycan để bảo vệ. Chúng đề kháng với các kháng sinh
tác động lên thành tế bào như nhóm β-lactam nhưng lại rất nhạy cảm với các kháng
sinh tác động lên quá trình sinh tổng hợp protein hay acid nhân.
™ Đặc điểm của Mycoplasma hyopneumoniae (MH)
Ngoài các đặc điểm chung của giống, MH còn có thêm những đặc điểm sau:
− Khuẩn lạc không lồi lên ở giữa, không có dạng trứng chiên như các
Mycoplasma khác, khuẩn lạc có kích thước 200 – 400 μm sau 5 – 10 ngày nuôi cấy
(Trần Thanh Phong, 1996).
− Đề kháng kém với nhiệt độ và các chất sát trùng thông thường. MH có khả
năng sản sinh độc tố cytotoxin nhưng độc tố bị vô hoạt ở 1000C trong 15 phút. MH bị
vô hoạt sau 48 giờ trong điều kiện khô nhưng có thể tồn tại 17 ngày trong môi trường
nước mưa ở 2 – 70C. MH có khả năng phân tán trong không khí với đường kính 3 đến
3,5 km, do đó làm lây lan bệnh từ trại này sang trại khác nhất là trong điều kiện thời
tiết lạnh và ẩm (Quách Tuyết Anh, 2003).
2.1.3. Truyền nhiễm học
2.1.3.1. Loài vật mắc bệnh
Trong tự nhiên: MH chỉ gây bệnh trên heo. Heo ở tất cả các lứa tuổi đều có thể
mắc bệnh nhưng bệnh trầm trọng ở heo con và heo nái mới đẻ. Heo sơ sinh thường
cảm nhiễm từ mẹ hoặc từ môi trường, trong điều kiện môi trường nuôi xấu có thể phát
bệnh lúc 1 tháng tuổi hoặc giai đoạn sau cai sữa. Heo thịt giai đoạn 30 – 70 kg, giai
đoạn cuối nuôi thịt (vỗ béo) cũng dễ mắc bệnh. Giống heo ngoại nhập có tỉ lệ mắc
bệnh cao hơn giống heo lai và heo thuần giống nội (Quách Tuyết Anh, 2003).
Trong phòng thí nghiệm: heo con từ 10 – 21 ngày tuổi được chọn làm động vật
thí nghiệm.


6


2.1.3.2. Chất chứa căn bệnh
Mầm bệnh tập trung chủ yếu ở tổ chức phổi, hạch phổi và chất tiết đường hô
hấp. Năm 1972, Goodwin chứng minh rằng MH cũng có thể phân lập được từ mẫu
ngoáy mũi của thú bệnh. Ngoài ra trong các hạch bạch huyết dọc khí quản cũng chứa
nhiều MH, do đó có thể phân lập MH từ các hạch bạch huyết này (Nguyễn Như Pho,
1999).
Heo khỏi bệnh vẫn mang vi khuẩn trong đường hô hấp từ vài tháng đến cả năm.
Do đó bệnh tích đã lành vẫn có khả năng còn vi khuẩn.
2.1.3.3. Đường xâm nhập
Vi khuẩn xâm nhập chủ yếu qua đường hô hấp.
2.1.3.4. Cách sinh bệnh
Theo Trần Thanh Phong (1996), sau khi theo đường hô hấp vào trong cơ thể,
MH đến phổi và định vị ở tiểu phế quản, phế nang; MH sẽ sinh sản ở khoảng giữa các
tế bào phổi và có 2 trường hợp xảy ra:
Nếu sức đề kháng của cơ thể con thú tốt thì MH tạm thời bị cô lập.
Nếu sức đề kháng của cơ thể con thú kém (do nuôi dưỡng kém, chuồng trại dơ
bẩn, thời tiết thay đổi đột ngột…), trạng thái cân bằng bị phá vỡ, MH sẽ tăng cường
độc lực, sinh sản nhanh và tấn công từ thùy tim sang thùy đỉnh rồi thùy hoành cách
mô, tạo bệnh tích hóa gan đỏ rồi hóa gan xám, nhục hóa, tụy tạng hóa, xuất hiện những
vùng khí thũng. Cơ thể sẽ phản ứng bằng cách tăng sinh và huy động bạch cầu đơn
nhân và đặc biệt là bạch cầu lympho đến (bệnh tích vi thể cho thấy tổ chức lâm ba tại
chỗ tăng sinh, nhiều bạch cầu lympho tới các tổ chức quanh phế quản và mạch máu ở
phổi).
Nếu có sự kế phát của các vi sinh vật khác, đặc biệt là Pasteurella multocida,
bệnh sẽ trầm trọng hơn, thú bệnh có thể chết nhanh hơn và tỷ lệ tử vong cũng cao hơn.
2.1.3.5. Cách lây lan và truyền bệnh

Bệnh lây lan qua đường hô hấp, chủ yếu do tiếp xúc trực tiếp giữa heo mang
trùng và heo khỏe mạnh (mũi với mũi). Thông thường, heo mẹ là những thú mang
trùng, mầm bệnh khu trú trong đường hô hấp, dễ dàng lây sang heo con.
7


Trên heo nuôi thịt sự lây nhiễm dễ xảy ra khi trong đàn có heo mắc bệnh. Ngoài
việc tiếp xúc trực tiếp, heo khỏe rất dễ hít phải mầm bệnh mà heo bệnh thải ra không
khí sau cơn ho.
Bên cạnh đó, mầm bệnh có thể phát tán trong không khí với đường kính 3 –
3,5 km. Đây là lý do chính gây nên sự nhiễm trùng từ trại bệnh sang trại chưa có bệnh
hoặc sự xuất hiện bệnh trên những đàn heo SPF (specific pathogen free).
Bệnh thường kéo dài và khó dập tắt, khó tiêu diệt do heo khỏi bệnh vẫn mang
mầm bệnh một thời gian dài với bệnh tích ở phổi. Bệnh lây lan mạnh trong các ổ dịch
mới làm chết nhiều heo ở thời kỳ đầu, dần dần bớt trầm trọng và trở thành dịch lẻ tẻ,
lây lan chậm, số con chết ít, bệnh trở nên âm ỉ nhưng nếu nhập heo mới hoặc đưa heo
mắc bệnh vào đàn mới thì bệnh phát ra mạnh mẽ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).
2.1.4. Triệu chứng
Phạm Sỹ Lăng và Trương Văn Dung (2002) cho rằng bệnh viêm phổi địa
phương là một bệnh kinh niên, có bệnh số cao và tử số thấp. Sau một thời gian nung
bệnh (thường từ 10 – 16 ngày trong tự nhiên), bệnh tiến triển dưới thể bán cấp tính hay
mãn tính, có khi cấp tính.
™ Thể bán cấp:
− Từ tuần thứ tư đến tuần thứ sáu, heo bệnh bắt đầu xuất hiện những rối loạn
như mệt mỏi, kém ăn, da xanh, viêm kết mạc mắt, sốt nhẹ (39,5 – 40,50C) trong
khoảng 4 ngày, có khi hắt hơi. Sau đó 1 đến 2 tuần, heo bắt đầu ho khan từng cơn, nhất
là sau khi vận động. Chỉ từ ngày thứ 12 đến ngày thứ 16 khám mới thấy dấu hiệu viêm
phổi, nếu bệnh tích ở phổi rộng thì thấy heo khó thở.
− Mặc dù heo bệnh vẫn ăn nhưng sinh trưởng chậm rõ rệt so với heo bình
thường. Tỷ lệ chết thường không quá 5 – 10 %, tỷ lệ đó sẽ tăng nếu chuồng trại lạnh,

ẩm ướt, nuôi dưỡng kém.
™ Những heo bệnh không chết sẽ chuyển sang thể mãn tính: ho dai dẳng, gầy
còm, da có vảy và đen lại. Thú bệnh phục hồi rất chậm, khó khăn và không hoàn toàn.
™ Thể cấp tính: thể này ít gặp, chủ yếu xuất hiện ở đàn heo chưa từng nhiễm
bệnh. Triệu chứng rõ rệt hơn thể bán cấp tính. Thông thường tử số thấp nhưng nếu gặp
điều kiện nuôi dưỡng kém, tử số có thể tăng lên 20 – 80 %.
8


2.1.5. Bệnh tích
Bệnh tích chủ yếu trên bộ máy hô hấp và hạch phổi.
2.1.5.1. Bệnh tích đại thể
Viêm phổi bắt đầu từ thùy tim lan sang thùy đỉnh, thùy hoành cách mô, thường
phát triển ở rìa, vùng thấp của phổi, có tính chất đối xứng và phân biệt rõ với vùng
phổi bình thường. Đầu tiên, trên phổi xuất hiện những chấm viêm đỏ hoặc xám bằng
hạt đậu xanh, to dần ra và tập trung lại thành vùng rộng lớn. Chỗ viêm ở phổi cứng
dần, màu đỏ nhạt hoặc xám nhạt (hóa gan). Sau đó, vùng phổi bệnh dày đặc lại, cứng
và nhạt màu giống như màu thịt, lúc này phổi đã bị nhục hóa; cắt ra có dịch lỏng màu
trắng xám, có bọt; chất phổi dày đặc lại, không còn xốp như bình thường nữa. Sau 10
– 20 ngày vùng nhục hóa chuyển sang màu vàng hoặc xám rất cứng giống như tụy
tạng, gọi là phổi tụy tạng hóa. Cắt phổi bệnh thấy nhiều bọt, nhiều vùng hoại tử màu
vàng trắng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).
Khí quản và phế quản có nhiều dịch viêm đục, có thể có mủ.
Màng phổi có thể bị viêm làm phổi dính vào lồng ngực.
Hạch phổi sưng to 2 – 5 lần bình thường.
Nếu kế phát các vi khuẩn khác trong đường hô hấp thì bệnh tích có thêm các
dấu hiệu sau:
− Nếu ghép với P. multocida sẽ làm viêm thùy phổi kể cả những vùng sâu
bên trong, phổi viêm và tụ nhiều máu.
− Nếu ghép với các vi khuẩn sinh mủ như Streptococcus suis,

Corynebacterium pyogenes thì gây viêm phổi hóa mủ.
− Nếu ghép với APP sẽ gây bệnh tích viêm màng phổi làm phổi dính sườn.
− Nếu ghép với Haemophilus parasuis sẽ gây viêm phổi xuất huyết, toàn bộ
phổi viêm xuất huyết nặng ở phần trên.
2.1.5.2. Bệnh tích vi thể
Có sự tập trung các bạch cầu trung tính trong lòng ống và chung quanh đường
thở cũng như trong phế nang. Có sự gia tăng số lượng bạch cầu lympho quanh các
mao quản, quanh tiểu phế quản và quanh các mô của tiểu phế quản. Khoảng 10 – 15
ngày có thể thấy bệnh tích rõ ràng; ngày càng tích tụ nhiều dịch chất và tế bào đơn
9


nhân lớn, vách liên phế nang dày hơn. Bệnh tích nặng vào 17 – 40 ngày sau khi cảm
nhiễm. Những nốt lympho tăng sinh mạnh mẽ đặc biệt là trong đường thở. Vùng bệnh
tích đang lành có nhiều phế nang bị xẹp, khí thũng. Quan sát bệnh tích vi thể thấy hệ
thống lông rung bị bào mòn, lòng phế quản có nhiều chỗ tổn thương làm phế quản dày
lên, bên trong chứa nhiều dịch chất và tế bào bạch cầu; đây là nguyên nhân chính gây
hẹp phế quản từ đó gây ra hiện tượng khó thở cho heo. Bệnh tích bị ảnh hưởng đáng
kể bởi cảm nhiễm thứ cấp, stress, không khí bị ô nhiễm và quản lý kém (Quách Tuyết
Anh, 2003).
2.1.6. Chẩn đoán
™ Chẩn đoán lâm sàng phân biệt
Khi chẩn đoán bệnh cần dựa vào đặc điểm dịch tể học là bệnh xảy ra trong điều
kiện vệ sinh nuôi dưỡng chăm sóc kém, phát triển chậm.
Triệu chứng lâm sàng giúp chúng ta định hướng nghi ngờ bệnh suyễn heo bao
gồm ho kinh niên, ho lúc di chuyển, heo chậm lớn và còi cọc, tử số thấp, bệnh chậm
phát triển, lây lan mạnh, bệnh thường tái phát.
Bệnh tích khá đặc trưng nhưng không chuyên biệt vì có trường hợp bệnh tích
tương tự nhưng lại do tác nhân khác, đó là có nhiều vùng bị gan hóa, nhục hóa, tụy
tạng hóa mang tính đối xứng.

™ Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Việc chẩn đoán MH bằng nuôi cấy phân lập thường gặp nhiều khó khăn do MH
cần môi trường nuôi cấy chuyên biệt, khó mọc, mọc chậm và thường bị vấy nhiễm bởi
các vi khuẩn khác hiện diện trên phổi. Tuy nhiên việc phân lập MH được xem là “tiêu
chuẩn vàng” cho việc kết luận sự hiện diện của MH trên heo và được sử dụng để so
sánh với các phương pháp khác trong chẩn đoán nghi ngờ MH (Trần Thị Dân và ctv,
2005).
Các phương pháp huyết thanh học tỏ ra có hiệu quả trong việc chẩn đoán MH
gồm có phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA), phản ứng kết hợp bổ thể (CF),
phản ứng ELISA và phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Trong đó, kỹ thuật ELISA gián
tiếp với Tween 20 được phát triển bởi Nicolet (1980) và Bommeli (1983) tỏ ra khá hữu
hiệu khi phát hiện kháng thể kháng MH, phản ứng chéo với M. Flocculave được loại
trừ tối đa nhờ Tween 20.
10


Ngoài ra có thể dùng Xquang để chẩn đoán bệnh. Nếu heo mắc bệnh này thì
vành tim và đường huyết quản xám mờ đi. Bệnh mới bắt đầu thì thấy mờ ở mõm tim
trước. Nếu cảm nhiễm càng lâu thì diện tích mờ càng rộng. Nếu bệnh nặng thì vùng
phổi mờ xơ bông ra.
Kỹ thuật PCR cũng được nhiều nhà khoa học quan tâm. Người đặt nền móng
cho kỹ thuật PCR là Kary Mullis (1985). Tiếp theo đó là Mattson và ctv (1995) đã
dùng kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh chóng và đặc hiệu MH trong dịch mũi và nước
rửa khí phế quản của phổi bệnh. Calsamiglia (1998) cho rằng phương pháp PCR có độ
chính xác cao, ít tốn kém thời gian, và không phụ thuộc vào sự sống hay chết của MH
(Trích dẫn bởi Nguyễn Tất Toàn, 2004).
2.1.7. Điều trị
Do không có thành tế bào nên MH đề kháng với các kháng sinh tác động lên
thành tế bào vi khuẩn như các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam, nhưng lại rất nhạy
cảm với các kháng sinh có hướng tác động khác. Hiện nay, có rất nhiều kháng sinh

được dùng trong việc điều trị và phòng bệnh suyễn heo. Tuy nhiên, việc lựa chọn
kháng sinh nên dựa vào phạm vi tác động và hiệu quả điều trị.
Theo Nguyễn Như Pho (1999) bệnh có thể điều trị bằng các loại kháng sinh
nhóm tetracyline, macrolide và quinolone.
Phạm Sỹ Lăng và Trương Văn Dung (2002) cho biết khi dùng tylosin ở liều 20
mg/kg thể trọng, tiêm bắp thịt, dùng liên tục trong 6 ngày, ngưng 5 ngày, tiếp tục dùng
trong 5 ngày nữa đã cho kết quả là heo khỏi bệnh về lâm sàng (thở bình thường, hết
ho, ăn khỏe). Bên cạnh đó cần kết hợp cho heo sử dụng thêm các loại thuốc trợ sức
như vitamin B2, vitamin C…và chăm sóc nuôi dưỡng tốt.
Nguyễn Ngọc Nhiên (1992) đã dùng tylosin kết hợp với streptomycin hoặc
kanamycin với liều 30 mg/kg thể trọng cho biết heo khỏi bệnh 80 – 90 %.
Ngoài ra, tiamulin thường được sử dụng để diệt cả MH và các vi khuẩn khác
trong đường hô hấp. Khi dùng với liều 20 mg/kg thể trọng kết hợp dùng kanamycin
cũng ở liều 20 mg/kg thể trọng, heo khỏi bệnh 85 – 90 % (Nguyễn Hữu Vũ, 1993).
Tuy nhiên, khi bệnh đã phát thì hệ thống lông rung đã bị hư hại, việc điều trị
bằng kháng sinh chỉ giúp diệt MH chứ không giúp tái tạo hệ thống lông rung. Khi yếu
11


tố bảo vệ bị mất đi, thú dễ dàng tái nhiễm các mầm bệnh gây viêm phổi chỉ một thời
gian ngắn sau khi ngừng dùng thuốc.
2.1.8. Phòng bệnh
Để kiểm soát bệnh trên động vật nói chung và bệnh suyễn heo nói riêng, cần
thực hiện tốt các biện pháp quản lý trong chăn nuôi. Do đó, cần phải tạo ra môi trường
thuận lợi cho đàn heo như chuồng trại sạch sẽ, thông thoáng, nhiệt độ ấm áp và mật độ
heo trong chuồng vừa phải. Đồng thời phải cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để nâng
cao sức đề kháng cho con vật.
Kiểm tra kỹ trước khi mua heo về và phải cách ly theo dõi 2 tháng trước khi
cho nhập đàn. Thường xuyên theo dõi con thú bằng các phản ứng PCR, phản ứng
huyết thanh học trên đàn nái đẻ để loại thải những cá thể dương tính.

Chương trình cùng vào cùng ra (all in all out) có thể là phương pháp hiệu quả
để kiểm soát bệnh trên những đàn đã nhiễm bệnh.
Ở các trại heo cung cấp giống, để xây dựng đàn heo không nhiễm MH cần sử
dụng kháng sinh liên tục cho con nái từ giai đoạn cuối quá trình mang thai cho đến khi
cai sữa. Cai sữa sớm và nuôi cách ly những heo con này trong điều kiện vệ sinh và
chăm sóc tốt. Trong quá trình nuôi cho đến khi trưởng thành phải kiểm tra thường
xuyên bằng các phản ứng huyết thanh học. Thực hiện thường xuyên biện pháp này sẽ
tạo ra đàn heo giống không có bệnh suyễn heo (Trần Văn Trường, 2009).
Phòng bệnh bằng vaccin: biện pháp sử dụng vaccin để phòng ngừa bệnh cũng
đang được quan tâm. Mặc dù vaccin không hoàn toàn ngăn ngừa được bệnh nhưng làm
giảm đáng kể tỷ lệ bệnh tích trên phổi. Tiêm vaccin cho heo nái mang thai giúp cho
lượng kháng thể heo con nhận được qua sữa đầu cao gấp 3 lần so với bình thường
(Clack, 1999; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thanh Trúc, 2006).
Cách tốt nhất là phối hợp các biện pháp vệ sinh và tiêm phòng vaccin cho heo
sau khi sinh và cho đàn heo nái.

2.2. Môi trường nuôi cấy MH
Những chương trình giải mã bộ gen của Mycoplasma gần đây đã giải thích tại
sao chúng rất khó nuôi cấy. Bản thân Mycoplasma không có hầu hết các gen cho sự
12


sinh tổng hợp các acid amin, acid béo, tiền chất và các vitamin. Vì vậy chúng phải tùy
thuộc vào vật chủ để phát triển (Nguyễn Thị Phước Ninh và ctv, 2006). Do đó, trong
môi trường nuôi cấy không có tế bào, MH đòi hỏi phải có nhiều dưỡng chất có bổ sung
thêm chất ức chế các vi sinh vật khác. Môi trường nuôi cấy MH thông dụng nhất là
môi trường do Friis mô tả (1975).
™ Công thức môi trường canh Friis’ (theo Kirchhoff và Rosengarten, 1984)
Dung dịch muối đệm Hanks (10X)
Nước khử ion


50 ml
1230 ml

BHI

8,2 g

PPLO pha canh

8,7 g

Huyết thanh heo đã bất hoạt bổ thể

300 ml

Chất chiết từ nấm men (50 %)

30 ml

Thalium acetate (1,25 %)

15 ml

Phenol red (1%)

1,25 ml

Penicillin


2.000 UI/ml môi trường

™ Công thức môi trường thạch Friis’: từ môi trường canh trên cho thêm thạch
nguyên chất (6 g trong 1 lít môi trường)
Ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy MH
− Brain heart infusion broth (BHI): thành phần này được xem như chất căn
bản trong môi trường nuôi cấy các Mycoplasma do chứa nhiều chất dinh dưỡng.
− Yeast extract: chất chiết từ nấm men tươi, là chất dịch lỏng chiết ra từ nấm
men đã được lên men. Mặc dù chưa được xác định một cách chính xác nhưng người ta
cho rằng chất chiết này chứa nhiều nucleic acid và tiền chất của nucleic acid.
− Huyết thanh: cung cấp các acid béo và cholesterol dễ đồng hóa và không
độc, thích hợp cho sự tổng hợp màng. Huyết thanh ngựa nồng độ 10 – 20 %, không bị
bất hoạt bởi nhiệt, là huyết thanh động vật thường xuyên được sử dụng.
− Glucose: có tác dụng kích thích những vi sinh vật dị hóa glucose phát triển
mạnh.
− Phenol red: chất chỉ thị để kiểm tra sự phát triển (do MH có khả năng lên
men glucose sẽ làm cho phenol red đổi màu từ đỏ sang vàng khi môi trường trở thành
acid).
13


− Penicillin: ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn Gram dương.
− Thalium acetate: cản trở sự phát triển của vi khuẩn Gram âm và nấm.
2.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.1. Giới thiệu sơ lược về PCR
PCR là một phương pháp dùng để khuyếch đại đoạn gen lên hàng triệu lần
trong một thời gian ngắn nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và một cặp mồi
đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu sinh học và y học nhằm phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện
các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene và

xác định huyết thống.
2.3.2. Nguyên tắc của phương pháp PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình
thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Nếu ta cung cấp hai mồi chuyên
biệt để bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự DNA, ta sẽ tổng hợp được đoạn DNA
nằm giữa hai mồi. Kỹ thuật PCR đòi hỏi chúng ta phải biết trình tự các đầu tận cùng
của đoạn DNA cần khuyếch đại, để tạo nên các oligonucleotide bổ sung chúng. Đoạn
mồi tác động lên đầu 3’ – 5’ gọi là mồi xuôi. Đoạn mồi tác tác động lên đầu 5’ – 3’ gọi
là mồi ngược.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước:
− Bước 1 (biến tính DNA): ở điều kiện nhiệt độ cao (thường là 94oC – 95oC
trong vòng 30 giây – 1 phút), phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn.
Chính hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ
sung.
− Bước 2 (ủ bắt cặp): nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của
các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này
14


− Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ được tăng đến 720C; dưới tác động của DNA
polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch
khuôn. Mạch mới tạo thành từ mồi được nối dài. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của
trình tự DNA cần khuyếch đại.
Trong phản ứng PCR, một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp lại nhiều
lần, làm gia tăng số lượng sản phẩm theo cấp số nhân. Theo tính toán sau 30 đến 40
chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA sản

phẩm có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose rồi
nhuộm bởi ethidium bromide và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm).

Chu kỳ 1

Chu kỳ 4

94 - 950C
Biến tính
Chu kỳ 2

40 – 700C
Bắt cặp

Chu kỳ 3

720C
Kéo dài

Hình 2.1: Nguyên tắc của phản ứng PCR (theo Phạm Hùng Vân, 2008)
2.3.3. Thành phần của phản ứng PCR
2.3.3.1. Taq DNA polymerase
Là enzyme polymerase chịu nhiệt, dùng để xúc tác sự tổng hợp đoạn DNA mục
tiêu từ khuôn mẫu.

15