Giới thiệu
Enzyme là protein hoạt động như chất xúc tác.
Liên kết với cơ chất thành lập phức hệ enzyme
cơ chất.
 Làm giảm năng lượng hoạt hóa
 Sản phẩm thường được tạo ra ở cuối phản ứng


Giới thiệu




Chương 4. Thử nghiệm enzyme

Enzyme thường xúc tác các phản ứng chuyên
biệt và quan trọng như:
o
o
o
o



dẫn truyền thần kinh,
sự co cơ,
dị hóa chất dinh dường,
tạo năng lượng,

Enzyme được tìm thấy trong tất cả các mô,
huyết thanh, tế bào bị tổn thương, thỉnh thoảng

trong các tế bào bị phân hủy.

Tính chất chung của enzymeac
Enzyme có cấu trúc bậc 1, 2, 3 và 4
giống như protein.
 Trung tâm hoạt động→ nơi tương tác
với cơ chất
 Trung tâm dị lập thể
o Vị trí gắn cofactor hoặc các phân
tử điều hòa


Cofactor
 Phần

không phải protein của enzyme

• Các chất hoạt hóa vô cơ
– Các ion như Cl-, Mg2+,….
• Coenzyme hữu cơ
– Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD),…

M. Zaharna Clin. Chem. 2009

1


Phân loại enzyme trong cơ thể
Enzyme chuyên biệt trong huyết tương/
ngoài huyết tương

a.

Phân loại enzyme trong cơ thể
b.

 Sự

1) Một số ít cũng được tiết vào huyết tương
2) Enzyme tham gia trong quá trình biến dưỡng của
tế bào, nồng độ rất thấp trong huyết tương.

Enzyme trong huyết tương: có chức năng
chuyên biệt trong huyết tương

phóng thích enzyme vào trong máu

o Sự phóng thích của enzyme từ tế bào
o Sản phẩm của enzyme
• Ví dụ: sự tăng hoạt động của tế bào osteoblast là
do sự tăng hoạt động của enzyme trong các bệnh
liên quan đến xương

– Sự tăng nồng độ của enzyme này trong tế bào là
nguyên nhân của sự phá hủy hoặc sự chết của tế
bào.

1) Huyết tương là nơi hoạt động bình thường
của enzyme
2) Nồng độ enzyme trong huyết tương cao hơn
các nơi khác

3) Thường được tổng hợp ở gan
Ví dụ: cholinesterase, plasmin, thrombin

 Vòng

đời của enzyme

o Chu kỳ bán rã của enzyme từ vài giờ đến
nhiều ngày.

Đo nồng độ enzyme

Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ
enzyme trong máu
o Nồng độ cơ chất
o Nồng độ enzyme
o pH
o Nhiệt độ
o Cofactor
o Chất ức chế

Enzyme không có trong huyết tương

Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ
enzyme trong máu

Đo nồng độ enzyme












Enzyme thường có nồng độ rất thấp trong các dịch sinh
học (dịch bào, dịch mô, dịch cơ thể,…) nên thường rất
khó phân lập enzyme.
Nên enzyme thường không đo được một cách trực tiếp
Enzyme thường được đo hoạt tính xúc tác
Đo tỷ lệ xúc tác của enzyme để biến đổi cơ chất thành
sản phẩm
Hoạt tính của enzyme sẽ phản ánh nồng độ của enzyme
Hoạt tính của enzyme tỷ lệ với nồng độ enzyme

Hoạt tính của enzyme có thể được khảo sát
bằng cách đo:
o Sự tăng của sản phẩm
o Sự giảm của cơ chất
o Sự giảm của coenzyme
o Sự tăng các chất biến đổi của coenzyme

2


Đo nồng độ enzyme
(coenzyme khá phổ biến ) (dạng khử)

hấp thu ánh sáng 340 nm
 NAD (dạng oxy hóa) KHÔNG hấp thu 340 nm
 NADH

o Sự tăng (hoặc giảm) nồng độ NADH là nguyên
nhân làm thay đổi độ hấp thu (Absorbance, A ) ở
340 nm.

Các phương pháp đo enzyme


Phương pháp khảo sát theo thời gian
o Đo sự thay đổi độ hấp thu quang phổ suốt thời
gian phản ứng
o Đo ở nhiều mức thời gian (thường mỗi 30 giây
hoặc 60 giây)
o Hoặc đo sự thay đổi liên tục của độ hấp thu
quang phổ
o Khảo sát theo thời gian thuận lợi hơn so với cố
định thời gian vì khảo sát được tiến trình phản
ứng

Điều kiện khảo sát
o Sự tăng quá mức cơ chất và cofactors hoặc
coenzymes
• Lượng enzyme tăng một cách bất thường

o Nhiệt độ và pH thích hợp
o Chất ức chế thiếu
o Nhiệt độ phải ổn định (±0.1°C) trong suốt quá

trình thử nghiệm và ở nhiệt độ enzyme hoạt
động tối thích

Các phương pháp đo enzyme
 Phương

pháp khảo sát theo thời gian

o Độ hấp thu quang phổ được đo ở nhiều mức
thời gian, nên có nhiều số liệu ở nhiều thời
điểm khảo sát → tăng tính chính xác của thử
nghiệm
o Khảo sát liên tục thường được lựa chọn nhiều
hơn vì độ lệch chuẩn có thể kiểm soát được.

Các phương pháp đo enzyme


Phương pháp cố định thời gian
o Thời gian phản ứng đã được xác định tối ưu
o Phản ứng phải được “dừng” (thường là các acid yếu)
o Thời gian thử nghiệm thường dài hơn thời gian phản
ứng, thể tích phản ứng lớn, nhiều enzyme hiện diện

Đo hoạt tính enzyme (Unit)
 Đo

hoạt tính của enzyme (không phải
nồng độ)
o IU = lượng enzyme để biến đổi 1 μmol cơ

chất trong 1 phút ở điều kiện tối ưu
o Thường được biểu diễn IU / L

 Đơn

vị SI = Katal = mol/giây

o moles cơ chất biến đổi trong 1 giây
o Thường được biểu diễn katal/ liter (kat / L)
o 1 IU = 17nkat

3


Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

Sự hấp thu quang phổ của cơ chất hoặc
sản phẩm

Phương pháp quang phổ
o Nhiều cơ chất và sản phẩm của enzyme hấp thu
ánh sáng trắng (visible) hoặc U.V.
o Đa số cơ chất và sản phẩm của phản ứng có sự
hấp thu quang phổ ở các bước sóng khác nhau.
o Khi phản ứng có sự xúc tác của enzyme thì cơ
chất sẽ giảm, sản phẩm sẽ tăng kèm theo sự
thay đổi độ hấp thu tương ứng với cơ chất hoặc
sản phẩm.
M. Zaharna Clin. Chem. 2009


Sự thay đổi độ hấp thu quang phổ của
coenzyme dạng khử và dạng oxy hóa

Giảm hấp thu
ở 450 nm
Hấp thu mạnh ở 450 nm

Sự thay đổi độ hấp thu quang phổ của
coenzyme dạng khử và dạng oxy hóa

NADH: hấp thu ở 340 nm
NAD+: không hấp thu ở 340 nm
Sự giảm độ hấp thu quang phổ của NADH/ phút được xem
như hoạt tính của enzyme.

Sự thay đổi độ hấp thu quang phổ của
coenzyme dạng khử và dạng oxy hóa

NADPH: hấp thu ở 340 nm
NAPD+: không hấp thu ở 340 nm
Sự tăng độ hấp thu quang phổ của NADH/ phút được xem
như hoạt tính của enzyme.

4


Đo gián tiếp sự thay đổi độ hấp thu
quang phổ của phản ứng kết hợp

Đo gián tiếp sự thay đổi độ hấp thu

quang phổ của phản ứng kết hợp

Khi phản ứng khảo sát không có sự thay đổi về độ
hấp thu quang phổ
 Phương pháp quang phổ được sử dụng bằng cách
thêm vào một enzyme tinh khiết để biến đổi sản
phẩm của phản ứng mà có sự thay đổi độ hấp thu
quang phổ có thể đo được.
 Hoạt tính của enzyme trong phản ứng thứ nhất
được xác định gián tiếp thông qua phản ứng thứ
hai

NADH: hấp thu ở 340 nm
NAD+: không hấp thu ở 340 nm

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

Đo gián tiếp sự thay đổi độ hấp thu
quang phổ của phản ứng kết hợp



Phương pháp fluorescence
o Fluorescence phát sáng bởi một cơ chất sau khi
hấp thu ánh sáng
o Sử dụng máy đo fluorescence

ATP và ADP hấp thu ở 260 nm

Sự tăng độ hấp thu quang phổ của NADH/ phút ở phản ứng thứ
hai được xem như hoạt tính của enzyme ở phản ứng thứ nhất

Phương pháp fluorescence
ATP

Fluorescence peptide substrate

Phương pháp fluorescence
ATP

ADP

Kinase

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

OPO3

Trạng thái FP
thấp
Fluorescence peptide substrate

Phosphopeptide
product

OPO3

ADP


Kinase

OPO3

Trạng thái FP thấp

Phosphopeptide product

OPO3

NAD(P)H, FADH2: dạng khử, không fluorescense
NAD(P), FAD: dạng oxy hóa, fluorescence xanh dương
OPO3
Ligand
MIII

Trạng thái FP
cao

Trạng thái FP cao

OPO3
Ligand
MIII

OPO3

Linker

Sensitizer


5


Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

Phương pháp fluorescence
o Thường sử dụng fluorescence trong các phản
ứng enzyme oxy hóa khử
o Phản ứng oxy hóa làm giảm fluorescence
o Phản ứng khử: tăng fluorescence

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme
Thử nghiệm độ nhạy của protease
Kinase

OPO



Thuận lợi của phương pháp fluorescence
o Nhạy hơn phương pháp quang phổ
o Phát hiện enzyme với lượng nhỏ
o Ít độc hơn so với phương pháp khác (đồng vị)

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

ATP


ADP

[33P]ATP ADP

3

Phosphopeptide product

O2

Luciferin

Ánh sáng

 620
OPO3

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme
Phương pháp Manometric

OPO

ADP

ATP

OPO3

Kinase


Phát hiện ATP

Phosphopeptide product

Protease

Phương pháp đồng vị phóng xạ

Phương pháp fluorescence

Kinase

3

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

Oxyluciferin + CO2 + AMP + PPi




Sử dụng manometer
Thuận lợi và chính xác đối với những phản ứng có
thành phần là khí
o Oxidase: O2
o Decarboxylase: CO2

Acid amin


6


Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

Một số ví dụ về thử nghiệm enzyme

Phương pháp điện cực (Electrode)



Sử dụng cho những phản ứng có tạo ra acid
Sử dụng pH kế để đo sự thay đổi nồng độ H+
(trong các phản ứng enzyme, sự thay đổi pH như
tiến trình phản ứng)

Phương pháp điện cực (Electrode)
Pyruvate + NAD+

Lactate + NADH + H+

• Enzyme lactate dehydrogenase
• Đo pH:
– Phản ứng theo chiều thuận: pH 7,1 – 7,4
– Phản ứng theo chiều nghịch: pH 8,3 – 8,9

Phát triển thử nghiệm
Xác định cơ cấu thử nghiệm
Cơ chế chuẩn của hoạt động thuốc
o Cơ chế hoạt động của chất ức chế

o Các khái niệm về cơ chế ức chế được ứng dụng để
khám phá thuốc.
• Sự ức chế với cơ chất hoặc ligand trong điều kiện
cân bằng/ ổn định
• Sự ức chế ở vị trí khác với vị trí gắn của cơ chất
• Sự ức chế ở trạng thái cân bằng hoạt động

Sự hiểu biết về cơ chế, động học, sự quan sát của thử
nghiệm
 Tiến hành các thử nghiệm nền (matrix): xác định pH, dung
dịch đệm, và các chỉ tiêu liên quan đến sự phát hiện tín
hiệu
 Chọn thể tích phản ứng phù hợp
 Đánh giá quy trình sàng lọc trong các thử nghiệm thăm dò,
xác định chất lượng của thử nghiệm dựa trên hiệu suất
phản ứng, chất chuẩn hoặc các chỉ tiêu khác


Phát triển thử nghiệm
Xác định cơ cấu thử nghiệm
 Cơ



Phát triển thử nghiệm
Các vấn đề cần xem xét khi phát triển thử
nghiệm enzyme

chế chuẩn của hoạt động thuốc


o Hạn chế của các cơ chế ứng dụng
(1) Sự tích tụ của cơ chất  Giảm hiệu suất chất ức chế
cạnh tranh
o Khắc phục
• Sử dụng cơ chế ức chế hoạt động: khi khởi đầu sự
gắn chất ức chế  hoạt động khối lượng cân bằng.
Khi chất ức chế gắn hoàn toàn sự hoạt động của hệ
thống bị ngăn cản do sự cân bằng đạt được
• Cải biến hóa trị của thuốc/ trung tâm hoạt động của
enzyme đối với chất ức chế (chất ức chế dựa trên
cơ chế)

Phát triển thử nghiệm
Ứng dụng cơ chế hoạt động thiết kế thử
nghiệm
Chất ức chế dị lập thể
Chất ức chế cạnh tranh
 Dạng bất hoạt hoặc hoạt động của enzyme



Thời gian ủ, nồng độ cơ chất, trình tự các chất
thêm vào phản ứng

7


Phát triển thử nghiệm

Phát triển thử nghiệm


Phát triển thử nghiệm

Ứng dụng cơ chế hoạt động thiết kế thử nghiệm

Ứng dụng cơ chế hoạt động thiết kế thử nghiệm
 Các bước quan trọng trong thiết kế thử nghiệm

Ứng dụng cơ chế hoạt động thiết kế thử nghiệm



Mỗi dạng có những thuận lợi riêng, sự lựa chọn thử nghiệm
phụ thuộc vào sinh học của bệnh
o Chất ức chế cạnh tranh vị trí gắn ATP ít kháng thuốc,
hiệu quả, và chọn lọc thấp, ảnh hưởng đến hoạt động
của tế bào
o Chất ức chế cạnh tranh vị trí gắn cơ chất thường khó
block đối với sự tương tác với các phân tử nhỏ (peptideenzyme) trên bề mặt lớn
o Chất ức chế dị lập thể thường hiệu quả và sự chọn lọc
cao, nhưng dễ dẫn đến hiện tượng kháng thuốc
Khó lựa chọn dạng thử nghiệm đối với enzyme có sự
tương thích sinh học cao

Phát triển thử nghiệm
Các chỉ tiêu khi tối ưu hóa thử nghiệm enzyme
o
o
o
o

o
o
o
o
o
o

Enzyme
pH
Co-factor
Cơ chất
Thời gian
Mg, Mn
Dung dịch đệm
Chất tẩy rửa
Protein mang
Kháng thể



o Tìm thời gian ủ thích hợp của enzyme với cơ chất 
thời gian thích hợp cho quy trình sàng lọc  khó khăn
đối với sự chuẩn bị enzyme không ổn định
o Ủ enzyme kinase với ATP để hoạt hóa enzyme 
“stock” enzyme  pha loãng khi thực hiện phản ứng 
Phân biệt được chất ức chế cạnh tranh hoặc không với
ATP bởi sự thay đổi nồng độ ATP  IC50 hoặc % ức
chế.

Phát triển thử nghiệm


Giảm khả năng can thiệp không tốt tới hoạt động của chất
ức chế cạnh tranh
o Nồng độ cơ chất (Km)
o Động học enzyme
o Hệ số gắn giữa enzyme và cơ chất

Phát triển thử nghiệm

Dung dịch đệm và dung môi

Thời gian ủ

Nồng độ chất tẩy rửa, dung dịch đệm, protein mang, chất
khử …ảnh hưởng đến tín hiệu phát hiện và đường biểu
diễn sự đáp ứng.
 Sự lựa chọn dung dịch đệm thích hợp cho từng phản ứng
là cần thiết, và được tham khảo cũng như khảo sát trước
khi tiến hành thử nghiệm





Thời gian ủ ở các bước khác nhau phụ thuộc vào động học
enzyme, thường từ 10 phút đến 15 giờ
 Tỷ lệ phản ứng tăng, khi tăng nồng độ enzyme hoặc nhiệt
độ và như vậy thời gian ủ sẽ giảm.

8



Phát triển thử nghiệm
Nồng độ dimethylsulfoside (DMSO)
Phần lớn các chất cần kiểm tra tan tốt trong DMSO, chính
vì vậy ảnh hưởng của DMSO đến phản ứng cần được kiểm
tra.
 Các phản ứng enzyme, phản ứng gắn phân tử sinh học
nồng độ DMSO có thể sử dụng từ 5% đến 10%
 Các thử nghiệm dựa trên tế bào nồng độ 0,5%


9