TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ
THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC

2015

1


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ
THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO
(HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
Ts. NGUYỄN THỊ THU THỦY
CN. La Văn Thái
CN. Bùi Thị Quỳnh Hoa

2015
2


Trƣờng Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
----------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
2. Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine
trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC).
3. Sinh viên thực hiện:Nguyễn Thị Ngọc Châm
MSSV: B1203424
Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:
 Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp
..............................................................................................................................

..............................................................................................................................
 Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015
Cán bộ hướng dẫn

Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
3


Trƣờng Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
----------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện:......................................................................................
2. Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine
trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)
3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Ngọc Châm
MSSV: B1203424
Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:
 Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015
Cán bộ phản biện

4



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
____________

___________________________
Năm học 2015 – 2016

Đề tài: “XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ
THREONINETRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LỜI CAM ĐOAN
Em tên: Nguyễn Thị Ngọc Châm tác giả của luận văn này, em xin cam
đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của riêng
em, các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp
nào khác và đã được chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng chấm bảo vệ luận
văn.
Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015

Nguyễn Thị Ngọc Châm

Luận văn tốt nghiệp đại học
Chuyên nghành: Hóa Dược
Đã bảo vệ và được duyệt
Hiệu trưởng:.................................................
Trưởng khoa: ...............................................
Trưởng chuyên ngành

Cán bộ hướng dẫn


Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
5


LỜI CẢM ƠN
---Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện tại Trường Đại học Cần Thơ
cùng với quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, dưới sự quan tâm, giúp đỡ và
tận tình chỉ dẫn từ quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè, em đã học hỏi được rất
nhiều kiến thức từ sách vỡ, cũng như kinh nghiệm thực tiễn rất bổ ích cho bản
thân. Để có được thành quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc
đến:
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Khoa Khoa học
tự nhiên cùng tất cả quý Thầy Cô đã giảng dạy những kiến thức quý báu cho
em trong suốt quá trình học tập của mình.
Ban lãnh đạo Trung tâm Phân Tích và Giám định Vinacert Control – Cần
Thơ, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về hóa chất, thiết bị, dụng cụ để giúp em
hoàn thành tốt nhất luận văn này.
Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy.
Cảm ơn cô đã truyền dạy những kiến thức sâu rộng của mình, tận tình hướng
dẫn cùng với sự quan tâm ân cần, âm thầm hỗ trợ và động viên tinh thần, cô đã
tạo mọi điều kiện tốt nhất để em vượt qua mọi khó khăn và hoàn thành luận
văn của mình. Xin gửi đến cô lời cảm ơn sâu sắc nhất!
Xin gửi lời cảm ơn đến Ts. Tôn Nữ Liên Hƣơng, đã dẫn dắt em và lớp
Cử nhân Hóa Dược Khóa 38 trong suốt 4 năm học tại trường. Cảm ơn cô đã
truyền lại những kiến thức quý báu về chuyên ngành cũng như sự quan tâm
sâu sắc và tận tụy, giúp chúng em vượt qua mọi rào cản khó khăn trong học
tập.
Cảm ơn CN. La Văn Thái – Trưởng phòng thí nghiệm Trung tâm Phân
Tích và Giám định Vinacert Control – Cần Thơ, CN. Bùi Thị Quỳnh Hoa –

kiểm nghiệm viên phòng phân tích sắc ký và các anh chị tại công ty, đã nhiệt
tình hướng dẫn, chia sẽ kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện đề tài tại đây.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã yêu
thương, chăm sóc và hỗ trợ con trong suốt quãng thời gian học tập, là chỗ dựa
tinh thần cho con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống, tạo mọi điều kiện
để con hoàn thành chương trình học của mình. Cám ơn bạn bè và mọi người
xung quanh đã luôn đồng hành, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập.

i


TÓM TẮT
Để đảm bảo sự cân bằng giữa các amino acid trong sản phẩm thức ăn
chăn nuôi cần tiến hành phân tích xác định hàm lượng các amino acid bằng
các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao , đề tài tiến hành phân tích
định lượng lysine, methionine và threonine là các amino acid thiết yếu
thường được phối trộn trong thức ăn chăn nuôi nhằm tăng tốc độ sinh trưởng
và năng suất sản xuất của vật nuôi, phương pháp ứng dụng phân tích bằng
máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu thức ăn chăn nuôi được thủy
phân với dung dịch HCl 6M (103◦C trong 24 giờ) và tạo dẫn xuất tiền cột với
ortho-phthaladehyde với sự có mặt của tác chất 3-mercaptopropanoic acid
tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang mạnh, quá trình tạo dẫn
xuất tiền cột được tự động hóa với thiết bị bơm và lấy mẫu tự động
(autosampler), sự phân tách được thực hiện trên cột Agilent Zorbax EclipseAAA (4,6 150 mm, 5 m) và được phát hiện bằng detector DAD ở bước sóng
( 338nm.
Phương pháp phân tích có độ chọn lọc cao (sự sai khác về thời gian lưu
trên mẫu thử và mẫu chuẩn nhỏ hơn 4 %), khoảng tuyến tính rộng (3 - 150
ppm, R2 > 0,995), phương pháp có độ chụm đạt (RSD = 2,6 % với lysine, 2,5

% với methionine, 0,8 % với threonine ). Giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng thấp (Lysine: LOD = 1,131 ppm; LOQ = 3,392 ppm, Methionine: LOD
= 1,343 ppm; LOQ = 4,029 ppm, Threonine: LOD = 1,593 ppm; LOQ =
4,779 ppm). Kết quả phân tích độ đúng trên mẫu thử có kết quả khá chính xác
với độ lệch chuẩn tương đối của mẫu nguyên liệu lysine đạt (RSD = 1,03 %),
độ chệch (bias) đạt -1,43 %. Kết quả phân tích thu được hàm lượng phù hợp
với tỉ lệ phối trộn trong thức ăn chăn nuôi với hàm lượng lysine khoảng 0,53 –
1,89 %, methionine 0,25 – 0,52 % và threonine 0,32 – 1,44 %.
Từ khóa: amino acid, thức ăn chăn nuôi, sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC), tạo dẫn xuất tiền cột với OPA.

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i
TÓM TẮT .......................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... viii
DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT ................................................................... ix
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU .............................................................................. 2
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................ 2
1.2 Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 3
1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 3
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................... 4
2.1 Khái quát về amino acid........................................................................... 4
2.1.1 Giới thiệu chung về amino acid ........................................................ 4
2.1.2 Phân loại amino acid ......................................................................... 4
2.1.3 Tính chất vật lý .................................................................................. 8

2.1.4 Tính chất hóa học .............................................................................. 9
2.2 Lysine ..................................................................................................... 11
2.2.1 Giới thiệu về lysine ......................................................................... 11
2.2.2 Tác dụng của Lysine........................................................................ 12
2.3 Methionine ............................................................................................ 13
2.3.1 Giới thiệu về Methionine................................................................. 13
2.3.2 Tác dụng của methionine ................................................................ 13
2.4 Threonine ............................................................................................... 14
2.4.1 Giới thiệu về threonine .................................................................... 14
2.4.2 Tác dụng của threonine ................................................................... 15
2.5 Một số phương pháp định lượng amino acid ......................................... 15
2.5.1 Phương pháp sắc ký giấy................................................................. 15
2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................................ 17
2.5.3 Phương pháp sắc ký khí .................................................................. 17
iii


2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................... 17
2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................. 18
2.6.1 Khái niệm ........................................................................................ 18
2.6.2 Nguyên lí hoạt động và tách sắc ký................................................. 18
2.6.3 Phân loại .......................................................................................... 19
2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................. 20
2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định ........................................................... 22
2.8 Thủy phân protein .................................................................................. 23
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .... 25
3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm .................................................................... 25
3.1.1 Địa điểm thí nghiệm ........................................................................ 25
3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm ....................................................... 25
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ .......................................................................... 25

3.1.4 Hóa chất ........................................................................................... 25
3.1.5 Đối tượng thí nghiệm ...................................................................... 26
3.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 26
3.2.1 Chuẩn bị mẫu................................................................................... 26
3.2.2 Khảo sát thời gian lưu ..................................................................... 26
3.2.3 Xây dựng đường chuẩn dựa trên khoảng tuyến tính ....................... 27
3.2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện ............................................................. 29
3.2.5 Khảo sát giới hạn định lượng ......................................................... 30
3.2.6 Độ chính xác (độ chụm và độ đúng) ............................................... 31
3.3 Thực nghiệm .......................................................................................... 36
3.3.1 Quy trình xử lý mẫu và phân tích trên HPLC ................................. 36
3.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, pha động và dung dịch phân tích .. 36
3.3.3 Điều kiện chạy máy HPLC .............................................................. 39
3.3.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian lưu của mẫu chuẩn lysine, methionine
và threonine .............................................................................................. 40
3.3.5 Xây dựng đường chuẩn ................................................................... 40
3.3.6 Xác định giới hạn phát hiện............................................................. 40
3.3.7 Xác định giới hạn định lượng ......................................................... 40
3.3.8 Thí nghiệm khảo sát độ chính xác của phương pháp ...................... 40
iv


3.3.9 Tiến hành thí nghiệm trên mẫu ....................................................... 41
3.3.10 Công thức tính toán kết quả .......................................................... 41
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 42
4.1 Kết quả khảo sát thời gian lưu ............................................................... 42
4.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn ............................................................. 42
4.3 Giới hạn phát hiện .................................................................................. 44
4.4 Giới hạn định lượng ............................................................................... 44
4.5 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp ................................... 44

4.5.1 Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp................................... 44
4.5.2 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ................................... 45
4.6 Kết quả tiến hành trên mẫu thử .............................................................. 46
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................. 48
4.1 Kết luận .................................................................................................. 48
4.2 Kiến nghị ................................................................................................ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 50
PHỤ LỤC........................................................................................................ 51

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp ............................................................... 7
Bảng 3.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
.......................................................................................................................... 33
Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ....... 35
Bảng 3.3 Quy định về độ thu hồi của Hội đồng châu Âu ............................... 35
Bảng 3.4 Điều kiện điều chỉnh máy HPLC trong quá trình phân tích ............ 39
Bảng 3.5 Xây dựng dãy chuẩn lysine, methionine và threonine ..................... 40
Bảng 4.1 Thời gian lưu của mẫu chuẩn của 3 loại amino acid ....................... 42
Bảng 4.2 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính ............ 42
Bảng 4.3 RSD (%) của hàm lượng methionine trong thức ăn chăn nuôi ........ 44
Bảng 4.4 RSD (%) của hàm lượng lysine trong thức ăn chăn nuôi ................ 45
Bảng 4.5 RSD (%) của hàm lượng threonine trong thức ăn chăn nuôi ........... 45
Bảng 4.6 Hàm lượng lysine trong mẫu nguyên liệu........................................ 45
Bảng 4.7 Độ chệch của phương pháp dựa trên độ chệch của hàm lượng mẫu
nguyên liệu ....................................................................................................... 46
Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng lysine, methionine, threonine trong
thức ăn chăn nuôi ............................................................................................. 46

Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lượng mẫu nguyên liệu lysine .................... 47

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Công thức cấu tạo chung của amino acid .......................................... 4
Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I ......................................... 5
Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II ........................................ 5
Hình 2.4 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm III ...................................... 6
Hình 2.5 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm IV ...................................... 6
Hình 2.6 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm V ....................................... 6
Hình 2.7 Đồng phân lập thể của amino acid ..................................................... 9
Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid ....... 9
Hình 2.9 Phản ứng tạo phức với ninhydrin của amino acid............................ 10
Hình 2.10 Phản ứng Sorensen ......................................................................... 10
Hình 2.11 Phản ứng màu Biure ....................................................................... 11
Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein ......................................................... 11
Hình 2.13 Công thức các dạng đồng phân lập thể của lysine ......................... 12
Hình 2.14 Công thức các dạng đồng phân lập thể của methionine ................. 13
Hình 2.15 Công thức các dạng đồng phân lập thể của threonine .................. 14
Hình 2.16 Mô tả sắc ký giấy đi lên ................................................................. 16
Hình 2.17 Sơ đồ bể sắc ký giấy một chiều đi lên ............................................ 16
Hình 2.18 Hệ thống máy sắc ký HPLC tại các phòng thí nghiệm .................. 18
Hình 2.19 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ........................................................ 20
Hình 2.20 Công thức cấu tạo của OPA ........................................................... 22
Hình 2.21 Phương trình tạo dẫn xuất với thuốc thử OPA............................... 23
Hình 3.1 Thời gian lưu trên sắc ký đồ ............................................................ 27
Hình 3.2 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc............................................ 28
Hình 3.3 Minh họa tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu.............................................. 30

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu và phân tích amino acid trên HPLC ...... 36
Hình 4.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn của lysine ................................... 42
Hình 4.2 Đồ thị phương trình đường chuẩn của methionine .......................... 43
Hình 4.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn của threonine ............................. 43

vii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
2-ME

2 – Mercaptoethanol

3-MPA

3 – Mercaptopropanoic acid

ACN

Acetonitrile

AOAC

Association of analytical comunities

AQC

6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate

HPLC


High perfomance liquid chromatography

LOD

Limit of detection

LOQ

Limit of quantitation

Lys

Lysine

mAu

Milli absorbance units

MeOH

Methanol

Met

Methionine

Min

Minute


NRC

National Reasearch Council

OPA

ortho-Phthaladehyde

pI

Isoelectric point

RSD

Relative standard deviation

S/N

Signal to Noise

SKPB

Sắc ký phân bố

SKPĐ

Sắc ký pha đảo

SKPT


Sắc ký pha thường

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

Thr

Threonine

USFDA

United States Food and Drug Administration

viii


DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT
◦

C

Celcius degree

g

gram

Kg


Kilogram

L

Liter

mg

Milligram

mL

Milliliter

ppb

parts per billion

ppm

parts per million
Microgram
Microliter

ix


CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, chăn nuôi đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp hiện
đại ở nước ta. Trong năm 2014, ngành chăn nuôi đạt 24,5% trong tổng giá trị
sản xuất nông nghiệp, là một trong hai nguồn cung cấp lương thực – thực
phẩm chủ yếu cho đời sống người dân bên cạnh ngành trồng trọt. Chăn nuôi
cũng là một mắt xích quan trọng trong sản xuất nông nghiệp bền vững, góp
phần tạo việc làm, tăng thu nhập cho người dân. Như chúng ta đã biết, ngành
chăn nuôi là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho con người, các sản phẩm
chăn nuôi có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp protein và có hàm lượng cao
hơn các thức ăn có nguồn gốc thực vật. Vì vậy, thực phẩm từ chăn nuôi có giá
trị dinh dưỡng cao đối với đời sống con người. Để đáp ứng nhu cầu đó, đối với
ngành chăn nuôi ngoài yếu tố cần có chất lượng con giống tốt, chúng ta cũng
cần đảm bảo các yếu tố dinh dưỡng cho vật nuôi bằng việc cung cấp đầy đủ
thức ăn và cân bằng giữa các yếu tố dinh dưỡng. Thị trường thức ăn chăn nuôi
hiện nay ở nước ta rất đa dạng, các nhà sản xuất đã nghiên cứu và phát triển ra
những dòng sản phẩm thức ăn chăn nuôi bổ sung đầy đủ các thành phần như:
protein, amino acid, carbohydrate và các thành phần quan trọng khác như:
vitamin, khoáng đa lượng và vi lượng,... Trong đó, việc bổ sung và cân đối
hàm lượng amino acid là rất quan trọng. Vì amino acid là nhân tố không thể
thiếu trong thức ăn chăn nuôi, nó giữ vai trò quan trọng đối với cơ thể gia súc,
gia cầm. Thêm vào đó, amino acid là một trong những dưỡng chất quan trọng
trong quá trình sinh trưởng, tạo ra sản phẩm và nâng cao hiệu quả, hiệu suất sử
dụng thức ăn của vật nuôi, giúp nâng cao tốc độ tăng trưởng và chất lượng thịt
của gia súc, gia cầm mà không dùng đến các chất kích thích tăng trọng họ β –
agonist bị cấm sử dụng trong chăn nuôi.
Đối với gia súc và gia cầm, các loại amino acid đặc biệt quan trọng cần
cung cấp hằng ngày gồm: methionine, lysine, threonine. Trong đó,
methionine, lysine, threonine là các loại amino acid thiết yếu mà cơ thể động
vật không thể tự tổng hợp được, phải lấy từ thức ăn bên ngoài. Do vậy, cần
cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng và amino acid trong khẩu phần ăn theo
đúng nhu cầu cho từng loại vật nuôi nhằm tăng khả năng sinh trưởng, phát

triển và chất lượng thịt của gia súc và gia cầm.
Để xác định hàm lượng và đảm bảo cân bằng tỉ lệ các thành phần dinh
dưỡng nói chung và amino acid nói riêng, bằng các phương pháp phân tích
hóa học hiện đại, ta có thể định lượng và đánh giá thành phần các amino acid
trong thức ăn chăn nuôi một cách dễ dàng mà vô cùng chính xác.

2


Do vậy, đề tài “Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine
trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)” nhằm khảo sát quy trình định lượng các loại amino acid nói chung
và lysine, methionine, threonine nói riêng, góp phần xác định thành phần dinh
dưỡng và đánh giá chất lượng các sản phẩm thức ăn chăn nuôi bằng một
phương pháp phổ biến, có độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp. Từ đó,
có thể ứng dụng vào thực tiễn để làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về
nhu cầu protein, amino acid của người và động vật, cũng như góp phần làm
hoàn thiện các phương pháp phân tích protein.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Tìm điều kiện tối ưu về quy trình xử lý mẫu, quy trình định lượng
lysine, methionine, threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Áp dụng và ổn định phương pháp phân tích amino acid trong thức ăn
chăn nuôi từ đó đánh giá được chất lượng một số loại thức ăn chăn nuôi được
bán trên thị trường ở thành phố Cần Thơ.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Phân tích định tính: lysine, methionine, threonine dựa vào thời gian lưu
của mẫu chuẩn và mẫu thử từ kết quả phân tích trên HPLC.
Phân tích định lượng: Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện
(LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lệch chuẩn (RSD), độ chính xác của

phương pháp.
Tiến hành phân tích định lượng lysine, methionine, threonine trên mẫu
thức ăn chăn nuôi tại địa bàn Thành phố Cần Thơ.

3


CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát về amino acid
2.1.1 Giới thiệu chung về amino acid
Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein, hormone và enzyme,…là
hợp chất hữu cơ mà trong phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxylic (–COOH)
và một nhóm amine (–NH2) trừ proline chỉ có nhóm NH (được gọi là imino
acid). Trong phân tử amino acid đều có các nhóm –NH2 và –COOH gắn với
carbon ở vị trí .

Hình 2.1 Công thức cấu tạo chung của amino acid
Trong tự nhiên có khoảng 150 loại amino acid khác nhau nhưng chỉ có 20
loại trong số chúng tham gia cấu tạo nên phân tử protein. Hầu hết các protein
khi thủy phân đều thu được dưới dạng L-α-amino acid. Như vậy các amino
acid chỉ khác nhau ở mạch nhánh hay còn gọi là chuỗi bên (Kí hiệu: R).
2.1.2 Phân loại amino acid [1]
Có nhiều cách để phân loại amino acid, mỗi loại đều có ý nghĩa và mục
đích riêng. Tuy nhiên, có thể phân loại amino acid một cách chung nhất theo
hai quan điểm: quan điểm hóa học và quan điểm sinh vật học.
- Quan điểm hóa học (xét về cấu tạo phân tử, hóa tính): có thể chia
amino acid ra thành các nhóm.

Amino acid mạch thẳng: Dựa vào số lượng nhóm –NH2 và –COOH
mà lại chia ra thành:

 Acid monoamine – monocarboxylic (amino acid chứa 1 nhóm –
NH2 và 1 nhóm –COOH).
 Acid monoamine – dicarboxylic (amino acid chứa 1 nhóm –NH2
và 2 nhóm –COOH).
 Diamine – monocarboxylic (amino acid chứa 2 nhóm –COOH
và 1 nhóm –NH2).

Amino acid mạch vòng: gồm 2 loại đồng vòng và dị vòng.

4


Ngoài ra, dựa vào tính chất của gốc R người ta còn phân loại amino acid
thành 5 nhóm: nhóm không phân cực (nhóm kỵ nước), nhóm phân cực nhưng
không tích điện, nhóm tích điện dương, nhóm tích điện âm và nhóm R là nhân
thơm.
 Nhóm I. Gồm 7 amino acid có gốc R không phân cực kỵ nước:
glycine, alanine, proline, leucine, isoleucine, valine, methionine.

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I
 Nhóm II. Gồm 3 amino acid có R là nhân thơm: phenylalanine,
tyrosine, tryptophan.

Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II
 Nhóm III. Gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện:
serine, threonine, aspargine, cystein, glutamine.

5



Hình 2.4 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm III
 Nhóm IV. Gồm 3 amino acid có gốc R tích điện dương: lysine,
histindine, arginine.

Hình 2.5 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm IV
 Nhóm V. Gồm 2 amino acid có gốc R tích điện âm: aspartate,
glutamate.

Hình 2.6 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm V
- Quan điểm sinh vật học (xét về tầm quan trọng đối với dinh dưỡng động
vật) được chia thành 2 loại:


Amino acid không thay thế được hay còn gọi là amino acid thiết yếu:
đây là amino acid rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể
6


động vật. Cơ thể động vật không thể tự tổng hợp được loại amino acid
này mà phải bổ sung vào cơ thể hằng ngày bằng thức ăn.
 Đối với người trưởng thành có 8 loại amino acid thiết yếu: lysine,
valine, methionine, threonine, tryptophan, leucine, isoleucine,
phenylalanine.
 Đối với trẻ em, do quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể chưa hoàn
chỉnh nên ngoài 8 amino acid thiết yếu trên còn cần thêm 2 amino
acid là arginine và histidine.


Amino acid thay thế được hay còn gọi là amino acid không thiết yếu: là
amino acid mà cơ thể động vật có thể tự tổng hợp được từ các nguyên

liệu sẵn có. Nhóm này gồm các amino acid còn lại.

Theo nhiều nghiên cứu, tuy tyrosine và cystein là các amino acid không
thiết yếu cơ thể có thể tổng hợp được nhưng với điều kiện phải có
phenylalanine cơ thể mới có thể tổng hợp được tyrosine và phải có methionine
mới tổng hợp được cystein. Do vậy, nếu trong khẩu phần ăn của người và
động vật nếu không bổ sung đầy đủ phenylalanine và methionine sẽ dẫn đến
thiếu hụt tyrosine và cystein.
Ngoài các amino acid thường gặp ở trên, trong phân tử protein còn có một
số amino acid khác, đó là những loại ít gặp. Các amino acid này là dẫn xuất
của những amino acid thường gặp như: trong phân tử colagen có chứa 4 –
hydrogenxyproline là dẫn xuất của proline, 5 – hydrogenxylysine là dẫn xuất
của lysine... Mặt khác, mặc dù không có trong cấu trúc protein, nhưng có rất
nhiều loại amino acid khác thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với hợp chất
khác trong các mô và tế bào, chúng có thể là chất tiền thân hay là các sản
phẩm trung gian của quá trình chuyển hoá trong cơ thể sinh vật.
Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp
Tên amino
acid
Glycine
Alanine
Proline
Valine
Leucine
Isoleucine
Methionine

Tên amino acid gọi theo danh
pháp hoá học


-aminoacetic
-aminoprpionic
-pirolidincarboxylic
-aminoiaovaleric
-aminonoisocaproic
-amino--metylvaleric
-amino--metyltiobutiric
7

Tên
Khối
Ký
viết
lượng
hiệu
tắt
(M)
Gly
Ala
Pro
Val
Leu
Ile
Met

G
A
P
V
L

I
M

75
89
115
117
131
131
149


Phenylalanine -amino--phenylpropionic
Phe
Tyrosine
Tyr
-amino-hydrogengenxyphenylpropionic
-amino--idolylpropionic
Tryptophan
Trp
-amino--hydoxypropionic
Serine
Ser
-amino-Threonine
Thr
hydrogengenxybutiric
Cysteine
Aspargine
Glutamine
Lysine

Histidine
Arginine
Aspartate
Glutamate

-amino--tiopropionic
amide của aspartate
amide của glutamate
, diaminocaproic
-amino--imidazolpropionic
-amino--guanidinvaleric
-aminosucinic
-aminoglutarate

Cys
Asn
Gln
Lys
His
Arg
Asp
Glu

F
Y

165
181

W

S
T

204
105
119

C
B
Q
K
H
R
D
E

121
132
146
146
155
174
133
147

2.1.3 Tính chất vật lý [1]
Màu sắc và mùi vị:
Các amino acid thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như
glycine, alanine, valine, serine, histidine, tryptophan; một số loại có vị đắng
như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là

mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium glutamate).
Tính tan trong nước:
Các amino acid thường dễ tan trong nước, khó tan trong alcohol và ether
(trừ proline và hydrogenxyproline). Chúng cũng dễ hòa tan trong acid và kiềm
loãng (trừ tyrosine).
Tính quang học
Các amino acid trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ
glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm
quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. Quay phải
được ký hiệu bằng dấu (+), quay trái được ký hiệu bằng dấu (-). Góc quay đặc
hiệu của amino acid phụ thuộc vào pH của môi trường. Tuỳ theo sự sắp xếp
trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối mà các amino
acid có cấu trúc dạng D hay L (Hình 2.7) gọi là đồng phân lập thể. Số đồng
phân lập thể được tính theo 2n (n là số carbon bất đối).
8


L-Amino

acid
D-Amino acid
Hình 2.7 Đồng phân lập thể của amino acid

Hầu hết các amino acid khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng ( ) khoảng từ
220 - 280 nm. Đặc biệt cùng nồng độ 10-3 M, trong bước sóng khoảng 280 nm
tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ
của tyrosine và phenylalanine là yếu nhất. Phần lớn các protein đều chứa
tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein.
2.1.4 Tính chất hóa học [2]
Amino acid có tính lưỡng tính

Do trong phân tử có cả nhóm amino (–NH2) và nhóm carboxylic (–COOH)
vừa có khả năng nhận proton (H+) thể hiện tính base, vừa có khả năng nhường
proton thể hiện tính acid.

Dạng ion lƣỡng cực

Dạng phân tử

Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid

9


Phản ứng với ninhydrin
Khi đun nóng amino acid với ninhydrin tạo phức màu xanh tím (trừ proline
cho màu vàng).Các nhà phân tích cũng lợi dụng tính chất này để định lượng
amino acid bằng cách định lượng khí NH3, CO2 hoặc aldehyde vừa tạo thành
từ phản ứng.
Amino acids

Phức xanh tím

2 x ninhydrin

Hình 2.9 Phản ứng tạo phức với ninhydrin của amino acid
Phản ứng Sanger
Đây là một phương pháp phổ biến nhất được ứng dụng để xác định amino
acid trong mạch polypeptide từ đầu N.
Khi nghiên cứu tính chất hóa học của amino acid ta phát hiện ra rằng nhóm
α– amine có khả năng trùng hợp với dinitrobenzene. Trong mạch chỉ có một

nhóm α– amine tự do ở đầu N, khi trùng hợp sẽ tạo thành dinitropheny –
polypeptide. Liên kết này rất bền, do đó khi dùng HCl thủy phân protein sẽ
giải phóng ra tất cả các amino acid tự do cùng với amino acid liên kết với
dinitrobenzene dưới dạng dinitrophenyl – amino acid. Sau đó, với phương
pháp sắc ký ta có thể định danh amino acid đó.
Phản ứng Sorensen (phản ứng với aldehyde formic – formalin)

Amino acid

Formalin

Hợp chất vinyl của amino acid

Hình 2.10 Phản ứng Sorensen
Ứng dụng: bằng cách chuẩn độ với dung dịch kiềm tiêu chuẩn người ta có
thể định lượng được hàm lượng các amino acid có trong dung dịch.

10


Phản ứng với kim loại nặng

Phức Biure có màu đỏ tím

Hình 2.11 Phản ứng màu Biure
Các amino acid có khả năng phản ứng với các kim loại nặng, tạo thành hợp
chất phức nội phân tử với các muối của kim loại đó, đặc biệt là với ion Cu2+,
phản ứng tạo thành phức chất Biure có màu đỏ tím.
Ngoài ra, do các amino acid có cấu tạo gốc R khác nhau, nên người ta có
thể dùng để xác định từng amino acid riêng rẽ nhờ phản ứng đặc trưng của nó,

ví dụ phản ứng oxy hoá khử do nhóm –SH của cysteine, phản ứng tạo muối do
các nhóm –COOH hay –NH2 của glutamte hay lysine, phản ứng tạo ester do
nhóm OH của tyrosine...

Oxy hóa
Khử

Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein
2.2 Lysine [3]

-

2.2.1 Giới thiệu về lysine
Lysine (viết tắt là Lys hoặc K). Tên khoa học: 2,6-diaminohexanoic acid.
Lysine là một α-amino acid chứa hai nhóm –NH2 và một nhóm –COOH
với công thức phân tử: C6H14N2O2.
Công thức hóa học: HOOCCH(NH2)(CH2)4NH2.
Nó là một amino acid thiết yếu, cơ thể không thể tự tổng hợp được.
Trong cấu tạo phân tử có chứa một carbon bất đối xứng nên chúng có hai
dạng đồng phân quang học: D-Lysine và L-Lysine. Hai đồng phân này có
11


tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng
phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học
của chúng hoàn toàn khác nhau và cơ thể sinh vật chỉ hấp thu được dạng
L-Lysine.

L-Lysine


D-Lysine

Hình 2.13 Công thức các dạng đồng phân lập thể của lysine
-

Điểm đẳng điện ở pI = 9,74

-

Khối lượng phân tử: 146,189 g/mol

-

Nhiệt độ nóng chảy (T◦nc): 224◦C.

-

Lysine là một amino acid thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con
đường trao đổi chất phân nhánh. Qua con đường này còn có methionine,
threonine, isoleucine cũng được tạo thành.

-

Lysine tồn tại ở dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân
hủy ở 200-300◦C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrine.

-

Lysine có nhiều trong trứng, thịt, sữa, cá, đậu nành… nhưng dễ bị phá
huỷ trong quá trình chế biến, nấu nướng thức ăn.


-

-

2.2.2 Tác dụng của Lysine
Lysine là một amino acid rất cần cho hoạt động sống của người và động
vật. Nghĩa là cơ thể không tự tổng hợp được nó, phải lấy từ nguồn thức
ăn bên ngoài (chúng thuộc loại amino acid thiết yếu). Lysine giữ vai trò
sống còn trong sự tổng hợp protein. Nó là chìa khoá trong việc sản xuất
các enzyme, hormone và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề
kháng và chống trả với bệnh tật, đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi
khuẩn gây bệnh.
Lysine cần thiết cho sự phát triển xương của trẻ, hỗ trợ sự hấp thụ calci,
duy trì sự cân bằng nitơ trong cơ thể.
Lysine giúp ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hoá và hấp thu tối đa chất
dinh dưỡng và phát triển chiều cao.
Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ khó hoạt động bình
thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm
lớn, trí tuệ phát triển kém, dễ thiếu men tiêu hoá và nội tiết tố. Chính vì

12