140526 – Báo cáo thực hành trypsin tế bào BHK21, P15 – Nhuận TT

BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH – MIỄN DỊCH
V/v Thực hành trypsin tế bào BHK-21 ra chai T25
1.Mục đích:
Thành thạo các bước của quy trình trypsin tế bào BHK21.
2.Thời gian, địa điểm:
Thời gian: Ngày 26 tháng 5 năm 2014.
Địa điểm: Phòng tế bào bộ môn Hóa sinh – Miễn dịch
3.Người thực hiện
Người thực hiện: Trần Thị Nhuận
4.Cách tiến hành
4.1.Nguyên vật liệu:
a.Tế bào: Tế bào BHK21 được nuôi cấy ngày 140521, P15. Tế bào đã phát triển, tỉ lệ
bám đáy 100%. Tế bào hình thuôn dài, mượt, bám đáy đều.
b. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:
MEM1x:
Thành phần:
NaHCO3………………...2,2g
MEM bột……..................9,53g
Gentamycin……………..50µg
Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít.
MEM 10%
Thành phần:
MEM1x……………….100ml
FBS…………………….10ml
1


140526 – Báo cáo thực hành trypsin tế bào BHK21, P15 – Nhuận TT

FBS:
Thành phần:
PBS bột …………………..9,55 gam
Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít
Trypsin – EDTA
10ml trypsin EDTA / ống ly tâm 15ml
Trypan blue 0,4%
c. Dụng cụ an toàn sinh học
Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay
Chai xịt cồn 700 .
d.Dụng cụ hấp, sấy:
STT

Vật liệu

Số lượng

1

Cốc đựng thủy tinh

01

2

Ống ly tâm 15

01

3


Khay đựng dụng cụ

01

4

Hộp type 5ml

01

5

Hộp type 200µl

01

6

Hộp giấy lau

01

7

Eppendorf

02

e.Máy móc, thiết bị

2


140526 – Báo cáo thực hành trypsin tế bào BHK21, P15 – Nhuận TT

STT

Vật liệu

Số lượng

1

Pipet 5ml

01

2

Pipet 100- 1000µl

01

3

Cabinet

01

4


Máy ly tâm

01

5

Tủ ấm CO2

01

6

Tủ lạnh 40C

01

7

Tủ lạnh -200C

01

8

Buồng đếm tế bào

01

9


Kính hiển vi soi ngược

01

4.2.Các bước thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng
Chuẩn bị Cabinet:
Vô trùng Cabinet trong 15 phút
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông.
Bước 2: Quan sát tế bào
Mục đích: quan sát mức độ phát triển của tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy.

Cách tiến hành:
Quan sát trên kính hiển vi soi ngược về hình dạng tế bào, mức độ phát triển, tỷ
lệ tế bào bám đáy.
Tế bào BHK21 sau khi nuôi cấy 5 ngày thấy tế bào hình thuôn nhỏ, mượt, tỷ lệ
bám đáy 100%.
3


140526 – Báo cáo thực hành trypsin tế bào BHK21, P15 – Nhuận TT

Bước 3: Loại bỏ môi trường đang nuôi:
Mục đích: loại bỏ tế bào chết
Cách tiến hành:
Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai
Dùng pipet 5ml hút bỏ môi trường.
Chú ý: Cho đầu type xuống dưới đáy chai, hút hết môi trường nuôi cấy.

Bước 4: Rửa PBSMục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết thanh và môi trường còn sót lại.
Cách tiến hành:
Thêm vào bình nuôi 5ml PBS- vào chai nuôi T25.
Lắc ngang chai, hút bỏ PBS- .
Rửa tế bào 2 lần với PBS-.
Chú ý:
Khi cho PBS- nên để đầu type vào gần miệng chai, không cho sâu quá, cho vào
mặt không có tế bào bám dính, đầu pipet không được chạm vào thành chai.
Bước 5: Trypsin tế bào
Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình.
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 1ml Trypsin cho vào mặt chai không có tế bào, nghiêng chai nhẹ
nhàng để các tế bào đồng pha cùng tách nhau.
Quan sát tế bào sau khi trypsin dưới kính hiển vi nếu tế bào bắt đầu co tròn lại,
tách rời nhau thì tiến hành dừng trypsin.
Thời gian trypsin tế bào BHK21(140521, P15) là 4 phút.
Chú ý:
Không được lắc chai nuôi TB.
4


140526 – Báo cáo thực hành trypsin tế bào BHK21, P15 – Nhuận TT

Bước 6: Trung hòa trypsin
Mục đích: Dừng quá trình trypsin
Cách tiến hành:
Vỗ mạnh chai hoặc đập chai nuôi để các tế bào tách nhau hoàn toàn (tránh làm
môi trường bắn lên thành bình).
Dùng pipet hút 3ml môi trường MEM10% cho vào chai nuôi để trung hòa
trypsin.

Dùng pipet đảo đều môi trường, tưới đều lên mặt tế bào bám đáy, lắc đều nhiều
lần để bong hết các tế bào bám dính đáy chai.
Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 15ml. Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc
nhẹ, đem ly tâm.
Bước 7: Ly tâm và đánh tan cặn
Mục đích: thu cặn tế bào
Cách tiến hành:
Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700vòng/phút trong 10 phút.
Dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào
Hút 3ml môi trường MEM10% cho vào ống, dùng pipet đảo đều hoặc rà đáy
ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào.
Chú ý :
Khi hút dung dịch phía trên, không để đầu type chạm vào đáy ống có tế bào sẽ
hút lẫn cặn tế bào.
Bước 8: Đếm tế bào
Mục đích: xác định lượng tế bào có trong 1ml huyễn dịch
Cách tiến hành:
Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10% : Hút 900µl môi trường MEM10% cho
vào ống eppendorf. Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn đều.
5


140526 – Báo cáo thực hành trypsin tế bào BHK21, P15 – Nhuận TT

Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số 2: cho vào
ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha loãng 10 lần với 100µl trypan blue.
Dùng pipet hút 1 lượng huyễn dịch tế bào sau khi nhuộm nhỏ từ từ vào buồng
đếm tế bào.
Đếm sô tế bào trên buồng đếm:
Đếm tế bào ở 4 góc, trong mỗi góc có 16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằm trong

khung 16 ô vuông nhỏ.
Đếm từng tế bào riêng lẻ trong đám tế bào.
Đếm theo hình zic zắc.
Đếm các tế bào có kích thước tương đồng nhau.
Không đếm các tế bào chết bắt màu xanh, chỉ đếm các tế bào còn sống.
Ước lượng số tế bào trong 1ml:
số tế bào/1ml = (số tế bào đếm được trong 4góc/4 )x 2 x độ pha loãng tế bào x 104
Số tế bào BHK21 /1ml = (45/4) x2 x 105 = 2,25 . 106 cell
Muốn ra chai T25 với số lượng 1,2 . 106 cell thì cần 0,53 ml huyễn dịch tế bào
và 5,47 ml MEM10%.
Bước 10: Ra chai nuôi
Mục đích: Tiếp tục nuôi tế bào, để tế bào nhân lên.
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 5,47 ml MEM10% cho vào T25.
Dùng pipet lấy 0,53ml huyễn dịch cho vào chai nuôi
Lắc nhẹ nhàng để tế bào được trải đều khắp mặt đáy chai nuôi.
Bước 11: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng
Thu dọn rác, Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet
Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet
6


140526 – Báo cáo thực hành trypsin tế bào BHK21, P15 – Nhuận TT

Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút
Bước 12: Theo dõi sự phát triển của tế bào
Nuôi tế bào ở tủ ấm 370C, 5% CO2
Hằng ngày quan sát tế bào phát triển ở đáy chai nuôi trên kính hiển vi soi
ngược.
5. Nhận xét:

Thao tác ra chai nuôi, tế bào đã bám đáy đều.
Thao tác nhuộm tế bào, chuyển huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm lên buồng
đếm còn chưa chuẩn làm tế bào trong 4 góc lớn không đều nhau.

Bảng theo dõi trypsin ra chai T25 (140512, BHK-21, P16)
STT

Ngày

Thao tác

Thời Mật độ

% TB

%

Hình dạng TB

Màu môi
7


140526 – Báo cáo thực hành trypsin tế bào BHK21, P15 – Nhuận TT

theo
dõi
26/05
/2014


Ra chai
T25

2

27/05
/2014

Quan sát
tế bào

18h

3040%

1%

Tế bào hình
thuôn dài, tế
bào bám đáy
đều. Tế bào
đang phát
triển

Môi
trường
màu
hồng đỏ,
trong


3

28/05
/2014

Quan sát
tế bào

42h

6070%

1%

Tế bào hình
thon dài, tế
bào bám đáy
đều, một số tế
bào co tròn,tế
bào đang phát
triển

Môi
trường
màu đỏ
hồng,
trong.

4


29/05
/2014

Quan sát
tế bào

90100%

2%

Tế bào hình
thon, nhỏ,
bám đáy dầy,
có những cụm
tế bào co tròn
tụ lại thành
từng đám nhỏ.

Môi
trường
màu đỏ
vàng, có
ít vẩn
nhỏ li ti
màu
trắng

1

gian

nuôi

bám
đáy

TB
chết

trường

1,2.106
cell/ T25

Màu
hồng đỏ,
trong

Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2014
Người thực hiện

Trần Thị Nhuận

8