HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
THỬ NGHIỆM BIỂU HIỆN PROTEIN MÀNG (OUTER MEMBRANE
PROTEIN) CỦA VI KHUẨN CANDIDATUS LIBERIBACTER ASIATICUS
GÂY BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH TRÊN CÂY CÓ MÚI
Giảng

viên

hướng PGS.TS. Hà Viết Cường

dẫn
:
Sinh viên thực hiện
Mã sinh viên
Lớp

:
:
:

Phạm Thị Ngọc Ánh
591215
K59CNSHB

Hà Nội, 01/2018

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ
và động viên tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS. Hà Viết
Cường – Trưởng Bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học – người đã trực tiếp hướng dẫn,
dành nhiều công sức, thời gian, đóng góp những ý kiến vô cùng quan trọng và tạo mọi
điều kiện để tôi có thể thực hiện và hoàn thành đề tài này.
Trân trọng cám ơn tất cả các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học đã
dạy dỗ, truyền đạt kiến thức để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập đại học
cũng như thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cám ơn các cán bộ nhân viên của Trung tâm Nghiên
cứu Bệnh cây nhiệt đới đã luôn giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè những người
đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện
khóa luận tốt nghiệp.
Một lần nữa tôi xin chân thành cám ơn!
Hà Nội, ngày 19 tháng 12 năm 2017
Sinh viên
Phạm Thị Ngọc Ánh

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong báo cáo này là hoàn toàn trung thực và chưa được sử dụng, công bố trong các
báo cáo, luận văn, luận án và các công trình nghiên cứu khoa học trước đây.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn được sử dụng trong luận văn đều
được ghi nguồn gốc rõ ràng, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan này.

Hà Nội ngày 19 tháng 12 năm 2017
Sinh viên
Phạm Thị Ngọc Ánh

ii


MỤC LỤC
PHẦN I: MỞ ĐẦU......................................................................................................xi

1.1 Đặt vấn đề.......................................................................................................xi
1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu................................................................xiii
2.1.1. Mục đích...........................................................................................................xiii
2.1.2. Nội dung nghiên cứu.........................................................................................xiii
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................................xiv

2.1. Bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi.......................................................xiv
2.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh...................................................................................xiv
2.1.2. Vi khuẩn Candidatus Liberibacter......................................................................xv
2.1.3. Triệu chứng........................................................................................................xv
2.1.4. Truyền bệnh......................................................................................................xvi
2.1.5. Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh..................................................................xviii

3.1. Các hệ thống biểu hiện................................................................................xix
2.1.1. Hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân sơ (vi khuẩn).............................................xix
2.1.2. Hệ thống biểu hện ở sinh vật nhân chuẩn...........................................................xx

4.1. Hệ thống vector biểu hiện...........................................................................xxi
5.1. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu.......................................................xxii
2.1.1. PCR (Poly Chain Reaction).............................................................................xxii

2.1.2. Điện di............................................................................................................xxiv
2.1.3. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG trong E. coli.........................................xxv
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................xxvi

3.1. Vị trí và thời gian nghiên cứu....................................................................xxvi
3.2. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................xxvi

iii


3.2.1. Sinh phẩm.......................................................................................................xxvi
3.2.2. Chất kháng sinh.............................................................................................xxvii
3.2.3. Hóa chất.........................................................................................................xxvii
3.2.4. Các thiết bị máy chủ yếu...............................................................................xxviii

3.3. Nội dung nghiên cứu...............................................................................xxviii
3.4. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................xxviii
3.4.1. Tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn bằng NaOH...........................................xxviii
3.4.2. Tách chiết DNA bằng CTAB........................................................................xxviii
3.4.3. PCR................................................................................................................xxix
3.4.4. Điện di Agarose..............................................................................................xxix
3.4.5. Phục hồi dòng vi khuẩn Rosetta......................................................................xxx
3.4.6. Chuẩn bị plasmid tái tổ hợp pET28a...............................................................xxx
3.4.6.3. Xây dựng cấu trúc biểu hiện pET28a và OMP gen.....................................xxxi
3.4.7. Tinh sạch cấu trúc pET28a.............................................................................xxxi
3.4.8. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta bằng kĩ thuật xung điện
................................................................................................................................ xxxiii
3.4.9. Nghiên cứu cảm ứng biểu hiện gen mã hóa protein màng OMP trong tế bào vi
khuẩn E.coli dòng Rosetta......................................................................................xxxiv
3.4.10. Điện di SDS – PAGE.................................................................................xxxiv

3.4.11.Tinh chiết protein tái tổ hợp bằng NI-NTA Agarose....................................xxxvi

4.1. Dòng hóa các cấu trúc biểu hiện protein OMP (outer membrain protein) của
vi khuẩn Cadidantus Liberibater asiaticus...................................................xxxviii
4.1.1. Chuẩn bị các nguồn vi khuẩn.....................................................................xxxviii
4.1.2.Nhân 2 phân đoạn gen đầu C của gen OmpA bằng phương pháp PCR..............41
4.1.3. Dòng hóa 2 phân đoạn gen đầu C của gen OmpA trên vector pET28a..............42

iv


4.1.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn biểu hiện Rosetta 2(DE3)......46

4.2. Nghiên cứu biểu hiện cấu trúc pET28a-OMP-C5m/3m-1 và pET28a-OMPN-1 trong vi khuẩn Rosetta 2 (DE3)....................................................................50
4.2.1. Nghiên cứu biểu hiện cấu trúc pET28a-OMP-C5m/3m-1 trong vi khuẩn Rosetta
2 (DE3)........................................................................................................................ 51
4.2.2. Nghiên cứu biểu hiện cấu trúc pET28a-OMP-N-1 trong vi khuẩn Rosetta 2
(DE3)........................................................................................................................... 53

4.3. Đặc trưng phân tử phân đoạn gen OMP-C5m/3m.......................................57
NHư trình bày ở mục 4.1, 2 phân đoạn gen mã hóa 2 đoạn protein đầu C của OMP đã
được dòng hóa. Cả 2 phân đoạn đã được giải trình tự từ 2 cấu trúc pET28a-OMPC5m/3m-1 và pET28-OMP-F1/R1-1. Do đoạn OMP-F1/R1 nằm trùng trong phân
đoạn pET28a-OMP-C5m/3m-1 (Hình 4.3) nên chúng tôi chỉ tiến hành phân tích trình
tự của phân đoạn OMP-C5m/3m.................................................................................57
4.3.1. Giải trình tự pET28a-OMP-C5m/3m-1.............................................................57
Kết quả giải trình tự cho thấy phân đoạn OMP-C5m/3m có kích thước 1047 bp, mã
hóa cho 1 protein gồm 342 amino acid (MW = 37.7kDa), cụ thể như sau:..................57
4.3.2. So sánh trình tự.................................................................................................58
STT............................................................................................................................. 59
Vi khuẩn...................................................................................................................... 59

Viết tắt......................................................................................................................... 59
Mã GenBank............................................................................................................... 59
Mức đồng nhất trình tự (%)........................................................................................59
1.................................................................................................................................. 59
Candidatus Liberibacter asiaticus................................................................................59
C.Las........................................................................................................................... 59
KC473160...................................................................................................................59

v


100.............................................................................................................................. 59
2.................................................................................................................................. 59
C.Las........................................................................................................................... 59
KC473159...................................................................................................................59
100.............................................................................................................................. 59
3.................................................................................................................................. 59
JQ928887....................................................................................................................59
99.9............................................................................................................................. 59
4.................................................................................................................................. 59
AY842431...................................................................................................................59
99.8............................................................................................................................. 59
5.................................................................................................................................. 59
JQ686728....................................................................................................................59
94.2............................................................................................................................. 59
6.................................................................................................................................. 59
Candidatus Liberibacter africanus...............................................................................59
C.Laf........................................................................................................................... 59
CP004021...................................................................................................................59
65.4............................................................................................................................. 59

7.................................................................................................................................. 59
Candidatus Liberibacter solanacearum.......................................................................59
C.Lso........................................................................................................................... 59
CP002371...................................................................................................................59
64.6............................................................................................................................. 59

vi


8.................................................................................................................................. 59
Candidatus Liberibacter crescens................................................................................59
C.Lcr........................................................................................................................... 59
CP010522...................................................................................................................59
57.1............................................................................................................................. 59
9.................................................................................................................................. 59
Candidatus Liberibacter americanus...........................................................................59
C.Lam.........................................................................................................................59
CP006604...................................................................................................................59
56.5............................................................................................................................. 59
4.3.3. Đặc điểm kháng nguyên của protein OMP-C5m/3m.........................................60
Kết quả cho thấy trên phân tử OMP-C5m/3m xuất hiện rất nhiều các epitope tiềm tàng
rất thuận lợi cho việc sử dụng tạo kháng thể chẩn đoán bệnh VLGX trên cây cam quýt.
..................................................................................................................................... 61

5.1. Kết luận.......................................................................................................63
5.1. Kiến nghị......................................................................................................63
PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................65

vii



DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AP

Alkaline phosphate

APS

Amonium persulfate

CTAB

Cetyl trimethylammonium bromide

PCR

Poly Chain Reaction

ELISA

Enzyme Linked Immono Sorbent Assay

DNA

Deoxyribonucleic acid

E. Coli

Escherichia coli


BBTV

Bảo vệ thực vật

HLB

Huanglongbinh

VLGX

Vàng lá gân xanh

EtBr

Ethidium Bromide

IPTG

Isopropyl – b, D – thiogalactoside

OMP

Outer membrain protein

Kb

Kilo base

kDa


Kilodalton

LB

Luria Bertani

SOB

Super Optimal Broth

SOC

Super Optimal Catabolite

mg

Miligram

µl

Microliter

ml

Mililiter

MW

Moleculer weight – khối lượng phân tử


OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

viii


SDS-PAGE

Sodium dedecyl sulfate- polyacrylamide gel

TAE

electrophoresis
Tris-acetate-EDTA

TE

Tris-EDTA

TEMED

Tetramethyl ethylenediamine

β-ME


β – Mercaptoethanol

DANH MỤC BẢNG

ix


DANH MỤC HÌNH

x


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây ăn quả vó múi (cam, quýt, chanh, bưởi…) là nhóm cây ăn quả quan trọng
trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta. Năm 2011, diện tích cây ăn quả có múi ở Việt
Nam đạt 124.057 ha, trong đó diện tích trồng cam quýt tới 70.300 ha, bưởi 45.000 ha
và chanh là 18.000 ha (FAOSAT, 2011). Các loại quả có múi không chỉ là hàng hóa
đáp ứng cho tiêu thụ nội địa mà còn là loại mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh tế cao.
Nghề trồng cây ăn quả có múi được phát triển mạnh mẽ ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt
đới, á nhiệt đới và ôn đới.Tuy nhiên với sự đa dạng khí hậu ở các vùng trồng trọt là
điều kiện thích hợp cho nhiều loại sâu bệnh phát sinh gây hại trên cây có múi, đặc biệt
là bệnh vàng lá gân xanh (Greening). Bệnh lan truyền với tốc độ chóng mặt và gây hại
cho nhiều vườn cam trên toàn thế giới.
Bệnh vàng lá gân xanh (tên tiếng Anh là Greening) là bệnh nguy hiểm nhất trên
cây có múi trên thế giới, đặc biệt trên cây cam. Tương tự tại Việt Nam, khắp cả nước,
bệnh là một trong các nguyên nhân chính cản trở việc phát triển sản xuất cây có múi.
Tại miền Bắc, các vùng trồng cây có múi chính đều bị nhiễm bệnh vàng lá gân xanh
với tỷ lệ bệnh thường 50 %, nhiều vườn có thể nhiễm tới 100 % (Lê Mai Nhất, 2014).
Theo thống kê của Cục Trồng trọt và BVTV, trong những năm gần đây, diện tích cây

có múi bị nhiễm bệnh vàng lá gân xanh tại các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long đều
xấp xỉ 5000 ha.
Cây bị bệnh vàng lá gân xanh sinh trưởng rất còi cọc; bộ lá, đặc biệt là lá non,
bị biến vàng; quả nhỏ, lệch, bị biến vàng phần cuống trước khi chín, không có giá trị
sử dụng.
Tác nhân gây bệnh là một loài vi khuẩn biệt dưỡng (Ca. L. asiaticus) nên không
thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo. Vi khuẩn lan truyền ngoài tự nhiên qua
các vật liệu ghép và rầy chổng cánh (Diaphorina citri).
Các chiến lược quản lý bệnh chủ yếu trên thế giới dựa vào (i) sử dụng vật liệu
giống sạch bệnh, (ii) loại bỏ sớm cây bệnh, (iii) phòng chống vector và (iv) tạo giống

xi


kháng bệnh.
Tất cả các chiến lược trên đều yêu cầu một kỹ thuật chẩn đoán chính xác. Chẩn
đoán bệnh vàng lá gân xanh dựa vào triệu chứng rất khó vì bệnh biểu hiện triệu chứng
không đặc trưng. Nhiều tác nhân như virus tàn lụi (Citrus tristeza virus, CTV) cũng
gây triệu chứng tương tự. Xác định trực tiếp vi khuẩn trong cây bằng kính hiển vi điện
tử hoặc PCR rất phức tạp và đắt, đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt. Chính vì vậy, việc phát
triển các kít chẩn đoán bệnh nhanh, rẻ, dễ sử dụng, dựa trên kháng thể đặc hiệu, như
ELISA, que thử nhanh là yêu cầu cấp thiết cho nông dân trồng cam trong quá trình tạo
giống sạch bệnh và loại bỏ cây bệnh trong sản xuất. Hiện nay, trên thế giới, kít chẩn
đoán bệnh vàng lá gân xanh cũng đã được thương mại, nhưng giá thành rất đắt,
khoảng 18 triệu đồng/ 500 phản ứng (Hãng Agdia, Mỹ). Tại Việt Nam, chưa có một
nghiên cứu nhằm tạo kít chẩn đoán bệnh này.
Để có thể chẩn đoán bệnh bằng các kỹ thuật miễn dịch như ELISA cần phải có
kháng thể đặc hiệu được tạo ra từ kháng nguyên phù hợp. Vì vi khuẩn Ca. L. asiaticus
không nuôi cấy được nên việc tạo kháng nguyên trực tiếp từ vi khuẩn có nhiều nhược
điểm: protein thu được là protein tổng số (protein của vi khuẩn + protein cây) nên sẽ

tạo ra nhiều kháng thể không đặc hiệu, lượng protein vi khuẩn thu được ít. Hậu quả
các kháng thể thu được ít được sử dụng trong chẩn đoán.
Gần đây, Lau et al. (2011), Lu et al. (2013) và Ding et al. (2015) đã chứng tỏ các
đoạn protein của protein màng ngoài (Outer membrane protein A, OmpA) của vi
khuẩn Ca. L. asiaticus có hoạt tính kháng nguyên tốt và đặc hiệu. Các đoạn protein
màng ngoài đã được gây miễn dịch trên thỏ và có thể sử dụng để chẩn đoán bệnh vàng
lá gân xanh.
Do tầm quan trọng của cây có múi, đặc biệt cây cam, trong sản xuất nông
nghiệp của Việt Nam và tầm quan trọng của bệnh vàng lá gân xanh, chúng tôi đề xuất
đề tài : Thử nghiệm biểu hiện protein màng (Outer membrane protein, OMP) của
vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus gây bệnh vàng lá gân xanh trên cây
có múi.

xii


1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục đích
Tạo được phân đoạn protein màng ngoài tái tổ hợp của vi khuẩn Ca. L. asiaticus
phục vụ nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu vi khuẩn.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
1. Dòng hóa các cấu trúc biểu hiện protein OMP của Las (Ca. L. asiaticus) trên
vector biểu hiện vi khuẩn pET28a. Xác nhận cấu trúc bằng giải trình tự.
2. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli, chủng biểu hiện (Rosetta).
3. Phân tích trình tự của các phân đoạn protein OMP đã được dòng hóa và giải
trình tự.

xiii



PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi
2.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh
Bệnh vàng lá gân xanh trên cây cam quýt được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung
Quốc vào năm 1919 với tên gọi Huanglongbing hay chồi vàng (yellow shoot) và được
tài liệu hóa năm 1943. Các nghiên cứu về bệnh vàng lá gân xanh đã đưuọc tiến hành ở
miền nam Trung Quốc năm 1941-1955. Các nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh đã
chứng minh các triệu chứng vàng lá gân xanh lốm đốm vàng trên lá không phải do rối
loạn sinh lí, thiếu hụt khoáng, cũng không phải bệnh truyền nhiễm qua đất do tuyến
trùng hoặc nấm Fusarium.
Năm 1929, triệu chứng bệnh tương tự vàng lá gân xanh đưuọc tìm thấy ở Nam
Phi (Oberholzer et al. 1965). Khi giải phẫu chồi cây bị vàng trên cam ngọt ở Nam Phi.
(Schneider, 1968) đã phát hiện mạch libe có những đốm hoại tử trong hệ thống mạch
trưởn thành, mạch trở nên tắc nghẽn và cản trở sự vận chuyển của các chất dinh
dưỡng. Các nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh được bệnh vàng lá gân xanh ở Nam
Phi đưuọc truyền qua mắt ghép (McClean and Schwartz,1970).
Năm 1921, bệnh được mô tả lần đầu tiên tại Philipine và được cho rằng là có liên
quan đến sự thiếu hụt kẽm ở cây. Năm 1986, các nghiên cứu đã chứng minh mô giới
truyền bệnh lở Philipin là loài rầy chổng cánh (psyliid) Diaphorina citri (Martinez
and Wallace, 1967). Salibe and Cortez (1968) đã tìm thấy sự tương đồng của các
chứng bệnh ở Philipin với các triệu chứng “ vàng lốm đốm” ở Trung Quốc và triệu
chứng “greening” ở Nam Phi.
Hiện nay bệnh được tìm thấy ở hơn 40 quốc gia trên toàn thế giới từ châu Á,
châu Phi, châu Đại Dương, phía Nam và Tây châu Mĩ. Tác nhân gây bệnh là một loại
vi khuẩn Gram âm không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo gây ra các triệu
chứng như “greening” ở Nam Phi, đốm lá ở Philipin, “dieback” ở Ấn Độ, thoái hóa
mạch phoelm ở Indonesia.

xiv



2.1.2. Vi khuẩn Candidatus Liberibacter
Ca. L là một chi vi khuẩn Gram âm thuộc họ Rhizobiaceae.vi khuẩn không định
hình, có vách dầy, không có nhân, không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo, vi
khuẩn di chuyển theo dòng nhựa cây (Bové, 2006). Vi khuẩn được lan truyền qua mắt
ghép, cành chiết và qua côn trồng môi giới là loài rầy chổng cánh Trioza erytreae ở
châu Phi và Diaphorina citri ở châu Á.
Vi khuẩn gây bệnh vàng lá gân xanh có bề dày khoảng 25 mm với 3 lớp của vi
khuẩn Gram âm. Vi khuẩn này có 2 dạng: dạng dài và dạng hình cầu. Dạng dài có
chiều dài từ 1-4mm, đường kính 0,15-0,3mm và dạng hình cầu có đường kính khoảng
0,1mm.
Một số loài bao gồm:
- Libacteria africanus có nguồn gốc từ châu Phi, là một tác nhân gây ra bệnh
vàng lá gân xanh ở châu Phi và được truyền qua vector là loài rầy chổng cánh châu Phi
Trioza erytreae.
- Libacteria americanus là loài mới ở Brazil được công bố năm 2005 và vector
môi giới là loài rầy chổng cánh châu Á Diaphorina citri.
- Libacteria asiaticus tìm thấy ở châu Á và là tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cây
cam quýt châu A. loài bày có vector truyền bênh là rầy chổng cánh châu Á Diaphorina
citri.
- Libacteia crecens được phân lập từ cây đu đủ được trồng ở Puerto Rico.
- Libacteria psyllaurous là loài mới được phát hiện vào năm 2008, kí chủ trên các
cây họ cà như cà chua, khoai tây và có vector truyền bệnh là loài rầy chổng cánh trên
cây cà chua khoai tây Bactericera cockerelli. L. psyllaurous.
- Liberibacter solanacearum là tác nhân gây ra bệnh đốm vàng trên khoai tây và
có vector truyền bệnh là loài rầy chổng cánh cà chua Bactericera cockerelli.
2.1.3. Triệu chứng
Người ta thường nghĩ rằng rất khó để chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh dựa trên
các triệu chứng vì hầu như không có triệu chứng nào trong số đó là cụ thể, và cây có
múi thường bị ảnh hưởng bởi các vấn đề khác.Tuy nhiên, vẫn có một số triệu chứng rất

đặc trưng, và những biểu hiện này sẽ được nhấn mạnh ở đây. Chúng áp dụng cho hầu

xv


hết các loài cây có múi, vì gần như tất cả cây giống cây có múi đều rất nhạy cảm.
- Triệu chứng của bệnh được thể hiện trên khắp bộ phận của cây bao gồm:
- Trên lá: Biểu hiện đặc trưng là phiến lá hẹp, khoảng cách giữa các lá ngắn lại,
có màu vàng nhưng gân chính và gân phụ vẫn còn màu xanh, nhỏ, mọc thẳng đứng
giống như tai thỏ, vì vậy nên có tên là bệnh vàng lá gân xanh. Trên lá già, là bị dày lên,
nhám, gân lồi sần sùi và hóa bần (nâu đen).
- Trên quả: Quả nhỏ hơn bình thường, khi bổ dọc thì tâm quả bị lệch hẳn sang
một bên, có quầng đỏ từ dưới lên. Hạt trên quả bị bệnh thường bị thối, có màu nâu.
- Trên rễ: Khi cây bị bệnh, hệ thống rễ trên cây bị thối nhiều, đa phần rễ tơ không
hút được chất dinh dưỡng để nuôi cây.
Cây bị rụng quả cùng với sự phát triển của bệnh, cây sẽ chết sau 2-3 tùy mức độ
nhiễm (Aubert et al 1988).

Hình 1.1. Triệu chứng của bệnh vàng lá gân xanh
1. triệu chứng thiếu kẽm; 2. Biến vàng ;3. Biến màu trên quả ;4. Quả biến dạng
2.1.4. Truyền bệnh
Bệnh vàng lá gân xanh ban đầu được cho là một bệnh do vi rút gây ra nhưng sau
đó được phát hiện là do côn trùng gây ra. Nhiễm Greening có thể xuất hiện ở các thời
kì khác nhau và thường liên quan đến các loài rầy chổng cánh khác nhau. Ví dụ, cây có
múi ở Châu Phi bị nhiễm bệnh trong điều kiện mát vì vi khuẩn lây truyền qua loài

xvi


Trioza ertreae, một loại côn trùng xâm lấn có lợi cho điều kiện mát và ẩm để tăng

trưởng tối ưu. Tuy nhiên,ccây có múi ở Châu Á bao gồm cả Việt Nam thường bị nhiễm
bệnh trong điều kiện ấm vì vi khuẩn này lây truyền qua loài rầy chổng cánh châu Á
Diaphorina citri.
Rầy chổng cánh châu Á, Diaphorina citri, là một loài rầy thuộc họ rầy Psyllidae,
chúng là một loài côn trùng có hại đối với các cây ăn quả có múi mà điển hình là cam,
quýt, chanh, là là tác nhân chính của bệnh vàng lá gân xanh hay bệnh vàng lá cam
(Greening) ở cây có múi. Đây được xem là đối tượng côn trùng gây hại nguy hiểm
nhất trên cây có múi.
Rầy chổng cánh sinh trưởng và phát triển trong nhiều điều kiện nhiệt độ khác
nhau, rầy trưởng thành có thể tồn tại được ở nhiệt độ lạnh – 4˚C và cả vùng khí hậu
nóng và khô. Thân hình chúng rất nhỏ, thành trùng dài từ 2-3mm, ít bay nhảy, có cánh
dài, màu xám đen với vệt trắng lớn chạy từ đầu đến cuối cánh. Vào mùa mưa, khi các
họ cây có múi (cam, quýt, bưởi...) bắt đầu ra đọt non hoặc trổ bông, là lúc rầy chổng
cánh xuất hiện và gây hại.

Hình 1.2. Rầy chổng cánh châu Á.
Loài này gây thiệt hại cho cây có múi trực tiếp bằng cách ăn lá mới phát triển.
Việc này có thể làm các chồi non không phát triển được hoặc làm cho lá bị xoắn hoặc
bị rụng khi chúng trưởng thành. Nghiêm trọng hơn, côn trùng là một vector của vi
khuẩn Ca. L. asiaticus, có liên quan đến bệnh vàng lá gân xanh trên cây cam quýt hay
còn gọi là bệnh Greening . Rầy chổng cánh đưa vi khuẩn vào cơ thể của nó khi chúng

xvii


ăn các cây bị nhiễm vi khuẩn, bệnh sẽ được lan truyền khi một loài này chứa vi khuẩn
bay tới một cây khỏe mạnh và tiêm vi khuẩn vào trong khi ăn.
2.1.5. Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh
2.5.1. Chẩn đoán bằng PCR
Phương pháp PCR đã được ứng dụng phổ biến để chẩn đoán bệnh vàng lá gân

xanh. Dựa trên gen 16S rDNA, các cặp mồi OI1/OI2c có khả năng nhận biết được cả
loài vi khuẩn châu Á và châu Phi, cặp mồi OA1/OI2c ưu tiên cho loài châu Phi. Để
nhận biết được loài châu Á và châu Phi trên cùng một phản ứng, 2 mồi xuôi là OI1 +
OA1, và 1 mồi ngược OI2c được sử dụng tròng cùng 1 phản ứng PCR (Jagoueix et
al., 1996).
Các kỹ thuật dựa trên DNA khác như PCR-RFLP (Jagoueix et al, 1996), lai dotblot (Garnier and Bove, 1993), nested PCR và TaqMan® PCR (Lin et al. 2010) cũng
được thử nghiệm nhưng ít được ứng dụng trong thực tiễn.
2.5.2. Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA.
Kỹ thuật Enzyme-Linked Immuno-Sorbant Assay (ELISA) rẻ hơn, có thể chẩn
đoán cho một lượng lớn mẫu. Tuy nhiên kỹ thuật yêu cầu có nguồn kháng thể đặc
hiệu.
Khoảng 10 kháng thể đơn dòng đặc hiệu Ca. L. asiaticus đã được tạo ra bằng
phương pháp sử dụng kháng nguyên là protein được tinh chiết từ cây dừa cạn được lây
nhiễm với vi khuẩn Ca. L. asiaticus. Việc tạo kháng nguyên vi khuẩn Ca. L. asiaticus
bằng cách này có nhiều nhược điểm vì:
+ Quá trình tinh chiết kháng nguyên phức tạp.
+ Protein (kháng nguyên) thu được là protein tổng số (protein của vi khuẩn +
protein cây dừa cạn) nên sẽ tạo ra nhiều kháng thể không đặc hiệu. Mặc dù đã có
nghiên cứu nhằm tinh chiết chỉ protein vi khuẩn từ cây dừa cạn nhưng qui trình cực kỳ
phức tạp và vẫn không thể loại bỏ được potein cây.
+ Lượng protein vi khuẩn thu được ít.

xviii


Hậu quả các kháng thể thu được ít được sử dụng trong chẩn đoán.
Gần đây (Lu et al., 2013), kháng thể đặc hiệu với Ca. L. asiaticus đã được tạo từ
nguồn kháng nguyên tái tổ hợp là protein OmpA và kháng thế đã chứng tỏ có thể sử
dụng trong chẩn đoán vi khuẩn Ca. L. asiaticus.
Bộ gen của Ca. L. asiaticus đã được giải mã toàn bộ và gen OmpA của vi khuẩn

có kích thước 2364 nucleotide. Nghiên cứu cho thấy gen này rất bảo thủ trong loài
(trình tự đồng nhất 99.9% ) và khác xa gen tương ứng của 2 loài gần gũi là Ca. L.
africanus (trình tự đồng nhất 75%) và Ca. L. solanacearum (trình tự đồng nhất 69). Kết
quả này cho thấy gen OmpA là lựa chọn rất tốt để tạo kháng nguyên tái tổ hợp của vi
khuẩn Ca. L. asiaticus. Do biểu hiện toàn bộ gen OmpA trong vi khuẩn E. coli không
thành công nên các phần gen khác nhau đã được nghiên cứu biểu hiện. Kết quả 2 vùng
gen ở phần đầu N (tương ứng đoạn POTRA) và phần đầu C (tương ứng đoạn ống beta)
đã được biểu hiện. Kháng thể đa dòng được tạo ra từ 2 kháng nguyên tái tổ hợp này có
tính đặc hiệu rất cao và có thể phát hiện được Ca. L. asiaticus bằng ELISA ở độ chính
xác +90% so với PCR (Lau et al., 2011; Lu et al., 2013; Ding et al., 2015).
3.1.

Các hệ thống biểu hiện
Tùy theo mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng hệ thống biểu hiện gen thích

hợp. Để thu được protein ngoại lai với hàm lượng lớn và hoạt tính tốt thì việc lựa chọn
hệ biểu hiện và vector biểu hiện là rất quan trọng. Bởi vì mỗi loại protein đích có các
đặc điểm khác nhau phù hợp với các hệ thống biểu hiện khác nhau và mỗi hệ biểu hiện
đều có ưu nhược điểm khác nhau. Hiện nay có 2 hệ thống biều hiện gen chính là tế bào
sinh vật nhân sơ và tế bào sinh vật nhân chuẩn:
2.1.1. Hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân sơ (vi khuẩn)
Hiện nay tế bào E.coli là hệ thống tế bào chủ được sử dụng rộng rãi nhất vì rất dễ
nuôi cấy, dễ giữ, nhân giống, cảm ứng dễ dàng bằng cách sử dụng IPTG. Ngoài ra do
đặc tính sinh trưởng nhanh nên rất nhanh chóng thu được protein mong muốn, việc
tinh chiết rất đơn giản nhờ sử dụng hệ thống sắc ký ái lực.
E.coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 1µm, không gây bệnh thường

xix



gặp trong đường ruột của người. E.coli có nhiễm sắc thể dạng vòng nằm trong vùng
nhân. Kích thước của phân tử khoảng 4.106 bp. Các quá trình biểu hiện gen như phiên
mã, dịch mã được xảy ra đồng thời. Sau khi được phiên mã thì mARN sẽ được sử
dụng để dịch mã mà không qua quá trình sửa đổi sau phiên mã do vậy hệ thống này rất
thích hợp cho việc biểu hiện các gen khi các gen này không có quá trình biến đổi sau
dịch mã. Đặc biệt nhiều năm qua, các đặc điểm về di truyền và sinh lý của E. coli đã
được nghiên cứu rất cặn kẽ. Trên thị trường đã thương mại nhiều chủng E. coli cùng
nhiều loại vector cải tiến trở thành vật chủ hữu hiệu trong kĩ thuật tách dòng và biểu
hiện gen.
Tuy nhiên ở hệ biểu hiện E. coli cũng bộc lộ một số nhược điểm như E. coli
không có khả năng sản xuất hiệu quả các loại protein có kích thước quá lớn hoặc quá
nhỏ. Các gen của sinh vật nhân chuẩn không thể biều hiện được hoặc có biểu hiện
được nhưng không được cải biến chính xác. Đồng thời các protein thường biểu hiện ở
dạng thể vùi do việc tổng hợp protein một cách ồ ạt hay thiếu các phân tử đặc hiệu
giúp cuộn xoắn cấu trúc, điều này tuy có thuận lợi cho quá trình tinh sạch protein
nhưng sau đó protein rất khó phục hồi hoạt tính sinh học (Yin et al., 2007). Ngoài ra,
trong nghiên cứu sản xuất các protein trị liệu bằng E. coli luôn tiềm ẩn nhiều nguy cơ
gây ra phản ứng phụ trên người và động vật bởi một số chất (nội độc tố) sinh ra trong
quá trình biểu hiện.
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho thấy, hiệu suất tổng hợp một số protein ngoại
lai trong E. coli rất cao nếu sử dụng plasmid phù hợp. Chính vì vậy, E. coli vẫn đang là
hệ biểu hiện được sử dụng rộng rãi nhất trong việc tạo protein tái tổ hợp.
2.1.2. Hệ thống biểu hện ở sinh vật nhân chuẩn
Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân chuẩn
bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các sinh vật đa bảo phức tạp như động
vật, thực vật. Hệ thống nay có mức độ biểu hiện cao, các protein dễ tinh chiết bằng
cách sử dụng các đuôi đặc biệt được gắn vào trong các vector như His, Myc... Đồng
thời rất thuận tiện trong việc thu protein mà không phải phá vỡ tế bào. Ngoài ra các
protein biểu hiện ở dạng tan, lại không bị ảnh hưởng bởi các biến đổi hậu dịch mã nên


xx


rất thuận lợi cho các nghiên cứu tương tác protein.
Nấm men (S.cerevisiae) được sử dụng rộng rãi trông công nghệ di truyền. Chúng
có thể nuôi cấy quy mô lớn để thu sinh khối tế bào. Một số nấm men có promotor
mạnh và plasmid YAC biều hiện gen. S.cervisiae có khả năng biến đổi sau dịch mã
như đường hóa, phosphoril hóa… để protein có đầy đủ hoạt tính sinh học. Đặc biệt,
S.cerevisiae bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó, nếu đưa gen lạ tổng
hợp protein mới thì sản phẩm dễ làm tinh sạch. Các vi nấm khác cũng được sử dụng
như Aspergilus nidulans, Neurospora crassa hoặc Pechia pastoris.
Các tế bào chủ thực vật được sử dụng chủ yếu là các loài tảo đơn bào như loài
Chramydomonas Rainhardii. Loài này có đầy đủ các đặc tính ưu việt của vi sinh vật
cộng với cấu trúc và chức năng của tế bòa thực vật do vậy chúng ngày càng được sử
dụng rộng rãi trong thao tác di truyền.. Tuy nhiên người ta cũng còn dùng các tế bào
thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp để làm tế bào chủ.
Đối với các tế bào động vật mặc dù việc nuôi khá phức tạp nhưng trong những
điều kiện cần thiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học người ta vẫn
sử dụng. Ví dụ như: tế bào thận của khỉ xanh châu Phi, của chuột đồng nhỏ, phôi
người, tế bào tử cung chuột bạch, tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biều hiện
protein người, tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans.
4.1.

Hệ thống vector biểu hiện
Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phép thực

hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã của các mRNA của
chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ gen ngoại lai. Vector
có thể là các DNA plasmid, cosmid hay phage…đây là các DNA có khả năng nhận đôi,
phiên mã, dịch mã độc lập với DNA của vật chủ. Vector phải chứa gen mã hóa cho

protein chức năng dùng làm dấu hiệu chọn lọc (thường là gen kháng kháng sinh).
Một trong những vector đang được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong việc
biểu hiện protein trong E. coli hiện nay là pET nhờ khả năng sản xuất hàng loạt
protein, thao tác sinh học phân tử dễ dàng, chứa promoter T7 có đặc tính dựa trên

xxi


promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao. Vector pET28a là thành viên đại diện trong họ
pET do Novagen cung cấp. Nó chứa các vùng cần thiết cho biểu hiện gen trong vi
khuẩn (hình 1.8): 1 gen kháng Kanamycin chọn lọc, 1 vùng MCS chứa nhiều vị trí cắt
phục vụ quá trình cắt nối gen, 1 vùng promoter T7 polymerase, 2 vùng chứa nhãn
Histidin (Hig-tag) giúp cho quá trình tinh chiết protein tái tổ hợp. Đặc biệt là trên
vector này chứa 1 chuỗi lac operator sát đầu 3’ của T7 promoter, giúp ngăn cản sự biểu
hiện của gen đích khi chưa cảm ứng IPTG và rất có ý nghĩa khi protein biểu hiện là
độc với tế bào.

Hình 1.3 Vector pET28a và các vùng chức năng quan trọng
(pET System Manual, 2006)
5.1.

Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.1.1. PCR (Poly Chain Reaction)
Kĩ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Poly Chain Reaction) là phương pháp

xxii


invitro để nhân nhanh một đoạn DNA nào đó, có độ nhạy rất cao mà chỉ cần sử dụng

một lượng mẫu ban đầu rất hạn chế. Kĩ thuật này được sáng tạo bởi K.Mullins cùng
cộng sự vào năm 1985. Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân
tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus,
vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Mặt khác, sự phân tích
thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn
trong phân loại các loài sinh vật.
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA
dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng
bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những
đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và
nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành
mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase,
đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến
mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn
DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch
đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của
DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung
chuyên biệt (trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation). Giai đoạn này được thực hiện ở
nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95 0 C) trong vòng 30 giây đến
1 phút, làm cho phân tử DNA mạch Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 4 kép tách thành 2
mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch
bổ sung mới.
Bước 2: (Bắt cặp, annealing). Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn.
Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 0 C. Tùy thuộc vào

xxiii



Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bước 3: (kéo dài, elongation – extension). Nhiệt độ được tăng lên 72 0 C giúp
cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác động của DNA polymerase, các
nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian
của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ
30 giây đến vài phút. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau: Tổng lượng DNA
khuếch đại = m x 2n m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa. n: Là số chu kỳ. Như vậy,
qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu
kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản
được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng PCR (poly chain reaction)
2.1.2. Điện di
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động của
điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA, protein
dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng.
Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ
thuật để phân tích các phân tử DNA,RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của
chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point). Kĩ thuật
này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản
gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các

xxiv