BỘ GIÁO
O DỤC VÀ
À ĐÀO TẠO
O
TRƯỜ
ỜNG ĐẠI HỌC
H
NÔN
NG LÂM TH
HÀNH PH
HỐ HỒ CH
HÍ MINH
BỘ
Ộ MÔN CÔ
ÔNG NGH
HỆ SINH HỌC
H

KHÓA
K
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆ
ỆP

PHÁT HIỆN
H
VÀ
À ĐỊNH LƯỢNG
L

G HBV (H
Hepatitis B Virus))
BẰNG KỸ THU
UẬT REA
AL-TIM
ME PCR

Ngành
h học

: CÔNG
G NGHỆ SIINH HỌC

Sinh viiên thực hiiện : TRƯƠ
ƠNG HỒNG
G TÂM
Niên khóa
k

: 2010 - 2014

1
Tháng 1/2014


O DỤC VÀ
À ĐÀO TẠO
O
BỘ GIÁO
ỜNG ĐẠI HỌC

H
NÔN
NG LÂM TH
HÀNH PH
HỐ HỒ CH
HÍ MINH
TRƯỜ
BỘ
Ộ MÔN CÔ
ÔNG NGH
HỆ SINH HỌC
H

KHÓA
K
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆ
ỆP
PHÁT HIỆN
H
VÀ
À ĐỊNH LƯỢNG
L
G HBV (H
Hepatitis B Virus))
BẰNG KỸ THU
UẬT REA
AL-TIM

ME PCR

Hướng dẫ
ẫn khoa họọc:

Sinh viên thực hiện:
h

TS. HUỲ
ỲNH VĂN BIẾT
B

TRƯ
ƯƠNG HỒN
NG TÂM

ThS. NGÔ
Ô ĐẶNG QUỐC
Q
ĐỊN
NH

T
Tháng
1/2014


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ
Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã

truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường.
Với tất cả lòng kính trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Huỳnh Văn Biết
và thầy Ngô Đặng Quốc Định đã hết lòng dạy dỗ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực
hiện đề tài và hoàn thành tốt khóa luận. Em xin cảm ơn thầy Định đã nhiệt tình giúp đỡ và
cho phép em làm xét nghiệm cho các bệnh nhân trong nghiên cứu của em.
Em xin chân thành cảm ơn cô Lộc Thị Khánh Dung, anh Nguyễn Anh Tuấnvà các anh
chị trong phòng Vi Sinh đã hết lòng hướng dẫn em, truyền dạy cho em những kinh
nghiệm quý báu và những kiến thức chuyên ngành và các kỹ thuật cơ bản trong xét
nghiệm vi sinh.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc bệnh viện Thủ Đức đã cho phép và tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tạibệnh viện.
Chân thành cảm ơn cô Tôn Bảo Linh và thầy Võ Khánh Hưng đã nhiệt tình giúp đỡ
chúng em trong suốt quá trình học tập.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Nguyễn Văn Nhản, người bạn quý và là người anh
em tốt đã hết lòng giúp đỡ tôi trong việc học cũng như san sẻ những buồn vui trong cuộc
sống. Cám ơn Đỗ Khắc Sáng, Lê Thị Ân và Lê Hoàng Thái đã hết lòng giúp đỡ tôi vượt
qua những khó khăn trong khoảng thời gian thực hiện đề tài. Cám ơn các bạn bè thân yêu
của lớp DH10SH đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ và người thân luôn là chỗ dựa vững chắc
về tinh thần và vật chất cho con.

i


TÓM TẮT
Bệnh viêm gan B do virus HBV(Hepatitis B virus) là bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm và phổ biến. Phát hiện và định lượng virusđóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán
và theo dõi tình trạng nhiễm bệnh cũng như đánh giá hiệu quả điều trị.
Đề tài với mục đích “Phát hiện và định lượng HBV-DNA bằng kỹ thuật real-time
PCR” để đánh giá tỷ lệ bệnh nhân dương tính HBsAg thực sự có mang HBV-DNA trong

máu (nhóm nhiễm virus cấp tính) và so sánh kết quả định lượng với xét nghiệm phát hiện
HBeAg (nhóm bệnh nhân mãn tính).
Đề tài được thực hiện trên 200 bệnh nhân, trong đó có 69 bệnh nhân nhiễm HBV
cấp tính có kết quả xét nghiệm dương tính với HBsAg và 131 bệnh nhân viêm gan B mãn
tính đã được xét nghiệm phát hiện HBeAg. DNA từ mẫu huyết thanh được ly trích bằng
phương pháp Boom. Phát hện HBV-DNA bằng real-time PCR sử dụng probe đánh dấu
huỳnh quang FAM, phát hiện mẫu chứng nội được ly trích cùng với mẫu bằng probe đánh
dấu huỳnh quang HEX. Định lượng nồng độ HBV-DNA nhờ 3 nồng độ chuẩn 100.000,
10.000 và 1.000 IU/5µl.
Trong 200 bệnh nhân, tỷ lệ nam nhiễm HBV-DNA khoảng 64,41%và tỷ lệ này ở
nữ khoảng 45,12%. Trong số 69 bệnh nhân nhóm bệnh nhân nhiễm HBV cấp tính, có
khoảng 65,22% trường hợp dương tính với HBV-DNA. Ở nhóm bệnh nhân viêm gan B
mãn tính, phát hiện 45,04% trường hợp dương tính với cả HBV-DNA và HBeAg; khoảng
11,45% trường hợp dương tính với HBeAg nhưng âm tính với HBV-DNA; 6,87% trường
hợp âm tính với HBeAg và dương tính với HBV-DNA; 36,64% trường hợp âm tính với
cả hai loại xét nghiệm.
Kết quả khảo sát cho thấy tình trạng HBsAg không nhất thiết phản ánh mức độ
virus hoàn chỉnh trong máu. Kỹ thuật real-time PCR có độ nhạy cao giúp phát hiện các
trường hợp bệnh nhân âm tính với HBeAg nhưng lại mang HBV-DNA trong máu. Tỷ lệ
nhiễm HBV có liên quan tới giới tính, nam giới có nguy cơ nhiễm virus cao hơn nữ giới.

ii


SUMMARY
Hepatitis B caused by HBV (Hepatitis B virus) is an infectious disease which is very
common and dangerous. Detection and quantification of virus plays an important role in
the diagnosis and monitoring of disease status and treatment efficacy evaluation.
The study was focused to quantitate HBV-DNA by Real-time PCR method to
evaluate patient rate whose HBsAg positive were really carrying HBV-DNA in blood

(acute hepatitis B virus infection group) and to compare thequantitative results with
HBeAg test(chronic Hepatitis B group).
The study was experimented on 200 serum samples. In there, 69 serum samples of
Hepatitis group of patients (all HBsAg positive), 131serum samples fromChronic
Hepatitis B group (all tested HBeAg). DNA from serum samples were extracted by Boom
method.Serum HBV-DNA levels were quantified using a FAM dye-labeled TaqMan
probe to detect HBV-DNA, using HEX dye-labeled TaqMan probe to detect Internal
Controls which wereparallel extracted with samples. The HBV-DNA concentration was
quantitated by 3 quantitation standard 100.000, 10.000 và 1.000 IU/5µl.
Amongst 200 patients, 64.41% (76/118)of male were positive for HBV-DNA and
this rate was higher than female 45.12% (37/82). In 69 patients who was positive HBsAg,
65.22% (45/69) of cases positived HBV-DNA. In 131 patients with chronic hepatitis B,
59/131 (45.04%) of samples were positive with both HBeAg and HBV-DNA,
whereas,15/131 (11.45%) of samples were positive for HBeAg and negative for HBVDNA, 9/131 (6.87%) were negative by HBeAg and positive, 48/131 (36.64%) were
negative for the both tests.
Thus, there were 65.22% of patients whose HBV-DNA positivewere real carried
HBV-DNA in blood. HBsAg status did not necessarily reflect HBV-DNA level in the
serum. The risk of hepatitis B infection was greater in males than females patients. The
results of the study showed thatTaqMan probe based real time PCR assays could offer
quick, sensitive and accurate results for quantifying HBV-DNA in serum samples.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN....................................................................................................................... i 
TÓM TẮT............................................................................................................................ ii 
SUMMARY........................................................................................................................ iii 
MỤC LỤC .......................................................................................................................... iv 

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................ vi 
DANH SÁCH CÁC BẢNG .............................................................................................. vii 
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................... viii 
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 
1.2. Yêu cầu...................................................................................................................... 2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3 
2.1. Sơ lược về virus viêm gan B ..................................................................................... 3 
2.1.1. Lịch sử phát hiện virus viêm gan B .................................................................... 3 
2.1.2. Cấu trúc của virus viêm gan B............................................................................ 3 
2.1.3. Các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan B....................................................... 6 
2.1.4. Chu kỳ sao chép của virus HBV ......................................................................... 8 
2.2. Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán viêm gan siêu vi B .............................. 8 
2.4.1. Chẩn đoán huyết học .......................................................................................... 8 
2.4.2. Chẩn đoán huyết thanh học................................................................................. 8 
2.3. Chẩn đoán sinh học phân tử ...................................................................................... 9 
2.3.1. Định lượng HBV-DNA thông qua phản ứng lai trực tiếp acid nucleic .............. 9 
2.3.2. Định lượng dựa trên phản ứng PCR ................................................................. 11 
2.4. Kỹ thuật Real-time PCR ......................................................................................... 12 
2.4.1. Nguyên tắc và một số lý thuyết cơ bản............................................................. 12 
2.4.2. Lịch sử real-time PCR ...................................................................................... 13 
2.4.3. Thiết bị real-time PCR ...................................................................................... 13 
2.5. Phân loại phản ứng real-time PCR .......................................................................... 13 
2.5.1. Nhóm chất phát chuỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA .................................... 13 
2.5.2. Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang .............................. 14 
2.5.3. Real-time PCR sử dụng primer làm chất phát huỳnh quang ............................ 16 
2.6. Ưu điểm và giới hạn của kỹ thuật real-time PCR ................................................... 17 
2.7. Ứng dụng của phương pháp real-time PCR ............................................................ 17 
2.7.1. Định lượng virus ............................................................................................... 17 
2.7.2. Phát hiện đột biến ............................................................................................. 18 

2.7.3. Nghiên cứu biểu hiện gen ................................................................................. 18 
2.7.4. Phát hiện GMO ................................................................................................. 18 
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................................... 19 
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................................... 19 
3.2. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................. 19 
3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 19 
3.3.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 19 
iv


3.3.2. Thiết bị và Dụng cụ .......................................................................................... 21 
3.4. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................... 21 
3.4.1. Chuẩn bị mẫu thử.............................................................................................. 21 
3.4.2. Phương pháp ly trích DNA ............................................................................... 22 
3.4.3. Phương pháp real-time PCR phát hiện và định lượng HBV-DNA .................. 24 
3.4.5. Đọc và nhận xét kết quả.................................................................................... 25 
3.4.6. Khảo sát tính lặp lại của phản ứng real-time PCR ........................................... 27 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 28 
4.1. Phân tích kết quả định lượng HBV bằng real-time PCR ........................................ 28 
4.1.1. Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm và độ nhạy của thử nghiệm ............................. 28 
4.1.2. Kiểm tra độ nhạy của master mix và độ chính xác của thao tác pipet ............. 28 
4.1.3. Biểu đồ đường chuẩn cho real-time PCR định lượng ...................................... 31 
4.1.4. Xác định các mẫu dương tính HBV- DNA ...................................................... 32 
4.1.5. Xác định mẫu âm tính ....................................................................................... 33 
4.1.6. Xác định mẫu dưới ngưỡng phát hiện .............................................................. 34 
4.2. Kiểm tra độ lặp lại của các chuẩn ........................................................................... 35 
4.3. Kết quả Real-time PCR phát hiện và định lượng HBV-DNA ................................ 36 
4.3.1. Ảnh hưởng của giới tính đến tỷ lệ bệnh nhân mang HBV-DNA trong máu .... 36 
4.3.2. Ảnh hưởng của giới tính tới nồng độ HBV-DNA ............................................ 37 
4.3.3. So sánh kết quả real-time PCR với chỉ số miễn dịch HBsAg .......................... 38 

4.3.4. Kết quả real-time PCR đối chiếu với các chỉ số miễn dịch .............................. 39 
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 41 
5.1. Kết luận ................................................................................................................... 41 
5.2. Đề nghị .................................................................................................................... 41 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 42 
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 44 

v


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
AP: ankaline phosphastase
AV-HRP: avidin conjugated horseradish peroxidase
bDNA : branch DNA
cccDNA: covalently closed circular DNA
DNP: dinitrophenyl
ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay
FAM : 6-carboxy fluorescein
FRET : fluorescence resonance energy transfer
HEX: hexachloro-carbonyl-fluorescein
IC: internal control
LUX : light upon eXtension
MGB: minor groove binders
ORF : open reading frame
PHC : primary hepatocellular carcinoma
ROX : 6-carboxy-X-rhodamine
TMA : transcription-mediated amplification
TMB : 3,5,3’,5’-tetramethylbenxidine
SSCP : single-strand conformation polymorphism
RFLP : restriction fragment-length polymorphism

EIA : enzyme Immuno Assay
RIA : radio Immuno Assay

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Nguyên tắc thử nghiệm miễn dịch phát hiện các dấu ấn của HBV ................. 9
Bảng 3.1 Thành phần bộ kit NKHBVDNA chuẩn ........................................................ 20
Bảng 3.2 Thành phần bộ kit NKDNAPREP-BOOM ...................................................... 20
Bảng 3.3 Giá trị Ct chấp nhận được cho các chuẩn ...................................................... 26
Bảng 4.1 Giá trị Ct và cách biệt Ct qua các lần thực hiện real-time PCR..................... 29
Bảng 4.2 Độ chính xác của thao tác pipet qua các lần thử nghiệm .............................. 29
Bảng 4.3 Bảng độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm ......................................................... 35
Bảng 4.4 Kết quả định lượng HBV bằng kỹ thuật real-time PCR ................................ 36
Bảng 4.5 Nồng độ HBV-DNA dựa theo giới tính ......................................................... 37
Bảng 4.6 So sánh kết quả real-time PCR với test HBsAg............................................. 38
Bảng 4.7 So sánh kết quả real-time PCR với xét nghiệm phát hiện HBeAg ................ 39

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cấu tạo của một HBV hoàn chỉnh .................................................................... 4
Hình 2.2 Các dạng HBV trong máu người nhiễm bệnh .................................................. 5
Hình 2.3 Tổ chức bộ gen của HBV ................................................................................. 6
Hình 2.4 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR ............... 15
Hình 3.1 Quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp BOOM .................................. 35
Hình 4.1 Biểu đồ khuếch đại của các chuẩn và chứng âm ............................................ 29
Hình 4.2 Đường chuẩn cho real-time PCR định lượng HBV-DNA ............................. 31

Hình 4.3 Biểu đồ khuếch đại của mẫu bệnh phẩm dương tính HBV-DNA ................. 32
Hình 4.4 Biểu đồ tương quang giữa số chu kỳ và tín hiệu huỳnh quang nền ............... 33
Hình 4.5 Biểu đồ khuếch đại mẫu âm tính HBV-DNA................................................. 34
Hình 4.6 Kết quả real-time PCR mẫu âm tính HBV-DNA ........................................ 34
Hình 4.7 Biểu đồ khuếch đại mẫu HBV-DNA dưới ngưỡng phát hiện ........................ 35
Hình 4.8 Kết quả real-time PCR mẫu HBV-DNA dưới ngưỡng phát hiện................... 35

viii


Chương 1MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh viêm gan B là hậu quả của tình trạng nhiễm trùng do virus viêm gan B
(Hepatitis B virus) gây ra. Tỉ lệ người nhiễm HBV cao gấp khoảng 50-100 lần so với
nhiễm HIV. Theo thống kê của một số nghiên cứu, trên toàn thế giới có khoảng 2 tỷ
người đã từng nhiễm HBV và có khoảng 400 – 800 triệu người chuyển sang giai đoạn
mãn tính. Những biến chứng của viêm gan B được xếp vào 1 trong 10 nguyên nhân gây tử
vong hàng đầu trên toàn thể giới. Đây thực sự là một vấn đề lớn cho sức khoẻ cộng đồng
do các kết quả nghiên cứu cho thấy sự liên quan rõ rệt giữa tình trạng mang kháng nguyên
virus B trong máu với xơ gan và ung thư gan (Ghanim và ctv, 2012).
Có nhiều phương pháp được sử dụng để chẩn đoán HBV, các phương pháp này chủ
yếu dựa trên hệ thống xét nghiệm huyết thanh học và sinh học phân tử (Susser, 2009).
Các phương pháp huyết thanh học dựa trên các dấu ấn như HBsAg, HBsAb, HBcAb,
HBeAg chỉ có thể chỉ ra các giai đoạn của nhiễm trùng, mức độ lây nhiễm cũng như tình
trạng miễn dịch của cơ thể. Tuy nhiên, độ tin cậy của các xét nghiệm này có thể bị ảnh
hưởng bởi đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Ngoài ra, xét nghiệm HBeAg không thể phát
hiện sự hiện diện hay vắng mặt của virus trong máu trong những trường hợp virus bị đột
biến pre-core hoặc promoter core (Ho và Chan, 2000). Do đó, một công cụ chẩn đoán đặc
hiệu,có độ nhạy cao, phát hiện trực tiếp virus trong máu là cần thiết.
Trong những năm gần đây, việc đánh giá nồng độ HBV-DNA được xem là phương

pháp đáng tin cậy để đánh giá hiệu quả của các phương pháp điều trị, phát hiện khảnăng
kháng thuốc ở virus và phát hiện quá trình tái nhiễm sau khi kết thúc đều trị. Nồng độ
HBV-DNA trong máu phản ánh mức độ sao chép của virus.Chính vì vậy, định lượng
nồng độ HBV trong máu đóng một vai trò quan trọng trong theo dõi và đánh giá hiệu quả
điều trị (Ghanim, 2012). Hiện nay, có rất nhiều phương pháp cho phép xác định hàm
lượng DNA của virus như phương pháp dựa trên kỹ thuật lai nucleic acid, phương pháp
PCR cạnh tranh...Mặc dù các phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR có độnhạy cao. Tuy
nhiên kỹ thuật rất phức tạp, dễ bị ngoại nhiễm và kết quả thu nhận không ổn định... Chính
1


vì những yếu tố trên đã cản trở khả năng ứng dụng của các kỹ thuật này trong chẩn đoán
thường quy.
Trước thực tế đó, đề tài “Phát hiện và định lượng HBV (Hepatitis B virus) bằng kỹ
thuật real-time PCR”nhằm mục tiêu định lượng HBV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR
ở những bệnh nhân viêm gan B cấp tính và mãn tính đến khám và điều trị tại bệnh viện
quận Thủ Đức.
1.2. Yêu cầu
-

Ly trích DNA mẫu bệnh phẩm, đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch cao để chuẩn
bị cho phản ứng real-time PCR.

-

Nắm rõ quy trình kỹ thuật real-time PCR định lượng virus HBV.

-

Xác định tình hình nhiễm virus viêm gan B và tìm hiểu một số yếu tố liên quan đến

tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B ở những bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện
quận Thủ Đức.

-

Tìm hiểu tỷ lệ bệnh nhân dương tính với HBsAg thực sự có mang HBV-DNA trong
máu.

-

Với các kết quả phát hiện và định lượng, tiến hành đánh giá và so sánh với kết quả
xét nghiệm HBeAg trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mãn tính.

2


Chương2TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Sơ lược về virus viêm gan B
2.1.1. Lịch sử phát hiện virus viêm gan B
Năm 1965, Baruch Blumberg và ctvkhi nghiên cứu về các loại huyết thanh người
bình thường đã tìm thấy một loại kháng thể ở bệnh nhân bị bệnh máu khó đông được
truyền máu nhiều lần. Kháng thể này có thể phản ứng với một loại kháng nguyên trong
mẫu huyết thanh của một thổ dân châu Úc. Sau đó kháng nguyên trên được tìm thấy trong
huyết thanh của những bệnh nhân bị viêm gan. Vì phát hiện ra kháng nguyên trong huyết
thanh của thổ dân, nên ban đầunó được gọi là kháng nguyên Úc châu (Au). Ngày nay,
kháng nguyên Au được xác định là lớp vỏ protein của virus viêm gan B và được đổi tên
thành kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg – Hepatitis B surface Antigen).
Năm 1976, Blumberg được trao giải Nobel cho phát hiện nguyên nhân gây ra bệnh viêm
gan B (Lok, 2011).
Năm 1973, Dane phát hiện ra các hạt virus trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm virus

viêm gan B. Ông đã mô tả hình dạng hoàn chỉnh của hạt virus viêm gan B mà sau này
người ta gọi là hạt tử Dane.
Nhiễm HBV là vấn đề y tế mang tính chất toàn cầu. Theo thống kê của WHO, 2 tỷ
người trên toàn thế giới đã bị nhiễm bệnh và 400 triệu người mắc bệnh chuyển sang giai
đoạn mãn tính. Mặc dù hầu hết những người bị nhiễm viêm gan B mãn tính sẽ không phát
triển các biến chứng, nhưng vẫn có khoảng 15 – 40% trường hợp sẽ và khoảng 500.000
người tử vong do các biến chứng mỗi năm (Phạm Hùng Vân, 2009).
2.1.2.Cấu trúc củavirus viêm gan B
HBV thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại virus hướng gan (Hepatotropic), có cấu
trúc di truyền là DNA mạch kép không hoàn toàn. Đây là tác nhân chủ yếu gây viêm gan
và ung thư gan, được tìm thấy trong tế bào gan và trong huyết thanh của người bị nhiễm
bệnh(Carter và Saunders, 2007).

3


2.1.2.1 Cấu trúcc của virus hoàn chỉnh
H
HBV
hoàn ch
hỉnh(HBV virion) có dạng
d
hình cầu,
c đường kính
k
khoảnng 42 nm, còòn được
gọi làà hạt tử Daane. HBV có
c cấu trúc 2 lần vỏ đồng
đ
tâm gồm

g
vỏ protein bao quuanh lõi
capsidd, bên trong
g capsid là DNA
D
và DN
NA polymeerase(Carterr vàSaunderrs, 2007).
Lớp vỏ proteein có đườnng kính khooảng 7 nm, được tạo thhành từ cácc kháng nguuyên bề
H
glyccoprotein và lipid. Khááng nguyênn bề mặt gồm
m protein bề
b mặt lớn (Large
(
–
mặt HBsAg,
L), prrotein bề mặt trung bìnnh (Middle – M) và prrotein bề mặt
m nhỏ (Sm
mall – S) (C
Carter và
Saundders, 2007)..
N
Nucleocapsid
d có đườngg kính khoảnng 27 nm chứa
c
một phhân tử DNA
A và hai loạại kháng
nguyêên là HBcA
Ag và HbeA
Ag(Kuntz và
v Kuntz, 20006).Vỏ caapsid có cấuu trúc đối xứng

x
20
mặt, có
c nhiều lỗ nhỏ và có nhiều
n
gai nggắn nhô ra. Vỏ capsid của HBV được
đ
cấu tạo từ các
chất nhị
n trùng củ
ủa protein lõi,
l phần lớ
ớn ở dạng xoắn
x
α. Đầuu tận cùng C của proteein C có
tính base
b
cao, do
o sự hiện diệện của một số lượng lớ
ớn các arginnine, khu vực
v này liênn kết với
bộ genn của virus((Carter và Saunders,
S
2
2007).
B cạnh nhữ
Bên
ững hạt viruus hoàn chỉỉnh (virion)) có khả nănng truyền nhhiễm thì troong máu
bệnh nhân
n

còn tồ
ồn tại một lư
ượng lớn cáác hạt viruss không truyyền nhiễm được
đ
giải phóng
p
từ
nhữngg tế bào gan
n bị nhiễm bệnh. Nhữ
ững hạt nàyy được cấu tạo từ lipidd và proteinn vỏ của
virus, nhưng chú
úng không chứa
c
nucleoocapsid. Cáác hạt khôngg truyền nhhiễm tồn tạii ở dạng
ỏ có đườngg kính khoảản 20nm vàà các hạt dạạng khối cũũng có đườ
ờng kính
hạt hìình cầu nhỏ
20nm
m nhưng chiềều dài có thhể thay đổi lên
l tới 200nnm (Carter và Saunderrs, 2007).

H
Hình
2.2 Cáác dạng HB
BV trong mááu người nhhiễm bệnh (Carter
(
và Saaunders, 20007).
4



Tất cả cáchạt virus (gồm hạt truyền nhiễm và hạt không truyền nhiễm) tồn tại trong
máu với số lượng rất lớn trong gan. Những hạt virus không truyền nhiễm, đặc biệt là các
hạt hình cầu chiếm phần lớn so với các virus hoàn chỉnh. Cho đến nay, khoa học vẫn chưa
thể lý giải hiện tượng này. Nhiều giả thuyết cho rằng các hạt virus không hoàn chỉnh đóng
vai trò là mồi nhử các kháng thể, bằng cách này virus hoàn chỉnh sẽ được bảo vệ khỏi hệ
thống miễn dịch của vật chủ (Carter và Saunders, 2007).
2.1.2.2.Bộ gen của HBV
Bộ gen của virus được cấu thành từ2 sợi DNA, trong đó có một sợi hoàn chỉnh được
gọi là sợi âm và một sợikhông hoàn chỉnh được gọi là sợi dương liên kết với phân tử
DNA polymerase. Vì vậy, DNA của HBV là một phần sợi đơn và một phần sợi kép, một
trình tự ngắn là sợi ba, đây là kết quả của một trình tự bổ sung ở đầu 5’, và điều này dẫn
đến hệ quả là DNA của HBV có dạng hình tròn(Carter vàSaunders, 2007).
Với kích thước 3,2kb bộ gen của HBV được xem là rất nhỏ. Bộ gen của virus gồm 4
khung đọc mở (ORF), từ đó có 7 protein được dịch mã. Bộ gen chứa hai chuỗi mã có kích
thước 10 hoặc 11 base đượcgọi là lặp lại trực tiếp DR1 ở đầu 5’ của sợi âm và DR2 ở đầu
5’ của chuỗi dương, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp các chuỗi
DNA âm và dương.
Gen S mã hóa kháng nguyên bề mặt HBsAg. Khung đọc mở của gen S gồm 2
promoter và 3 codon bắt đầu được gọi là preS1, preS2 và S. Vùng S mã hóa cho protein
bề mặt nhỏ chứa 226 amino acid. Vùng S và preS mã hóa các protein bề mặt trung bình
chứa 281 amino acid. Để mã hóa protein bề mặt lớn, virus sử dụng cả 3 vùng S, preS1 và
preS2 dịch mã một đoạn 389 – 400 amino acid (Susser và ctv, 2009).
Gen C (core) mã hóa các polypeptide ở phần lõi của virus, gồm kháng nguyên lõi là
HBcAg có trọng lượng phân tử khoảng 21 kD. Gen C có một trình tự ngắn là pre C
(precore) mã hóa HBeAg, có trọng lượng phân tử là 17,5 kD (Lê Thúy Quyên, 1999).
Khung đọc mở P (ORF P) chiếm khoảng 80% bộ gen gối chồng lên khung đọc mở C
và X và gối chồng lên toàn bộ khung đọc mở S. Gen P mã hóa một polypeptide cơ bản,
trọng lượng phân tử khoảng 90kD, có hoạt tính polymerase và ribonuclease H.

5



Gen X là gencó kích thước nhỏ nhất, nó mã hóa một polypepetid gồm 154 amino
acid. Có chức năng điều hòa phiên mã virus (Lê Thúy Quyên, 1999).
Bộ gen của virus thuộc họ Hepadnaviridae có cấu trúc khác thường, bao gồm các gen
gối chồng lên nhau ở những vùng mã hóa. Những trình tự giống nhau mã hóa nhiều
protein khác nhau và toàn bộ các trình tự đều mã hóa protein. Vì vậy, sự cắt đứt phân tử
DNA vòng tại bất kỳ vị trí nào cũng sẽ khiến cho phân tử DNA bị bất hoạt (Lê Thúy
Quyên, 1999).

Hình 2.3Tổ chức bộ gen của HBV (Warner và Locarnini, 2011)
2.1.3. Các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan B
2.1.3.1. Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg)và kháng thể HBsAb
HBsAg (Hepatitis B surface Antigen) là kháng nguyên bề mặt của HBV và cũng
chính là lớp vỏ protein bao quanh lõi capsid. HBsAg hiện diện trong huyết thanh khoảng
1 – 10 tuần sau khi cơ thể tiếp xúc với mầm bệnh, trước khi bắt đầu viêm gan và tăng
lượng men gan. HBsAg thường biến mất sau 4 – 6 tháng ở những bệnh nhân phục hồi sau

6


viêm gan cấp tính. Sự tồn tại dai dẳng của HBsAg hơn 6 tháng là dấu hiệu của nhiễm
HBV mãn tính (Petersen, 2012).
Theo sau sự biến mất của HBsAg là sự xuất hiện của HBsAb (Hepatitis B surface
Antibody). HBsAb là kháng thể chống HBsAg. Trong hầu hết các trường hợp, HBsAb tồn
tại trong cơ thể và tạo khả năng miễn dịch lâu dài. Ngoài ra, có một số trường hợp kháng
thể không thể vô hiệu hóa các virion lưu hành trong máu nên khi xét nghiệm bằng phương
pháp miễn dịch đều dương tính với HBsAg và HBsAb. Những người này được xem là
người lành mang virus (Petersen, 2012).
2.1.3.2.Kháng nguyên lõi HBcAg và kháng thể HBcAb

Kháng nguyên lõi (HBcAg) của virus viêm gan B là kháng nguyên nội bào, chỉ tồn tại
trong tế bào gan bị nhiễm bệnh. Nó không được phát hiện trong huyết thanh (Petersen,
2012).
Ngược lại, HBcAb (Hepatitis B Core Antibody) lạicó thể đượcphát hiệntrong suốt
quá trìnhnhiễm HBVtronghuyết thanh.IgM và IgG là hai dạng của HBcAb. Trong viêm
gan cấp, HBcAb chủ yếu ở dạng IgM, đây là dấu ấn quan trọng của nhiễm HBV trong
thời kỳ cửa sổ, giữagiai đoạn biến mất củaHBsAgvàxuất hiện HBsAb. IgG xuất hiện
muộn hơn nhưng tồn tại lâu hơn (Petersen, 2012).
2.1.3.3.Kháng nguyên tiết HbeAb và kháng thể HBeAb
Kháng nguyên e (Hepatitis B e antigen) là protein tiết, được biến đổi từ protein tiền
lõi (precore). Nó được xem như là dấu hiệu của HBV và lây nhiễm. Việc phát
hiệnHbeAgthườngcó liên quan đếnnồng độ cao HBV-DNA. Vì vậy, sự chuyển đổi huyết
thanh từ HBeAg sang HBeAb (Hepatitis B e Antibody) thường chỉ ra sự thay đổi từ nồng
độ cao xuống nồng độ thấp của các hạt virus hoàn chỉnh. Tuy nhiên, trong một số đột biến
HBeAg (đột biến promoterPrecore/core) thì việc phát hiện HBeAb không thể phân biệt
được tình trạng nhiễm HBV với các hạt virus hoàn chỉnh(Petersen, 2012).
2.1.3.4. HBV-DNA
HBV-DNA chỉ thấy trong huyết thanh có chứa các hạt virus hoàn chỉnh, phát hiện
HBV-DNA là bằng chứng trực tiếp về sự hiện diện HBV trong máu. Định lượng HBVDNA cho phép đánh giá mức độ nhiễm virus viêm gan B(Petersen, 2012).
7


2.1.4.Chu kỳ sao chép của virus HBV
Sau khi xâm nhiễm, HBV gắn đặc hiệu lên một thụ thể trên tế bào gan. Sau đó virus
cởi bỏ lớp vỏ protein, nucleocapsid bên trong di chuyển vào vùng nhân của tế bào gan và
giải phóng bộ gen, tại đây bộ gen mạch đôi không hoàn toàn của virus sẽ chuyển hóa
thành dạng cccDNA (covalently closed circular DNA). Các cccDNA này đóng vai trò làm
khuôn mẫu để phiên mã các mRNA của virus. Các mRNA được dùng để mã hóa các
DNA-polymerase, protein lõi, protein bề mặt, protein X và protein tiền lõi (pre-C). Trong
quá trình dịch mã, DNA polymerase liên kết với các pgRNA. Sau đó, các protein lõi liên

kết với DNA polymerase để tổng hợp nucleocapsid. Quá trình phiên mã ngược diễn ra
bên trong các nucleocapsid để tạo thành bộ genmạch đôi không hoàn toàn. Nucleocapsid
tương tác với protein bề mặt bên trong màng tế bào dẫn đến sự hình thành các thể đa thủy
bào(multivescular bodies - MVB) và cuối cùng hình thành các virion. Các protein bề mặt
cũng có thể nảy chồi ở mạng lưới nội chất và bộ máy Golgi khi không có sự hiện của các
nucleocapsid để hình thành vỏ ngoài của virus tương lai. Các nucleocapsid cũng có thể
quay trở lại nhân và giải phóng bộ gen và lại chuyển sang dạng cccDNA để lập lại chu
trình sao chép của mình. Các protein tiền lõi cũng được sửa đổi và bài tiết qua mạng lưới
nội chất (RE) để tạo thành HBeAg. Protein X là một protein phụ không tham gia vào cấu
trúc HBV(Warner và Locarnini, 2011).
2.2.Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán viêm gan siêu vi B
2.4.1.Chẩn đoán huyết học
Phương pháp chẩn đoán huyết học dựa vào sự biến động các thành phần của máu khi
bị nhiễm virus.Những bệnh nhân bị viêm gan thì bạch cầu đa nhân giảm, lympho bào tăng
ở thời kỳ trước vàng da và trở về bình thường khi vàng da xuất hiện, trường hợp ít gặp
hơn là vòng đời hồng cầu giảm, thiếu máu do suy tủy, tuy nhiên các giá trị huyết học
thường không mang tính đặc hiệu.
2.4.2.Chẩn đoán huyết thanh học
Đa số các thử nghiệm miễn dịch phát hiện các chỉ số miễn dịch đặc hiệu HBV đều
dựa trên thử nghiệm miễn dịch enzyme (EIA) và miễn dịch phóng xạ (RIA). Cả hai thử
nghiệm này đều thực hiện theo nguyên tắc sandwich hay nguyên tắc cạnh tranh
8


(competition). Các thành phần tham gia trong thử nghiệm gồm một hệ thống giá mang là
các giếng thử nghiệm hay hạt nhựa talex có gắn sẵn kháng nguyên hoặc kháng thể tùy
mục đích tìm. Các chỉ điểm huyết thanh nếu có trong mẫu huyết thanh sẽ liên kết với các
đánh dấu enzyme hay đồng vị phóng xạ. Đây là các liên kết đặc hiệu kháng nguyên –
kháng thể, và các liên kết này có thể được phát hiện bằng các quang phổ kế (thử nghiệm
EIA) hoặc máy đo chất đồng vị phóng xạ (thử nghiệm EIA) (Lê Thúy Quyên, 1999).

Bảng 2.1 Tóm tắt các nguyên tắc thử nghiệm miễn dịch phát hiện các dấu ấn của HBV
Nguyên tắc

Giá mang

Chất gắn

Cộng hợp

HBsAg

Sandwich

Hạt, giếng

HBsAb

HBsAb

HBeAg

Sandwich

Hạt, giếng

HBeAb

HBeAb

HBsAb


Sandwich

Hạt, giếng

HBsAg

HBsAg

HBcAb IgM

Sandwich

Hạt, giếng

Anti-IgM

HBcAb

HBcAb

Cạnh tranh

Hạt, giếng

HBcAg

HBcAb

HBeAb


Cạnh tranh

Hạt, giếng

HBeAb

HBeAb

2.3.Chẩn đoán sinh học phân tử
2.3.1. Định lượng HBV-DNA thông qua phản ứng lai trực tiếp acid nucleic
2.3.1.1. Phương pháp lai thấm điểm
Phương pháp lai thấm điểm (Dot blot hybridization) cho phép bán định lượng
HBV-DNA trực tiếp trong mẫu thử mà không cần trải qua giai đoạn khuếch đại. Đây là
phương pháp được ứng dụng trong những năm đầu 1890 để phát hiện HBV-DNA trong
huyết thanh (Ho và Chan, 2000).
Trước tiên, DNA của HBV trong mẫu thử được biến tính để tạo thành các sợi đơn
dưới tác dụng của dung dịch kiềm và nhiệt độ cao. Sau đó mẫu biến tính được cố địnhtrên
một màng nilon tạo thành các điểm (dot) và lai với probe có đánh dấu phóng xạ 32P,probe
sẽ bắt cặp đặc hiệu với HBV-DNA. Màng lai được rữa sạch và ủ với Rnase hai lần. Tín
hiệu lai được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiographed). Kích thước và
cường độ của các chấm lai (hybridized dot) được so sánh với các chuẩn đã biết trước
nồng độ, từ đó cho phép suy ra lượng HBV-DNA trong mẫu thử. Phương pháp Dot
blotcần 4 - 7 ngày để thực hiện(Valentine-Thon, 1995). Bên cạnh việc sử dụng các probe
9


đáng dấu phóng xạ,có thể sử dụng alkaline phosphatase, digoxigenin, FITC và biotin, thời
gian thực hiện sẽ được rút ngắn xuống còn 2-3 ngày (Ho và Chan, 2000).
2.3.1.2. Phương pháp lai phân tử trên pha lỏng

Lai phân tử trên pha lỏng (Liquid-phase molecular hybridization assay) là phương
pháp laiDNA bộ gen HBVvớiprobeđánh dấu phóng xạ 125Itrongdung dịch. HBV-DNA sợi
đôi nếu có trong huyết thanh sẽ bị biến tính thành các sợi đơn DNA.Các sợi đơn DNA
được lai với một probe đặc hiệu đánh dấu phóng xạ
giờ.Sản phẩm lai giữa HBV-DNA và

125

125

I trong dung dịch khoảng 18

I-DNA probe được tách bằng cột Sepharose.Các

phân tử lai được định lượng bằng máy đếm hạtgamma. Phóng xạ trong mỗi mẫu được so
sánh với các mẫu chứng dương và mẫu chứng âm (Zeuzem, 2004).
2.3.1.3.Khuếch đại tín hiệu bởi bDNA
Kỹ thuật DNA nhánh (Branched-DNA Assay)là phương pháp phát hiệnvà định lượng
DNA dựa trên kỹ thuật lai và khuếch đại tín hiệu trên pha rắn(Ho và Chan, 2000).
HBV-DNA nếu có trong mẫu thử sẽ đượcly giải bởi các tác nhân ly giải và nhiệt. Sau
đó được lai với 2 bộ probe (target probes) khác nhau, có trình tự bổ sung với hai vùng bảo
tồn trên đoạn gen S và genC của HBV. Trong đó, có một bộ probe vừa bắt cặp bổ sung
với trình tự DNA của HBV, vừa bắt cặp với một probe tóm bắt (capture probes) đã được
cố định sẵn trên vi giếng, nhờ đó mà HBV-DNA được cố định trên giếng thử nghiệm.
Probe đích còn lại cũng bắt cặp bổ sung với trình tự DNA của HBV nhưng đầu tận cùng
của nó sẽ gắn với bDNA tổng hợp (synthetic bDNA). Các phân tử bDNA có nhiều vùng
lặp lại có khả năng bắt cặp với các probe đánh dấu bởi alkaline phosphatase. Lượng
HBV-DNA bị bắt giữ sẽ được biểu thị bởi chemiluminescence sau khi thêm cơ chất
dioxetane (Ho và Chan, 2000).
2.3.1.4. Phương pháp lai chéo dưới tác dụng của tia UV

Kỹ thuật lai chéo dưới tác dụng của tia UVsử dụng 2 loại probe tổng hợp gồm probe
tóm bắt đánh dấu biotin và probe tín hiệu đánh dấu huỳnh quang.
Mẫu được biến tính bằng các tác nhân ly giải như proteinase K, sodium dodecyl
sulfate và ủ ở nhiệt độ cao. Tiếp theo, nucleic acid có trong mẫu sẽ bị biến tính dưới tác
động của kiềm và nhiệt độ. Thêm HBV probe và thuốc thử trung hòa, HBV-DNA được
10


lai với cả hai probe. Sau đó,mẫu được chiếu xạ dưới tia UV. Sau giai đoạn chiếu xạ, các
hạt từ tính có gắn streptavidine được thêm vào để đánh bắt các phân tử lai thông qua dư
lượng biotin gắn vào probe tóm bắt. Các hạt trong vi giếng được rửa hai lần và ủ trong sự
hiện diện của “Kháng thể kháng huỳnh quang liên kết với alkaline phosphatase”và rửa 4
lần. Sau đó ủ với attophos. Huỳnh quang phát ra từ phản ứng củaattophosvớiAP đượcphát
hiệnbằng cách đocác tín hiệuhuỳnh quangvới một đầu đọcmicroplate.Nồng độ HBV-DNA
được tính toán bằng cách so sánh tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mỗi mẫu với đường
chuẩn đã biết trước nồng độ (Lai và ctv, 1999).
2.3.1.5.Phương pháp lai bắt RNA-DNA
Phương pháp lai bắt RNA-DNA (DNA–RNA Hybridization)sử dụng 2 loại kháng thể
gồm kháng thể kháng phân tử lai RNA-DNA (anti-RNA:DNA antibody) và kháng thể
kháng phân tử lai RNA-DNA đánh dấu bởi alkaline phosphatase (AP-bound antibodies).
Trước tiên, HBV-DNA trải qua giai đoạn biến tính. Sau đó, phân tử lai RNA-DNA
được tạo thành bởi phản ứng lai giữa HBV-DNA có trong huyết thanh với các RNA
probe. Sau đó, những phân tử lai này được cố định trên các vi giếng có gắn sẵn các kháng
thể kháng phân tử lai RNA-DNA. Thể lai mới này sẽ phản ứng với các kháng thể kháng
RNA-DNA thứ hai được đánh dấu với AP và tiếp tục phản ứng với có chất phát quang
qua phản ứng huỳnh quang (chemiluminescent). Ánh sáng phát ra được ghi nhận bằng
máy đo ánh sáng.Nồng độ HBV-DNA được so sánh với đường chuẩn(Zeuzem, 2004).
2.3.2. Định lượng dựa trên phản ứng PCR
2.3.2.1. PCR định tính HBV (Qualitative HBV-PCR)
PCR định tính là phương pháp có độ nhạy cảm cao để phát hiện HBV-DNA trong

máu mà không cần xác định tải lượng virus. Kết quả dương tính với PCR định tính HBV
phát hiện hầu hết các trường hợp người lành mang virus(Susser và ctv, 2009).
Trong giai đoạn biến tính DNA sợi đôi thành các sợi đơn khuôn mẫu ở 96°C.Trong
giai đoạn bắt cặp, primer bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ và 5’ của gen mục tiêu. Trong giai
đoạn kéo dài, enzyme polymerase kéo dài các primer theo nguyên tắc bổ sung với DNA
sợi khuôn mẫu tạo thành 2 sợi đôi mới. Bởi vìcả hai sợiđược sao chéptrong quá trìnhPCR,
số lượng bản sao trên một chu kỳ của gen mục tiêu tăng lên theo cấp số nhân. Sự khuếch
11


đại RNA cần phiên mã ngược thành các cDNA. Sau chu trình PCR, DNA có thể được
phát hiện bằng một số phương pháp như: điện di để tách DNA và nhuộm với
ethidiumbromide hoặc bằng cách sử dụng primer tổng hợp có gắn enzyme…. Primer đánh
dấu biotin được phát hiện bởi AV-HRP. Phân tích dựa trên sự oxy hóa cơ chất sinh màu
TMB thành AV-HRP. Hợp chất trung gian AV-HRP có khả năng hấp thụ bước sóng tối
đa 450nm (Susser và ctv, 2009).
2.3.2.2. PCR cạnh tranh định lượng
Kỹ thuật PCR cạnh tranh được sử dụng trong các xét nghiệm định lượng HBV-DNA.
Phương pháp này sử dụng cặp primer đánh dấu biotinecho phép đồng khuếch đại HBVDNA và mẫu chứng nội đã biết trước nồng độ. Sản phẩm PCR của HBV và của chứng nội
được bắt giữ bởi streptavidine và cố định dưới đáy vi giếng. Sau đó chúng được lai với
các DNP (dinitrophenyl) đặc hiệu với HBV và với chứng nội. Anti-DNP-AP sẽ gắn lên
gốc DNP của sản phẩm lai.Khi thêm cơ chất, dưới ánh sáng chiếu xạ có thể định lượng
trực tiếp HBV-DNA. Lượng bản sao DNA có thể suy luận từ chứng nội với nồng độ đã
biết trước(Susser và ctv, 2009).
2.4.Kỹ thuật Real-time PCR
2.4.1. Nguyên tắc và một số lý thuyết cơ bản
Real-time PCR là một tập hợp liên tục các tín hiệu huỳnh quang từ một hay nhiều
phản ứng PCR qua nhiều chu kỳ. Real-time PCR định lượng là việc chuyển đổi tín huỳnh
quang thu được thành một giá trị cho từng mẫu(Shipley, 2006).
Real-time PCR hoạt động dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp PCR. Tuy

nhiên, không giống như PCR thông thường thu nhận kết quả tại thời điểm cuối của phản
ứng PCR, trong real-time PCR tín hiệu huỳnh quang thu nhận được trong suốt quá trình
của phản ứng. Mẫu càng có nhiều DNA đích sẽ có nhiều tín hiệu huỳnh quang phát sáng
và chu kỳ bắt đầu ghi nhận được tín hiệu càng nhanh. Một điểm khác biệt nữa của realtime PCR so với PCR thông thường là kỹ thuật này không đòi hỏi thao tác trên gel do đó
loại bỏ hiện tượng ngoại nhiễm, gia tăng tính đặc hiệu của phản ứng real-time PCR.

12


2.4.2. Lịch sử real-time PCR
Higuchi và ctv là những người đầu tiên phân tích động học của phản ứng PCR bằng
cách xây dựng một hệ thống cho phép phát hiện các sản phẩm khuếch đại song song với
quá trình PCR. Bằng cách sử dụng chất nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr)
trong PCR và chạy phản ứng dưới tia cực tím có thể hiển thị và thu lại sự tích tụ DNA
nhờ một camera (Valasek và Repa, 2005). Mục đích cơ bản của real-time PCR là phân
biệt một cách chính xác và đo lượng trình tự DNA đích trong mẫu. Real-time PCR
khuếch đại trình tự đích trong mẫu và sau đó theo dõi tiến trình khuếch đại nhờ sử dụng
huỳnh quang. Trong quá trình khuếch đại, tín hiệu huỳnh quang nhanh chóng đạt tới một
ngưỡng tương quang với số lượng trình tự mục tiêu ban đầu.
2.4.3. Thiết bị real-time PCR
Điều kiện đầu tiên để có thể thực hiện được real-time PCR là phải có máy real-time
PCR. Cấu tạo máy gồm một buồng ủ nhiệt như PCR bình thường nhưng có thêm một thiết
bị được gọi là thiết bị real-time. Đây là thiết bị quang học có chức năng phát nguồn sóng
kích thích với bước sóng xác định lên các ống phản ứng real-time PCR và ghi nhận được
ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng bằng camera hay cảm biến quang
(Phạm Hùng Vân, 2009).Tùy theo cách phát ra nguồn sáng kích thích và cách ghi nhận
huỳnh quang phát ra mà người ta chia thiết bị real-time PCR thành 3 nhóm: nguồn laser,
iode phát sáng (Light-emitting diode – LED) hay đèn (tungsten halogen hoặc quartz
tungsten halogen). Đèn được phân vào nhóm phát sáng phổ rộng trong khi LED và laser
thuộc nhóm phát chùm sáng phổ hẹp. Vì thế, thiết bị sử dụng đèn cần thêm một bộ lọc để

loại những bước sóng không thích hợp trước khi chiếu tới mẫu và trước khi được đọc bởi
camera hay cảm biến quang(Valasek và Repa, 2005).
2.5. Phân loại phản ứng real-time PCR
2.5.1.Nhóm chất phát chuỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA
Màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA là một loại màu huỳnh quang có ái lựcrất
cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA và ái lực này là do khả năng chèn của màuvào
giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khinhận
được nguồn sáng kích thích (Phạm Hùng Vân, 2009). Hóa chất dùng trong phương pháp
13


này có thể là BEBO, YOYO-1, TOTO-1 và SYBR Green I. Trong đó, SYBR Green I là
chất nhuộm được sử dụng phổ biến nhất(Valasek và Repa, 2005).
SYBR Green I hầu như không phát huỳnh quang khi ở dạng tự do trong dung dịch,
nhưng lượng huỳnh quang phát ra sẽ tăng lên rất nhiều lần khi chúng chèn vào sợi đôi
DNA. Sự tăng cường tín hiệu của SYBR Green I (đo ở bước sóng 530nm)tương quan với
lượng sản phẩm DNA được tạo ra trong quá trình khuếch đại DNA. Để đạt được kết quả
tối ưu,tín hiệu huỳnh quang được đo vào mỗi cuối giai đoạn kéo dài (elongation phase).
SYBR Green I có ưu điểm dễ dàng thiết kế và tối ưu. Phương phápnày đơn giản và thuận
tiện đểphát hiện và định lượng bất kỳ sản phẩm RT-PCRhoặc PCR. Tuy nhiên, vì SYBR
Green liên kết với các sợi đôi DNA bất kỳ nên chúng không thể phân biệt được các sợi
đôi DNA của những loài khác nhau. Sản phẩm đặc hiệu, không đặc hiệu và primer-dimer
đều được phát hiện. Để khắc phục vấnđề này, có thể phân tích đường cong nóng chảy
(melting curve), các phân tích này có thể giúp phân biệt được các sản phẩm đặc hiệu,
primer-dimer và các sản phẩm khác(Shipley, 2006).
2.5.2. Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang
2.5.2.1. Real-time PCR sử dụng Taqman probe
Taqman probe là những oligonucleotide được đánh dấu bởi cả chất phát huỳnh quang
(reporter) và chất hấp phụ huỳnh quang (quencher). Khi probe ở trạng thái nguyên vẹn,
reporter và quencher ở gần nhau, lúc này, tín hiệu huỳnh quang do reporter phát ra sẽ bị

quencher hấp phụ nên tín hiệu huỳnh quang ở giai đoạn này rất thấp. Ở giai đoạn bắt cặp,
probe bắt cặp bổ sung với trình tự khuôn mẫu ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ primer gắn lên
sợi khuôn. Khi primer kéo dài nhờ Taq DNA polymerase, reporter sẽ bị cắt và tách khỏi
quenchernhờ hoạt tính 5’ exonuclease. Reporter được giải phóng khỏi phân tử probe, tín
hiệu huỳnh quang tăng lên và được thu nhận(Shipley, 2006).
Chiều dài của probe có một mối tương quan nghịch với hiệu suất hấp phụ. Chính vì lý
do này nên độ dài của probe thường không dài quá 30bases.Một điều quan trọng nữa là
probe phải bắt cặp lên trình tự đích trước primer để tín hiệu huỳnh quang có thể phát ra từ
những mạch DNA mới tổng hợp. Taq DNA polymerase liên kết và kéo dài rất nhanh sau

14


khi probe liên kết DNA. Chính vì vậy, Taqman probe thường đượcthiết kế sao cho Tm
cao hơn 9 – 10oC so với nhiệt độ bắt cặp của primer(Shipley, 2006).

Hình 2.4Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR
2.5.2.2. Real-time PCR sử dụng Beacon probe
Tương tự như Taqman probe,Molecular beaconscũng được đánh dấu ở mỗi đầu bởi
một reporter và một quencher và Tm của chúng cũng cao hơn của primer. Điểm khác biệt
so với Taqman probe là Molecular beacons cần Taq DNA polymerase ly giải và giải
phóng reporter để phát tính hiệu. Molecular beacons có 4-6 base tự bắt cặp bổ sung của
các trình tự tương đồng ở 2 đầu của phân tử. Vì vậy, trong dung dịch, hai đầu của phân tử
beacon gập lại, tạo thành cấu trúc dạng kẹp tóc(Shipley, 2006).
2.5.2.3. Real-time PCR sử dụng probe lai
Probe lai (Hybridization probe) sử dụng cùng lúc hai probe, mỗi probe gắn một chất
nhuộm huỳnh quang riêng biệt. Hệ thống probe lai sử dụng FRET (Flourescen Resonance
Energy Transfer) để phát tín hiệu huỳnh quang chứ không hấp phụ huỳnh quang như các
kỹ thuật khác. Phân tử probe thứ nhất được đánh dấu bằng một phân tử phát huỳnh quang
(Donor dye) ở đầu 3’; phân tử probe thứ hai mang ở đầu 5’ một chất nhận tín hiệu huỳnh

quang (Acceptor dye). Trình tự của hai probe bổ sung với 2 đoạn trình tự rất gần nhau
trên DNA khuôn mẫu, chúng chỉ cách nhau khoảng 1-3 base. Phân tử nhuộm thứ nhất
(nhuộm huỳnh quang) nhận năng lượng từ ánh sáng nguồn và năng lượng mà phân tử
15