BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
 
 

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH TÊN LOÀI NẤM
Beauveria sp. KÍ SINH CÔN TRÙNG
BẰNG HÌNH THÁI VÀ PHÂNTỬ

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THỊ TÚ NGÂN

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 06/2013
 
 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 
 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH TÊN LOÀI NẤM
Beauveria sp. KÍ SINH CÔN TRÙNG
BẰNG HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TRẦN THỊ VÂN

TRẦN THỊ TÚ NGÂN

Tháng 06/2013
 
 


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi muốn gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình tôi. Ba mẹ là người
sinh thành và không quản khó khăn, vất vả nuôi dưỡng con cho đến ngày hôm nay. Ba
mẹ luôn luôn yêu thương, chăm sóc, động viên con vô điều kiện, là chỗ dựa tinh thần
vững chắc nhất để con có thể vượt qua mọi khó khăn trong học tập và cuộc sống. Em
cảm ơn hai anh trai của em, hai anh đã luôn thương yêu, quan tâm và giúp đỡ em
những lúc em gặp rắc rối.

Tiếp theo tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh
học trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng tất cả các thấy cô đã tận
tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian theo học ở trường. Đặc biệt, tôi muốn gửi lời
cảm ơn đến:
Th.S Trần Thị Vân đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
PGS. TS. Lê Đình Đôn luôn hết lòng vì sinh viên, đã cố gắng tạo mọi điều kiện
tốt nhất cho sinh viên học tập và rèn luyện. Thầy luôn vui vẻ và yêu thương chúng tôi
như là con của mình.
TS. Lê Thị Diệu Trang đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình tìm đề tài tốt
nghiệp, cho tôi những góp ý chân tình về đề tài.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô, anh chị và các bạn
đang làm đề tài ở Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường trường Đại học
Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đề tài. Cảm ơn hai
bạn cùng phòng trọ đã động viên tinh thần, cho tôi những lời khuyên chân thành nhất,
luôn bên tôi trong những lúc chán nản, khó khăn.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 05 năm 2013
Người viết
Trần Thị Tú Ngân

i
 


TÓM TẮT
Theo thống kê của Cục Bảo vệ Thực vật, hàng năm các loài dịch hại, bệnh hại,
đã làm giảm 35 – 40% tổng sản lượng, mặt khác làm giảm chất lượng của nông sản.
Để giảm thiệt hại do sâu, bệnh hại, người nông dân đã sử dụng nhiều phương pháp,
trong đó sử dụng thuốc hóa học rất phổ biến vì dễ áp dụng, có hiệu quả kịp thời mà giá
thành lại rẻ.Nhưng việc sử dụng thuốc hóa họcgây ô nhiễm môi trường, mất cân bằng

sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và làm tăng tính kháng thuốc của sâu
bệnh. Do đó,đề tài “ Phân lập, định danh tên loài nấm Beauveria sp. kí sinh trên côn
trùngbằng hình thái và phân tử” được tiến hành nhằm tạo bộ mẫu nguồn và chọn lọc
loài Beauveria có khả năng sử dụng trong đấu tranh sinh học.
Nội dung của nghiên cứu bao gồm: Phân lập và làm thuần các chủng nấm từ
các mẫu côn trùng bị bệnh thu thập tại các tỉnh, định danh các chủng nấm bằngcác đặc
điểm hình thái, định danh các chủng nấm có đặc điểm hình thái giống Beauveria sp.
dựa trên trình tự DNA của vùng rDNA – ITS.
Kết quả của nghiên cứu đã phân lập được 10 mẫu nấm khác nhau kí sinh trên
côn trùng tại Củ Chi, Hóc Môn, Tây Ninh, An Giang, Lâm Đồng; bằng định danh hình
tháiđã định danh được 2 mẫu nấm BPH – HM2, BW – CC thuộc giống Verticillium
sp., 2 mẫu nấmBC – LĐ1, BC – LĐ2 là Nomuraea rileyi, 5 mẫu nấm BPH –
HM1,BPH – TN, BPH – HM3, BW – HM, BSW – AGlà Beauveria bassiana; bằng
phương pháp định danh phân tử đã xác định được 2 mẫu nấm BW – HM, BSW –
AGlàBeauveria bassiana,mẫunấmBC – LĐ1 Cordyceps takaomontana và mẫu BC –
LĐ2 là Cordyceps cicadae.

ii
 


SUMMARY
The thesis title: Isolation and identification fungi Beauveria sp. parasitic on
insects by morphology and molecules.
According to the Department of Plant Protection, pests, diseases reduced 35 to
40% of total production, on the other toreduces the quality of agricultural products. To
reduce losses due to pests and diseases, farmers use a variety of methods, which using
chemicals are very popular because it is easy apply, effective timely, and cheap cost.
However, the use of chemicals causing environmental pollution, ecological imbalance,
affecting human health and increase resistance of pests.Therefore, the thesis "Isolation

and identification fungi Beauveriasp.parasitic on insects by morphology and
molecules" which aims to create Beauveria sp. samples capable used in biocontrol.
The thesis includes isolation and purifing fungi strains from disease insect
samples collected at the local, strains were identified by morphological observation.
Identification of fungi strains have morphological characteristics similar with
Beauveria sp. based on the DNA sequences of rDNA – ITS.
Isolationresults show that10 fungi samples parasitic on insects in Cu Chi, Hoc
Mon, Tay Ninh, An Giang, Lam Đong; there were two fungi samples BPH – HM2,
BW – CC belong strains Verticillium sp., two fungi samples BC – LĐ1, BC –
LĐ2were Nomureae rileyi, five samples BPH – HM1, BPH – TN, BPH – HM3, BW –
HM,BSW – AGwere Beauveria bassiana. By molecular biology indentification, there
were 2 samples BW – HM, BSW – AG belong Beauveria bassianafungi,samples
– LĐ1 were Cordyceps takaomontana, samples BC – LĐ2wereCordyceps cicadae.
Key words: Beauveria bassiana.

iii
 

BC


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ................................................................................................................. i
Tóm tắt ...................................................................................................................... ii
Summary .................................................................................................................. iii
Mục lục .................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ tóm tắt ........................................................................................ v
Danh sách các bảng ................................................................................................. vi
Danh sách các hình ................................................................................................. vii

Chương 1 Mở đầu ..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu .............................................................................................................. 3
1.3. Nội dung thực hiện ............................................................................................ 3
Chương 2 Tổng quan tài liệu .................................................................................... 4
2.1. Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng ................................................... 4
2.2. Sơ lược về nấm kí sinh côn trùng ..................................................................... 5
2.3. Triệu chứng côn trùng bị bệnh do vi nấm ........................................................ 5
2.4. Điều kiện để nấm có thể tấn công côn trùng .................................................... 6
2.5. Sơ lược về nấm Beauveria bassiana ................................................................ 6
2.5.1. Vị trí phân loại ................................................................................................ 6
2.5.2. Đặc điểm nhận biết nấm Beauveria bassiana ............................................... 6
2.5.3. Đặc điểm nuôi cấy nấm Beauveria bassiana ................................................ 7
2.5.4. Hoạt tính sinh học của nấm Beauveria bassiana .......................................... 7
2.6. Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm kí sinh côn trùng ................................... 8
2.7. Cơ chế xâm nhiễm của nấm gây bệnh côn trùng.............................................. 9
2.8. Tính an toàn của nấm đối với động vật máu nóng .......................................... 10
2.9. Phương pháp định danh nấm .......................................................................... 10
2.9.1. Định danh bằng hình thái các mẫu nấm ...................................................... 10
2.9.2. Định danh sinh học phân tử nấm ................................................................. 11
2.9.2.1. Khái niệm PCR ......................................................................................... 11
iv
 


2.9.2.2. Nguyên tắc phản ứng PCR ....................................................................... 11
2.9.2.3. Giới thiệu về rDNA và vùng ITS ............................................................. 12
2.10. Các nghiên cứu về nấm Beauveria ............................................................... 13
2.10.1. Nghiên cứu trong nước .............................................................................. 13
2.10.2. Nghiên cứu ngoài nước ............................................................................. 14

Chương 3 Vật liệu và phương pháp........................................................................ 17
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ..................................................................... 17
3.2. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................... 17
3.2.1. Mẫu thí nghiệm............................................................................................ 17
3.2.2. Hóa chất ....................................................................................................... 17
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 18
3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 18
3.3.1.Phân lập nấm từ côn trùng ............................................................................. 18
3.3.1.1.Chuẩn bị môi trường................................................................................... 18
3.3.1.2. Phân lập nấm từ côn trùng trên môi trường PGA .................................... 18
3.3.2. Định danh bằng hình thái các mẫu nấm đã phân lập .................................... 18
3.3.3. Định danh bằng PCR .................................................................................... 18
3.3.3.1. Ly trích DNA............................................................................................. 18
3.3.3.2.

Quy trình điện di kiểm tra DNA tổng số nấm ......................................... 19

3.3.3.3. Khuếch đại trình tự ITS của nấm bằng phản ứng PCR ............................. 19
3.3.3.4. Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose ........................................... 20
3.3.3.5. Kỹ thuật xử lý trình tự ............................................................................... 21
Chương 4 Kết quả và thảo luận .............................................................................. 22
4.1. Kết quả ............................................................................................................. 22
4.1.1. Một số hình ảnh khuẩn lạc nấm thu được sau khi phân lập và làm thuần ... 22
4.1.2. Khảo sát hình thái nấm ............................................................................... 23
4.1.2.1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy ........................................ 23
4.1.2.2. Một số đặc điểm khác của các mẫu nấm quan sát dưới kính hiển vi ........ 24

v
 



4.1.3. Kết quả định danh Beauveria sp. bằng phương pháp PCR ......................... 33
4.1.3.1. Kết quả nhân sinh khối nấm trong môi trường PG ................................. 33
4.1.3.2. Kết quả ly trích DNA ............................................................................... 33
4.1.3.3. Kết quả khuếch đại trình tự ITS của các mẫu nấm ................................... 34
4.1.3.4. Kết quả giải trình tự và xử lý mẫu ............................................................ 35
4.2. Thảo luận ....................................................................................................... 41
Chương 5 Kết luận và đề nghị ................................................................................ 43
5.1. Kết luận.......................................................................................................... 41
5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 43
Tài liệu tham khảo .................................................................................................. 44
Phụ lục .................................................................................................................... 48

vi
 


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
BVTV: Bảo vệ thực vật
CMA:Cornmeal Agar
Ctv: cộng tác viên
DOR: Directororate of Oilseeds Research
DNA: Deoxyribonucleic acids
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate 
EDTA: Ethylendiamin Tetraacetic Acid
MEA:Malt Extract Agar
NA:Nutrient agar
PDA: Potato dextrose agar
PDBC : Project Directororate of Biological control
PG: Potato glucose

PGA: Potato glucose agar
RNA: Ribonucleic acid
SDA: Sabouraud’s dextrose agar
SDS: Sodium dodecyl sulfate
YPDA: Yeast extract potato dextrose agar

vii
 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và địa điểmthu thập ................................................................... 17
Bảng 3.2 Primer sử dụng khuếch đại trình tự ITS của nấm .......................................... 20
Bảng 3.3Các thành phần để thực hiện một phản ứng PCR ........................................... 20
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ................................................................ 20
Bảng 4.1Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy ............................................... 24
Bảng 4.2Đặc điểm của 10 mẫu nấm quan sát dưới kính hiển vi................................... 25

viii
 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 4.1 Một số khuẩn lạc nấm thu được sau khi phân lập ......................................... 23
Hình 4.2Đặc điểm hình thái mẫu BPH – CC quan sát dưới kính hiển vi ..................... 26
Hình 4.3 Đặc điểm hình thái mẫu BW – CC quan sát dưới kính hiển vi .................... 26
Hình 4.4 Đặc điểm hình thái mẫu BPH – HM2 quan sát dưới kính hiển vi ................. 27
Hình 4.5Đặc điểm hình thái mẫu BPH – TN quan sát dưới kính hiển vi ..................... 27
Hình 4.6Đặc điểm hình thái mẫu BC – LĐ1 quan sát dưới kính hiển vi ..................... 28 
Hình 4.7Đặc điểm hình thái mẫu BPH – HM3 quan sát dưới kính hiển vi .................. 28

Hình 4.8Đặc điểm hình thái mẫu BW – HM quan sát dưới kính hiển vi ..................... 29
Hình 4.9 Đặc điểm hình thái mẫu BSW – AG quan sát dưới kính hiển vi................... 30
Hình 4.10 Đặc điểm hình thái mẫu BC –LĐ2 quan sát dưới kính hiển vi ................... 31
Hình 4.11 Đặc điểm hình thái mẫu BPH – HM1 quan sát dưới kính hiển vi ............... 32
Hình 4.12 Kết quả kiểm tra DNA tổng số các mẫu nấm .............................................. 33
Hình 4.13Sản phẩm PCR .............................................................................................. 34

ix
 


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên rất thuận

tiện cho cây trồng phát triển. Đồng thời với cây trồng phát triển, sâu bệnh hại cũng
phát sinh, chúng gây hại đáng kể đến năng suất. Theo ước tính của Viện lúa đồng bằng
sông Cửu Long (2004), mức độ tổn thất do sâu hại nếu không sử dụng thuốc trừ sâu là
83% ở lúa gạo và 84% ở bông vải. Để bảo vệ cây trồng, mức chi phí cho công tác bảo
vệ thực vật, phòng trừ dịch hại đã không ngừng tăng lên trong phạm vi toàn quốc.
Để làm giảm thiệt hại do sâu, bệnh hại gây ra, người nông dân đã sử dụng nhiều
biện pháp phòng trừ như canh tác thủ công, luân canh, chuyên canh, chọn tạo giống
mới, dùng thuốc hóa học. Trong đó biện pháp sử dụng thuốc hóa học được xem là phổ
biến vì dễ áp dụng, có hiệu quả ngay, kịp thời và hiệu quả cao mà giá thành lại rẻ.
Nhưng việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học gây ô nhiễm môi trường trầm trọng, để lại
dư chất hóa học trong nông sản, giảm số lượng sinh vật có ích, làm mất cân bằng sinh
thái trong tự nhiên, làm tăng tính kháng thuốc của sâu bệnh. Do vậy, sử dụng thuốc
hóa học chỉ là biện pháp tình thế.

Hiện nay đời sống xã hội Việt Nam ngày càng phát triển, ý thức của người nông
dân cũng được nâng cao, người nông dân hiểu được tác hại của thuốc hóa học và mong
muốn có một loại thuốc mới diệt trừ sâu đạt hiệu quả cao mà không gây ra hậu quả xấu
như thuốc hóa học. Điều đó đòi hỏi các nhà khoa học cần phải nghiên cứu để thay thế
thuốc hóa học bằng các loại thuốc khác theo hướng công nghệ sinh học. Phòng trừ
bằng vi sinh vật là phương pháp được chú ý hơn cả. Với phương pháp này người ta
nhấn mạnh đến khả năng khống chế tự nhiên bởi các thiên địch như côn trùng kí sinh,
côn trùng ăn thịt, vi sinh vật gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, nguyên sinh…).
Nấm là một loài vi sinh vật gây bệnh có thể làm chết côn trùng, thuộc các chi
trong bộ nấm mốc gây hại trên sâu, ngành phụ nấm tiếp hợp và các chi trong các bộ
của ngành phụ nấm bất toàn.Trong đó nhiều loài thuộc các chi Beauveria,
Metarhizium, Entomopthora, Coelomyces có thể gây dịch bệnh cho sâu hại và có tác
dụng khống chế tác dụng của chúng trong tự nhiên.

1
 


Những năm cuối thế kỷ 19, nhiều nhà khoa học Châu Âu đã sử dụng nấm
Beauveria spp. để phòng trừ các loài sâu như ngài độc Portheria monocha, ong ăn lá
Diprion hercyniac…
Theo thống kê nấm Beauveria bào tử cầu có phạm vi kí sinh rất rộng, có thể
gây bệnh cho hơn 700 loài thuộc 149 họ của 15 bộ côn trùng sâu hại, hơn 10 loài nhện.
Tại Việt Nam việc sử dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana đã được tiến hành từ
năm 1979, đến nay vẫn tỏ ra có tác dụng đối với sâu róm thông và một số loài sâu hại
cây nông nghiệp (Nguyễn Xuân Thành, 1996).
NấmBeauveria (nấm bạch cương) hay còn gọi là nấm cứng trắng, nấm tằm
vôi, là loại thườnggặp trên nhiều loài sâu hại. Riêng chúng có mặt trên 120 loài thuộc
45 họ 7 bộ côn trùng rừng. Nếu tính cả sâu hại nông nghiệp chúng có thể kí sinh trên
gần 200 loài. Loài Beauveria thường được tìm thấy trong đất, các mảnh vụn thực vật

và ở côn trùng bị nhiễm bệnh, gây ra bệnh muscardinetrắng. Loài nổi tiếng nhất là B.
bassiana, một loài đáng chú ý về gây bệnh và tử vong ở côn trùng.
Beauveria là một chi nấm trong ascomycete hoặc “nấm túi”.Tốc độ tăng trưởng
củaBeauveria khá nhanh. Các khuẩn lạc đạt đến đường kính 1 đến 3 cm sau ủ ở 25oC
trong 7 ngày trên môi trường thạch glucose khoai tây. Đặc điểm cơ bản của loại nấm
này là thể sợi màu trắng, dạng lông, sợi nấm mảnh đường kính 1,5 - 2 µm, cuống bào tử
mọc đơn hoặc phân nhánh. Bề mặt có màu trắng nhạt, màu trắng vàng hoặc màu hồng
nhạt. Tế bào sinh bào tử hình bình, hình ống hoặc hình cầu, thẳng hoặc hơi uốn cong.
Trục sợi uốn hình chữ “Z” bào tử mọc trên đầu góc chữ Z cùng với cuống rất nhỏ.
Năm 1954, Macleod phân nấm bạch cương ra 2 loài chính là Beauveria
bassianacó bào tử hình cầu (hoặc trên 50% bào tử hình cầu) nằm trên cuống nhỏ gắn
về nhiều hướng và B. brongniartii (B. tenella) có bào tử hình trứng (2% bào tử hình
cầu). Trong hai loài này, loài B. bassiana phân bố rộng nhất, xâm nhiễm nhiều loài côn
trùng nhất được dùng để phòng trừ sâu thuộc bộ cánh vẩy và cánh nửa. Nấm B. tenella
thường phân bố trong đất và dùng để phòng trừ sâu non bọ hung.
Năm 1975, Hook lại công bố 2 loài nấm bạch cương không có tác dụng phòng
trừ sâu là B. alba và B. vermiconia. Sau đó Carmichae (1980) và Samson (1982) lại
công bố thêm 3 loài mớiB. felina, B. velata, B. amorpha. Như vậy nấm bạch cương đã
có đến 7 loài. Về sau năm 1984 ở Nhật Bản đã phân lập được rất nhiều loài có bào tử

2
 


hình ống và hình que ở giữa thắt lại và hơi uốn cong, tế bào sinh bào tử hình bình, đuôi
hình chữ Z, kích thước bào tử 3,4 – 4,7 µm x 1,2 – 1,8 µm.
1.1.

Yêu cầu
Phân lập và định danh giống Beauveria sp. gây bệnh trên côn trùng nhằm tạo bộ


mẫu nguồn và chọn lọc loài Beauveria có khả năng sử dụng trong đấu tranh sinh học.
1.2.

Nội dung thực hiện
Lấy mẫu và phân lập nấm Beauveria sp. từ các loại côn trùng.
Định danh bằng hình thái các mẫu nấm.
Định danh bằng phân tử các mẫu nấm.

3
 


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng
Từ năm 2700 trước công nguyên, nhà triết học Hy Lạp Aristotle đã tìm hiểu về
hiện tượng ong bị bệnh chết hàng loạt, 200 năm sau các nhà khoa học đã chứng minh
được côn trùng và một số động vật không xương sống khác bị chết là do nhiễm một số
loại vi nấm. Năm 1709, Balisneri là người đầu tiên mô tả về nấm gây bệnh trên côn
trùng.
Đến thế kỷ 18, các nhà khoa học đã chứng minh nấm gây bệnh côn trùng là
những loài sinh vật có khả năng lan truyền bệnh từ vật chủ này sang vật chủ khác.
Agostino được coi là người đi đầu trong lĩnh vực bệnh lý học côn trùng, đã bỏ hơn 30
năm nghiên cứu nấm trắng muscardine gây bệnh trên tằm dâu (Bombyx mori L.). Năm
1815, Agrostino đã mô tả khá tỉ mỉ về bệnh nấm trắng muscardin là nguyên nhân
chính gây bệnh cho tằm dâu. Năm 1835, ông tìm ra nấm Beauveria bassiana là nguyên
nhân gây bệnh.Khám phá của ông không chỉ đặt nền móng cho nghiên cứu về vi sinh
vật gây hại mà còn ảnh hưởng đáng kể đến nghiên cứu củaPasteur,Koch và nhiều
người đi đầu trong lĩnh vực vi sinh vật gây bệnh để trừ côn trùng hại. Từ năm 1885
đến 1890,Paster đã định danh được nấm trắng gây bệnh trên tằm là Beauveria

bassiana và những thí nghiệm của ông làm nền tảng cho việc nghiên cứu sử dụng nấm
trừ côn trùng gây hại cho cây trồng. Chính Pasteur (1874) đã đề xuất tìm kiếm nấm
côn trùng thích hợp để trừ rệp hại nho Phylloxera (Nguyễn Lân Dũng, 1981).
Năm 1944, Steinhaus là nhà khoa học đầu tiên thành lập phòng thí nghiệm
chuyên nghiên cứu bệnh lý côn trùng, mở đường cho hướng nghiên cứu thực nghiệm
về khả năng lây nhiễm bệnh và ứng dụng để phòng trừ sâu hại ngoài đồng ruộng. Theo
Steinhaus (1956), minh họa đầu tiên về nấm gây bệnh côn trùng được Reaumur công
bố năm 1726 với một loài nấm thuộc giống Cordyceps gây bệnh cho sâu non họ
Noctuidae.Và theo ôngý tưởng sử dụng vi sinh vật trừ côn trùng hại bắt nguồn từ các
nghiên cứu bệnh tằm. Năm 1824, Cist nghiên cứu về bệnh của sùng Melolonthado
nấm Cordyceps gây ra. Torrubia (1974) đã ghi nhận một loài cánh màng (có thể là
Polistes) bị chết do nấm Cordyceps sphecocephala. Năm 1837, Oduen cũng cho rằng
nấm bạch cương không chỉ gây bệnh cho tằm, đồng thời có thể dùng nấm này để trừ
4
 


các côn trùng khác. Năm 1892Tangi đã nuôi cấy nhân tạo thành công nấm bạch cương
Beauveria bassiana rồi dùng bào tử của chúng tiêu diệt sâu róm (Porthetriadisper)
(Nguyễn Lân Dũng, 1981).
2.2. Sơ lược về nấm kí sinh côn trùng
Theo Steinhaus (1949), nấm gây bệnh côn trùng có ý nghĩa rất lớn vì có thể gây
chết thường xuyên nhiều loại côn trùng có hại với tỷ lệ chết rất cao và là một trong
những tác nhân điều hòa quần thể vi sinh vật trong tự nhiên rất hiệu quả. Cũng như vi
khuẩn, nhiều nấm liên quan với côn trùng như vi sinh vật cộng sinh, hoại sinhhoặc kí
sinh. Chỉ có nấm kí sinh côn trùng mới gây hiện tượng bệnh lý, làm chết côn trùng, do
đó chúng có ý nghĩa rất lớn trong bảo vệ thực vật.
Nấm gây bệnh côn trùng thuộc nhiều nhóm khác nhau từ nhóm nấm nguyên
thủy sống dưới nước đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn. Đa số nấm diệt côn trùng
có số lượng lớn nhất thuộc bộ Entomophthoralesct (Mastigomycotina) và Moniliales

(Deuteromycotina).
Theo Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), nấm bất toàn kí
sinh trên côn trùng có rất nhiều loài, phân bố rộng. Người ta có thể sử dụng nhiều loại
dinh dưỡng để nuôi cấy và sản xuất chế phẩm, nên nấm này đã được ứng dụng rộng rãi
trong thực tế sản xuất.Hầu hết các nấm này thường kí sinh trên sâu non làm cho thân
sâu cứng lại, trên thân mọc đầy các sợi nấm và bào tử phân sinh tạo nên các màu.
Nấm bất toàn có thể sợi phân nhánh và có vách ngăn. Trong ngành phụ nấm bất
toàn có các lớp bào mầm, lớp bào tử sợi và lớp bào tử xoang. Hầu hết các loài nấm gây
bệnh côn trùng thuộc lớp bào tử sợi. Chúng không có cơ quan bao bọc, chỉ có cuống
bào tử và bào tử trần. Phần lớn chúng thuộc các họ cuống chùm. Một số loài thuộc bộ
vỏ cầu và bộ vỏ đỏ đệm. Cụ thể là: nấm bào tử hình thoi và nấm bạch cương.
2.3. Triệu chứng côn trùng bị bệnh do vi nấm
Khi bị bệnh nấm, côn trùng ngưng vận động 2 – 3 ngày, màu sắc cơ thể thay
đổi ngay tại vị trí nấm phát bệnh, bên trong thân của sâu non xuất hiện những vệt đen,
không có hình thù nhất định. Cơ thể có màu vàng nhạt, trắng và hồng, thân hơi cứng,
màu sắc thay đổi tùy thuộc vào màu sắc của bào tử nấm gây bệnh. Kích thước cơ thể
ngắn lại hoặc bị khô do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn và chết.
Kèm theo đó là hiện tượng tiêu hủy mô đặc trưng của bệnh nấm và trải qua hai giai
đoạn:
5
 


- Hiện tượng chấn thương: các mô bị tổn thương do nấm gây ra, các lympho máu
đọng lại và mô tái sinh được tạo thành bên trên bề mặt phần thân côn trùng bị tổn
thương.
- Hiện tượng nhiễm trùng máu: xảy ra hiện tượng thực bào do lympho chứa đầy
sợi nấm, các tế bào bao vây nuốt một phần tiểu thể nhất định tạo thành những hợp bào
và các tế bào khổng lồ làm cho côn trùng chết.
2.4. Điều kiện để nấm có thể tấn công côn trùng

Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), để bệnh dịch
nấm phát triển được thì ngoài điều kiện thời tiết thuận lợi còn cần yếu tố mật độ côn
trùng cao và tình trạng sinh lý của chúng. Bệnh dịch nấm lan truyền được khi độ ẩm
không khí đạt 90% - 100%. Ngoài cấu trúc vỏ côn trùng giữ vai trò quan trọng trong
sự xâm nhập phá hủy vỏ của nấmdiệt sâu thì các vấn đề như trạng thái sinh lý của côn
trùng (Rudens, 1996), độ bền vững của chitin (PyPat, 1940), sự có mặt của nấm ức chế
(Sussman, 1951), hay chất kích thích (Natini, 1944) và thành phần của tấm cutin ngoài
của một số loại côn trùng cũng có ý nghĩa quan trọng.
2.5. Sơ lược về nấm Beauveria bassiana
2.5.1. Vị trí phân loại
Lớp: Deuteromycetes.
Bộ: Moniliales.
Họ: Moniliaceae.
Giống: Beauveria.
2.5.2. Đặc điểm nhận biết nấm Beauveria bassiana
Theo Kirk và ctv (2001), về mặt hình thái Beauveria được phân biệt dựa vào
hình dạng của tế bào sinh bào tử. Trong quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria sinh ra các
sợi nấm trắng và bào tử đính,khi bào tử già có các giọt màu vàng xuất hiện ở giữa đối
với loài B. amorpha và B. velata. Một số loài khác xuất hiện các giọt dịch màu đỏ trên
bề mặt khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng.Trước đây, các loài trong
chiBeauveria được nhận biết dựa vào kích thước bào tử, tuy nhiên phương pháp định
danh này thường gặp nhiều khó khăn bởi vì các loài nấm Beauveria không khác biệt
nhiều về kích thước. Dựa vào đặc điểm hình thái, De Hoog (1972) đã mô tả rất chi tiết
hình dạng của 8 loài trong chi Beauveria và cho biết chỉ có thể nhận biết chắc chắn
được hai loài là B. bassiana và B.densodựa vào hình dạng của bào tử đính. Theo Glare
6
 


và cs (1998), sự khác biệt về hình thái giữa các loài trong chi Beauveria chịu ảnh

hưởng bởi các điều kiện nuôi cấy và thành phần các chất có trong môi trường dinh
dưỡng vì vậy rất khó nhận biết đến loài nếu chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái. Tương
tự, Samson (1981) khi xác định 16 mẫu Beauveria cũng chỉ phân biệt được hai loài là
bassiana và B. denso hoặc B. tenella. Về sau B. denso được đổi tên là B. brongniartii
và đã phát hiện thêm một loài mới nữa là B. album.
2.5.3. Đặc điểm nuôi cấynấm Beauveria bassiana
Nấm Beauveria bassiana nảy mầm tốt trong môi trường có đường mía và
pepton. Trong các loại đường nói chung,glucoza luôn luôn là nguồn carbon rất tốt cho
các loài nấm kí sinh côn trùng nấm cũng cần nito hữu cơ và vô cơ, trong nito vô cơ
thích hợp với NO3- hơn NH4+. Phốt pho (P) là nhân tố quan trọng làm tăng số lượng
nấm, trong giai đoạn sinh trưởng nhu cầu carbon (C), nito (N) của nấm rất rõ rệt nhưng
đến khi sợi nấm đứt ra hình thành bào tử đốt nhu cầu C, N giảm dần còn P lại tăng lên
(trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2008).
Theo Trần Văn Mão (2008) phạm vi nhiệt độ của nấm khoảng 5 – 35oC, thích
hợp nhất cho sự nảy mầm,phát triển và tạo bào tử của nấm là 20 – 30oC, nếu nhiệt độ
thấp nấm sinh trưởng chậm, nhiệt độ cao sinh trưởng nhanh nấm mau già yếu. Nhiệt
độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử. Brunno (1964), cho biết sự nảy mầm và
phát triển sợi nấm của Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã bị ức chế
mạnh ở nhiệt độ dưới 1oC. Khi tăng nhiệt độ tốc độ phát triển của nấm tăng và nhiệt độ
thích hợp là 22 – 26oC.
Độ ẩm cao có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, nhưng nhiệt
độ thấp lại có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Theo Phạm Thị Thùy (2004), ẩm độ
thích hợp trong phạm vi 80 – 90%, nếu trên hoặc dưới ngưỡng thì nấm phát triển yếu.
Nấm Beauveria có tính thích nghi rộng, phạm vi nảy mầm là pH 3,0 – 9,4. Ở
pH 4,4 thì nảy mầm nhiều nhất, tốc độ nảy mầm cũng nhanh nhất.Sợi nấm sinh trưởng
ở pH 4,5 – 5,0, hình thành bào tử tốt nhất ở pH 6 (Trần Văn Mão, 2008).
2.5.4. Hoạt tính sinh học của nấm Beauveria bassiana
Nấm Beauveria bassiana có khả năng tổng hợp một lượng lớn các enzyme,
trong đóchitinaza, proteinaza, lipaza, ureaza, aspatainaza và amylaza có ý nghĩa lớn
nhất cho khả năng gây bệnh trên côn trùng. Enzyme amylaza có mức độ hoạt tính gấp

3 lần hoạt tính enzyme khác.
7
 


Năm 1969, các nhà khoa học đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm
bạch cương Beauveria bassianavà đặt tên cho độc tố này là beauvericin. Chất này
được chúng tiết ra khi bào tử nảy mầm.Về mặt hóa học, beauvericin có danh pháp là
xyclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - α - hydroxylzovalery). Đó là một loại
depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93 – 94oC. Từ một lít dung dịch môi trường
nuôi cấy nấm Beauveria bassiana các nhà khoa học Trường Đại học Tổng hợp Nam
Khai (Trung Quốc) đã tách ra được 1,5 g độc tố beauvericin và từ 1 kg môi trường đặc
các tác giả đã tách ra được 3,8 g beauvericin.
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Đại học Kitasoto – Nhật Bản
nhóm chất beauveriolide trong nấm Beauveria có khả năng ngăn chặn đại thực bào hấp
thu cholesterol các axít béo cấu thành giọt nhỏ - hìnhthái cho phép các đại thực bào dễ
dàng hấp thu, hai là khống chế hoạt động của một loại enzyme có mặt trong đại thực
bào chịu trách nhiệm thu giữ những giọt chất trên.Thử nghiệm beauveriolide trên
những con chuột mắc chứng xơ vữa động mạch cho thấy sự tích tụ cholesterol và các
chất béo giảm tới 50% so với những con khác. Nhóm nghiên cứu khẳng định liệu pháp
này không gây phản ứng phụ như tiêu chảy hay làm tổn thương tuyến thượng thận điều
mà các thuốc kiềm chế enzyme không thể làm được.
2.6. Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm kí sinh côn trùng
Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm bên trong cơ thể côn trùng là một quá trình
phức tạp gồm ba giai đoạn chính:
- Giai đoạn xâm nhập: từ lúc bào tử nấm mọc đến lúc hoàn thành việc xâm nhập
vào cơ thể côn trùng.
- Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng đến khi côn trùng chết: lúc
này nấm tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn phân tán khắp cơ thể theo dịch máu. Về phía
côn trùng chỉ có phản ứng tự vệ kéo dài trong một thời gian ngắn để kìm hãm sự xâm

nhập của nấm vào các nội quan. Khi các sợi nấm xâm nhập vào tất cả các bộ phận
chúng đồng thời gây chết vật chủ.
- Giai đoạn sinh trưởng phát triển của nấm sau khi vật chủ chết: đây là giai đoạn
hoại sinh của nấm kí sinh côn trùng, nấm sẽ hình thành các bào tửhoặc nấm mọc thành
sợi ra ngoài cơ thể vật chủ. Cuối cùng các bào tửđược tạo thành trên lớp sợi nấm ở
ngoài bề mặt cơ thể côn trùng.

8
 


2.7. Cơ chế xâm nhiễm của nấm gây bệnh côn trùng
Độc tố của nấm trắng là Boverixin và men kitinaza phân giải kitin (Nguyễn
Xuân Thành, 1996).
Bào tử nấm rơi trên cơ thể côn trùng, sau đó trương lên, nảy mầm và phát triển
khi gặp các điều kiện thích hợp, nhất là khi độ ẩm cao. Nấm phát triển sợi và phân
nhánh. Cuống bào tử hình thành bào tử đính, bào tử phát triển rụng ra ngoài gặp gió
phát tán (Nguyễn Xuân Thành, 1996).
Năm 2003, Nguyễn Xuân Thành và ctv đã đưa ra cơ chế rõ hơn về sự xâm
nhiễm của nấm trắng vào côn trùng. Nấm xâm nhập vào cơ thể côn trùng chủ yếu qua
lớp vỏ cutin (ngoài ra còn có thể qua đường tiêu hóa, hô hấp và qua lỗ của thân) tức là
có sự tiếp xúc của bào tử nấm với cơ thể vật chủ bắt đầu sau khi vật chủ bị nhiễm bào
tử nấm sau khoảng 10 giờ và có thể kéo dài vài ngày sau, sau đó bắt đầu sinh trưởng
và phát triển. Trong quá trình xâm nhiễm, nấm bị các tế bào bạch huyết tấn công do đó
nấm sẽ tiêu diệt các tế bào bạch huyết. Sau khi diệt hết các tế bào bạch huyết thì côn
trùng chết và nấm tiếp tục sinh trưởng, phát triển. Lượng sợi nấm bên trong côn trùng
ngày càng tăng và xác côn trùng trở nên rắn lại, khi gặp đủ ẩm, các sợi nấm mọc ra
ngoài bề mặt cơ thể côn trùng và hình thành bào tử mới.
Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử nấm phình lên, nảy mầm thành ống mầm,
ống mầm tiếp xúc với da côn trùng hình thành vòi bám. Vòi bám là một tế bào có kích

thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy để dính vào da. Vòi bám hình thành sợi nhỏ
chọc thủng da. Sau khi xuyên qua da sợi nấm phình to thành dạng bàn, mép bàn mọc
sợi nấm rồi hình thành các sợi ngắn. Sợi ngắn nhờ áp lực đẩy vào lớp trong cuối cùng
đạt đến da thật. Nếu côn trùng lột xác, chúng lại hình thành vòi bám mới để tiến hành
tái xâm nhiễm. Nấm thông qua áp lực cơ giới để xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng
và nhờ tác dụng của enzyme phân giải mà chọc thủng biểu bì. Những enzyme phân
giải là proteaza, lipoaza và kitinaza. Muốn da phân giải trước hết là nhờ proteaza, rồi
lipoaza, cuối cùng mới có tác dụng của kitinaza.Mỗi loài nấm khác nhau sẽ hình thành
các enzyme khác nhau nhưng chúng đều có thể tự tạo ra enzyme kitinaza (Trần Văn
Mão, 2008).
Khi xâm nhập vào bên trong cơ thể qua đường tiêu hóa, bào tử từ miệng đi tới
ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan để gây bệnh.Xâm nhiễm
kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm sống ở nước. Dưới tác động của độc tố do
9
 


nấm tiết ra có thể dẫn đến hiện tượng ngừng nhu động ruột của vật chủ. Bào tử còn có
thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng
nhưng rất ít.
2.8. Tính an toàn của nấm đối với động vật máu nóng
Nói chung nấm thường phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp và không ảnh
hưởng đến động vật máu nóng. Pian đã nêu rõ, nấm bạch cương trong cơ thể sống ở
nhiệt độ 35oC, dù ở điều kiện ẩm độ nào đều ngưng phát triển và sau 28 ngày là mất
khả năng sống, cho nên chúng rất an toàn đối với con người (Trần Văn Mão, 2008).
Schaerffenberg (1968) đã làm thí nghiệm để thử tính độc của nấm trên chuột
bạch. Ông dùng 0,5 ml dịch chứa 25 bào tử nấm tiêm vào tĩnh mạch chuột sau đó quan
sát thấy những con chuột này không có biểu hiện gì khác thường, sau đó thí nghiệm
khác được lặp lại bằng cách dùng bột bào tử rắc vào hộp 4 mg/m2 cho chúng hít vào
sau 2 tháng quan sát vẫn không thấy chuột có hiện tượng trúng độc.

Các nhà khoa học đã thử nghiệm tiêm dung dịch bào tử nấm Beauveria
bassiana lên chuột, lợn và cho chúng ăn, theo dõi sau 2 tháng vẫn không thấy chúng
có phản ứng. Điều này chứng tỏ nấm không có ảnh hưởng xấu đối với con người và
động vật máu nóng. Thí nghiệm độc lý cho thấy chúng có độ độc rất thấp LD50 > 2500
mg/kg. Nhiều thí nghiệm đều chứng tỏ nấm bạch cương là loại nấm an toàn.
2.9. Phương pháp định danh nấm
2.9.1. Định danh bằng hình tháicác mẫu nấm
Quan sát đặt điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch: hình dáng, kích thước, dạng
mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, lồi lõm, có khía cạnh hay không,…). Màu sắc khuẩn
lạc mặt trên và mặt dưới, dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…), giọt
tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc),…
Quan sát các đặc điểm vi học: sợi nấm (có vách ngăn, không có vách ngăn, có
mấu); bào tử trần (kiểu phát sinh bào tử trần, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề
mặt…); kiểu sinh bào tử trần (thể bình, dạng có khuyên ở đính, dạng sinh bào tử trần
đồng thời, dạng sinh bào tử trần không đồng thời, bào tử đính kiểu nảy chồi, hình
dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp, vị trí…
Tiến hành định loại: căn cứ vào kết quả quan sát đầy đủ, chính xác đặc điểm
khuẩn lạc và các đặc điểm vi học tiến hành xác định tên loài:

10
 


Dùng khóa phân loại của các nhóm phân loại bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp,
bộ, họ, chi) để xác định lần lượt xem thuộc chi nào. Tiếp theo dùng khóa phân loại của
chi đó để xác định đến loài bằng cách so sánh tất cả các đặc điểm đã quan sát được của
chủng nấm đó với các đặc điểm tương ứng của loài nào đó trong khóa phân loại. Nếu
các đặc điểm so sánh phù hợp với đặc điểm của loài mô tả, ta xác định được tên loài
nấm cần định danh.
2.9.2. Định danh sinh học phân tử nấm

2.9.2.1. Khái niệm PCR
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa
vào các base trình tự. Kỹ thuật này thường dùng để xác định mối quan hệ phát sinh
loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim
và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990).
Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh năm 1985 và được tiếp thu hoàn
thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất được enzyme DNApolymerase chịu nhiệt từ
vi khuẩn Themophilus aquaticusvà một số vi khuẩn khác.Máy PCR ngày càng hoàn
thiện cho phép thay đổi nhanh chóng, chính xác nhiệt độ từng giai đoạn nhân bản
DNA. Cho đến nay, kỹ thuật PCR được coi là phương pháp nền quan trọng của công
nghệ di truyền.
PCR bao gồm enzyme khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu. Vùng thường
được sử dụng để khuếch đại là vùng lặp lại không mã hóa ITS (Internal Transcribeb
Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó
có thể xác định mối quan hệ giữa các loài (Bruns và cộng sự, 1992). Kỹ thuật này rất
có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao của các loài và các chủng có thể được so sánh.
PCR rất có giá trị trong việc xác định ở mức độ loài và chủng. Nó phù hợp để xác định
các nhóm, các chủng đặc biệt.
2.9.2.2.

Nguyên tắc phản ứng PCR

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản
của sao chép DNA trong cơ thể như: đoạn DNA cần nhân bản mở xoắn thành hai
mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu và điều kiện
môi trường thích hợp và enzyme DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi
hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của
những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung
11
 



với một đầu của mạch khuôn và DNA sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương
phápPCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase
(HồHuỳnh Thùy Dương, 2008). Theo tác giả nếu cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp
bổ sung với hai đầu của một trình tự DNAchỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi.
Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, phải có thông tin tối
thiểu về trình tự đó đủ để tạo ra các mồi chuyên biệt.
2.9.2.3.

Giới thiệu về rDNA và vùng ITS

rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong
các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một
gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein. Các bản sao của gen nằm
liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosom
hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử
rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác
biệt khi so sánhcácsinh vật khác nhau.Cácprimerthiết kế dựa trên những
oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại
các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được
thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh
vật.Các rDNA 5,8 S, 18 S, và 25 S phiên mã thành các tiền rRNA riêng lẻ, nằm xen kẽ
với cácvùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Giữa
cácnhóm gen gồm nhiều bản saolặp lại làvùng không phiên mã. Có một rDNA 5 S
thường không có vị trí cốđịnh và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5
S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm. Kích thước của mỗi
vùng lặp lại nằm trong khoảng 7,7 – 24 kbp (Guarro và cs, 1999).
rDNA 18 S thường được quan tâm nghiên cứu; rDNA 5,8 S có kích thước rất
nhỏ và ítcó sự biến đổi song rRNA 5,8 S là thành phần không thể thiếucủa

nu – LSU – rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng
hợp protein; rDNA 25 S mặc dù ít có sự biến đổi song lại rất có ý nghĩa trong phân
loại (Guarro và cs, 1999).
Vùng ITS là vùng có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử
dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng
nàychỉ sửdụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro và cs, 1999).

12
 


2.10.

Các nghiên cứu về nấm Beauveria

2.10.1. Nghiên cứu trong nước
Ở nước ta kể từ năm 1990 đến nay, các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana
chủ yếu là các nghiên cứu về công nghệ sản xuất các chế phẩm từ nấm và hiệu quả
phòng trừ côn trùng của chúng.
Từ giữa thập niên 1970, trường Đại học Lâm nghiệp bắt đầu nghiên cứu nấm
Beauveria bassiana để trừ sâu róm thông(Dendrolimus punctatus)nhưng chưa chế
phẩm nào được ứng dụng trong sản xuất.
Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương pháp lên men
xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 108 bào tử/gram, đồng thời thu hoạch nấm tốt nhất theo
phương pháp này là 10 ngày. Chế phẩm này được làm khô ở nhiệt độ 45oC trong vòng
8 giờ và có thể bảo quản được trong 6 tháng. Khi thực hiện phương pháp lên men chìm
có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trường có pepton, cao nấm men và muối
khoáng, sau 48 giờ ở 30oC bào tử nấm đạt 8,5 x 109 bào tử/gram. Hiệu quả sử dụng tốt
nhất của chế phẩm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lưng
vàng với nồng độ sử dụng là 5 – 6 x 108 bào tử/ml. Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc

chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm(Phạm Thị Thùy và ctv, 1991 – 1995).
Phạm Thị Thùy và ctv (1996), tiến hành thí nghiệm trong nhà lưới với hai chế
phẩm nấm Beauveria và Metarhizium. Với nồng độ dưới 200 triệu bào tử/ml cho hiệu
quả thấp đối với rầy non tuổi 3 của rầy nâu. Ở nồng độ 500 triệu bào tử/ml cho hiệu
quả đối với rầy non 3 tuổi là 72 – 75%. Nồng độ cao hơn 600 – 650 triệu bào tử/ml,
hiệu lực của hai loại nấm đều đạt từ 65 – 80%. Dựa trên cơ sở đó, đã tiến hành thí
nghiệm ngoài đồng ruộng với diện tích 5000 m2 dùng nấm để trừ rầy nâu ở viện
BVTV, Tiền Giang, Hà Nam, Bà Rịa – Vũng Tàu. Sau 10 ngày phun chế phẩm, hiệu
lực đối với rầy nâu của nấm Beauveria, Metarhizium đạt tương ứng là 47,5 – 69,9% và
20,6 – 79,5%. Hiệu lực này kéo dài đến ngày thứ 15 sau khi phun nấm.
Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các giống nấm có hiệu
lực diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng phương
pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn được các chủng nấm diệt sâu có độc tính
cao. Từ các mẫu sâu chết đã phân lập được 9 chủng nấm Beauveria bassiana trên sâu
xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang tại Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia.

13
 


Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9chủng đều có hiệu lực diệt ấu
trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trưởng thành và sâu xanh da láng nhưng ở các mức độ
khác nhau.Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng
khoai lang ở Thủ Đức làm giảm 10 % số củ khoai lang bị hà (trích dẫn bởi Nguyễn
Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Nguyễn Thị Lộc (2000), đã sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ nấm trắng
Beauveria bassiana ở dạng bột thấm nước cho chất lượng tốt, số lượng bào tử cao
(1,5 – 2,0 x 1010 bào tử/gram). Sau 8 tháng bảo quản ở nhiệt độ và độ ẩm bình
thường, chế phẩm vẫn còn hiệu lực ổn định và kéo dài 3 – 4 tuần sau khi phun. Các thí
nghiệm trong nhà lưới và trên đồng ruộng cho kết quả diệt rầy đạt 65 – 87%, diệt trừ

bọ xít hại cây trồng là 69 – 87% sau phun 5 – 7 ngày.
Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế phẩm
Bemetent (được phối từ 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và
Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ cánh cứng
hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ cả thành trùng
và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa.
Theo Trần Văn Mão (2004), ở nước ta có nhiều chế phẩm Boverin đã được thực
hiện ở nhiều tỉnh như Nghệ An, Thanh Hóa, Viện BảoVệ Thực Vật, đã áp dụng
phương pháp phòng trừ sâu róm thông cho hàng ngàn hecta bằng nổ pháo, nổ mìn, treo
lên cây, phun mù, phun bột tại các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Ninh, Ninh Bình,
Bắc Giang từ năm 1980, hiệu quả diệt sâu đều đạt 80%. Ngày nay chế phẩm này vẫn
còn được sản xuất và có tác dụng phòng trừ rõ rệt. Một số vùng sử dụng chế phẩm
Boverin phòng trừ sâu đục quả đậu bằng cách phun vào đất làm cho sâu non khi chui vào
đất bị bào tử nấm xâm nhiễm, tỷ lệ sâu chết tới 50 – 70%. Ngài đục táo, mọt cà phêsau khi
phun chế phẩm nấm B. bassiana thì tỷ lệ trứng của con cái giảm xuống 45– 60%.
Kết quả nghiên cứu của Viện Bảo Vệ Thực Vật đã ứng dụng các chế phẩm nấm
gây hại côn trùng như nấm trắng B. bassiana, nấm xanh M. anisopliae, M. flavoviridae
trừ sâu róm thông, rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đay, châu chấu hại ngô, mía, kiến
vương hại dừa.
2.10.2. Các nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới, việc sử dụng thiên địch trong đấu tranh sinh học chống sâu hại có
lịch sử khá lâu đời.
14