BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX-PCR CHẨN
ĐOÁNMycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma hyorhinis
TRÊN HEO CÓ DẤU HIỆUBỆNH HÔ HẤP
vàVIÊM KHỚP

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

TRẦN THỊ BÍCH TRÂM

Niên khóa:

2010 – 2014

Tháng1/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX-PCR CHẨN

ĐOÁNMycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma hyorhinis
TRÊN HEO CÓ DẤU HIỆU BỆNHHÔ HẤP
vàVIÊM KHỚP

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

TRẦN THỊ BÍCH TRÂM

ThS. ĐỖ TIẾN DUY

Tháng1/2014


LỜI CẢM ƠN 
Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông
Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học,Ban
Quản Lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm, Phòng xét nghiệm Sinh học
Phân tử - Tế bào thuộc Bệnh viện Thú Y- khoa Chăn Nuôi Thú Yđã tạo mọi điều kiện
thuận lợi nhất để tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Tất Toàn và
ThS. Đỗ Tiến Duy đã tận tình chỉ dạy, giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
thực hiện khóa luận!
Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn BSTY. Lê Thị Hạnh Dung và BSTY. Nguyễn
Phạm Huỳnh và tất cả các anh chị trong Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm
là những người đã hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong những lúc tôi gặp
khó khăn khi thực hiện đề tài.

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Đình Đôn,
ThS. Tôn Bảo Linh, KS. Võ Khánh Hưngcùng toàn thể quý thầy cô đã dạy dỗ và
truyền đạt cho tôi những kiến thức quý giá, những kinh nghiệm về cuộc sống trong
suốt những năm tháng học tại trường và trong suốt thời gian thực hiện khoá luận này.
Cảm ơn tất cả các bạn trong tập thể lớp DH10SH đã luôn gắn bó, chia sẻ, động
viên và sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Và trên hết, con xin cảm ơn Ba, Mẹ và Anh Chị đã là những người luôn tin
tưởng, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để con có thể hoàn thành khóa luận
cũng như tất cả thành công trên lớn hơn trên đường đời. Gia đình không chỉ là chỗ dựa
vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn, là nơi chốn để con trở về mà còn là nguồn
động lực để con tiếp tục hoàn thành những mục tiêu sắp tới.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013
TRẦN THỊ BÍCH TRÂM

i


TÓM TẮT 
Bệnh truyền nhiễm trên đường hô hấp heo diễn biến rất phức tạp với tốc độ lây
lan nhanh và đồng nhiễm bởi nhiều tác nhân khác nhau trong đó Mycoplasma
hyopneumoniae (Mhp) và Mycoplasma hyorhinis(Mhr) là hai nguyên nhân quan trọng
đồng thời gây ảnh hưởng nặng trên đường hô hấp (phổi) và gây viêm khớp của heo.
Do đó, chẩn đoán sớm và phát hiện đồng thời các căn nguyên nhiễm ghép để cách ly,
áp dụng các biện pháp phòng trị hợp lý là rất cần thiết cho việckhống chế dịch bệnh
triệt để tại các trang trại chăn nuôi. Chính vì lý do đó, mục đích của đề tài này đặt ra là
xây dựng quy trình PCR đôi (Multiplex-PCR) phát hiện đồng thời MhpvàMhrtừ
đógiúp cho việc chẩn đoán bệnh ghép được nhanh chóng, tiết kiệm chi phí hơn.
Đề tài thực hiện các nội dung như: (1) xây dựng từng quy trình PCR đơn phát
hiện gen 16s rRNA của Mhpvà gen 37p của Mhr, (2) tối ưu hóa quy trình m-PCR và
xác minh hiệu lực phương pháp thông qua việc xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của

phản ứng, (3) ứng dụng quy trình vừa thiết lập trên mẫu bệnh phẩm và so sánh khả
năng phát hiện với quy trình đơn.
Các kết quả đạt được như sau nồng độ mồi cho Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37pF, và Mhr37p-R lần lượt là 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM; và 0,5 µM. Chu trình nhiệt tối ưu
cho phản ứng m-PCR bao gồm giai đoạn tiền biến tính ở 94 oC trong 3 phút, biến tính
ở 94 oC trong 1 phút, bắt cặp ở 45 oC trong 1 phút, kéo dài ở 72 oC trong 1 phút và giai
đoạn hậu kéo dài ở 72 oC trong 5 phút, lặp lại trong 35 chu kỳ.Quy trình m-PCR có độ
nhạy cao với khả năng phát hiện 20,9 copies/ng (Mhp) và 15,0 copies/ng (Mhr). Độ
đặc hiệu cao và thử nghiệm trên các virus, vi khuẩn thường xuyên có mặt cùng Mhp và
Mhr như PRRSV, HP, APP, Salmonella, Staphylococcusaureus, E.coli và Classical
swine fever virus(CSFV).Quy trình có tính ứng dụng cao khi 11 mẫu thực địa cho kết
quả hoàn toàn đồng nhất với quy trình s-PCR 11/11 (100%).
Keyword:

Multiplex-PCR,

Mycoplasma

hyorhinis, heo

ii

hyopneumoniae,

Mycoplasma


SUMMARY
The infectious diseases on respiratory tract occured commonly and
complicatedly because of rapid transmission and combination with numerous
pathogens


included

Mycoplasma

hyopneumoniae

(Mhp)

andMycoplasma

hyorhinis(Mhr) which are two important agents that causing negative effects on
respiratory tract (lung) and/or arthritis in pigs. Then, the early diagnosis and parallel
detection co-infection of different pathogens to insulate, apply the methods for
treatment and protection are very needful control program at farm-gate. Therefore, the
aim of this studywas to establish a protocol (m-PCR)for simultaneously detection of
Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasmahyorhinisthen furthersupport to get the
rapiddiagnosis in diseases and cost-effectiveness.
The thesis contents included: (1) building a each single protocol for detection
gene of 16s rRNA of Mhpand gene 37p of Mhr, (2) optimizing the multiplex – PCR
protocol and identifying

the effectiveness of developed protocol based on the

sensitivity and specificity,(3) finally applying to diagnose these pathogens from 11
field samples and comparing with s-PCR protocol.
The results were obtained as follows the optimized concentration of primers for
Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37p-F, and Mhr37p-R were 0.5 µM; 0.5 µM; 0.5 µM; 0.5
µM, respectively. The m-PCR consisted of 35 optimized thermal cycles of initial
denaturation at 94 oC for 3 minutes, denaturation at 94 oC for 1 min, annealing at 45 oC

for 1 minute, extension at 72 oC for 1 min and the final extension at 72 oC for 5 mins.
The final m-PCR had very high sensitivity to detect 20.9copies/ng (Mhp)and 15.0
copies/ng (Mhr).The specifictitywas 100% for PRRSV, HP, APP, Salmonella,
Staphylococcusaureus, E.coli và CSFV.This m-PCR protocol could be highly applied in
the field when result of determine Mhp and Mhr on 11 field specimens matched 11/11
(100%) compared with s-PCR.
Keyword:

Multiplex-PCR,

Mycoplasma

hyorhinis, pigs

iii

hyopneumoniae,

Mycoplasma


MỤC LỤC 
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt ............................................................................................................................. ii
Summary .......................................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. vii
Danh sách các bảng ...................................................................................................... viii
Danh sách các hình ......................................................................................................... ix

Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề: ................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu của đề tài : ................................................................................................... 2
1.3 Nội dung thực hiện: ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1Tổng quan về Mycoplasma ......................................................................................... 3
2.2.Tổng quan bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra ........................................ 4
2.2.1Đặc điểm nổi bật của Mycoplasma hyopneumoniae ( Mhp) .................................. 4
2.2.2Dịch tễ học của Mycoplasma hyopneumoniae ........................................................ 5
2.2.3Cơ chế sinh bệnh ..................................................................................................... 5
2.2.4Triệu chứng do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra .............................................. 6
2.2.5Bệnh tíchdo Mycoplasma hyopneumoniae gây ra .................................................. 6
2.3.Tổng quan về bệnh do Mycoplasma hyorhinis gây ra ............................................... 7
2.3.1Đặc điểm nổi bật của Mycoplasma hyorhinis ......................................................... 7
2.3.2Dịch tể học Mycoplasma hyorhinis ......................................................................... 7
2.3.3Cơ chế sinh bệnh ..................................................................................................... 8
2.3.4Triệu chứng do Mycoplasmahyorhinis gây ra ......................................................... 8
2.3.5Bệnh tíchdo Mycoplasma hyorhinis gây ra ............................................................ 8
2.4. Ứng dụng của kỹ thuật m-PCR để phát hiện các tác nhân gây bệnh ....................... 8
2.4.1Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công của m-PCR ................................................. 9
2.4.2Ưu và nhược của kỹ thuật PCR ............................................................................. 10
iv


2.4.3So sánh các phương pháp phát hiện đồng thời Mhp và Mhr ................................. 10
2.5. Đọc kết quả PCR và định lượng DNA ................................................................... 10
2.5.1 Đọc kết quả PCR ................................................................................................. 11
2.5.2 Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang ....................................... 12
2.6.Tình hình nghiên cứu chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma
hyorhinis trong và ngoài nước ....................................................................................... 12

2.6.1Tình hình trong nướcMycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma hyorhinis ... 12
2.6.2Tình hình ngoài nướcMycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma hyorhinis .. 13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................ 15
3.3.1. Phản ứng s-PCR phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae ................................... 18
3.3.1.1Kiểm tra đặc tính chung của các mồi ................................................................. 18
3.3.1.2Bước đầu xây dựng quy trình s-PCR.................................................................. 18
3.3.2Phản ứng s-PCR phát hiện Mycoplasma hyorhinis ............................................... 20
3.3.3. Xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát hiện Mhp, Mhr ................................... 21
3.3.3.1Đánh giá khả năng hoạt động của mồi ............................................................... 21
3.3.3.2Khảo sát nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho phản ứng m-PCR................................ 22
3.3.3.3Xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR .......................................... 23
3.3.3.4Xác định lượng Master mix tối ưu cho phản ứng m-PCR.................................. 23
3.3.3.5Kiểm tra độ nhạy của phản ứng m-PCR............................................................. 24
3.3.3.6Kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng .................................................................... 25
3.3.4. Ứng dụng quy trình m-PCR đã tối ưu trên mẫu thực địa .................................... 26
3.3.4.1Điện di sản phẩm PCR ....................................................................................... 27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 28
4.1. Phản ứng s-PCR phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae ...................................... 28
4.1.1Khảo sát đặc tính chung của các mồi .................................................................... 28
4.1.2Xây dựng quy trình s-PCR .................................................................................... 28
4.2Phản ứng s-PCR phát hiện Mycoplasma hyorhinis .................................................. 35
4.3. Xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát hiện Mhp và Mhr .................................. 39
4.3.1Đánh giá khả năng hoạt động của mồi .................................................................. 39
4.3.2Khảo sát nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho phản ứng m-PCR................................... 39
4.3.3Khảo sát về nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR ......................................... 40
4.3.4Xác định lượng Master mix tối ưu cho phản ứng m-PCR..................................... 41
v


4.3.5Kiểm tra độ nhạy của phản ứng m-PCR ................................................................ 41

4.4Ứng dụng quy trình m-PCR đã tối ưu trên mẫu thực địa ......................................... 43
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 47
PHỤLỤC ....................................................................................................................... 50

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APP

Actinobacillus pleuropneumoniae

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CSFV

Classical swine fever virus

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

E.coli


Escherichia coli

HP

Haemophilus parasuis

LOD

Limit of Detection

m-PCR

Multiplex Polymerase Chain Reaction

MWM

Molecular Weight Marker

Mhp

Mycoplasma hyopneumoniae

Mhr

Mycoplasma hyorhinis

NCBI

National Center for Biotechnology Information


NT

Nghiệm thức

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PRRSV

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

RT-PCR

Reverse transcription polymerase chain reaction

s-PCR

Single Polymerase Chain Reaction

TBE

Tris borate EDTA

UV


Ultraviolet

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Bảng 3.1 Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 15
Bảng 3.2 Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng s-PCR và m-PCR ........................... 16
Sơ đồ 3.3 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 17
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện Mhp ............................................. 18
Bảng 3.5Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát hiện Mhp ................................. 18
Bảng 3.6 Nghiệm thức chuẩn hóa quy trình s-PCR .................................................. 19
Bảng 3.7Chuẩn hóa nhiệt độ trong phản ứng s-PCR ................................................ 19
Bảng 3.8 Chuẩn hóa thể tích Master mix trong phản ứng s-PCR .............................. 20
Bảng 3.9 Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện Mhr .............................................. 20
Bảng 3.10Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát hiện Mhr ............................... 20
Bảng 3.11Chu trình luân nhiệt phản ứng m-PCR phát hiện Mhp và Mhr ................ 21
Bảng 3.12Thành phần phản ứng m-PCR đánh giá khả năng hoạt động của mồi ...... 22
Bảng 3.13Chuẩn hóa nhiệt độ trong phản ứng m-PCR ........................................... 22
Bảng 3.14 Thành phần phản ứng m-PCR xác định nồng độ mồi ............................. 23
Bảng 3.15 Chuẩn hóa thể tích Master mix trong phản ứng s-PCR ............................ 24
Bảng 3.16Nghiệm thức pha loãng DNA .................................................................... 25
Bảng 3.17 Các nghiệm thức kiểm tra độ đặc hiệu ..................................................... 26
Bảng 3.18Các mẫu sử dụng trong quy trình m-PCR và s-PCR ................................. 27
Bảng 4.1 Các đặc tính cơ bản của các cặp mồi .......................................................... 28
Bảng 4.2 Kết quả cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất ....................... 27
Bảng 4.3Kết quả nồng độ DNA và số copies ............................................................ 41
Bảng 4.4 Kết quả phản ứng m-PCR và s-PCR trên các mẫu thực địa ....................... 43


viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 4.1 Kết quả s-PCR phát hiện Mhp ................................................................... 30
Hình 4.2 Kết quả blast trên NCBI cuả trình tự gen 16s rRNA ................................. 31
Hình4.3 Đánh giá mức độ tương đồng của trình tự được giải so với các trình tự
khác được đăng tải trên cơ sở dữ liệu NCBI ............................................................. 32
Hình 4.4 Kết quả chuẩn hóa quy trình s-PCR phát hiện Mhp ở nhiệt độ 43oC ......... 33
Hình 4.5 Kết quả chuẩn hóa quy trình s-PCR phát hiện Mhp ở nhiệt độ 45oC ......... 33
Hình 4.6 Kết quả chuẩn hóa quy trình s-PCR phát hiện Mhp ở nhiệt độ 47oC ........ 33
Hình 4.6 Kết quả chuẩn hóa quy trình s-PCR phát hiện Mhp ở nhiệt độ 49oC ........ 34
Hình 4.7 Kết quả s-PCR phát hiện Mhr .................................................................... 35
Hình 4.8 Kết quả blast trên NCBI cuả trình tự gen 37p ........................................... 35
Hình4.9 Đánh giá mức độ tương đồng của trình tự được giải so với các trình tự
khác được đăng tải trên cơ sở dữ liệu NCBI ............................................................. 36
Hình 4.10 Kết quả chuẩn hóa quy trình s-PCR phát hiện Mhr ở nhiệt độ 43oC........ 36
Hình 4.11 Kết quả chuẩn hóa quy trình s-PCR phát hiện Mhr ở nhiệt độ 45oC........ 37
Hình 4.12 Kết quả chuẩn hóa quy trình s-PCR phát hiện Mhr ở nhiệt độ 47oC....... 37
Hình 4.13 Kết quả chuẩn hóa quy trình s-PCR phát hiện Mhr ở nhiệt độ 49oC........ 37
Hình 4.14 Kết quả đánh giá khả năng hoạt động của mồi ......................................... 38
Hình 4.15 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu .............................................................. 39
Hình 4.16 Kết quả xác định nồng độ mồi tối ưu ....................................................... 39
Hình 4.17 Kết quả xác định lượng master mix thích hợp ......................................... 40
Hình 4.18 Kết quả kiểm tra độ nhạy của phản ứng m-PCR .................................... 41
Hình 4.19 Kết quả lập lại 10 lần ở nồng độ pha loãng 10-9 xác định LOD ............. 41
Hình 4.20 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng m-PCR ................................ 42
Hình 4.21 Kết quả ứng dụng quy trình m-PCR ........................................................ 43


ix


x


Chương 1MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Các bệnh trên đường hô hấp do Mycoplasma hyopneumoniae(Mhp) và viêm
khớp do Mycoplasma hyorhinis(Mhr) đang là một trong số các bệnh gây thiệt hại về
kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi heo trên thế giới nói chung và Việt Nam nói
riêng. Cả hai bệnh trên đều có tốc độ lây lan nhanh do bởi heo dễ tiếp xúc mầm bệnh
trực tiếp hoặc qua môi trường không khí và diễn biến bệnh phức tạp.Theo một nghiên
cứu gần đây nhất của Villarreal (2010) từ tháng 5/2008 đến tháng 3/2009 trên chín
quốc gia Châu Âu trong tổng số 52 đàn heo và 1.555 heo con có 10,7% heo con dương
tính với vi khuẩn này. Tình hình nhiễm bệnh ngày càng gia tăng nhưng vẫn chưa có
con số thống kê chính xác trên toàn thế giới do triệu chứng không đặc trưng.
Bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae xảy ra ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ heo ốm cao
có thể lên đến 80% (Phạm Sỹ Lăng, 2002), tốn chi phí thức ăn do khả năng chuyển
hóa giảm 15-20%, thậm chí không tăng trọng sau vài tháng nuôi dưỡng (Trần Thanh
Phong, 1996). Trước đây, Mycoplasma hyorhinis được biết nhưlà vi khuẩn gây sưng
khớp và viêm thanh dịch nhưng theo nghiên cứu của Kobayashi và ctv (1995) và Labo
và ctv (2011)cho thấyMycoplasma hyorhinis có mặt thường xuyên trên đường hô hấp
kể cả phổi và cùng với Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis cũng là
nguyên nhân dẫn đến hiện tượng đồng nhiễm các tác nhân khác nhưPRRSV,
Pasteurella

multocida,


Actinobacillus

pleuropneumoniae,

Streptococcus

suis,

Haemophilus parasuis trong bệnh Hô hấp phức hợp (PRDC) (Thacker, 2004).
Việc xét nghiệm chẩn đoán là rất quan trọng trong việc phát triển chiến lược
can thiệp kiểm soát bệnh hô hấp trong đàn heo (Thacker, 2004). Để có biện pháp tiêm
chủng phù hợp khi chưa có dịch và điều trị đối với heo bị nhiễm, việc phát hiện tác
nhân gây bệnh nhanh chóng, hiệu quả là rất cần thiết.Phương pháp nuôi cấy phân lập
được xem là “ tiêu chuẩn vàng” để khẳng định sự có mặt của vi khuẩn nhưng hạn chế
là tốn thời gian và cần môi trường chuyên biệt cho Mhp và Mhr phát triển(Freeman và
ctv, 1984). Trước đây các phương pháp huyết thanh học tỏ ra có hiệu quả trong việc
chẩn đoán như phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA), phản ứng kết hợp bổ thể
(CF), phản ứng ELISA và phản ứng miễn dịch huỳnh quang(trích dẫn bởi Nguyễn Tất
Toàn, 2004). Nhưng theoFriis và ctv (1996) phương pháp phát hiện huyết thanh học
1


hiện

đang

bị

cản


trở

bởi

vì

phản

ứng

chéo

giữaMhp,

Mhr

và

Mycoplasmaflocculare.Bên cạnh đó vấn đề về chi phí cho các xét nghiệm cũng được
các hộ chăn nuôi quan tâm.Nhằm giải quyết nhu cầu thực tiễn đó đề tài “Xây dựng quy
trình Multiplex-PCR chẩn đoánMycoplasma hyopneumoniaevàMycoplasmahyorhinis
trên heo có dấu hiệu bệnh hô hấp và viêm khớp” được thực hiện.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát hiện đồng thờiMycoplasma
hyopneumoniaevà Mycoplasma hyorhinisđể có thể chẩn đoán nhanh chóng, chính xác
cả hai tác nhân gây bệnh trên heo.
1.3. Nội dung thực hiện
 Xây dựng phản ứng s-PCRphát hiện Mycoplasma hyopneumoniae.
 Xây dựng phản ứng s-PCRphát hiệnMycoplasma hyorhinis.
 Thiết lậpquy trình Multiplex-PCR với 2 cặp mồi để phát hiện đồng thời

Mycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma hyorhinis.
 Thử nghiệm quy trình m-PCR trên heo mắc bệnh hô hấp và viêm khớp và so
sánh với quy trình đơn.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về Mycoplasma
2.1.1 Đặc điểm chính và phân loài
Đặc điểm phân loài của Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes (Quinn và ctv,
1994).Thuộc bộ Mycoplasmatales,họ Mycoplasmataceae,giống Mycoplasma.Các loài
Mycoplasma gây bệnh trên heo như Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma
hyorhinis, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma flocculae (Holt,1994; trích dẫn bởi Đỗ
Tiến Duy, 2004).
Theo Quinn và ctv (1994), Mycoplasma là những Procaryotes nhỏ nhất, qua
được lọc 0,22 µm. Bộ gen của Mycoplasma khoảng 5x108 dalton nhỏ hơn nhiều so với
vi khuẩn (2x109 dalton). Mycoplasma có cả DNA và RNA, chúng mang bộ gen nhỏ
nhất trong tất cả các cơ thể sống tự do (khoảng từ 580 kb đến 1.380 kb và có ít hơn
300 gen) (Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009). Chúng thiếu gen tổng hợp thành tế bào nên
chỉ được bao bọc bởi màng bào tương, giống như màng tế bào chất của vi khuẩn.
Màng này bao gồm: protein, glycoprotein, glycolipid và photpholipid. Vì không có
thành tế bào nên Mycoplasma rất mềm và có nhiều hình dạng như hình cầu, bầu dục,
que, dạng xoắn, dạng vòng.Mycoplasma thuộc Gram âm nhưng chúng bắt màu rất yếu
với thuốc nhuộm Gram; thường được nhuộm bằng phương pháp Giemsa,
Romanowsky.
Nuôi cấy và phân lập Mycoplasma rất khó vì nó đòi hỏi môi trường dinh dưỡng
khá cao, mọc chậm và dễ bị lấn át bởi các vi khuẩn khác và nấm. Hầu hết các
Mycoplasma sống kỵ khí tùy nghi hoặc hiếu khí, cần bổ sung 5-10% CO2, nhiệt độ
thích hợp là 37oC, pH 7-8. Trong môi trường thạch, khuẩn lạc của Mycoplasma có

dạng trứng chiên có kích thước nhỏ, sau 2-6 ngày nuôi cấy có thể quan sát bằng kính
lúp hoặc kính hiển vi (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001; trích dẫn bởi
Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009).
Trong tự nhiênMycoplasmacó thể sống ký sinh hay hoại sinh, tuy nhiên phần
lớn sống ký sinh.Chúngchỉ sống và phát triển mạnh ở một số vật chủ cụ thể (dải thích
nghi hẹp).Mycoplasma gây bệnh tự nhiên ở động vật có vú, chim, bò sát, chân đốt,

3


thực vật và cá. Theo Đỗ Tiến Duy (2004) thì những loại gây bệnh hay không gây bệnh
đều tìm thấy trên màng nhầy đường hô hấp, tiêu hóa, sinh dục và tuyến vú.
Sức đề kháng của Mycoplasmathì rất nhạy cảm đối với các tác nhân vật lý, hóa
học do không có thành peptidoglycan (Trần Thanh Phong, 1996). Chúng đề kháng với
kháng sinh tác động lên thành tế bào như nhóm β-lactam nhưng lại rất nhạy cảm với
các kháng sinh tác động lên quá trình sinh tổng hợp protein hay nucleic acid.
Mycoplasma gây bệnh bằng cách bám chắc trên màng nhày vật chủ. Những vi
khuẩn này sống ngoại bào và sản sinh ra haemolysin, protease, nuclease và những yếu
tố độc khác có thể dẫn đến chết tế bào chủ hoặc nhiễm trùng mãn tính. Đường hô hấp
và phổi lànơi thường gặp Mycoplasma nhất, Mycoplasma có thể phá hủy lôngrung tế
bào đường hô hấp. Do đó, chúng mở đường cho các vi sinh vật khác xâm nhiễm. Bệnh
thường xảy ra ở dạng tiềm ẩn, thể nhẹ hay thể mãn.
2.2 Tổng quan bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra
Bệnh được phát hiện đầu tiên trên thế giới vào năm 1907 và lan nhanh.Đến nay
bệnh hầu như xuất hiện khắp nơi. Năm 1933, Kobe (Đức) phát hiện bệnh viêm phổi
mãn tính trên heo và bệnh được gọi là bệnh cúm heo. Nghiên cứu của Pullar (1948),
Gulrajani và Beveridge (1951) đã mô tả đặc điểm của bệnh viêm phổi địa phương và
phân biệt với bệnh cúm heo. Sau đó bệnh xuất hiện ở khắp các nước như Mỹ, Pháp,
Thụy Sĩ, Hungari, Bỉ, Phần Lan, Trung Quốc, Nhật Bản và châu Phi (trích dẫn bởi Đỗ
Tiến Duy, 2005).Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào những năm 1957 từ đàn heo

ngoại nhập vào miền Bắc sau đó lan tràn nhanh tuy nhiên vào thời điểm đó chưa xác
định được nguyên nhân gây bệnh.
2.2.1 Đặc điểm nổi bật của Mycoplasma hyopneumoniae ( Mhp)
Ngoài những đặc điểm chung của giống, Mhp có những đặc điểm riêng như
khuẩn lạc không lồi lên ở giữa, không có dạng trứng chiên như các Mycoplasma khác,
khuẩn lạc có kích thước 200-400µm sau 5-10 ngày nuôi cấy(Trần Thanh Phong,
1996). Chúng có các protein có khối lượng phân tử 40,43, 64, 74, 97 kDa giúp phân
biệt với Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma flocculare (theo Đỗ Tiến Duy, 2004). Do
không có thành tế bào nên đề kháng kém với nhiệt độ và các chất sát trùng thông
thường, Mhp có khả năng sản sinh độc tố Cytotocin nhưng độc tố bị vô hoạt ở 100oC
trong 15 phút. Mhp bị vô hoạt trong 48 giờ ở điều kiện khô nhưng có thể tồn tại 17
ngày trong môi trường nước mưa ở 2-7 oC.
4


2.2.2 Dịch tễ học của Mycoplasma hyopneumoniae
Bệnh chủ yếu lây qua đường không khí bằng cách tiếp xúc trực tiếp giữa mẹ và
heo con (mũi và mũi) thường heo mẹ là những thú mang trùng (carrier swine) mầm
bệnh khu trú trong đường hô hấp, dễ dàng truyền lây sang heo con. Trên heo nuôi thịt,
sự lây lan bệnh xảy ra trong đàn có heo mắc bệnh, sau cơn ho có rất nhiều hạt nhỏ,
chất tiết lơ lửng trong không khí, heo khỏe mạnh hít phải sẽ mắc bệnh. Hoặc mầm
bệnh có thể phát tán qua không khí với đường kính lên đến 3 - 3,5 km,do đó làm lây
lan bệnh từ trại này sang trại khác nhất là trong điều kiện thời tiết lạnh và ẩm (Quách
Tuyết Anh, 2003). Bệnh do Mhp được xem là một bệnh có thời gian ủ bệnh khá dài (2
tuần) và sự truyền lây khá chậm. Tuy nhiên tỉ lệ nhiễm sẽ tăng theo độ tuổi. Khi được
20 tuần tuổi tỉ lệ nhiễm bệnh có thể lên tới 100%.
2.2.3 Cơ chế sinh bệnh

Sau khi theo đường hô hấp vào trong phế quản và tiểu phế quản, Mhp bám lên
tế bào lông rung nhờ vào protein 97 kDa, xâm lấn bề mặt tế bào biểu mô của lông rung

(không xâm lấn vào tế bào chất) và phế nang làm phá hỏng hệ thống tiết dịch nhày, hư
hại lông rung và biểu mô đường hô hấp. Chính những tổn thương ở hệ thống lông rung
và biểu mô tạo điều kiện cho sự kế phát các vi sinh vật khác. Sau đó Mhp phân tán độc
tố làm ức chế đại thực bào ở phế nang. Độc tố còn tác động lên hệ thống miễn dịch
đưa đến sự tăng sinh hạch bạch huyết quanh phế quản và tiểu phế quản. Tuy nhiên
không có bằng chứng cho thấy sự xâm nhập của Mhp vào các tế bào lympho quanh
tiểu phế quản.
Mhp chỉ gây những tổn thương nhỏ và những biểu hiện cận lâm sàng khi nhiễm
đơn độc nhưng khi kế phát các bệnh đường hô hấp khác triệu chứng và biểu hiện của
bệnh kế phát sẽ trở lên trầm trọng hơn. Khi nhiễm Mhp heo con sẽ trở lên nhạy cảm
hơn với sự tấn công của Pasteurella multocida. Heo nhiễm kế phát virus PRRS
(Porcine reproductive and respiratory syndrome) gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh
sản trên heo sau khi nhiễm nguyên phát Mhp thì tổn thương ở phổi sẽ trầm trọng hơn
so với heo nhiễm nguyên phát virus PRRS (Thacker, 2004). Theo Yazawa và ctv
(2004) cho biết tổn thương ở phổi của heo nhiễm Mhp và virus cúm heo sẽ trầm trọng
hơn so với heo chỉ nhiễm Mhp (trích dẫn bởi Marois, 2007).

5


2.2.4 Triệu chứng do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra

Các triệu chứng do Mycoplasmahyopneumoniaegây ra thường phụ thuộc vào
thể bệnh mà vật chủ nhiễm phải, có 3 thể bệnh chủ yếu. Thể mãn tính thường xuất
hiện trên heo nuôi thịt triệu chứng không điển hình như ho nhiều, ho khan, kéo dài
trong nhiều tuần, không có dấu hiệu chảy nước mũi và sốt, thú tăng trọng hơi chậm,
tăng chỉ số biến chuyển thức ăn do đó ít được các nhà chăn nuôi lưu ý. Tuy nhiên thể
bệnh này gây thiệt hại kinh tế lớn nhất do heo chậm lớn và tiêu tốn thức ăn cao.
Thứ hai là thể mang trùng thường xảy ra trên heo giống (nái, nọc) hoặc heo
nuôi thịt có thời gian nuôi trên 6 tháng tuổi.Hiện tượng mang trùng trên heo có thể kéo

dài rất lâu, từ nhiều tháng đến nhiều năm.Trên lâm sàng không thấy rõ các triệu chứng,
thỉnh thoảng có những cơn ho nhẹ, thành tích sinh sản có xu hướng giảm thấp, tốc độ
tăng trọng giảm thấp đến 15%.
Đối với thể viêm phổi phức hợp thường hay xảy ra trên heo con giai đoạn sau
cai sữa, sau khi đã nhiễm Mycoplasma vài tuần và điều kiện nuôi dưỡng không tốt, các
vi khuẩn, virus khác như PRRSV, Pasteurella multocida, Actinobacillus
pleuropneumoniae, Haemophilus parasuisđồng nhiễm gây nên bệnh hô hấp phức hợp.
Với các triệu chứng: ho nhiều, thở nhanh, rất khó thở sau cơn ho, bệnh tiến triển trong
2 - 3 tuần thì giảm dần, tỉ lệ chết thấp nhưng tốc độ tăng trưởng rất chậm. Nếu cảm
nhiễm nặng heo sẽ sốt cao, bỏ ăn, rất khó thở, tỉ lệ chết khoảng 20 – 25%. Các heo
được chữa khỏi thường bị còi, bệnh tích viêm phổi tồn tại đến lúc giết mổ.
2.2.5 Bệnh tích do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra trên heo
Bệnh tích đại thể trên heo gồm những vùng rắn chắc màu đỏ sậm đến tím. Bệnh
tích thường xuất hiện ở vùng trung gian của thùy giữa và thùy đỉnh, thùy phụ và phần
đỉnh của thùy hoành cách mô. Các vùng tổn thương có ranh giới rất rõ với các vùng
khác. Trên những heo khác nhau mức độ và phạm vi tổn thương ở phổi cũng khác
nhau. Dịch nhày trắng được tìm thấy ở khí quản, phế quản và tiểu phế quản, hạch
lympho quanh phế quản, tiểu phế quản và quanh mạch máu triển dưỡng.Khảo sát bệnh
tích vi thể trên heo viêm phổi địa phương cho thấy một lượng lớn bạch cầu đơn nhân,
bạch cầu đa hình thái và dịch phù tích trong phế nang và đường thở. Có sự xâm nhiễm
tế bào lympho vào trong các tiểu động mạch và tiểu tĩnh mạch (Whilestone, 1972;
trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2004).

6


2.3 Tổng quan về bệnh do Mycoplasma hyorhinis gây ra
2.3.1 Đặc điểm nổi bật của Mycoplasma hyorhinis
Khác với các loài khác,Mycoplasma hyorhinisyêu cầu điều kiện hiếu khí để
phát triển (Roberta vàRichard, 1995). Để phân lập chúng cần 3 - 5 ngày nhưng để

chúng phát triển trên môi trường nuôi cấy chỉ cần 1 – 2 ngày.Mhr lên men đường và
không sử dụng arginine hoặc thủy phân ure. Khuẩn lạc của Mhr từ 2 - 5 ngày có
đường kính khoảng 0,5- 1mm và có hình thái dạng trứng chiên điển hình(Friis, 1996).
Chúng thường được tìm thấy trên màng nhầy ở đường hô hấp và hạch
amidan.Cole và ctv (1985) đề cập là Mhr cư trú với số lượng lớn bên trong mũi của
heo trưởng thành và heo đang phát triển.Chúng dễ dàng lây lan đến phổi và Mhr được
coi là một yếu tố phức hợp gây bệnh viêm phổi trên heo con (Friis,1996).
Theo nghiên cứu của Kobayashi và ctv (1995) trên 55 heo con về sự nhiễm
đồng thời Mhr trên heo mắc PRRS cho kết quả có 44 trường hợp phân lập được Mhr.
Mặt khác, Mhp được phân lập chỉ có 4/55heo con được kiểm tra và
Mycoplasmahyosynoviae là không có sự hiện diện. Những mẫu sau khi phân lập đã
được kiểm tra bằng phản ứng PCR để khẳng định độ chính xác. Điều này cho thấy,
Mhr có sự đồng nhiễm trong bệnh PRRS nói riêng và bệnh PRDC nói chung và là tác
nhân hiện diện đồng thời với Mhp nên việc phân biệt 2 loài này là quan trọng.
2.3.2 Dịch tể học Mycoplasma hyorhinis
Theo Friis(1996)Mhr nhiễm vào heo con sau khi sinh bằng con đường tiếp xúc
dịch mũi của heo nái và heo lớn tuổi hơn.Vi khuẩn có thể được phân lập khoảng 10%
từ dịch tiết xoang mũi của heo nái và 30-40% từ dịch mũi của heo sau cai sữa. Mhr có
thể được phân lập từ mô phổi của heo con được kiểm soát (SPF-Specific Pathogen
Free) (20%) và heo con bình thường (66%) (Kobisch,1996).
Theo Lobo (2011) những khếch đại và nghiên cứu trên vùng intergenic 16S23S của Mhr chứng minh sự thay đổi giữa các dòng của cùng một loài. Mhr là
mộttrong những tác nhânbệnh nguyêncủabệnh viêm khớp ởheo, nhưngnhững nghiên
cứu gần đâycho thấy một số chủngMhr có thể gây viêm phổimà không thểphân biệt
với cácbệnhdoMhp. Những phát hiện cho thấy rằng trong bệnh viêm phổi mãn tính,
nhiễm đồng thời Mhr có thể làm tăng tổn thương viêm phế quản gây viêm màng
phổi(Lobo và ctv,2011).

7



2.3.3 Cơ chế sinh bệnh
Mycoplasma hyorhinis là vi khuẩn hội sinh phổ biến ở đường hô hấp gây viêm
thanh dịch (Polyserositis) và viêm khớp trên heo sau cai sữa. Chúng thường kết hợp
với các tác nhân khác như Mhp, Actinobacilluspleuropneumoniae xâm nhập vào niêm
mạc đường hô hấp sau đó phá hủy các tế bào niêm mạc dẫn đến tạo điều kiện để cho
các vi khuẩn khác xâm nhập vào thể chủ. Bùngphát bệnh sẽ xảy ra ở heo 3-10 tuần
tuổi nhưng đôi khi trên heo lớn hơn (Ross, 1992).
2.3.4 Triệu chứng do Mycoplasmahyorhinis gây ra
Các biểu hiện sẽ xuất hiện sau 3-10 ngày kể từ khi tiếp xúc với mầm bệnh hoặc
gây stress. Những biểu hiện lâm sàng ở đường hô hấp như khó thở kéo dài ở vùng
khác bao gồm sốt cao, khập khyễn, lười vận động, di chuyển khó khăn và gây sưng
khớp đặc biệt là ở chân sau (Kobisch, 1996).
2.3.5 Bệnh tíchdo Mycoplasmahyorhinis gây ra trên heo
Tổn thương cấp tính được đặc trưng bởi viêm màng phổi, viêm fibrin màng
ngoài tim và viêm phúc mạc. Tổn thương mãn tính được đặc trưng bởi dính màng phổi
và màng ngoài tim. Trong heo, Mhr chủ yếu được tìm thấy trong các trường hợp viêm
khớp và thường ảnh hưởng đến chân sau.Khớp có thể chứa một lượng lớn chất lỏng và
fibrin, với màng hoạt dịch dày lên và màu đỏ. Tổn thương tổng thể và những quan sát
mô bệnh học giống hệt nhau từ những trường hợp nhiễm Haemophilus parasuis(bệnh
Glasser), vì vậy để chẩn đoán chính xác và phân biệt cần thiết phải thực hiện xét
nghiệm PCR hoặc cố gắng cô lập vi khuẩn, từ đó xác định điều trị kháng sinh thích
hợp cho đàn gia súc bị ảnh hưởng.
2.4 Ứng dụng của kỹ thuật m-PCR để phát hiện các tác nhân gây bệnh
Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự (1985) phát minh đến tháng
10/1993, Kary Mullis cùng với Micheal Smith đã nhận giải Nobel hóa học nhờ thành
tựu này.Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp DNAdựa
trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt
động của enzym DNApolymerase và một cặp primer đặc hiệu, là các đoạn
oligonucleotide ngắn. Cácmạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn
cho quá trình tổng hợpmạch mới của chu kỳ tiếp theo(Khuất Hữu Thanh, 2003).

PCR hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: chẩn đoán, vân
tay di truyền, tách dòng gen, gây đột biến…trong đó được ứng dụng trong chẩn đoán
8


bệnh cho kết quả chính xác, nhanh chóng và hiệu quả rất có ích cho việc phát hiện và
điều trị bệnh. Theo thời gian PCR đã phát triển nhiều loại khác nhau để phục vụ
chocác mục đích nghiên cứu khác nhau như Nested-PCR, RT-PCR, Mutiplex-PCR,
Realtime-PCR.
2.4.1Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công của m-PCR
Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông
thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản
ứng. Phương pháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng
thành công trong nhiều nghiên cứu gồm có phân tích mất đoạn, đột biến, đa hình hoặc
trong các phương pháp định lượng kết hợp với kỹ thuật PCR sao chép ngược (RTPCR). Cho đến nay chưa có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối
ưu hóa phản ứng multiplex-PCR. Do đó, ứng với mỗi phản ứng cần phải điều chỉnh
cho phù hợp với mục đích mong muốn.
Có 2 dạng m-PCR là phản ứng dùng cùng một khuôn mẫu nhưng có thể dùng
nhiều cặp mồi và phản ứng m-PCR trong đó dùng nhiều khuôn mẫu và nhiều cặp mồi
trong cùng một phản ứng.Các thông số quyết định trong phản ứng multiplex PCR
(Henegariu,1994):
Mồi và nồng độ mồi: Việc lựa chọn mồi tuân theo các quy tắc cơ bản sau: chiều
dài mồi khoảng 18 – 24 bp hoặc hơn và phần trăm GC chiếm 35 % - 60 %, do vậy,
nhiệt độ gắn mồi vào khoảng 55 – 58oC hoặc cao hơn. Những mồi dài hơn cho phép
phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn và thu được ít sản phẩm không
đặc hiệu hơn. Việc kết hợp nhiều mồi trong các hỗn hợp phản ứng khác nhau và nhân
lên đồng thời nhiều locus đòi hỏi sự thay đổi và tối ưu các thông số của phản ứng. Lần
đầu khi thực hiện phản ứng multiplex PCR, nên sử dụng các mồi với một đương lượng
gram tương đương nhau (cùng nồng độ). Kết quả này sẽ cho ta thấy những nồng độ
mồi nào hay các thông số nào cần phải thay đổi. Từ đó tăng nồng độ mồi đối với các

locus “yếu” và giảm lượng mồi đối với các locus “mạnh”. Nồng độ cuối cùng của các
mồi thay đổi đáng kể giữa các locus và được tính toán tuỳ theo kinh nghiệm.
Nhiệt độ gắn mồi: đối với các locus được nhân lên riêng biệt, thời gian gắn mồi
(30 – 120 giây) và thời gian kéo dài (30 – 150 giây) không ảnh hưởng rõ rệt tới kết
quả, nhưng tính đặc hiệu của sản phẩm PCR tăng lên hoặc giảm đi phụ thuộc rất nhiều

9


vào sự thay đổi nhiệt độ gắn mồi. Thấy rằng việc hạ thấp nhiệt độ gắn mồi từ 4-6oC là
cần thiết đối với các locus được nhân lên đồng thời trong phản ứng multiplex PCR.
Nồng độ Mg2+ và dNTP: Để làm việc một cách có hiệu quả, Taq polymerase
đòi hỏi phải có Mg2+ tự do, vì vậy nếu gia tăng nồng độ dNTP có thể ức chế tức thời
phản ứng PCR, ngược lại việc tăng nồng độ Mg2+ thường mang lại hiệu quả rõ
rệt.Nồng độ Mg2+ yêu cầu cho một phản ứng PCR chuẩn là 1,5mM và nồng độ dNTP
vào khoảng 200µM mỗi loại. Nồng độ Mg2+ phù hợp việc khuếch đại trở nên đặc hiệu
hơn, các sản phẩm thu được có độ tập trung cao và với nồng độ Mg2+ cao phản ứng bị
ức chế, sản phẩm trở nên khó có thể quan sát. dNTP với nồng độ cao làm cho việc
khuếch đại tức thời bị ức chế và nồng độ dNTP thấp hơn cho phép khuếch đại phản
ứng PCR nhưng với lượng sản phẩm ít hơn.
Nồng độ DNA khuôn và enzyme: ở lượng ADN khuôn vào khoảng 30 và
500ng/25 µl phản ứng, tuy nhiên dưới 30 ng, sản lượng của một vài sản phẩm PCR bị
giảm xuống. Khi lượng ADN khuôn rất nhỏ (tính bằng pg), việc khuyếch đại đặc hiệu
và có hiệu quả vẫn có thể thu được bằng cách hạ thấp hơn nữa nhiệt độ gắn mồi, đôi
khi xuống từ 10 - 12oC. Nồng độ enzyme hiệu quả nhất vào khoảng 0,4 ul hoặc
2U/25µl thể tích phản ứng.
2.4.2 Ưu và nhược của kỹ thuật PCR
Ưu điểm của kỹ thuật PCR có độ nhạy cao, thời gian thực hiện nhanh, thao tác
đơn giản, yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao, lượng mẫu cần ít. Tuy nhiên
bên cạnh những ưu điểm trên, để thực hiện phương pháp PCR cần có DNA mồi đặc

trưng cho DNA cần khuếch đại, để có đoạn mồi này cần phải biết trước trình tự
nucleotide cần khuếch đại. DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb, cần thận trọng
đăc biệt trong thao tác tiến hành dễ dẫn đến ngoại nhiễm.
2.4.3 So sánh các phương pháp phát hiện đồng thời Mhp và Mhr
Có nhiều phương pháp được dùng để phát hiện đồng thời Mhp và Mhr nhưng
tùy thuộc vào mục đích và điều kiện ta phải lựa chọn được các phương pháp tốt nhất.
Trong tình hình dịch bệnh hiện nay việc phát hiện nhanh chóng và chính xác cả hai tác
nhân cùng một lúc là điều quan trọng. Đối với chẩn đoán lâm sàng do Mhp và Mhr gây
ra bệnh tích và triệu chứng khá đặc trưng như ho kinh niên, ho lúc di chuyển, chậm
lớn, còi cọc, tử số thấp, bệnh chậm phát triển, lây lan mạnh, bệnh thường tái phát
(Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009), có nhiều dịch lỏng ở khớp và gây què quặt ở các chi
10


nhưng không chuyên biệt và có khi bị nhầm với các tác nhân gây bệnh khác. Việc
phân lập vi khuẩn được xem là “tiêu chuẩn vàng” để kết luận sự hiện diện của vi
khuẩn nhưng chúng thường gặp nhiều khó khăn do Mhp và Mhr cần môi trường nuôi
cấy chuyên biệt, khó mọc, mọc chậm và thường bị vấy nhiễm bởi các vi khuẩn khác
(Trần Thị Dân và ctv, 2005). Theo Freeman và ctv (1984) thì khuẩn lạc Mycoplasma
hyorhinis dễ dàng mọc và che lấp khuẩn lạc Mycoplasma hyopneumoniae.
Trước đây các phương pháp huyết thanh học tỏ ra có hiệu quả trong việc chẩn
đoán như phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA), phản ứng kết hợp bổ thể (CF),
phản ứng ELISA và phản ứng miễn dịch huỳnh quang(trích dẫn bởi Nguyễn Tất Toàn,
2004). Nhưng theoFriis và ctv (1996) phương pháp phát hiện huyết thanh học hiện
đang bị cản trở bởi vì phản ứng chéo giữaMhp, Mhr và Mycoplasmaflocculare.
Vì vậy PCR là phương pháp thường được chọn để chẩn đoán tác nhân gây bệnh
thay thế cho phương pháp chẩn đoán khác.Theo Calsamiglia (1998) cho rằng phương
pháp PCR có độ chính xác cao, ít tốn kém thời gian, và không phụ thuộc vào sự sống
hay chết của tác nhân (trích dẫn bởi Nguyễn Tất Toàn, 2004).
2.5 Phương pháp đọc kết quả PCR và định lượng DNA

2.5.1 Đọc kết quả phản ứng PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc của phương pháp điện di được dựa trên đặc tính DNA là các đại phân
tửtích điện âm sẽ di chuyển về điện cực dương của từ trường dưới tác động của điện
trường. Sự di chuyển của các phân tử trong bản gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử
(số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel, điện thế của điện trường.Điện di
được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc thẳng đứng. Để nhận biết sự di chuyển
của phân tử DNA người ta có thể sử dụng một dung dịch có màu (loading dye). Trong
quá trình điện di, phân tử có màu này sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử DNA và ta có
thể nhìn thấy một vạch dài có màu này. Sau khi điện di, bản gel sẽ được nhuộm với
dung dịch ethidium bromide. Ethidium bromide có khả năng gắn xen giữa các liên kết
hidro giữa các base của nucleic. Chất này sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia
UV (bước sóng λ=300nm) tạo thành vạch đỏ da cam (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí
Bửu, 2005). Để ước lượng kích thước phân tử DNA trên gel agasore, người ta sử dụng
một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker – MWM). Đây là
một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết (DNA ladder).
11


2.5.2 Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang
Theo Đoàn Thị Nhung (2013) nguyên tắc dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tia
tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang
ở bước sóng 260 nm (OD260 nm – Optical Density 260 nm) của các mẫu đo cho phép
xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan sau:
Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một nồng độ là:
- 50 µg/ml cho một lượng dung dịch DNA sợi đôi.
- 40 µg/ml cho một lượng dung dịch DNA hay RNA sợi đơn.
Hàm lượng DNA được xác định bằng công thức: [DNA] = OD260 x 50 x X (µg)
Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch DNA gốc ban đầu.
Phương pháp này đơn giản, nhanh, nhưng có hạn chế là giá trị đọc được về độ

hấp thụ có thể bị ảnh hưởng khi trong mẫu chứa RNA và protein. Vì vậy, trong thực tế
phương pháp này thường được dùng để định lượng các mẫu DNA tinh khiết.
Độ sạch DNA được xác định bằng tỉ số OD260/ OD280. Nếu tỉ số này > 1,8 thì
dung dịch DNA đem đo được coi là sạch. Khái niệm sạch ở đây là lượng protein còn
lại trong dung dịch DNA tách được.
DNA (µg/ml) = [(62,9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x độ pha loãng
OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 260 nm.
OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 280 nm.
n: Độ pha loãng (thường n = 100).
2.6 Tình hình nghiên cứu chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma
hyorhinis trong và ngoài nước
2.6.1 Nghiên cứu trong nước về Mycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma
hyorhinis
Vào năm 2005, Trần Thị Dân và ctv đã thực hiện nghiên cứu “Xác định tuổi
nhiễm và các phương pháp phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae, virus PRRS ở trại
chăn nuôi heo.”
Trần Văn Trường (2009) chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae trên 3 loại mẫu
bệnh: mẫu phổi nghi nhiễm Mhp trên heo thịt, mẫu canh nuôi cấy phân lập từ phổi
nghi ngờ nhiễm Mhp trên môi trường thạch Friis, mẫu dịch hầu họng (dịch mũi) trên
heo từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi bằng kỹ thuật PCR và ELISA. Kết quả PCR 100%
12


mẫu dịch hầu họng dịch mũi) âm tính, 12,5% mẫu phổi dương tính, 80% mẫu canh
nuôi cấy phân lập, nghiên cứu này cũng thực hiện kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng
thể chống Mhp và có 10,53% mẫu huyết thanh dương tính. Cho thấy tùy vào mục đích
sử dụng mà có biện pháp khác nhau.
Hiện nay nước ta đang dần có nhiều nghiên cứu liên quan đến Mycoplasma
hyopneumoniae bằng các kỹ thuật hiện đạido thấy được những thiệt hại mà nó mang
lại cho ngành chăn nuôi nói riêng và nông nghiệp nói chung, không chỉ ảnh hưởng về

kinh tế mà còn cả về chất lượng nuôi vì heo có thể mang mầm bệnh mãn tính và việc
lây lan trong đàn cũng như trong những đàn khác nhau là rất dễ xảy ra. Nhưng chỉ
dừng lại ở việc phát hiện đơn tác nhân mà chưa quan tâm nhiều đến Mycoplasma
hyorhinis và chưa có nghiên cứu sau về mối quan hệ giữa các bệnh trên đường hô hấp
với nhau. Cũng chưa có nhiều khuyến cáo cho người chăn nuôi về tình hình bệnh.
2.6.2 Nghiên cứu ngoài nướcvề Mycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma
hyorhinis
Năm 2008, Palzer và ctv đã đánh giá mối liên quan giữa tác nhân gây bệnh khác
nhau trong sự phát triển của viêm phổi và viêm phế quản phổi ở heo. Mẫu dịch rửa phế
quản từ 100 con heo không có dấu hiệu lâm sàng và 239 heo có dấu hiệu lâm sàng của
bệnh đường hô hấp đã được kiểm tra Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma
hyorhinis, virus gây hội chứng sinh sản và hô hấp ở heo (PRRS ) chủng Bắc Mỹ, virus
PRRS chủng Châu Âu,Circovirustype 2(PCV2), loại virus cúm A, loài Streptococcus
alpha-tan huyết, loài Streptococcus beta-tan máu, Posteurella multocida, Bordetella
bronchiseptica, Haemophilus parasuis và Actinobacillus pleuropneumaniae.
Metta Makhanon và ctv (2011) đã nghiên cứu so sánh các quá trình phát hiện
Mycoplasma hyoneumoniae, Mycoplasma hyosynoviae, và Mycoplasma hyorhinis
trong mẫu phổi, hạch amidan và dịch hoạt của heo được giết mổ và phân phối tại Thái
Lan. Tổng cộng 724 mẫu gồm phổi, hạch amidan và các dịch lỏng từ 270 con heo giết
mổ được sử dụng. Các mẫu này từ các con heo được theo dõi có dấu hiệu lâm sàng, bị
tổn thương phổi và khớp. Kết quả giữa nuôi cấy trước khi tiến hành PCR (CPP) và
phản ứng PCR trực tiếp (DP) cho thấy tỷ lệ nhiễm chung giữa Mhp, Mycoplasma
hyosynoviaevàMhrtương ứng là 40,3% , 12,3% và 64,6%.
Năm 2013, nghiên cứu từ đại học Quốc gia Seoul trong việc sử dụng quy trình
m-PCR phát hiện tác nhân gây bệnh cho thấy trong 312 trường hợp phát hiện
13