BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐẶC TRƯNG KIỂU GENE S VÀ GENE M CỦA PORCINE
EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS (PEDV) GÂY BỆNH
TIÊU CHẢY CẤP TRÊN HEO TRONG GIAI ĐOẠN
TỪ 2011 - 2013

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: THẠCH LỜI

Niên khóa

: 2009 - 2013

Tháng 06/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐẶC TRƯNG KIỂU GENE S VÀ GENE M CỦA PORCINE
EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS (PEDV) GÂY BỆNH
TIÊU CHẢY CẤP TRÊN HEO TRONG GIAI ĐOẠN
TỪ 2011 - 2013

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

THẠCH LỜI

ThS. ĐỖ TIẾN DUY

Tháng 06/2013


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
Nguyễn Tất Toàn, Giảng viên Khoa Chăn nuôi thú y, Trường đại học Nông
Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Đỗ Tiến Duy, Giảng viên Khoa Chăn nuôi thú y, Trường đại học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh.
Đã t ận tình hư ớng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện, hoàn thành tốt luận văn
tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm
Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức

quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học và Khoa Chăn nuôi thú y và các cán bộ
Bệnh viện thú y Trường đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp.
Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học khóa 2009 trường đại học
Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã luôn luôn bên tôi nh ững lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ
buồn vui trong quá trình học và quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dư ỡng dục con
nên người, để con được như ngày hôm nay.
Tp, Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Sinh viên
Thạch Lời

i


TÓM TẮT
Trong những năm qua, ngành chăn nuôi heo đang đứng trước nhiều khó khăn
do dịch bệnh liên tiếp xảy ra, trong đó có dịch tiêu chảy cấp trên heo con gây thiệt hại
nặng nếu không có biện pháp phòng ngừa và ngặn chặn kịp thời. Bệnh do một loại virút có tên là PED, vi-rút này rất dễ bị biến chủng và thay đổi độc lực. Do đó việc xác
định đặc trưng và sự đa dạng kiểu gene của PEDV qua các năm xảy ra dịch bệnh tại
Việt Nam (2011 - 2013). Giải trình tự và so sánh sự khác biệt trên đoạn gene S (spike
protein) và gene M (membrane protein) của chủng PEDV (Porcine epidemic diarrhea
virus) là rất cần thiết.
9 mẫu ruột non heo bị tiêu chảy cấp dương tính với PEDV được chọn để phân
tích đặc trưng và đa dạng di truyền. Các mẫu này thu thập từ các địa phương khác
nhau bao gồm 2 mẫu ở Đồng Nai (VN01S1, VN01M1; VN01S2, VN01M2), 1 mẫu ở
Đăk Lăk (VN02S3, VN02M3), 1 mẫu ở Tây Ninh (VN02S4, VN02M4), 2 mẫu ở Lâm
Đồng (VN02S5; VN03S9, VN03M9), 1 mẫu ở Bình Dương (VN02S6, VN02M6) và 2
mẫu ở Bà Rịa - Vũng Tàu ( VN03S7, VN03M7; VN03S8, VN03M8).

Qua kết quả nghiên cứu, thấy có sự đa dạng di truyền giữa các chủng PEDV
Việt Nam trong đợt dịch từ năm 2009 - 2013. Cả 3 phân nhánh nhỏ trong nhóm I của
2 cây sinh dòng của các chủng PEDV Việt Nam đều tương đồng cao và rất gần với
chủng JS-2004-2/DX (Trung Quốc), 07NP01 (Thái Lan) trên cả hai gene S và M.

ii


SUMMARY
The thesis “Genetic characterization of the partial S gene and M gene of
Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) caused acute diarrhea in pigs in 2011 2013” was performed during 5 months from 15/12/2012 to 15/05/2013 at Veterinary
Hospital of Nong Lam University. The objective of this study was to identify genetic
characterization and genetic diversity of PEDV over the years of outbreaks in Vietnam
(2011 - 2013) through sequencing and comparing the differences in the gene S gene
(spike protein) and gene M (membrane protein).
There were 9 intestinal specimens from PEDV - positive pigs dealing with
acute diarrhea were chosen to analyze genetic characteristics and diversity. The
samples collected from various localities including 2 samles in Dong Nai (VN01S1,
VN01M1; VN01S2, VN01M2), 1 sample in Dak Lak (VN02S3, VN02M3), 1 sample
in Tay Ninh (VN02S4, VN02M4), 2 samples in Lam Dong (VN02S5; VN03S9,
VN03M9), 1 sample in Binh Duong (VN02S6, VN02M6) and 2 samples in Ba Ria Vung Tau (VN03S7, VN03M7; VN03S8, VN03M8).
There was genetic diversity among strains of PEDVs in different outbreaks in
Vietnam during 2009 - 2013, divided into 3 small branches in phylogenetic tree
following sampling time-point in 2009/2010 and in 2011/2013. All 3 small branches
in Group I of phylogenetics (gene S and M) of Vietnamese PEDV strains had
nucleotide homology with each other and ranged from 99.2 to 99.9%, and they had
very close relationship with strain JS-2004-2 / and DX (China) and strain 07NP01
(Thailand).

iii



MỤC LỤC
Trang
Tóm tắt ........................................................................................................................ii
Summary ....................................................................................................................iii
Danh sách chữ viết tắt.................................................................................................vi
Danh sách các bảng ...................................................................................................vii
Danh sách các hình ...................................................................................................viii
Chương 1 Mở đầu........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................1
1.2.Yêu cầu của đề tài..................................................................................................1
1.3. Nội dung thực hiện................................................................................................2
Chương 2 Tổng quan tài liệu........................................................................................ 3
2.1. Dịch tiêu chảy cấp trên heo (PED) ........................................................................3
2.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh PED...............................................................................3
2.1.2. Tác hại của bệnh PED ........................................................................................4
2.1.3. Căn bệnh PEDV.................................................................................................4
2.1.4. Dịch tễ học của PED ..........................................................................................5
2.1.5. Triệu chứng của bệnh PED ................................................................................6
2.1.6. Bệnh tích của bệnh PED ....................................................................................6
2.1.7. Các phương pháp chẩn đoán ..............................................................................7
2.1.8. Những biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh PED ...........................................8
2.2. Kỹ thuật chẩn đoán PEDV bởi RT-PCR và giải trình tự.......................................9
2.2.1. Kỹ thuật RT-PCR..............................................................................................9
2.2.2. Giải trình tự ....................................................................................................10
2.2.3. Xác định đặc trưng kiểu gene và cây sinh dòng................................................ 11
iv



2.3. Một số công trình nghiên cứu liên quan tới PEDV ............................................. 11
Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ......................................................... 13
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ..........................................................................13
3.2. Vật liệu nghiên cứu. ............................................................................................ 13
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 13
3.2.2. Dụng cụ ........................................................................................................... 13
3.2.3. Thiết bị ............................................................................................................ 13
3.2.4. Hóa chất........................................................................................................... 14
3.3. Phương pháp tiến hành........................................................................................ 15
3.3.1. Xác định mẫu dương tính với PEDV trên heo tiêu chảy cấp bằng RT-PCR......15
3.3.2. Xác định đặc trưng kiểu gene S và M ở Việt Nam năm 2011-2013 .................. 17
3.3.3. So sánh đa dạng kiểu gene PEDV phân lập với Việt Nam và Thế giới ............. 17
Chương 4 Kết quả và thảo luận.................................................................................. 20
4.1
Kết quả xác định mẫu dương tính với PEDV bằng kỹ thuật RT-PCR .................. 20
4.2. Đặc trưng kiểu gene S và M của PEDV qua giải trình tự.....................................21
4.2.1
Đặc trưng kiểu gene S và gene M của PEDV Việt Nam năm 2009-2013..........21
4.2.2. Đặc trưng kiểu gene S và gene M của PEDV Việt Nam với Thế giới ............... 23
4.3. Mối liên hệ dịch tễ phân tử của các chủng PEDV phân lập được......................... 25
Chương 5 Kết luận và đề nghị ................................................................................... 30
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 30
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 30
Tài liệu tham khảo ..................................................................................................... 31
Phụ lục ...................................................................................................................... 35

v


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
cDNA


Complementary Deoxyribonucleic acid

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetra acetate

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

Kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton



l

Microlit

Nested-RT-PCR

Nested-reverse-transcriptase polymerase chain reaction

PBS

Phosphat buffer Saline

PCR

Polymerase chain reaction

PED

Porcine epidemic diarrhea (dịch tiêu chảy cấp trên heo)

PEDV

Porcine epidemic diarrhea virus

TGEV

Transmissible gastroenteritis virus

RNA


Ribonucleic acid

Taq

Taq polymerase

TBE

Tris borate EDTA

Tm

Mealing temperature

V

Volt

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Hóa chất tách chiết RNA ............................................................................ 14
Bảng 3.2 Hóa chất dùng trong điện di........................................................................14
Bảng 3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR ........................................................... 14
Bảng 3.4 Các đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR để chẩn đoán PEDV ........................ 14
Bảng 3. 5 Mẫu PEDV phân lập ở Việt Nam .............................................................. 15
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất cho phản ứng RT-PCR .............................................. 16
Bảng 3.7 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR một bước (one - step RT-PCR) ....17
Bảng 3.8 Các chủng PEDV được giải trình tự trên đoạn gene S và gene M ............... 18

Bảng 3.9 Các chủng PEDV tham khảo Việt Nam và Thế giới trên gene M................ 19
Bảng 3.10 Các chủng PEDV tham khảo Việt Nam và Thế giới trên gene S ............... 19
Bảng 4.1 Tỉ lệ (%) dương tính với PEDV thu được năm 2013 ...................................20
Bảng 4.2 Sự tương đồng giữa các chủng PEDV Việt Nam 2009 - 2013................... 21
Bảng 4.3 Sự tương đồng và khoảng cách di truyền trên gene S..................................22
Bảng 4.4 Sự tương đồng giữa các chủng PEDV Việt Nam trên gene M..................... 22
Bảng 4.5 Sự tương đồng và khoảng cách di truyền trên gene M ................................ 23
Bảng 4.6 Sự tương đồng trên gene S của các chủng PEDV .......................................23
Bảng 4.7 Sự tương đồng và khoảng cách di truyền trên đoạn gene S ......................... 24
Bảng 4.8 Độ tương đồng trên gene M của các chủng PEDV......................................24
Bảng 4.9 Sự tương đồng và khoảng cách di truyền trên đoạn gene M........................ 24

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc của Coronavirus .............................................................................5
Hình 4.1 Kết quả điện di trên gene S sau khi chạy phản ứng RT-PCR....................... 21
Hình 4.2 Cây sinh dòng trên gene S các chủng PEDV ở Việt Nam với các chủng trên
thế giới. ..................................................................................................................... 26
Hình 4.3 Cây sinh dòng trên gene M các chủng PEDV ở Việt Nam với các chủng trên
thế giới ...................................................................................................................... 29

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Trong những năm qua, ngành chăn nuôi heo đứng trước rất nhiều khó khăn do

dịch bệnh liên tiếp xảy ra. Trong đó, bệnh tiêu chảy trên heo con, do nhiều nguyên
nhân khác nhau gây ra như thay đổi thức ăn từ sữa mẹ sang thức ăn tập ăn, sức đề
kháng với bệnh tật yếu, điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng không đảm bảo vệ sinh đã dẫn
đến nhiễm trùng các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn (Escherichia coli, Samolnella
ssp.) hay do một số loại vi-rút như Rotavirus, Transmissible gastroenteritis virus
(TGEV), Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).
Bệnh tiêu chảy cấp trên heo con gây thiệt hại nặng nếu không có biện pháp
ngăn ngừa hữu hiệu hay khi bệnh phát triển thành dịch. Bệnh này gây chết gần như
100% trên heo dưới 7 ngày tuổi (Puranaveja và ctv, 2009). Bệnh đã xảy ra ở nhiều
nước trên thế giới như Châu Âu, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Thái Lan,… Ở
Việt Nam, dịch tiêu chảy cấp là bệnh mới nổi trong thời gian gần đây (năm 2008).
Theo Quyết định số 70/2009/QĐ-UBND do Ủy ban nhân dân TP. Hồ Chí Minh ban
hành đã đề ra nhiệm vụ tầm soát một số bệnh mới trên vật nuôi trong đó có PED (dịch
tiêu chảy cấp) trên heo (Chương trình giám sát dịch tễ gia súc gia cầm trên địa bàn
thành phố Hồ Chí Minh từ 2010 - 2020). Một số tỉnh như Đồng Nai, Bình Dương,
Bà Rịa - Vũng Tàu, nơi có ngành chăn nuôi l ớn nhất cả nước, cũng đang nằm trong
vùng hoành hành của dịch tiêu chảy cấp trên heo trong thời gian vừa qua (Trịnh Thị
Thanh Huyền và ctv, 2011).
Trước những vấn đề thực tế trên, đề tài nghiên cứu: “Đặc trưng kiểu gene S và
gene M của Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây bệnh tiêu chảy cấp trên heo
trong giai đoạn 2011 - 2013” được tiến hành.
1.2.

Yêu cầu của đề tài
Xác định đặc trưng kiểu gene và sự đa dạng di truyền gene S và gene M của

PEDV phân lập thực địa qua các năm xảy ra ổ dịch khác nhau ở Việt Nam năm
2011 - 2013.


1


1.3.

Nội dung thực hiện
Xác định mẫu dương tính với PEDV trên heo tiêu chảy cấp bằng kỹ thuật

RT-PCR.
Xác định đặc trưng kiểu gene của chủng PEDV phân lập năm 2011 - 2013 qua
giải trình tự gene S và M.
So sánh đa dạng kiểu gene giữa các chủng PEDV phân lập được với các chủng
phân lập trước ở Việt Nam và trên thế giới.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Dịch tiêu chảy cấp trên heo (PED)

2.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh PED
Năm 1971, các ổ dịch tiêu chảy cấp trên heo đã nổ ra đầu tiên ở Anh quốc với
triệu chứng lâm sàng tương tự bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm TGE
(Transmissible gastroenteritis) (Oldham và ctv, 1972). Khi đó, người ta đã chẩn đoán
rằng nghi ngờ có một loại tác nhân vi-rút khác. Sau đó, bệnh đã lan rộng ra nhiều nước
khác ở Châu Âu như Đức, Bỉ, Hungary,… Vào thời điểm này dịch bệnh được gọi với
cái tên “Dịch tiêu chảy do vi-rút” (Epidemic viral diarhea - EDV).

Năm 1976, một lần nữa những đợt dịch tiêu chảy cấp có triệu chứng tương tự
như TGE xảy ra trên heo mọi lứa tuổi và lần này người ta cũng đã loại trừ khả năng
nhiễm bởi TGEV và các tác nhân gây bệnh đường ruột quen thuộc khác (Wood, 1977).
Các nhà khoa học đã gọi là EDV Type 2 để phân biệt với trận dịch xảy ra năm 1971.
Cho đến năm 1978, Pensaert và DeBouck đã xác đ ịnh được tác nhân vi-rút gây
ra các đợt dịch có triệu chứng giống TGE nói trên cũng là một loại Coronavirus. Năm
1980, DeBouck và Pensaent đã tiến hành gây nhiễm chủng vi-rút phân lập được (kí
hiệu CV777) trên heo con để nghiên cứu đặc tính gây bệnh đường ruột trên heo con và
heo vỗ béo. Nhóm tác giả này đã phát hiện ra rằng loại Coronavirus này đã gây ra
những ổ dịch EDV type 1 và EDV type 2 những năm trước đó. Sau đó, cái tên “dịch
tiêu chảy trên heo” (Porcine epidemic diarrhea - PED) đã đư ợc đề xuất (Pensaent và
ctv, 1982) và được sử dụng cho đến ngày nay. Tiếp theo, các cuộc điều tra về huyết
thanh trên diện rộng để tầm soát sự hiện diện của PEDV và đã phát hiện huyết thanh
dương tính tại nhiều quốc gia Châu Âu (Anh, Đức, Pháp, Bỉ, Hà Lan, Bungary). Ở
Nhật, bệnh này xuất hiện đầu tiên vào những năm 1982 - 1983 (Takahashi và ctv,
1983). Còn ở Hàn Quốc dịch bệnh đã x ảy ra năm 1993 (Kwon và ctv, 1993).
Puranaveja và ctv (2009) đã xác đ ịnh, dịch bệnh do PEDV xảy ra trở lại vào
cuối năm 2007 tại Thái Lan. Dịch bệnh làm chết 100% heo con sơ sinh và ảnh hưởng
trên heo ở mọi lứa tuổi. Triệu chứng ghi nhận tùy vào tuổi của heo nhiễm, đối với heo
đực và heo nái thường bình phục sau một tuần. Tác giả đã ti ến hành giải trình tự trên
33 mẫu dương tính với RT-PCR, phân tích trên ngân hàng gene và rút ra kết luận rằng
3


chủng PEDV nhiễm ở Thái Lan có nguồn gốc di truyền nhiễm từ chủng PEDV phân
lập được ở Trung Quốc năm 2004.
2.1.2. Tác hại của bệnh PED
PED rất nguy hiểm vì tỉ lệ tử vong cao ở heo sơ sinh, không có thuốc đặc trị và
hiện tại chưa có biện pháp hữu hiệu ngăn chặn vi-rút xâm nhập vào trại chăn nuôi.
Ở Châu Âu, đại dịch tiêu chảy do PEDV những năm 1970 đã gây thiệt hại kinh

tế rất lớn. Heo con dưới 2 tuần tuổi chết 100%. Dịch bệnh lúc đầu từ nước Anh sau đó
lan sang Bỉ, Đức, Tây Ban Nha, Hungary.
Ở Châu Á, những năm gần đây, nhiều ổ dịch PED trầm trọng với tỉ lệ chết cao
đã được ghi nhận. Cuối năm 1996, một ổ dịch PED đã nổ ra trên 108 trại heo từ sơ
sinh đến xuất chuồng ở Nhật Bản. Cũng ở Nhật Bản, những ổ dịch xảy ra từ tháng 9
năm 1993 đến tháng 6 tháng 1994 đã đư ợc ghi nhận, với 14000 con chết, tỉ lệ chết vào
khoảng 30 - 80% trên heo con theo mẹ (Sueyoshi và ctv, 1995).
Ở Hàn Quốc, PEDV cũng đã gây ra nh ững ổ dịch tiêu chảy trên heo mọi lứa
tuổi. Trong 71 mẫu ruột viêm được gửi đi xét nghiệm PEDV ở Viện nghiên cứu Thú y
từ tháng 1 năm 1992 đến tháng 12 năm 1993 đã xác đ ịnh được 56,3% mẫu dương tính
với PEDV. Bệnh xảy ra trên toàn quốc (Hàn Quốc) và 90% những ổ dịch được phát
hiện trên heo nhỏ hơn 10 ngày tuổi. Một nghiên cứu khác về huyết thanh ở Hàn Quốc
được thực hiện với 469 mẫu huyết thanh được lấy từ những heo được giết mổ ở 7 tỉnh
cho thấy có 45% heo có kháng thể PEDV trong tổng số heo xét nghiệm. Kết quả cho
thấy vi-rút đã trở thành dịch địa phương ở quốc gia này (Kweon và ctv, 1993).
2.1.3 Căn bệnh PEDV
Hình thái học và cấu trúc vi-rút PED
PEDV là một vi-rút RNA chuỗi đơn, có vỏ bọc bên ngoài. PEDV có hình thái
chung của họ Coronavirus. Chúng có nhiều hình dạng khác nhau, nhưng nhìn chung là
có hình cầu (Hình 2.1), đư ờng kính từ 95 - 190 nm, bề mặt có tua gai hình trụ dài
khoảng 20 nm (Siddell và ctv, 1993).
Thành phần ribonucleoprotein (RNP) nội bào của vi-rút này có thể quan sát
được ở dạng hình sợi, đường kính từ 1 - 2 nm, hay tụ lại dạng xoắn với đường kính
rất đa dạng, thông thường 10 - 20 nm. Sau khi vi-rút bị phá vỡ, nucleocapsid có tỉ
trọng đối với đường sucrose là 1,27 - 1,28 g/ml (Siddell và ctv, 1983).
4


Hình 2.1 Cấu trúc của Coronavirus
(Swiss Instute of Bioinformatics, ViralZone. 2011).


Trong đó, hai protein được quan tâm là protein S có chức năng gắn với thụ thể
tế bào chủ và protein M tham gia vào quá trình “tự ráp” của vi-rút. Cơ chế gây bệnh
của PEDV bắt đầu với sự bám của protein S vi-rút lên thụ thể aminopeptidase N trên
bề mặt các tế bào nhung mao ruột dẫn đến sự phá hủy biểu mô của tế bào nhung mao.
Điều này sẽ làm biến đổi quá trình tiêu hóa, vận chuyển tế bào và hấp thụ chất dinh
dưỡng ở heo con, dẫn đến tình trạng heo bị tiêu chảy (Nguyễn Thị Hoàng, 2011).
Đặc tính hóa lý và sức đề kháng
PEDV nhạy cảm với ether và chloroform, PEDV ổn định ở pH = 4 - 7 ở 40C
và pH = 6,5 - 7,5 ở 370C. PEDV chịu đựng được sự gia nhiệt đến 500C trong 180 phút
nhưng bất hoạt khi gia nhiệt ở 60 - 800C trong 30 phút (Lee và Yeo, 2003). PEDV bị
bất hoạt nhanh bởi hầu hết các chất sát trùng như cresol, NaOH 2%, formalin 1%
(Siddell và ctv, 1993).
2.1.4. Dịch tễ học của PED
Heo là kí chủ chính của PEDV. Chúng xâm nhập chủ yếu qua đường tiêu hóa.
Lây truyền do tiếp xúc trực tiếp với những heo bị bệnh hoặc do tiếp xúc với những
dụng cụ bị nhiễm (giày, ủng, công nhân, vận chuyển, mua bán,…). PEDV hiện diện
nhiều trong ruột non heo nhiễm (tá - không - hồi tràng), hạch màng treo ruột và
phân. Vi-rút tấn công vật chủ qua các tế bào nhung mao ruột nên gây cản trở sự hấp
thu nước và khoáng chất, đồng thời kích thích tiết dịch ở nhung mao gây tiêu chảy,
mất nước và chất điện giải trầm trọng (Ducatelle và ctv, 1982).
5


Bệnh tiêu chảy do PEDV gây ra đã di ễn ra ở nhiều quốc gia, gây hậu quả
nghiêm trọng lên nền kinh tế của các nước. Do vậy, ngày càng có nhiều công trình
nghiên cứu về PEDV được công bố, đã bổ sung nhiều vào kho dữ liệu về bệnh do
PEDV gây ra. PEDV xuất hiện đầu tiên ở các nước Châu Âu như Anh, Pháp, Tây Ban
Nha,… và lây sang một số nước ở Châu Á như Hàn Quốc, Nhật, Trung Quốc (Song và
ctv, 2007), Thái Lan (Puranaveja và ctv, 2009), Việt Nam (Đỗ Tiến Duy và ctv, 2011).

Ở Châu Âu, các chủng phân lập từ các quốc gia khác nhau đều bắt nguồn từ
chủng CV777 có nguồn gốc từ Anh (Egberink và ctv, 1988). Trong đó, có cả chủng
Br1/87 cũng bắt nguồn từ chủng CV777 (Bridgene và ctv, 1993). Ở Hàn Quốc, theo
công bố của Park và ctv (2007) dòng DR13 (phân lập năm 2006) có độ tương đồng và
quan hệ gần nhất với CV777, riêng chủng Spk1 (phân lập năm 2005) và Chinju99
(phân lập năm 2003) có quan hệ gần nhất với JS-2004-2 (Trung Quốc).
2.1.5. Triệu chứng của bệnh PED
Biểu hiện lâm sàng chính của bệnh là tiêu chảy nhiều nước, phân tiêu chảy chứa
nhiều nước, không có máu hoặc chất nhầy, có những cụm bông phủ lên trên và có mùi
tanh đặc trưng. Những đàn heo giống thường nhạy cảm với PEDV. Triệu chứng chính
trên heo còn bú bị nhiễm PEDV là ói mửa, tiêu chảy nhiều nước, mất cân nặng, gầy
sút nhanh, bỏ bú, thường nằm chồng lên nhau sau đó heo bệnh sẽ bị rối loạn chuyển
hóa acid, dẫn đến hôn mê và tỉ lệ tử vong khoảng 58 - 80% (Pensaert và ctv, 1982).
Triệu chứng điển hình trên heo cai sữa, heo choai và heo nuôi vỗ béo là tiêu chảy,
biếng ăn, suy nhược với tỉ lệ bệnh cao, nhưng tỉ lệ chết thấp (1 - 3%). Trên heo nuôi vỗ
béo, có mối liên hệ giữa bệnh PED với stress gây tỉ lệ tử vong cao đối với những trại
nhạy cảm với stress. Ở những vùng bệnh trở thành bệnh địa phương, PEDV có thể gây
tiêu chảy dai dẳng cho những heo con vừa mới cai sữa (Pensaert và ctv, 1982).
2.1.6. Bệnh tích của bệnh PED
Đại thể: Heo gầy còm. Dạ dày trống do ói mửa hoặc có sữa đông đặc, ruột non
chứa dịch, thành ruột mỏng. Những chất trong ruột thường kết thành cụm. Hoại tử cơ
lưng cấp tính thường thấy trên heo trưởng thành hoặc xuất chuồng.
Vi thể: Có nhiều không bào trong tế bào chất của tế bào biểu mô đường tiêu
hóa. Nhung mao kết dưỡng lại ngắn hay biến mất. Sau đó các tế bào biểu mô trở nên
dẹt, mất chức năng và bị bong tróc đi vào trong xoang ruột (Ducatelle và ctv, 1982).
6


2.1.7 Các phương pháp chẩn đoán
Hiện nay có nhiều phương pháp dùng để chẩn đoán trực tiếp vi-rút (RT-PCR,

nested RT-PCR,…) hay gián tiếp qua kháng thể. Mỗi phương pháp có những ưu nhược
điểm và tùy vào mục đích nghiên cứu mà chọn phương pháp thích hợp.
Phương pháp FAT (kháng thể huỳnh quang) cho kết quả nhanh, độ nhạy và tính
đặc hiệu tương đối tốt. Tuy nhiên, do yêu cầu nghiêm ngặt về tình trạng mẫu như: mẫu
phải được lấy ở heo dưới 4 tuần tuổi, heo vừa bị nhiễm (trong khoảng 24 - 28 giờ),
mẫu phải tươi và được bảo quản đúng cách.
Đối với Coronavirus, việc nuôi cấy phân lập gặp nhiều khó khăn và mất nhiều
thời gian do chúng khó phát triển trên môi trường nuôi cấy tế bào tế bào một lớp. Phân
lập vi-rút trực tiếp từ ruột non heo mắc bệnh, không phân lập vi-rút trên phân cũng
như xác thú.
Kỹ thuật ELISA là kỹ thuật đơn giản, xác định nhanh tác nhân gây bệnh thông
qua việc phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên vi-rút hoặc kháng thể sinh ra khi
nhiễm vi-rút. Một số công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp ELISA để xét
nghiệm hiệu quả trên tác nhân tiêu chảy cấp đã được tiến hành bởi Carman và ctv,
2001; Guscetti và ctv, 1995.
Trong phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử (EM: electron microscopy),
các mẫu phải trải qua các quá trình xử lý, rồi nhuộm trước khi quan sát dưới kính hiển
vi điện tử. Phương pháp này được xem là phương pháp chẩn đoán PEDV bởi vì có thể
xác định hình thái của PEDV trong mô ruột nhiễm bệnh. Một số nghiên cứu đã sử
dụng phương pháp EM để quán sát, phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây tiêu chảy
cấp trên heo.
Phương pháp hóa mô miễn dịch là phương pháp được cải tiến dựa trên nguyên
tắc của phương pháp miễn dịch huỳnh quang, cũng dùng để phát hiện kháng nguyên
PEDV tại mô ruột nhiễm. Phương pháp ISH có nhiều ưu điểm hơn so với IHC như chi
phí thấp, độ nhạy cao. Mục đích của phương pháp này là việc xác định đoạn
nucleotide đặc trưng trên bộ gene của tác nhân gây bệnh, dựa vào sự bắt cặp của các
nucleotide của đoạn gene mục tiêu với đoạn nucleotide được đánh dấu.
Kỹ thuật PCR đã đư ợc phát triển và được sử dụng từ rất lâu để chẩn đoán vi
sinh vật. Đối với vi-rút RNA, để ứng dụng kỹ thuật PCR cần phải trải qua bước tổng
7



hợp cDNA trước khi thực hiện phản ứng PCR cơ bản. Vì quá trình phân lập vi-rút rất
khó khăn và tốn nhiền thời gian, nên kỹ thuật RT-PCR được xem là phương pháp ưu
việt để chẩn đoán vi-rút gây bệnh tiêu chảy cấp trên heo, nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu
cao. Kỹ thuật RT-PCR cũng yêu c ầu vào quá trình lấy mẫu chính xác, xử lý mẫu cũng
như thao tác thực hiện hợp lý. Để tăng độ nhạy của phản ứng RT-PCR cho những mẫu
chứa RNA số lượng ít người ta dùng nested-RT PCR (RT-nPCR) khuếch đại 2 lần
giúp phát hiện lượng mẫu rất nhỏ với độ đặc hiệu cao. Đây là đặc điểm nổi trội của
phương pháp này và do đó phương pháp này hoàn toàn phù hợp để dùng trong các
nghiên cứu dịch tễ.
2.1.8. Những biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh PED
Để phòng sự xâm nhập của vi-rút vào đàn heo phải lưu ý heo nhiễm bệnh ở thời
kỳ nung bệnh đang thải trùng hoặc mang trùng là nguồn reo rắc mầm bệnh. Nếu không
có điều kiện xét nghiệm heo mới mua về thì phải cách ly theo dõi 3 tuần lễ mới được
đưa vào trại. Ngăn cản sự lây lan vi-rút bằng con đường cơ học hoặc động vật trung
gian truyền bệnh. Người vào tham quan trại cần phải đi giày sạch, ủng sạch do trại
cung cấp để tránh sự lây lan (Pensaert và Yeo, 2006).
Để cắt đứt vòng truyền lây bệnh phải loại bỏ những heo nhiễm bệnh, không liên
tiếp nhập heo vào trại, điều chỉnh lịch sinh sản của heo nái cho phù hợp, chia nhỏ các
đàn nái đẻ hoặc nuôi con thành từng nhóm để thực hiện tốt việc cùng xuất, cùng nhập
(Kweon và ctv, 1993).
Trên thực tế, phòng bệnh này bằng cách tạo miễn dịch đây là việc mà người
chăn nuôi áp dụng. Để phòng bệnh cho heo con, người ta cho heo nái mang thai ăn
chất chứa hay ruột non của những heo con mắc tiêu chảy cấp (hoặc băm nhuyễn cả con
heo con cho heo nái ăn). Cách này tạo được miễn dịch chủ động cho heo mẹ và thông
qua sữa mẹ tạo được miễn dịch thụ động cho heo con, giảm được số heo con mẫn cảm
với bệnh. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có th ể tiền nguy cơ làm heo nái trở thành
vật mang trùng và liên tục bài thải vi-rút ra ngoài môi trường (Phạm Sỹ Lăng và
Nguyễn Thiện, 2004).

Hiện nay, có một vài loại vaccine sử dụng để phòng bệnh, nhưng hiệu quả
mang lại chưa hoàn hảo. Trong điều trị, để làm giảm tỉ lệ tử vong của heo bệnh cần
thực hiện biện pháp chống mất nước và acidosis (nhiễm acid). Đối với heo bệnh từ 2 8


5 tuần tuổi trở lên nên dùng thuốc kháng khuẩn để điều trị đồng nhiễm hoặc kế phát
do vi khuẩn (Shibata và ctv, 2001).
2.2.

Kỹ thuật chẩn đoán PEDV bởi RT-PCR và giải trình tự

2.2.1. Kỹ thuật RT-PCR
Thiết kế mồi
Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có
hiệu quả cao nhất. Chọn mồi là công việc rất quan trọng quyết định thành công của
phương pháp và công việc đó phải dựa theo một số nguyên tắc là: trình tự mồi xuôi và
mồi ngược không bắt cặp bổ sung và không có cấu trúc kẹp tóc giữa các phần khác
nhau của mồi; phải đặc hiệu với DNA cần khuếch đại; trình tự nằm giữa mồi xuôi và
mồi ngược không được quá lớn; độ dài mồi khoảng 18 - 30 nucleotide; thành phần
nucleotide của các mồi phải cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần để nhiệt
độ bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược không được quá cách biệt (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 2008).
Nguyên tắc tiến hành thiết kế mồi: đầu tiên phải xác định trình tự khuôn, thông
số của phản ứng PCR, các quy tắc chọn mồi; sau đó chọn trình tự thiết kế; kiểm tra lại
bằng BLAST trên NCBI (webside: www.ncbi.nlm.nih.gov).
Hiện nay có rất nhiều phần mềm để thiết kế mồi cho các phản ứng PCR. Trong
đó có 4 phần mềm: Primer3, PrimerQuest, PDA (Primer Design Assistant) và
DNAclub là thông dụng với độ tin cậy cao và được phép sử dụng miễn phí. Mồi sử
dụng trong phản ứng RT-PCR cũng được thiết kế tương tự.
Phương pháp RT-PCR

Phương pháp PCR là một công cụ đã trở nên phổ biến trong sinh học phân tử,
đem lại một cuộc cách mạng trong công nghệ di truyền học phân tử, đánh dấu một
bước tiến cực kỳ quan trọng cũng như các khám phá trư ớc đây về enzyme cắt giới hạn
và phương pháp Southern blot.
Phương pháp này kết hợp với phản ứng phiên mã ngược (nhờ vào đặc tính của
enzyme phiên mã ngư ợc - Reverse transcriptase) tổng hợp cDNA bổ sung từ mẫu
RNA với phản ứng khuếch đại mạch DNA nhờ bổ sung polymerase. Khi thực hiện
phương pháp này, người nghiên cứu nên nắm vững các yếu tố ảnh hưởng để tối ưu hóa
quy trình thực hiện.
9


Có nhiều công trình sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán và nghiên cứu
đối với các tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp. Ishikawa và ctv (1997) đã s ử dụng kỹ
thuật RT-PCR để phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh PEDV trên mẫu bệnh đã đư ợc
thu từ heo bị nhiễm bệnh. Năm 1999, Kubota và ctv đã s ử dụng kỹ thuật RT-PCR để
chẩn đoán tác nhân gây bệnh PED. Trong thí nghiệm của mình, Kubota và ctv đã thi ết
kế mồi trên đoạn gene mã hóa protein nucleocapsid (N) để khuếch đại đoạn gene có
kích thước 540bp.
Năm 2001, Kim và ctv đã ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định sự khác biệt
giữa tác nhân TGEV và PEDV gây bệnh trên heo nuôi. Năm 2006, Song và ctv đã
nghiên cứu sử dụng RT-PCR để chẩn đoán PEDV. Nhóm tác giả đã sử dụng mồi thiết
kế trên đoạn gene S để khuếch đại đoạn gene có kích thước 651bp của PEDV. Cùng
năm 2006, Song và ctv tiếp tục sử dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR để phát hiện cùng
một lúc ba tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp trên heo như PEDV, TGEV và porcine
GAR (porcine group A rotavirus).
2.2.2. Giải trình tự
Nhờ các ưu điểm nội trội trong nghiên cứu sinh học phân tử mà kỹ thuật PCR
nhanh chóng được áp dụng rộng rãi đ ể chẩn đoán các bệnh về vi-rút, vi khuẩn, nấm, kí
sinh trùng và cho kết quả chính xác. Tiếp theo phản ứng PCR, sự phân tích thành phần

và trật tự nucleotide trên phân tử DNA bằng phương pháp PCR có ý nghĩa to l ớn trong
công tác phân loại các loài sinh vật cũng như d ịch tễ bệnh học. Nhất là đối với các
bệnh mới phát sinh ở các vùng lãnh thổ người ta thường tiến hành giải trình tự để thiết
lập cây sinh dòng sau đó so sánh với các trình tự của các chủng khác được phân lập ở
các địa phương khác để tìm ra nguồn gốc bắt nguồn của tác nhân nghiên cứu.
PEDV cũng đã đư ợc giải trình tự từ nhiều nghiên cứu ở nhiều quốc gia khác
nhau trên thế giới trong nhiều năm trước để làm giàu thêm ngân hàng dữ liệu về di
truyền vi-rút này. Năm 1993, Bridgene và ctv đã xác đ ịnh trình tự gene tổng hợp
nuclecapsid của PEDV đã phân l ập được ở Châu Âu từ năm 1977 đến 1987, đoạn gene
này có kích thước 1323bp. Tiếp đến, năm 1994, Duarte và Laude đã giải trình tự của
toàn bộ gene S, đoạn gene này dài 4146bp.
Hiện nay, người ta thường dùng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp đối với sản phẩm
PCR. Đây là một cải tiến quan trọng trong phân tích geneome. Theo phương pháp này,
10


chúng ta có thể biết được đặc điểm của trình tự mà mình nghiên cứu một cách nhanh
chóng, không cần phải xây dựng một thư viện “clone”, hoặc thanh lọc các “clone”
(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2008).
2.2.3. Xác định đặc trưng kiểu gene và cây sinh dòng
Để tìm ra nguồn gốc bắt nguồn của tác nhân gây nhiễm người ta lập cây sinh
dòng từ trình tự của tác nhân phát hiện được, sau đó so sánh với các trình tự của các
chủng khác được phân lập ở các địa phương khác. Cây sinh dòng là công cụ thể hiện
mức độ tương đồng giữa các trình tự qua quá trình tiến hóa. Có thể thiết lập cây sinh
dòng từ kết quả so sánh các trình tự tương đồng thông qua hai phần mềm sinh học
Lasergene v7.0 và MEGA v4.1.
Năm 2001, Kocherhans và ctv đã công bố trình tự geneome của PEDV dòng
CV777. Trình tự hoàn chỉnh của dòng vi-rút này dài 28033 nucleitide (bao gồm cả
đuôi polyA). Trên vùng bảo tồn ORF1 của họ Coronavirus dựa vào trình tự đã biết của
các Coronavirus khác, tác giả thiết kế mồi để tìm những trình tự chưa biết trên ORF1

của PEDV. Dựa vào phân tích sản phẩm khuếch đại gene của những Coronavirus
khác, 3 protease và 1 yếu tố tăng trưởng (growth factor) đã đư ợc tìm thấy trên ORF1a,
1 cấu trúc hình polymerase, 1 cấu hình có gắn ion kim loại, và một cấu trúc helicase
trên ORF1b. So sánh trình tự amino acid của PEDV thì chúng có quan hệ gần nhất với
Coronavirus trên người (HcoV-229E0), sau đó là TGEV (Kocherhans và ctv, 2001).
2.3.

Một số công trình nghiên cứu liên quan tới PEDV
Năm 1978, Pensaert và DeBouck đã quan sát mẫu ruột bằng kính hiển vi đã

nhận thấy vi-rút gây tiêu chảy ở Châu Âu từ những năm trước đó là vi-rút thuộc họ
Coronaviridae và kí hiệu chủng là CV777.
Năm 1993, Bridgene và ctv đã xác định trình tự gene tổng hợp nuclecapsid của
PEDV (phân lập được ở Châu Âu năm 1977 và 1987). Nhóm tác giả nghiên cứu trên
đoạn cDNA có kích thước dài 1,7 kb. Kết quả xác định đoạn gene này có kích thước
1323bp và có mức độ tương đồng rất lớn với Coronavirus trên người 229E.
Năm 1994, Duarte và Laude đã gi ải trình tự gene S, là gene mã hóa protein gai
gắn trên vỏ vi-rút (spike protein). Đoạn protein này trên PEDV dài 1382 acid amin
chứa 29 vị trí glycosyl hóa liên kết nitrogene.

11


Năm 1997, Ishikawa và ctv đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện nhanh
PEDV có trong mẫu heo bị tiêu chảy. Trong thí nghiệm, tác giả đã thi ết kế primer trên
gene mã hóa protein M của PEDV, cho phép khuếch đại một đoạn có kích thước
854bp. Kết quả đã phát hi ện được PEDV trong 11 mẫu bệnh phẩm lấy từ các trại heo
bị dịch bệnh.
Năm 1999, Kubota và ctv đã sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR để phát hiện
PEDV trong các mẫu bệnh phẩm thu được từ các trại bị nhiễm bệnh ở Nhật Bản. Đồng

thời tác giả này cũng đã so sánh trình t ự nucleotide của sản phẩm PCR của các dòng
vi-rút ở Nhật Bản và Hàn Quốc. Đoạn mồi được thiết kế đặc hiệu để khuếch đại một
đoạn gene có kích thước 540bp nằm trên gene mã hóa protein N. Kết quả đã phát hiện
được PEDV ở 4 trong tổng số 11 mẫu bệnh phẩm. Đồng thời kết quả khi so sánh trình
tự nucleotide cho thấy có sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 1 dòng vi-rút tại Hàn
Quốc với 2 dòng vi-rút tại Nhật Bản.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định mẫu
dương tính với PEDV gây tiêu chảy cấp trên heo qua 2 đoạn gene S và M. Sau đó, giải
trình tự trên kết quả sản phẩm RT-PCR của gene S và gene M để xác định đặc trưng
kiểu gene của các chủng phân lập năm 2011 - 2013 ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ
và so sánh đa dạng kiểu gene giữa các chủng PEDV phân lập được với các chủng phân
lập trước ở Việt Nam và trên thế giới.

12


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.

Thời gian và địa điểm tiến hành
Đề tài được thực hiện từ 12/2012 đến ngày 06/2013.
Mẫu được thu thập tại một số trại chăn nuôi xảy ra dịch tiêu chảy cấp ở một số

trại heo nuôi theo hình thức bán công nghiệp ở các tỉnh thành Phía Nam.
Kỹ thuật RT-PCR được thực hiện tại Bệnh viện Thú y, Khoa Chăn nuôi Thú y,
Trường đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh để xác định mẫu dương tính với PEDV
và thu thập sản phẩm PCR.
Sản phẩm PCR được tinh sạch và gửi đi giải trình tự tại công ty Macrogene
(Hàn Quốc).
3.2.


Vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Các chủng PEDV phân lập trên heo con theo mẹ bị tiêu chảy cấp ở một số trại

chăn nuôi ở 7 tỉnh thành phía Nam (Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Lâm Đ ồng, Bà
Rịa - Vũng Tàu).
Dụng cụ
Kim chích (20 hoặc 22)
Dao mổ (cán số 4)
Kéo cắt mô
Kẹp mô

Thùng đá
Eppendorf (1,5ml)
Micropipette các loại (10
l, 100
l, 1000
l)

Thiết bị
Tủ lạnh
Ống eppendorf (1,5 ml)
Máy chụp gel
Máy luân nhiệt PCR
Bộ điện di
Tủ sấy

Autoclave
Máy ly tâm
Tủ lạnh (-200C)
Tủ lạnh sâu (-700C)
Máy voktex


13


Hóa chất
Bảng 3.1 Hóa chất tách chiết RNA
Dung dịch đệm (Gồm:Tris-HCl, NaCl, SDS,
EDTA)
Ethanol 95%
Dung dịch rửa RNA
Yellow
MgCl2 (0,99 M)
Dnase I,
Dung dịch ngăn cản Dnase
Nuclease free water (Promega, Mỹ)
Bảng 3.2 Hóa chất dùng trong điện di
Agarose (1,5%)
TBE 0,5X (Tris borate EDTA, pH=8,3)
Loading dye 6X,
Thang chuẩn cho điện di 100 bp (Promega, Mỹ)
Ethidium bromide
Bảng 3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR
Nuclease free water (Promega, Mỹ)
Green master mix
AMV Reverse transcription (50
M)
Bảng 3.4 Các đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR để chẩn đoán PEDV
Gene Tên mồi
S

M


PS1
forward
PS2
reverse
PM1
forward
PM2
reverse

Trình tự

Kích thước
sản phẩm

5’- TTCTGAGTCACGAACAGCCA -3’
651bp
5’- CATATGCAGCCTGCTCTGAA -3’
5’- CCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAAC -3’
715bp
5’- GTTTAGACTAAATGAAGCACTTTC -3’
Trong đó: Forward (mồi xuôi), reverse (mồi ngược).

Mồi được thiết kế cho sự bắt cặp đặc hiệu với PEDV qua kỹ thuật RT-PCR theo
nghiên cứu Park và ctv (2007), mô tả ở Bảng 3.4.
Mẫu đối chứng dương là mẫu vaccine, mẫu đối chứng âm là nước (free water
nuclease, Promega, Mỹ).
14



3.3.

Phương pháp tiến hành

3.3.1. Xác định mẫu dương tính với PEDV trên heo tiêu chảy cấp bằng RT-PCR
3.3.1.1.

Lấy mẫu ruột non

Các trại khảo sát là những trại đang bị tiêu chảy cấp nghi do PEDV. Đối với
mẫu ruột, thì mổ lấy đoạn ruột non (không tràng) cho vào bịch nylon đã hấp khử trùng.
Sau khi lấy mẫu, cho tất cả những mẫu này vào thùng đá (0 - 40C) và nhanh chóng
đem về phòng thí nghiệm để ly trích RNA và thực hiện kỹ thuật RT-PCR. Trong đó,
các mẫu PEDV trong năm 2011/2012 được sử dụng từ các mẫu lưu trữ tại Bệnh viện
Thú y, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường đại học Nông Lâm TP. HCM.
Bảng 3. 5 Mẫu PEDV phân lập ở Việt Nam
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tổng

Năm thu thập

2011
2012
2012
2012
2012
2013
2013
2013
2013
2013

3.3.1.2.

Loại mẫu
Ruột non
Ruột non
Ruột non
Ruột non
Ruột non
Ruột non
Ruột non
Ruột non
Ruột non
Ruột non

Địa phương
Đồng Nai
Đăk Lăk
Tây Ninh
Lâm Đồng

Bình Dương
Bà Rịa - Vũng Tàu
Lâm Đồng
Đồng Nai
Bình Dương
Củ Chi - TP. HCM

Số mẫu (n)
2
1
1
1
1
7
1
1
5
4
24

Phương pháp ly trích RNA

Tiến hành ly trích theo quy trình tách chiết RNA theo bộ kit SV Total RNA
Isolation System (Promega, Mỹ).
Bước 1: Cắt nhỏ mẫu ruột bằng kéo vô trùng, sau đó nghiền mẫu bằng cối và
chày sứ, cho PBS thành huyễn dịch 10%.
Bước 2: Cho 1200
l vô eppendorf 1.5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút
để thu dịch mô.
Bước 3: Cho 200
l mẫu vào eppendorf chứa sẵn 1000
l RNAlysis buffer trộn
đều, để yên 30 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.

Bước 4: Hút 175 
hỗn hợp dung dịch trên vào effendorf chứa 350
l RNA
dilution buffer trộn đều, ủ ở 65oC trong 3 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong
10 phút.
15