B
Ộ
G
IÁ
O
D
Ụ
C
V
À
Đ
À
O
T
Ạ
O
T
R
Ư
Ờ
N
G
Đ
Ạ
IH
Ọ
C
N
Ô

N
G
L
M
Â
T
H
À
N
H
H
P
Ố
H
Ồ
C
H
ÍM
IN
H
B
Ộ
M
Ô
N
C
Ô
N
G
N

G
H
Ệ
SIN
H
H
Ọ
C

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE
TỪ VI SINH VẬT CHO MỤC ĐÍCH
SẢN XUẤT CỒN SINH HỌC

N
gànhhọc

:C
Ô
N
G
N
G
H
Ệ
SIN
H
H
Ọ
C


Sinhviênthựchiện

:Q
U
Ả
N
T
H
ỊT
H
U

N
iênkhóa

:209–2013

T
háng6/2013


B
Ộ
G
IÁ
O
D
Ụ
C

V
À
Đ
À
O
T
Ạ
O
T
R
Ư
Ờ
N
G
Đ
Ạ
IH
Ọ
C
N
Ô
N
G
L
M
Â
T
H
À
N

H
H
P
Ố
H
Ồ
C
H
ÍM
IN
H
B
Ộ
M
Ô
N
C
Ô
N
G
N
G
H
Ệ
SIN
H
H
Ọ
C


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE
TỪ VI SINH VẬT CHO MỤC ĐÍCH
SẢN XUẤT CỒN SINH HỌC

H
ư
ớ
ngdẫnkhoahọc

Sinhviênthựchiện

TS. BÙI MINH TRÍ

QUẢN THỊ THU

T
háng6/2013


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô Trường Đại
Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho em
trong bốn năm qua. Dưới sự chỉ bảo tận tình của quý Thầy, Cô đã giúp em có được
một nền tảng kiến thức và hành trang để vững bước trên con đường tương lai. Đặc
biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Bùi Minh Trí.Thầy đã hết lòng hướng
dẫn, quan tâm, dạy dỗ, truyền đạt kinh nghiệm cũng như cho em những ý kiến, kiến
thức quý báu trong suốt quá trình chuẩn bị, thực hiện và hoàn thành đề tàitốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn Cô Đỗ Thị Tuyến, Cô Võ Thị Thúy Huệ, Cô Trương

Phước Thiên Hoàng đã truyền đạt những kiến thức quý báu và giúp đỡ em rất nhiều
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gởi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô, Anh, Chị đang công tác tại Bộ môn
Công nghệ Sinh học, Viện Công Nghệ Sinh học và Môi trường, trường ĐH Nông Lâm
TPHCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên em trong thời gian thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin cảm ơn tất cả những người bạn thân yêu của tôi, những thành viên
của tập thể lớp DH09SH, các anh chị em đang làm đề tài tại bộ môn Công nghệ sinh
học thực vật đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình làm đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gởi lòng biết ơn vô hạn đến gia đình tôi. Cảm ơn Cha, Mẹ đã
sinh thành, nuôi nấng, yêu thương và dạy dỗ con để con có được ngày hôm nay. Em
cảm ơn Anh, Chị của em đã luôn chăm sóc, yêu thương em gái và luôn chia sẻ với em
những lúc em gặp khó khăn.
Một lần nữa xin chân thành cảm ơn.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013
Sinh viên

Quản Thị Thu

i


TÓM TẮT
Khi nguồn nguyên liệu nhiên liệu hóa thạch cạn kiệt chắc chắn nhiên liệu sinh
học trở thành nguồn thay thế hữu hiệu. Một trong những ứng dụng rộng rãi của
enzyme cellulase chính là tham gia vào quá trình đường phân để sản xuất nhiên liệu từ
sinh khối. Việc tinh sạch enzyme cellulase là một trong những vấn đề quan trọng nhằm
cung cấp lượng enzyme có độ tinh sạch cao phục vụ cho rất nhiều lĩnh vực, trong đó
bao gồm cả lĩnh vực sản xuất cồn sinh học.
Nhằm mục đích thu nhận được enzyme cellulase sạch có hoạt tính cao phục vụ
cho lĩnh vực sản xuất nhiên liệu sinh học đề tài đã được tiến hành với những nội dung

chính bao gồm phân lập, lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase cao bằng phương pháp đo đường kính vòng phân giải cơ chất và xác định
hoạt tính enzyme dựa vào lượng đường khử tạo thành. Khảo sát môi trường tối ưu cho
sự phát triển của chủng vi sinh vật. Chiết xuất enzyme cellulase thô từ canh trường
nuôi cấy, tủa và tinh sạch hệ enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ký lọc gel trên
Biogel P - 100.
Kết quả nghiên cứu này là đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp enzyme cellulase trong đó chủng T41 có hoạt tính enzyme cao nhất. Môi
trường và thời gian tối ưu cho sự phát triển của chủng vi sinh vật này là môi trường có
cơ chất bã mía được nuôi cấy sau thời gian 40 giờ. Enzyme thô đã được thu nhận bằng
phương pháp tủa cồn ở tỷ lệ 3:1 và tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel.Sau
quá trình tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel hoạt tính riêng của enzyme
tăng lên 3,542 lần.

ii


SUMMARY
Isolation and purification of cellulase from microorganism for producing bioethanol.
It is forseen that biological energy will be viable alternative sources when the
fossil fuel sources became exhausted. One of the wide application of cellulase is using
in the glycolytic process to produce biomass ethanol. The purification of cellulase is
critical step, that allows the enzyme technology obtaining highly qualified enzyme for
various biochemical process including bioethanol production.
In order to receivepure and highly active cellulase for producing bioethanol, this
research focussed onisolation and selection of microbial strains, those possesses highly
active cellulase. The enzyme activity was evaluated by measuring the diameter of
resolutional cycle and enzyme assay based on concentration of reducing sugars
formed. The researh is also investigated optimal environment for the growth and
development of the qualified strains. The extraction of coarsed cellulase enzyme from

culture soup and precipitation enzyme was conducted by using cold ethanol.
Purification of cellulase was conducted by using Gel filtration chromatography on
Biogel P-100.
The result indicated that the strain T41 possessed highest active cellulase. The
growth rate of this strain was fastest afer 40 hours in medium supplemented with
bagasse.The optimal solvent ratioto precipite cellulase enzyme was 3:1. Purified
cellulase from this strain obtained after gel filtration chromatography. The specific
activity of the cellulase increased upto 3.542 times after purification procedure.
Keywords: Bioethanol, microorganism, gel filtration chromatography.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi
Danh sách các bảng .......................................................................................................vii
Danh sách các hình và biểu đồ .................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu của đề tài ..................................................................................................... 2
1.3 Nội dung thực hiện .................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Sinh khối và thành phần của sinh khối..................................................................... 3
2.1.1 Sinh khối và nguồn sinh khối ở thực vật ................................................................ 3
2.1.2 Thành phần cơ bản của sinh khối ........................................................................... 3

2.2. Enzyme cellulase ...................................................................................................... 7
2.2.1 Các nguồn thu nhận enzyme cellulase ................................................................... 7
2.2.2 Phân loại enzyme cellulasevà cơ chế hoạt động .................................................... 7
2.2.3 Cấu trúc và tính chất enzyme cellulase .................................................................. 9
2.2.4 Cơ chất và hoạt lực enzyme cellulase .................................................................. 10
2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme cellulase ...................... 11
2.2.6 Kỹ thuật tách và làm sạch chế phẩm enzyme ...................................................... 11
2.2.7 Kỹ thuật sắc ký lọc gel ......................................................................................... 13
2.2.8. Ứng dụng enzyme cellulase từ VSV ................................................................... 15
2.2.8.1 Ứng dụng enzyme cellulase trong chế biến thực phẩm..................................... 15
2.2.8.2 Ứng dụng enzyme cellulase trong sản xuất thức ăn gia súc .............................. 15
2.2.8.3 Ứng dụng enzyme cellulase trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa ................. 16
2.2.8.4 Ứng dụng enzyme cellulase trong sản xuất nhiên liệu sinh học ....................... 16
2.2.9. Nghiên cứu trong và ngoài nước ......................................................................... 16
2.2.9.1 Nghiên cứu trong nước ...................................................................................... 16
2.2.9.2 Nghiên cứu ngoài nước ..................................................................................... 17
Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 18
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 18
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 18
3.2.1 Chủng VSV .......................................................................................................... 18
3.2.2 Hóa chất sử dụng ................................................................................................ 18
3.2.3 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm ........................................................... 18
3.2.4 Dụng cụ thí nghiệm .............................................................................................. 19
iv


3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 19
3.3.1 Phương pháp thu thập mẫu ................................................................................... 19
3.3.2 Phương pháp phân lập chủng VSV có khả năng phân hủy cellulose................... 20
3.3.3 Kiểm tra khả năng phân giải cellulose của VSV.................................................. 20

3.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase và xylanase ....................................... 21
3.3.4.1 Phương pháp xác định HT cellulase và xylanase trên MT lỏng........................ 21
3.3.4.2 Phương pháp xác định HT cellulase và xylanase trên MT bán rắn ................... 23
3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của MT và thời gian đến sự sinh trưởng của VSV ............. 24
3.3.6 Phương pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme cellulase .................................. 25
3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cồn đến việc tách chiết enzyme cellulase ............. 25
3.3.8 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry ....................................... 26
3.3.9 Tinh sạch enzyme cellulase .................................................................................. 27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 29
4.1 Phân lập chủng VSV có khả năng phân hủy cellulose ............................................ 29
4.2. Chọn chủng VSV có hoạt tính enzyme cao nhất.................................................... 33
4.2.1 HT cellulase và xylanase trên môi trường lỏng ................................................... 33
4.2.2 HT cellulase và xylanase trên môi trường bán rắn............................................... 34
4.3 Khảo sát ảnh hưởng của MT và TH đến sự ST của VSV ....................................... 37
4.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cồn đến việc tách chiết enzyme cellulase. ............... 38
4.5 Phân đoạn và tinh sạch enzyme qua sắc ký lọc gel ................................................. 39
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 42
5.1 Kết luận ................................................................................................................... 42
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 43
Phụ lục

 

 

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBD

Cellulose binding domain

CBH

1,4- β - D-glucan cellobiohydrolase

CMC

Carboxymethyl cellulose

CT

Công thức

Ctv

Cộng tác viên

DNS

Acid 2 - hydroxyl -3,5 - dinitrobenzoic

EG

1,4 - β - D - glucan - glucanohydrolase

ES


Enzyme - cơ chất

HEC

Hyroxyethyl cellulose

HL

Hàm lượng

HT

Hoạt tính

HTR

Hoạt tính riêng

MT

Môi trường

MTBR

Môi trường bán rắn

MTL

Môi trường lỏng


NN

Nông nghiệp

OD

Optical density

PGA

Potato Glucose Agar

ST

Sinh trưởng

TG

Thời gian

TN

Thí nghiệm

UI

International Unit

VSV


Vi sinh vật

WTO

World Trade Organization

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng2.1Thành phần lignocellulose trong rác thải và phụ phế phẩm nông nghiệp ...................... 3
Bảng2.2Trọng lượng phân tử cho phép của các loại gel sephadex .............................................. 14
Bảng3.1Danh sách các mẫu phân lập VSV ................................................................................. 19
Bảng3.1(tt) Danh sách các mẫu phân lập VSV ........................................................................... 20
Bảng3.2Thành phần hóa chất dựng đường chuẩn glucosevà xylose............................................ 22
Bảng3.3Các bước của quá trình xác định hoạt tính cellulase và xylanase ................................... 22
Bảng3.4Thành phần hóa chất dựng đường chuẩn glucose ........................................................... 23
Bảng3.5Thành phần hóa chấtxác định hoạt độ cellulose và xylanase ......................................... 23
Bảng3.6Mã hóa các CT TN trong TN ảnh hưởng của MT và TG đến sự ST của VSV.............. 26
Bảng3.7Dung tích và tỷ lệ cồn: enzyme trong TN tủa enzyme cellulase.................................... 27
Bảng3.8Thành phần hóa chất dựng đường chuẩn protein ............................................................ 26
Bảng4.1Các chủng VSV phân lâp được trên các nguồn mẫu thu thập khác nhau ....................... 29
Bảng4.2Khả năng phân giải CMC của các chủng VSV trên môi trường cảm ứng...................... 30
Bảng4.3Hoạt tính cellulase của chủng VSV theo TG nuôi cấy trên MT lỏng ............................. 33
Bảng4.4Hoạt tính xylanase của chủng VSV theo TG nuôi cấy trên MT lỏng ............................. 34
Bảng4.5Hoạt tính cellulase của chủng VSV theo TG nuôi cấy trên MT bán rắn ........................ 35
Bảng4.6Hoạt tính xylanase của chủng VSV theo TG nuôi cấy trên MT bán rắn ........................ 35
Bảng4.7Ảnh hưởng của MT và TG nuôi cấy tới sự ST và phát triển của chủng T41 ................. 37
Bảng4.8Hoạt tính enzyme và hàm lượng protein trong 5 ml dụng dịch tủa ................................ 38

Bảng4.9Hàm lượng protein và hoạt tính cellulase ở các phân đoạn sau tinh sạch ...................... 39
Bảng4.10Kết quả đánh giá hoạt tính enzyme cellulase trước và sau khi tinh sạch....................... 40
Bảng4.1HL protein và HT cellulase của ở các phân đoạn sau tinh sạch ..................................... 41
Bảng4.12Kết quả đánh giá HT cellulase thương mại trước và sau khi tinh sạch ......................... 41

 

vii


DANH SÁCHCÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Trang
H
ình2.1Công thức hóa học của một đoạn phân tử cellulose................................................... 4 
Hình 2.2Cơ chế hoạt động của hệ enzyme cellulase ....................................................... 8
H
ình2.3Cấu trúc tinh thể enzyme cellulase ............................................................................ 10 
H
ình2.4Mô phỏng hoạt động của lọc phân tử sephadex.......................................................... 14
H
ình4.1Hình ảnh kết quả định tính hệ enzyme cellulase của các chủng VSV ........................ 33 
H
ình4.1(tt) Hình ảnh kết quả định tính hệ enzyme cellulase của các chủng VSV ................. 32
B
iểuđồ4.1Sắc ký đồ tinh sạch enzyme cellulase từ chủng T41 ................................................ 39 
B
iểuđồ4.2Sắc ký đồ tinh sạch enzyme cellulase thương mại ................................................... 40 

viii



Chương 1MỞ ĐẦU
 

1.1Đ
ặtvấnđề
Ngày nay, nhiên liệu sinh học đang ngày càng trở nên quan trọng trong việc góp
phần giải quyết tình trạng khủng hoảng năng lượng và bảo vệ môi trường trên toàn thế
giới. Nhiều quốc gia đang hướng tới việc sản xuất và đưa nhiên liệu sinh học vào cuộc
sống nhằm thay thế dần cho các nhiên liệu hóa thạch.Hai dạngnhiên liệu sinh họcchính
là cồn sinh học và diesel sinh học ( đó, cồn sinh học được sản xuất chủ yếu từ nguồn nguyên liệu
tinh bột và đường. Điều này ảnh hưởng đến vấn đề an ninh lương thực thế giới. Do đó
cần phải tìm kiếm các nguồn nguyên liệu thay thế.
Lignocellulose là thành phần chính trong các phụ phế phẩm nông nghiệp, có tiềm
năng rất lớn trong quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học ở Việt Nam. Quá trình xử lý
các phụ phế phẩm nông nghiệp bằng cách đốt hay chôn lấp luôn gây ô nhiễm môi
trường và lãng phí nguồn nguyên liệu. Vì vậy, việc sản xuất cồn sinh học từ các nguồn
phế phẩm nông, lâm nghiệp như rơm rạ, bã mía, lá khô, mùn cưasẽ mang lại nguồn lợi
lớn về mặt kinh tế, không ảnh hưởng đến an ninh lương thực và giảm thiểu ô nhiễm
môi trường. Đây là hướng đi nhiều triển vọng trong phát triển nhiên liệu sinh học.
Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin. Các
đại phân tử này khó bị phá vỡ thành các thành phần polymer và monomer đơn lẻ. Sự
bền chặt của cấu trúc phức hợp làm cho việc chuyển hóa sinh khối thành đường
glucose và xylose trở nên khó khăn, tiêu tốn nhiều năng lượng và chi phí cao (Châu
Thành Nhân, 2010). Enzyme cellulase đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và
Việt Nam nghiên cứu là nguyên liệu chính trong quá trình phân giải lignocellulose.
Tuy nhiên, đến nay giá thành nguyên liệu còn cao và hiệu quả chưa được mong đợi.
Nhằm giảm giá thành nguyên liệu, tạo ra enzyme với giá thành hạ, nhiều nghiên
cứu được thực hiện nhằm tìm kiếm, tạo ra chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase hoạt tính cao.Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp có điều kiện tự

nhiên thuận lợi, tiềm năng đa dạng sinh học cao nên có nhiều cơ hội tìm kiếm, phát
hiện những chủng VSV mới.Một số loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme
cellulase bao gồm nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn. Enzyme thô thường chứa một lượng
1


enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Do đó việc tinh sạch nhằm thu
nhận enzyme có hoạt tính cao và độ tinh khiết là rất cần thiết.
Trên cơ sở đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và tinh sạch enzyme
cellulase từ VSV cho mục đích sản xuất cồn sinh học.”
1.2 Y
êucầucủađềtài
Chọn được chủng VSV có khả năng sinh cellulasehoạt tính cao; xác định môi
trường và thời gian tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của VSV; thu nhận cellulase
từ VSV; xác định tỷ lệ tủa enzyme tối ưu bằng cồn và sử dụng kỹ thuật sắc ký lọc gel
đểtinh sạch cellulase.
1.3N
ộidungthựchiện
Phân lập các chủng VSV từ các nguồn phế phẩm nông lâm nghiệp và xác định
khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của VSV trên môi trường cảm ứng nhằm thu
nhận chủng VSV có hoạt tính cellulase cao.
Khảo sát các yếu tố môi trường và thời gian ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp
cellulase của chủng VSV.
Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn và thu nhận được enzyme cellulase sạch có hoạt
tính cao bằng kỹ thuật sắc ký lọc gel để phục vụ cho mục đích sản xuất cồn sinh học.

2


Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU

 

2.1.Sinhkhốivàthànhphầncủasinhkhối
2.1.1Sinhkhốivànguồnsinhkhốiởthựcvật
Sinh khối là một thuật ngữ bao hàm ý nghĩa rất rộng dùng để mô tả các vật chất
có nguồn gốc sinh học như cây cối tự nhiên, cây trồng công nghiệp, tảo và các loài
thực vật khác hoặc là những xác bã nông nghiệp và lâm nghiệp. Sinh khối cũng bao
gồm cả những vật chất như chất thải từ quá trình sản xuất thức ăn, nước uống, bùn,
nước cống, phân bón, sản phẩm phụ gia công nghiệp và các thành phần hữu cơ của
chất thải sinh hoạt ( />Sử dụng hiệu quả năng lượng sinh khối đang là vấn đề được quan tâm trên thế
giới nhằm giảm một phần sức ép về sử dụng nhiên liệu.Sinh khối thực vật ở nước ta có
nhiều dưới dạng phế thải nông nghiệp như trấu, rơm,vỏ lạcphế thải của sản xuất; chế
biến gỗ như mùn cưa, dăm bào, gỗ vụn.
Theo số liệu năm 2011, Việt Nam sản xuất 42,3 triệu tấn lúa; 4,7 triệu tấn ngô; gần
10 triệu tấn sắn; 1,167 triệu tấn cà phê; 17,5 triệu tấn mía ( />lists/appspstatistic/).Điều này cho thấy lượng phế thải sẽ tập trung quy mô lớn và dự kiến
sẽ trở thành một nguồn tài nguyên sinh khối lớn cho các ứng dụng năng lượng sinh học.
2.1.2T
hànhphầncơbảncủasinhkhối
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật bao gồm cellulose,
hemicellulose và lignin.Trong đó, Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu
tạo từ các gốc đường khác nhau, lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ
tiền phenylpropanoid(Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2010).
Bảng2.1Thành phần lignocellulose trong rác thải và phụ phế phẩmnông nghiệp
Nguồn lignocellulose
Thân gỗ cứng
Thân gỗ mềm
Lõi ngô
Giấy
Vỏ trấu
Rác đã phân loại

Lá cây

Cellulose (%)
40-55
45-50
45
85-99
32
60
15-20

Hemicellulose (%)
24-40
25-35
35
0
24
20
80-85

3

Lignin(%)
18-25
25-35
15
0-15
18
20
0

(Betts và ctv, 1991)


Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành nông - lâm nghiệp và công nghiệp
giấy gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối thực vật dư thừa được coi
là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu
sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men, bổ sung chất dinh
dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật (Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2010).
 Celluloselà thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, có công thức cấu tạo
là (C6H10O5)n, thường liên kết với với các chất khác như lignin, hemicellulose, pectin,
có nhiều trong sợi bông vải (95- 98%), lanh (80 - 90%), đay (85 - 90%), gỗ (40 50%), lá (15 -20%)(Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003).

H
ình2.1Công thức hóa học của một đoạn phân tử cellulose
()
Cellulose không có trong tế bào động vật.Chúng là một homopolimer mạch
thẳng, được cấu tạo bởi các -D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với
nhau bởi liên kết -1,4 glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một
góc 180o và có dạng như một chiếc ghế bành.Cellulose thường chứa 10000-14000 gốc
đường và được cấu tạo phức tạp.Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết
hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là vùng kết tinh và
vùng vô định hình (Betts và ctv, 1991).
 Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết
hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon
của mạch khác. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên
ngoài. Enzyme cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này.

4



 Vùng vô định hình: các mạch cellulose liên kết với nhau nhờ lực Vander Waals. Ở
vùng này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài.
Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme cellulase rất dễ tác động, làm
thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.
Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục
lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh.Các cây gỗ lâu năm thường chứa
lượng cellulose kết tinh, ngược lại các cây thảo mộc thì chứa nhiều cellulose vô định
hình (Howard và ctv, 2003).
Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do,
hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hoá học như methyl hoặc gốc
acethyl tạo nên các dẫn xuất eter hoặc ester của cellulose. Một trong những dẫn xuất
được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được
thay thế bằng gốc (-OCH2COOH).
Trong thiên nhiên, khi thực vật và VSV có chứa cellulose bị chết, cellulose của
chúng bị phân hủy bởi cả một tập đoàn VSV. Các loài VSV sẽ thay phiên nhau phân
hủy cellulose để tạo ra mùn và từ đó các thành phần cấu tạo của cellulose lại được đi
vào các con đường chuyển hóa trong chu trình chuyển hóa vô tận của thiên nhiên.
Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn.Số lượng cellulose
thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật.Người ta thấy rằng, lượng
cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông, cellulose có thể
chiếm đến 80-90% (Nguyễn Đức Lượng, 2010).
 Hemicelluloselà polysaccharide có phân tử lượng nhỏ hơn phân tử lượng của
cellulose rất nhiều.Chúng được cấu tạo từ 150 gốc đường. Các gốc đường này được
nối với nhau bằng các liên kết -1,4;  -1,3; -1,6 glucoside. Chúng thường là những
mạch ngắn, phân nhánh.Cấu trúc của hemicellulose không bền, chúng không hòa tan
trong nước nhưng dễ dàng bị phân giải bởi acid loãng hoặc kiềm (Lê Ngọc Tú,
2002).Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy
nhiên có một vài điểm chung gồm:
 Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -1,4 glycosid.
 Thành phần quan trọng nhất là xylose.

 Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O - liên kết với vị trí 2 hoặc 3.
5


Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc
trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin
là nhờ các mạch nhánh này.Hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định
hình vì thế dễ bị thủy phân (Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2010).
Hemicellulose tan trong dung dịch kiềm và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một
trong ba sinh khối chính có trong tự nhiên. Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo
nên thành tế bào vững chắc ở thực vật.Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là
D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần
khác và nằm trong liên kết glycoside.Hemicellulose còn chứa cả acid 4 - Omethylglucuronic, axit D-galacturonic và axit glucuronic. Trong đó, đường D-xylose, Larabinose, D-glucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân cỏ và ngũ cốc. Tuy nhiên,
khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lượng lớn các
dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài và từng loại mô trong cùng một loài
cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó (Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2010).
Hemicellulose cũng là thành phần của tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các
phần như: vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu (Võ Thanh Trang, 2009). Khi thủy phân
hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose như manose,
galactose, nhóm pentose như arabinose, xylose. Tùy theothành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như mannan,
galactan và pentozan. Các polysaccharide như mannan, galactan, araban và xylan đều
là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các
cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ.
Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực
vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-Dxylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất. Đa số phân tử xylan
chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên (Puls và Schuseil, 1993).Các gốc thay thế
chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl.Các
nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin,
cellulose và các polymer khác (Sunna và Antranikian, 1997).
Cấu tạo, số lượng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau thì khác nhau.

Xylan tồn tại ở dạng O - acetyl-4 - O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng hay arabino6


4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm(Palonen, 2004), thành phần cấu tạo xylan là
axit D - glucuronic, có hoặc không có ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc.
 Lignin: Theo Palonen (2004), lignin là một hợp chất cao phân tử, chúng có
nhiều ở thực vật bậc cao. Ở cây gỗ, lignin chiếm tới 20-30%.Trong thành phần của
lignin, carbon chiếm tới 69%, hydro chiếm 7% và oxy chiếm 24%.
Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và trong acid vô cơ. Dưới tác
dụng của bisulfite natri và axit sulfuric, lignin bị phân giải tạo ra các hợp chất có
vòngthơm. Trong thực vật chúng liên kết các tế bào lại với nhau, làm tăng độ bền cơ học
cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các độc tố, các VSV từ bên ngoài.
2.2.Tổngquanvềenzym
celulase
2.2.1C
ácnguồnthunhậnenzym
ecelulase
Theo Nguyễn Hoàng Phúc và ctv (2012), enzyme cellulase có thể được thu nhận
từ các nguồn khác nhau như:
 Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm.
 Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen.
 Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men.
Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật, bao gồm:
 Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus.
 Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli.
 Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis.
2.2.2P
hânolạienzym
ecelulasevàcơchếhoạtđộng
Theo Dahot và Noomrio (1996), tên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các

enzyme tham gia phân cắt hợp chất cellulose. Tất cả các enzyme cellulase đều có tác
dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 đơn vị glucose và được các nhà khoa học phân ra
làm 3 nhóm chủ yếu sau đây:
 1,4-D-glucan cellobiohydrolase (CBH). Enzyme cắt đầu cuối của chuỗi cellulose
để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase.
 1,4-D-glucan-4-glucanohydrolase (EG). Enzyme này tham gia phân giải liên kết 
-1,4 glucoside trong cellulose và -D-glucanase. Sản phẩm của quá trình phân giải là

7


cellodextrin, cellobiose, và glucose. Enzyme này còn có một loạt tên khác như:
endoglucanase, endo 1,4-D-glucanase, C-cellulase.
 -D-glucoside glucohydrolase. Enzyme này tham gia phân hủy cellobiose tạo thành
glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Trong các tài
liệu khoa học, chúng còn có tên là cellobiase và -glucosidase.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzyme EG có tác dụng phân cắt tốt trên
cellulose vô định hình và đặc biệt có tác dụng trên cellulose biến tính như CMC,
HEC.Vì vậy, để xác định hoạt tính enzyme này người ta thường sử dụng cơ chất là
CMC.Còn các enzyme CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô
định hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính.Trong hệ thống
enzyme CBH thì enzyme CBH I tấn công từ đầu khử, trong khi CBH II tấn công vào
đầu không khử của chuỗi cellulose (Noomrio, 1996).
Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzyme trên.Đầu tiên enzyme EG
tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các đầu cuối của chuỗi.Tiếp sau đó các
enzyme CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là cellobiose.Việc phân cắt cuối
cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzyme-glucosidase (Worfgang Gerhartz, 1990).

Hình 2.2Cơ chế hoạt động của hệ enzyme cellulase
( />8



2.2.3C
ấutrúcvàtínhchấtenzym
ecelulase
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các axid
amin được nối với nhau bởi liên kết peptid (- CO-NH-). Trong hệ cellulase của nấm
sợi, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endo-glucanase (EG) và
exoglucanase (CBH) giống nhau, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng,
phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xác tác và được gắn thêm vùng glycosyl hóa,
cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain). CBD có vai
trò tạo liên kết với cellulose tinh thể.Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương
quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của
enzyme này đối với cellulose.Hơn nữa, hoạt tính của enzyme cellulase dựa vào tinh
thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm
gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho
enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể.Vùng
gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc
thay đổi chiều dài của vùng glycosyl hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của
enzyme (Lê Hồng Phú, 2003).

H
ình2.3Cấu trúc tinh thể enzyme cellulase
( />Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl
cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4glucosid trong cellulose, lichenin và các β - D-glucan của ngũ cốc.

9


Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.Cellulase hoạt động ở pH

từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5.Nhiệt độ tối ưu từ 40-50oC.Hoạt tính
cellulose bị phá hủy hoàn toàn ở 80oC trong 10 đến 15 phút.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và
bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác
như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ.
2.2.4C
ơchấtvàhoạtự
lcenzym
ecelulase
Cellulose là cơ chất của enzyme cellulase.Cellulose là một polysaccharide phong
phú nhất trong tự nhiên. Việc phân hủy sinh học cellulose bởi vi sinh vật là một trong
những bước chính của chu trình carbon trên trái đất.
Theo Nguyễn Đức Lượng (2004), thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả
ba loại enzyme cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase.Thiếu
một trong ba loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng.
Từ những nghiên cứu riêng lẻ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động
tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đưa ra kết luận chung là
các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm
cuối cùng là glucose.
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên
thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài
phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose
trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy
cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất,
lượng enzyme, một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulase
từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Quá trình thủy phân cellulose chỉ có thể được
tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại enzyme cellulase. Mỗi
loại vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tồng hợp ưu việt một loại enzyme. Chính vì thế
cần phải khai thác enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật.


10


2.2.5C
ácyếutốảnhhưởngđếntốcđộphảnứngcủaenzym
ecelulase
 Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme
của visinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Sinh trưởng và sinh tổng
hợp enzyme thường bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một
giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme. Hoạt tính enzyme đạt
cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng
40 - 50oC. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt
tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0oC, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể
phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp.
 pH môi trường:Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi
trường phản ứng.Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt
động có thể trung tính, kiềm hoặc axit.Đối với enzyme cellulase pH tối ưu là 5–6.
 Nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất thì tốc độ phản ứng enzyme tỉ lệ
tuyến tính với nồng độ enzyme. Nhưng khi nồng độ enzyme quá lớn tốc độphản ứng
enzyme cũng tăng chậm.
V= k [E]
Với

v:vận tốc phản ứng

[E]: nồng độ enzyme.
 Nồng độ cơ chất: Mở đầu phản ứng phải tạo thành phức enzyme-cơ chất (ES), sau
đó phức ES chuyển hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng enzyme tự do,

enzyme kết hợp với phân tử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới. Nồng độ cơ chất càng
cao tốc độ phản ứng càng tăng nhưng nồng độ cơ chất tăng đến mức độ nào đó thì dù
nồng độ cơ chất tăng nhưng tốc độ phản ứng vẫn không đổi(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.2.6K
ỹthuậtáchvàlàm
sạchchếphẩm
enzym
e
Theo Nguyễn Tiến Thắng (2010), trong dịch chiết ngoài enzyme còn có các
protein cấu trúc, các chất cao phân tử khác nhau như polysaccharid axit nucleic, các
chất có phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng. Để loại chúng
phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.

11


Để loại bỏ muối khoáng, các loại đường,là các tạp chất có phân tử lượng thấp,
người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung
dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc và protein trơ) và các chất có phân tử
lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các kỹ thuật khác nhau: kỹ thuật biến tích
chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, kỹ thuật kết tủa phân
đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các kỹ thuật sắc ký (sắc ký hấp
phụ và sắc ký trao đổi ion), điện di, kỹ thuật lọc gel. Kỹ thuật biến tích chọn lọc nhờ
tác dụng của nhiệt hoặc pH của môi trường chỉ dùng đối với trường hợp các enzyme
bền với nhiệt hoặc bền với axit.
 Kỹ thuậttủa enzyme bằng muối: Kỹ thuật này thường được sử dụng như là bước
tinh sạch đầu tiên, bởi chúng có độ chọn lọc không cao, dễ thay đổi. Ở nồng độ muối
thấp, độ hòa tan của protein tăng với nồng độ muối gia tăng, gọi là staling in. Khi nồng
độ muối tăng cao hơn, thì độ hòa tan của protein giảm và tạo tủa, gọi là staling out. Chủ

yếu các cation và anion của muối tương tác với nước bao quanh phân tử protein, làm
tăng tính kỵ nước của protein, dẫn đến tạo tủa. Trong đó, các muối trung tính như muối
sulphate và phosphate, đặc biệt là muối (NH4)2SO4 là thông dụng hơn cả.
 Kỹ thuật tủa enzyme bằng phức hợp nước và dung môi hữu cơ: Kỹ thuật này
thường được sử dụng ở giai đoạn đầu tinh sạch enzyme.Có nhược điểm là phải thực hiện
ở nhiệt độ thấp (khoảng 20oC), vì dung môi hữu cơ gây biến tính protein ở nhiệt độ
phòng. Ethanol và acetone là 2 dung môi thường được sử dụng nhiều nhất. Kết tủa bằng
dung môi hữu cơ ưu điểm hơn kết tủa bằng muối, vì có độ chọn lọc cao hơn, ít tạo tủa
vô định hình, dễ dàng thu nhận bằng ly tâm. Tủa tạo thành nhờ tương tác tĩnh điện giữa
các phân tử protein với nhau, kể cả sự có mặt tương tác hấp dẫn Van de Waals, làm giảm
hằng số điện môi giữa chúng.
 Kỹ thuật tủa enzyme bằng các polymer trung tính: Các polymer trung tính tạo
tương tác giữa các protein với nhau, nhờ ưu thế loại bỏ bọc nước, dẫn đến tạo tủa
protein và tách phase. Khác với dung môi hữu cơ, các polymer trung tính như
polyethylene glycol, không gây biến tính protein, nên có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng.
 Kỹ thuậttủa enzyme bằng điểm đẳng điện: Dựa trên tính chất protein có độ hoà
tan thấp ở điểm đẳng điện. Ở điểm đẳng điện độ hydrate hoá của protein là cực tiểu làm
12


tăng tương tác giữa các phân tử protein, dẫn đến tạo tủa. Khó khăn của kỹ thuật này là
do protein chỉ có khoảng giá trị pH đẳng điện giới hạn. Kỹ thuật này cho hiệu quả không
cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với kỹ thuật tủa bằng
dung môi hữu cơ(Đỗ Văn Hai, 2010).
2.2.7K
ỹthuậtsắckýọlcgel
Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm
bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng
phương pháp sắc ký lọc gel (Đỗ Văn Hai, 2010).
Cơ sở của kỹ thuật lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và

phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.Để đảm bảo cho việc
tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein
enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng
như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không
có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl).Gel sephadex là chất
thoả mãn các yếu tố trên. Sephadex là chếphẩm dextran do các loài vi sinh vật khác
nhau nhưLeuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môi trường chứa
saccharose. Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do các gốc glucose tạo thành các liên
kết glucsid 1,6. Sephadex nhận từ dextran bằng cách xử lý hóa học (do tác dụng của
epichlohidrin) để tạo ra các lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi là “sang phân tử” và
chất này trở thành không tan trong nước. Số liên kết ngang tạo ra càng nhiều, kích
thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ.
Kỹ thuật lọc trên sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy
tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định. Sau đó cho dung dịch
enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng
phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuyếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt
Sephadex bịtrương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là
protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ
rơi xuống trước, sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột (Hình 2.4). Vì vậy ta có thể tách được
chất có trọng lượng phân tử cao hơn ra khỏi chất có phân tử lượng nhỏ. Hãng Sephadex
(Pharmacia) của Thụy Điển đã tung ra thị trường các loại sephadex có kích thước khác
nhau có ký hiệu từ G10 đến G200. Số ký hiệu nhằm chỉ ra mức độ hút nước của chúng.
13


H
ình2.4Mô phỏng hoạt động của lọc phân tử sephadex
(Đỗ Văn Hai, 2010)
Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 đến G200 phục vụ trong việc lọc
phân tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau.nằm trong khoảng các

ngưỡng được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng2.2Trọng lượng phân tử cho phép của các loại gel sephadex
Các loại sephadex

Trọng lượng phân tử

G. 10

0 – 700

G. 15

0 - 1500

G. 25 hạt tinh (F)

100 - 5000

hạt thô (C)
G. 50 hạt tinh (F)

1500 - 30000

hạt thô (C)
G. 75

3000 - 70000

G. 100


4000 - 150000

G. 150

5000 - 400000

G. 200

5000 - 800000
(Đỗ Văn Hai, 2010)

Các gel lọc phân tử được sản xuất trong 4 cỡ hạt cùng trong một vòng lọc phân
tử: hạt thô, hạt trung bình, hạt mịn, hạt siêu mịn, rất mịn.

14


Sự chênh lệch nhiều vì phân tử lượng của các enzyme (12700 -1000000) cho phép
nghĩ rằng để tách và làm sạch enzyme, phương pháp lọc gel sephadex là phương pháp
có nhiều triển vọng.Nơi có ít liên kết ngang tách chất có trọng lượng phân tử lớn và
ngược lại.Người ta còn sửdụng sephadex để loại muối thay cho quá trình thẩm tích.
Ngoài nhóm chất rây phân tử là chế phẩm dextran còn có nhóm chất rây phân tử
khác như chế phẩm gel acrylamide bao gồm Biogel (Bio - Rad) và Acrilex
(Reanal).Acrilex gel là loại copolime, sản phẩm của Hungary được tạo ra từ
acrylamide và N, N' - methylen - bis - acrylamide.Các acrilex gel có ký hiệu từ P - 2
đến P -300 dùng để tách các chất có trọnglượng phân tử trong ngưỡng từ 100 đến
300000.Có thể sử dụng ở vùngpHtừ 2 - 11.Chất thứ ba là agarose loại sulphate.Hay
phổ biến là loại sepharose (pharmacia).Người ta thường dùng chất này để tách các
phân tửcó trọng lượng lớn hơn 106.
2.2.8.Ứ

ngdụngenzym
ecelulasetừV
V
S
2.2.8.1Ứ
ngdụngenzym
ecelulasetrongchếbiếnthựcphẩm
Enzyme cellulase không phải là enzyme được sử dụng nhiều trong thực phẩm.So
với những enzyme khác tỉ lệ ứng dụng enzyme này vào khoảng 1%.Đây là con số rất
nhỏ so với enzyme amylase (Nguyễn Đức Lượng, 2004).Trong nhiều ứng dụng trong
thực phẩm, cellulase không được sử dụng nhiều nhưng thêm vào để làm tăng hoạt tính
của những enzyme khác, chủ yếu là pectinase và xylanase. Endoglucanase có tác dụng
trên cơ chất 1,3-1,4--glucan, ngoài ra chúng cũng có tác dụng trên 1,3-1,4-glucanase, lichenase và laminarinase. 1,3-1,4--glucan và arabinoxylan là thành phần
chủ yếu trong thành tế bào ngũ cốc và 1,3-1,4--glucan tồn tại số lượng lớn trong lúa
mạch và yến mạch (Đỗ Quý Hai, 2010).
Vì vậy, cellulase là enzyme hữu ích trong chế biến ngũ cốc. Phần lớn cấu trúc glucanase khi hòa tan trong nước tạo độ nhớt rất cao. Trong một vài trường hợp chúng
có lợi do chúng đóng vai trò như màng lọc, nhưng trong một vài trường hợp khác
chúng gây khó khăn cho quá trình chế biến.
2.2.8.2Ứ
ngdụngenzym
ecelulasetrongsảnxuấthứcăngiasúc
Nguồn phế liệu giàu cellulose trong tự nhiên rất đa dạng, phong phú như: rơm rạ,
bã mía, cùi bắp. Tuy nhiên, phần lớn các chế phẩm này bị vứt bỏ, hoặc được ủ làm
phân bón, hoặc được sử dụng làm chất đốt.Trong khi đó, nguồn nguyên liệu rẻ tiền
15